Laserinducerad åtgärdspotentialliknande mätningar av kardiomyocyter på mikroelektrodmatriser för ökad prediktivitet för säkerhetsfarmakologi

Denna metod gör det möjligt att registrera intracellulära lika åtgärdspotentialer på traditionella MEA: er, vilket möjliggör en bättre beskrivning av AP-formen och en mer känslig klassificering av pro-arytmiska potentialer. Jämfört med typiska fältpotentialinspelningar ger den intracellulära lika faktiska potentiella formen mer insikt i den exakta auktoriseringen av de underliggande jonkanalerna. När metoden tillämpas på kardiomyocyter som härrör från kliniska patienter genom stamcellsteknik kan den bidra till kausal diagnos och personalisering av C R P och hjärtsjukdomar som arytmier Vår tekniker, Karin Gebhardt, kommer att demonstrera kardiomyocytodlingen.

För att börja belägga elektrodfälten för de tidigare autoklaverade MEA: erna, Dropwise med fibronektin med en 10 mikroliter pipett under den laminära flödeshuven. För att minska den osmotiska chocken, överför pläteringslösningen droppvis i 90 sekunder till 50 ml röret som innehåller tina kardiomyocyter. Tillsätt försiktigt åtta milliliter pläteringsmedium i röret och blanda cellsuspensionen försiktigt.

Använd en 10 ml pipett, ta bort supernatanten, se till att inte kassera pelleten och justera cellnumret till slutlig koncentration. Innan cellsittning ta bort den applicerade beläggningslösningen från MEA-elektrodområdet med en 10 mikroliter pipett. För att undvika torkning av beläggningen frö cellerna omedelbart genom att tillsätta fyra mikroliter av cellerna droppvis på elektrodfälten för båda, sex brunnar MEA och en brunn M E A.Låt nu cellerna hålla fast vid brunnarna i en timme vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid.

Under den laminära flödeshuven, tillsätt 200 mikroliter och en milliliter sterilt pläteringsmedium uppvärmt till 37 grader Celsius för sex Well MEA respektive single well MEA. För MEA-inspelningar, placera MEA-systemet ovanpå enheten med MEA-chiphållaren centrerad över målhålet. Låt sedan lasern fokusera på elektroderna genom att placera MEA-inställningen, så att målet ligger direkt under hålet i MEA-systemet.

För att låta cellerna återhämta sig från den mekaniska störningen, överför MEA-chipet med de odlade cellerna från inkubatorn till MEA-installationen 15 minuter före inspelningen. Rengör sedan kontaktdynorna och stiften försiktigt med en isopropanolpinne för att minska ljudnivåerna. Placera MEA försiktigt i MEA-installationen och placera MEA-chipet med sex brunnar med serienumret synligt på höger sida eller ett enda brunns-MEA-chip med referenselektroden till vänster.

Ställ nu in MEA-systemets integrerade uppvärmning till 38 grader Celsius. Stäng locket på enheten eftersom den integrerade säkerhetsbrytaren endast tillåter att lasern aktiveras om locket är stängt över MEA-chipet. Med hjälp av MEA-konfigurationsprogrammet ställer du in MEA-systemfiltret med högt pass och lågt pass till 0,1 hertz eller mindre respektive 3 500 hertz.

Använd MC-rackprogramvaran eller någon alternativ programvara för inspelning. Justera ingångsområdet enligt experimentet. Se till att signalen inte mättar förstärkaren och samplingsfrekvensen.

Använd programvarans långsiktiga visningsfunktion för att kontrollera inspelningen. Efter att ha satt in MEA-chipet i MEA-installationen och konfigurerat programvaran initierar du lasermekaniken med FB ALP-programvaran. Klicka nu på initialiseringsknappen.

I slutet av initialiseringen kommer den virtuella laserpunkten att vara i brunn D för en sex brunn MEA respektive längst ner till vänster för en enda brunn MEA. Använd sedan kontrolltangenten med ett musklick för att flytta den virtuella laserpunkten till mitten av D fem-elektroden och justera fokus genom att hålla kontrolltangenten intryckt och rulla med mushjulet. Du kan också använda autofokusfunktionen.

