Impianto di silicio cronica sonde e registrazione delle cellule ippocampali posto in un apparato di tapis roulant arricchito

Neuroscience

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Summary

Vengono descritti i diversi passi per impiantare microleve cronica e registrare posto cellule nei topi che vengono fissati a testa in esecuzione su un apparato di tapis roulant cue-arricchita.

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Sariev, A., Chung, J., Jung, D., Sharif, F., Lee, J. Y., Kim, S., Royer, S. Implantation of Chronic Silicon Probes and Recording of Hippocampal Place Cells in an Enriched Treadmill Apparatus. J. Vis. Exp. (128), e56438, doi:10.3791/56438 (2017).

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Abstract

Un requisito importante per comprendere la funzione del cervello è l'identificazione del comportamento e l'attività delle cellule correla. Punte in silicio sono avanzati elettrodi per registrazioni elettrofisiologiche su larga scala dell'attività neuronale, ma le procedure per il loro impianto cronica sono ancora poco sviluppate. L'attività delle cellule ippocampali posto è noto per correlare con la posizione di un animale nell'ambiente, ma i meccanismi di fondo sono ancora poco chiari. Per studiare le cellule posto, qui descriviamo un insieme di tecniche che vanno dalla fabbricazione dei dispositivi per sonda di silicio cronica gli impianti per il monitoraggio delle attività di campo posto in un apparato di tapis roulant cue-arricchita. Un micro-drive e un cappello sono costruiti da raccordo e fissare insieme le parti in plastica stampata in 3D. Una sonda di silicio è montata su micro-unità, pulita e rivestita con la tintura. Un primo intervento chirurgico viene eseguito per correggere il cappello sul cranio di un mouse. Piccoli punti di riferimento sono fabbricati e attaccate alla cintura di un tapis roulant. Il mouse è addestrato per eseguire testa-fisso sul tapis roulant. Un secondo intervento chirurgico viene eseguito per impiantare la sonda di silicio nell'ippocampo, seguendo quali segnali elettrofisiologici a banda larga sono registrati. Infine, la sonda di silicio è recuperata e pulita per il riutilizzo. L'analisi dell'attività delle cellule posto in tapis roulant rivela una diversità di meccanismi di campo, delineando il beneficio dell'approccio.

Introduction

Punte in silicio presentano diversi vantaggi per registrazioni elettrofisiologiche, compreso il fatto che essi sono progettati con profili taglienti, riducendo al minimo il danno tissutale e che essi presentano un layout preciso di densamente registrazione siti1, 2,3,4. Essi sono utilizzati per studiare i vari sistemi in specie differenti, compreso gli esseri umani3,5,6, con diversi approcci1,7. Ancora, il loro uso ricorrente è ancora relativamente limitato a causa del loro costo, fragilità e il fatto che i metodi utili per gli esperimenti cronici mancano8. Gli avanzamenti recenti nella tecnologia di stampa 3D hanno reso possibile la progettazione personalizzata di dispositivi come micro-Drive e testa-piastre per consentire una più facile gestione di questi elettrodi delicati. In una prima fase, descriveremo come costruire e utilizzare un insieme di strumenti che abbiamo sviluppato per l'impianto di silicone cronica sonde14.

Mentre le cellule di posizione sono in genere studiate usando gli animali liberi di muoversi in esecuzione in labirinti, recentemente essi sono stati studiati anche in ambienti virtuali15 e tapis roulant apparatii9 (Figura 1A). Questi metodi sperimentali offrono il vantaggio che gli animali possono essere testa-trattenuto, rendendo l'uso di microscopio 2 fotoni15, patch-clamp16e optrode9,10,11 tecniche più facile, oltre a fornire maggiore controllo sul comportamento animale e stimoli ambientali12. In una seconda fase, vi presentiamo le procedure per la formazione di topi e registrare l'attività delle cellule di posto in un apparato di tapis roulant.

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Protocol

tutti i metodi descritti sono stati approvati dal comitato di uso del Korea Institute of Science e tecnologia e cura degli animali.

1. preparare il Micro-drive e l'elettrodo

  1. micro-unità di montaggio.
    1. Stampa le parti della micro-drive (cursore, corpo e shell) 14 utilizzando una stampante 3D ad alta risoluzione. Assicurarsi che le parti non hanno difetti.
    2. Fissare il cursore nel corpo del micro-drive con una vite (dimensione 000-120 x 1/4).
    3. Saldare un dado (formato Hex 000-120 000 120/64) verso la punta della vite.
    4. Ruotare la vite in senso orario per spostare il cursore in alto o in senso antiorario per spostare verso il basso.
    5. Fissare il guscio al corpo con una vite (dimensione 000-120 x 1/4).
  2. Montaggio della sonda sull'unità micro-.
    1. Difficoltà il micro-unità in posizione orizzontale sotto un microscopio binoculare.
    2. Utilizzare un morsetto a coccodrillo piatto con imbottitura in gomma per afferrare il cavo della sonda silicio, mentre si toglie attentamente la sonda dal recinto della spedizione con il forcipe. Fissare il morsetto a coccodrillo per un manipolatore.
    3. Utilizzando il manipolatore, porre la sonda di silicio sul dispositivo di scorrimento di micro-unità, parallelo alla direzione di movimento.
    4. Applicare una goccia di cemento dentale (temperatura di polimerizzazione acrilico dentale materiale di riparazione) per fissare la sonda per il dispositivo di scorrimento. Correggere la posizione della sonda se è spostato. Colla non è raccomandato in quanto guarisce molto velocemente e rende difficile regolare nuovamente la posizione degli elettrodi.
    5. Fissare il connettore della sonda al titolare della C (supporto del connettore) con cemento dentale.
  3. Lavaggio e mettere colorante sulla sonda.
    1. Fix il Microdrive/sonda assemblaggio del dispositivo di pulizia sonda. Il dispositivo è dotato di 2 piccoli rotanti schiuma spugne (tamponi non sterili). Regolare il divario con il manipolatore.
    2. Bagnare le spugne con detersivi.
    3. Muovere lentamente la sonda su e giù tra le spugne, permettendo un tocco delicato. Monitorare il processo di pulizia sotto un microscopio.
    4. Sciacquare la sonda con acqua distillata. Immergere la sonda in alcool per la sterilizzazione.
    5. Dil applica (colorante fluorescente lipofilico) sul retro della tibia della sonda, utilizzando un tampone di gomma piuma. Questo vi permetterà in una fase successiva la visualizzazione delle posizioni di tibia nel cervello.
  4. Montaggio il cappello
    1. stampare le parti del cappello (piastra di testa, supporto del connettore e un coperchio) 14 utilizzando una stampante 3D. I 3 pezzi si incastrano per formare un involucro sigillato.
    2. Inserire dadi (dimensioni M2 e 00-90 00 90/4) nelle asole del piastra di testa e fissarlo con colla e cemento dentale.
    3. Inserire una rondella nello slot della PAC e difficoltà con cemento dentale.

2. Chirurgia per la fissazione del cappello sul cranio

tutti gli strumenti utilizzati per la chirurgia sono preventivamente sterilizzati in autoclave. Viene utilizzato un dispositivo di perline calore secco forto sterilizzare strumenti che essere contaminati e devono essere sterilizzati durante l'intervento chirurgico.

  1. Impostare il livello di isoflurane al 4% per l'inizio dell'anestesia. Mettere il mouse nella camera di anestesia per 5 min.
  2. Installare il mouse in un apparato stereotassica.
  3. Ridurre il livello di isoflurano a 1,5-2%. Regolare il livello durante l'intervento chirurgico in base allo stato animale, il tasso di respirazione e corpo temperatura 20.
  4. Applicare unguento oculare sugli occhi.
  5. Radere il cuoio capelluto e pulire la testa dell'animale con antisettico (iodopovidone). Mantenere condizioni asettiche durante tutte le fasi dell'intervento chirurgico.
  6. Inject bupivacaine (1 mg/kg) sotto il cuoio capelluto. Tagliare e rimuovere la parte della pelle parietale della testa del mouse utilizzando la forbice per esporre il cranio ai relativi bordi. Utilizzare soluzione salina e una spugna emostatica per pulire e controllare il sanguinamento durante l'intervento chirurgico.
  7. Rimuovere il periostio utilizzando uno strumento di raschietto.
  8. Trovare i punti di riferimento sul cranio 21: bregma, lambda, coronale e la sutura sagittale. Regolare la testa ' s angolo lungo l'asse sagittale, tale che il Bregma e lambda punti sono alla stessa altezza.
  9. Praticare due fori (~0.5 mm di diametro) nel cranio per gli elettrodi di riferimento e terra. I fori devono essere circa 1 mm caudale e laterale di 1 mm del Lambda.
  10. Inserire gli elettrodi di riferimento e di terra (viti di acciaio inox dimensioni miniatura 000-120 000 120/16 filo accoppiato ai connettori pin).
  11. Applica luce ultravioletta (UV) attivatore di dentina sul cranio di legame e quindi applicare la luce UV per 45-60 s.
  12. Applicare uno strato di cemento dentale sui bordi del cranio. Evitare la diffusione di cemento sulla pelle e capelli dei topi.
  13. Fissare la piastra di testa a un manipolatore stereotassica e posizionarlo sopra il cranio. Lentamente abbassare la piastra di testa fino a toccare leggermente il cranio e applicare il cemento dentale all'incrocio con il cranio. Lasciate che la cura di cemento dentale per 15 min.
  14. Rimuovere l'anestesia. Difficoltà un supporto del connettore e un berretto sulla testa-piastra. Mettere il mouse nella sua gabbia dopo aver dato un'iniezione sub-cutanea di ketaprofen 5 mg/kg.
  15. Dare Sub-cutanee iniezioni di ketaprofen 5 mg/kg per i prossimi due giorni e monitor con attenzione per qualsiasi segno di dolore. Topi in genere si sveglia dall'anestesia entro 20-40 min. L'impianto di cappello è relativamente leggero (3,34 gr), tale che topi non hanno problemi ad alzare la testa, eseguire in labirinti e salire sui bordi della loro gabbia a casa.