Tryck på knappen set P one, och den virtuella laserpunkten flyttas automatiskt in i brunnen F.Systemet är nu inställt. Justera lasereffekten och processtiden enligt de experimentella kraven. För att aktivera lasern, klicka på laseravstängningsknappen som kommer att visas som laser på, Byt till inspelningsprogramvaran.

Välj ett filnamn och klicka på den röda inspelningsknappen följt av uppspelningsknappen ovanpå fönstret för att spela in mätningen. Innan du öppnar cellerna med lasern registrerar du en baslinje i 60 sekunder. Byt tillbaka till initieringsprogramvaran och inaktivera elektroder som ska uteslutas av lasern på den virtuella kartan till höger om programvarufönstret.

För att starta lasern använd Alt-musklick och välj mittelektroden för denna brunn. Detta initierar lasern för att öppna cellerna på varje elektrod i denna brunn automatiskt, upprepa för varje brunn för att öppna alla tidigare aktiverade elektroder i denna valda brunn. Lös upp millimolär koncentration av Nifedipin E-40 31 och Dofetilide i DMSO först och sedan i fullständigt medium till 10 gånger den önskade koncentrationen.

Överskrid aldrig en slutlig DMSO-koncentration på 0,1% i brunnen. Registrera baslinjeaktiviteten i 60 sekunder. Starta den laserinducerade perationen som visats tidigare, vilket resulterar i en omvandling av FPS till liAPs.

Applicera alla droger som en enda koncentration per brunn. Ta bort 20 mikroliter och 100 mikroliter medium per brunn från sex brunnar respektive enstaka brunn MEA. Tillsätt 20 mikroliter eller 100 mikroliter av läkemedelsstamlösningen som ska mätas till brunnen.

Beroende på MEA-typ, och pipettera försiktigt upp och ner två till tre gånger. Låt föreningarna tvättas i 300 sekunder. Under denna tid kan liAP-formen omvandlas till FP-formen.

Återigen, inducerad laserinducerad peration och registrera möjliga föreningsinducerade defekter på liAP i ytterligare 60 sekunder. Tillsatsen av nifedipin minskade platåfasen av liAP på ett koncentrationsberoende sätt och förkortade därmed hela liAP. Denna förkortning var jämförbar med fältpotentialerna hos kardiomyocyter från omanipulerade elektroder.

E-40 31 hämmade repolariseringen av relevanta KV en punkt 11 kaliumkanaler och ledde till det arytmiska beteendet hos kardiomyocyter vid ökade koncentrationer. Dessutom ökade E-40 31 liAP-varaktigheten på ett koncentrationsberoende sätt. I slutet av liAP observerades små positiva spänningsavböjningar vid 0,1 mikromolar som blev mer framträdande med högre koncentrationer, vilket indikerar en övergående ny depolarisering som kallas EAD: s.

Vid den högsta koncentrationen på 0,1 mikromolar eskalerade dessa EAD: er med tiden till ektopiska slag. Vilka är för tidiga åtgärdspotentialer. EAD och ektopiska beats är nyckelindikatorer på proarytmisk aktivitet.

Och i slutändan resulterar den elektriska aktiviteten i arytmisk misshandel. Koncentrationsresponsrelationerna korrelerade med FP:s och liAP:s inspelningar. Vidare, i närvaro av dofetilid, visade både FP och liAP varaktigheter på cirka två sekunder inom samma brunn, FP-vågformen presenterade regelbundna repolariseringsavböjningar.

Medan i liAP EAD: er är detekterbara. Det är viktigt att justera fokus före varje melom eftersom en mikroskopbild utan fokus kan påverka cellernas öppning. Dessutom vidtas åtgärdspotential strax efter det att opterperation bör användas för analys.

Denna teknik är känsligare för att upptäcka tidigare arytmiska effekter jämfört med standard MEA, vilket möjliggör mer exakt detektering av negativa sammansatta effekter.