3. Formazione comportamentale

  1. dopo un periodo di recupero post-operatorio di 7 giorni, avviare la restrizione di acqua a 1 mL al giorno.
  2. Per rendere il nastro, tagliare un pezzo di tessuto in velluto (5 cm da 1-2 m) e correggere piccoli oggetti su di esso utilizzando la colla a caldo. Allegare oggetti eretti sui bordi della cintura in modo da non interferire con il movimento del mouse.
  3. Fissare la cinghia sulle ruote del tapis roulant suturando insieme le due estremità.
  4. Installare il mouse testa-fisso in tapis roulant inserendo e serrando le due viti della piastra di testa nelle fessure della piastra di testa-fissazione.
  5. Inizio formazione il mouse per eseguire testa-trattenuto sul tapis roulant per la ricompensa di acqua. Consegnare la ricompensa di acqua attraverso una porta di leccare. Inizialmente, mettere il mouse sul tapis roulant per periodi di 10 minuti, 3 volte al giorno.
  6. Come il mouse si abitua alla testa-fissazione e inizia a muoversi la cintura (in genere dopo circa 3 giorni), aumentare la sessione di allenamento durata 30 min. Dopo 2-3 settimane, alcuni topi eseguire più di 100 sperimentazioni in 30 min (una prova essendo una rotazione completa della cintura).
  7. Scegliere i topi che mostrano le migliori prestazioni comportamentali per gli esperimenti di registrazione.

4. L'impianto di silicone sonda

  1. mettere il mouse sotto anestesia.
  2. Installare il mouse nell'apparato stereotassica di testa-piastra di fissaggio. Pulire la superficie del cranio con soluzione fisiologica.
  3. Trovare marcatori stereotassica: bregma, lambda, coronale e la sutura sagittale. Misurare la distanza fino al punto di inserimento e segnare it.
  4. Trapano l'osso con attenzione fino a quando diventa sottile e trasparente. Inumidire e pulire con soluzione salina durante la foratura.
  5. Rimuovere attentamente l'osso assottigliata e la materia Dura usando la forza di precisionePS. Mantenere la superficie del cervello bagnato con soluzione fisiologica per tutto il tempo.
  6. Difficoltà l'assemblaggio di sonda Microdrive/silicio per un manipolatore stereotassica. Portare la sonda di silicio appena sopra il craniotomy. Avvitare il supporto del connettore della sonda silicio alla testa-piastra.
  7. Collegare gli elettrodi di registrazione amplificatore e riferimento di terra. Scudo del mouse con foglio di alluminio per proteggere dal rumore elettromagnetico. Avviare il sistema di registrazione per monitorare l'attività elettrica del cervello.
  8. Inserire lentamente la sonda di silicio nel cervello usando il micromanipolatore. Controllare continuamente i segnali elettrici, la distanza di manipolatore viaggiato e gli stinchi della sonda (assicurarsi che essi stanno penetrando nel cervello). Attività dell'unità è visibile nella corteccia, mentre la materia bianca sottostante è relativamente silenziosa. Attività dell'unità riappare quando gli stinchi toccare lo strato piramidale dell'ippocampo. Da questo punto, ritrarre il silicio sonda 200 µm (utilizzare il micro-drive, il giorno successivo per riportare la tibia nello strato piramidale).
  9. Coprire la superficie del cervello con una miscela di cera dell'osso e olio minerale.
  10. Difficoltà il micro-drive alla testa-piastra usando cemento dentale. Lasciate che la cura di cemento dentale per 15 min. Quindi scollegare l'unità di micro dal manipolatore stereotassica e mettiti il cappello.
  11. Mettere il mouse indietro nella sua gabbia e dare un'iniezione sub-cutanea di ketaprofen 5 mg/kg. Verifica di qualsiasi segno di dolore. Questa chirurgia è molto meno invasiva rispetto al primo e topi sono in genere attivi entro 45 min dopo si sveglia dall'anestesia. Tuttavia, lasciare che il mouse per recuperare un'intera giornata come la sonda di silicio ha bisogno di stabilizzare nel cervello.

5. Registrazione

  1. installare il mouse testa-fisso sul tapis roulant. Rimuovere il cappello cap.
  2. Collegare l'amplificatore di registrazione e avviare la registrazione.
  3. Il primo giorno, utilizzare il micro-drive per spostare la sonda di silicio nello strato piramidale dell'ippocampo. Ogni girata in senso antiorario della vite si muove la tibia 200 µm più profondo. Regolare la posizione di tibia lentamente (~ 20-50 µm alla volta) fino a ripple oscillazioni 13 e unità attività appaiono.
  4. Sui prossimi giorni, regolare la posizione del gambo e attendere ~ 1 h prima di registrare l'attività hippocampal mentre il mouse viene eseguito sulla cintura. Per mantenere la qualità del segnale buona registrazione per diversi giorni, rimuovere oggetti duri e soffitto dal mouse basso ' gabbia per minimizzare la probabilità che il cappello si imbatte in superfici dure.

6. Riprendendo la sonda

  1. mettere il mouse sotto anestesia.
  2. Installare il mouse nell'apparato stereotassica di testa-piastra di fissaggio. Rimuovere il cappello cap.
  3. Portare il manipolatore stereotassica appena sopra il micro-drive. Difficoltà il micro-drive per il manipolatore. Svitare il supporto del connettore dalla piastra di testa. Rimuovere la vite che collega il guscio e il corpo della micro-drive.
  4. Sotto la supervisione di microscopio binoculare, tirare lentamente l'assemblaggio sonda micro-unità/silicio con il manipolatore stereotassica, lasciando la parte di shell.
  5. Pulire la sonda del silicio con il dispositivo di pulizia.

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Representative Results

Un mouse in primo luogo è stato addestrato per eseguire su una cintura lunga due metri priva di spunti (Figura 1). Dopo l'impianto dell'elettrodo, una nuova cinghia della stessa lunghezza, ma che presenta 3 paia di stecche è stato installato sul tapis roulant, al fine di generare rappresentazioni spaziali allocentriche12,14. Segnali a banda larga sono stati registrati a una frequenza di campionamento di 30.000 Hz, utilizzando un sistema di 250 canali di registrazione (scheda amplificatore con scheda di interfaccia USB e su misura Labview interfaccia) e due punte in silicio (Figura 1A, 4 Tibia, 8 siti per tibia) impiantati in CA1 e CA3 (Figura 1B). Unità sono state rilevate utilizzando una funzione di soglia sui segnali filtrati passa-alto (0.8-5 kHz). Isolamento delle cellule è stato effettuato usando una punta semi-automatica l'ordinamento metodo15,16,17. Il movimento avanti/indietro del tapis roulant è stato monitorato mediante LED e fotosensore coppie e registrata da canali di input digitale del sistema di registrazione.

Una media di cellule 148±35 (mean±s.e.m) potrebbe essere isolata in ogni sessione, tra cui 38.4±3.5% hanno mostrato l'attività di collocazione chiara campo (Figura 2). I campi di posto erano relativamente stabili in molti studi clinici, in entrambi il giorno iniziale di registrazione (Figura 2A) o dopo diversi giorni di esposizione alla cintura acciaccata ( Figura 2eFigura 2B ). Diversi tipi di rappresentazioni spaziali potrebbero essere individuati. Alcune cellule hanno mostrato ripetute posto campi correlati con l'identità dei segnali (Figura 2A), mentre altre cellule hanno mostrato un luogo unico campo (Figura 2)12. Quindi, potremmo registrare le cellule ippocampali posto sopra parecchi giorni e identificare una varietà di meccanismi di campo, due importanti requisiti per studiare i meccanismi e le dinamiche associate a memoria, apprendimento e navigazione spaziale.

Figure 1
Figura 1: apparato di sonda e tapis roulant Silicon. (A) layout tibia e sito della sonda di silicio. (B) sito di impianto. (C) apparato di tapis roulant e il layout degli spunti sulla cintura. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: registrazione cronica delle cellule posto. (A) colore codificato rappresentazione del luogo campi (in alto), spike auto-Correlogramma (in basso a sinistra) e spike forme d'onda (in basso a destra) per un esempio di cella registrati il giorno 1. (B-C) Stesso che (A) per gli esempi di cellule registrata il giorno 5 (C) e 3 (B). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Registrazione cronica dell'attività neuronale è fondamentale per comprendere i processi neurali quali campi posto hippocampal. Il nostro approccio per eseguire cronica silicio sonda implantantation si distingue da altri metodi7,18,19,20 dal fatto che è relativamente semplice recuperare il pacchetto di elettrodo a alla fine dell'esperimento. Mentre le cellule posto in genere vengono studiate in liberi di muoversi condizioni, l'apparato di tapis roulant semplifica non solo notevolmente il disegno sperimentale e analisi dei dati, permette anche ai ricercatori di scrutare posto campo meccanismi in contesti minimi durante molte ripetizioni di traiettorie animale stereotipato12. È anche molto più semplice da costruire rispetto ai sistemi di realtà virtuale, poiché richiede solo la stampa 3D ruote, sensori di movimento unidimensionale e un microcontrollore.

Stabile posto campo attività potrebbero essere registrati nel corso di molti giorni, un requisito importante per indagare le dinamiche a lungo termine di rete associate all'apprendimento. A questo proposito, si devono considerare alcuni problemi. In primo luogo, i processi di formazione di tessuto cerebrale in degenerazione e cicatrice intorno le sonde in silicone potrebbero essi stessi generare variazioni a lungo termine a modelli di attività. Pertanto è importante per tutte le procedure chirurgiche essere fatto con attenzione per causare danni minimi ai tessuti del cervello e vasi sanguigni. In secondo luogo, è relativamente difficile tenere traccia di singole celle per giorni consecutivi, a causa delle derive di elettrodi nel cervello14. A questo proposito, tecniche di imaging come microscopia del due-fotone e micro-endoscopia potrebbe essere meglio adatto, come cella identità possono essere rintracciati dalla morfologia e la configurazione spaziale di cellule21,22,23 . Consentono inoltre una maggiore resa in termini di numero delle cellule registrata e fornire informazioni dirette sulla cella gene espressioni24. Tuttavia, tecniche di imaging sono piuttosto invasivi quando regioni profonde del cervello sono interessate e non possono risolvere i potenziali di azione singoli come essi si basano principalmente su segnali di calcio. Quindi, potrebbe essere una soluzione ottimale per gli studi longitudinali di combinare approcci sia ottici che elettrofisiologici.

Infine, vale la pena notare che l'insieme delle tecniche che abbiamo descritto potrebbe essere facilmente adattabile per altri tipi di elettrodo, tra cui Neuropixels (https://www.janelia.org/lab/harris-lab-apig) e optrodes11,25 , 26e può essere utilizzato in una gamma di modelli sperimentali diversi dalle cellule ippocampali posto. Con i rapidi progressi nella tecnologia di stampa 3D, l'ulteriore miglioramento e personalizzazione dei dispositivi di registrazioni e comportamentali dovrebbe diventare più semplice e accessibile ai laboratori.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato supportato da Korea Institute of Science e tecnologia programma istituzionale (n. progetti 2E26190 e 2E26170) e la Human Frontier Science Program (RGY0089/2012).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Silicon Probe Neuronexus Buzsabi32 Recording electrode
Recording system Intantech RHD2132/RHD2000
3D printer Asiga Pico Plus 27 High resolution printer for micro-drive
3D printer Stratasys Mojo Lower resolution printer for hat components
Stereotaxic apparatus Kopf Model 963
Binocular microscope Leica M60
Treadmill apparatus We build them

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References

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