Combinant la synchronisation cellulaire mitotique et microscopie confocale haute résolution pour étudier le rôle des protéines multifonctionnelles Cycle cellulaire au cours de la mitose

Biology

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Summary

Nous présentons un protocole pour la synchronisation de la thymidine double de cellules HeLa suivie d’analyse à l’aide de la microscopie confocale haute résolution. Cette méthode est essentielle pour obtenir le grand nombre de cellules qui procèdent de façon synchrone de la phase S de mitose, permettant des études sur les rôles mitotiques de protéines multifonctionnelles qui possèdent également des fonctions de l’interphase.

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Amin, M. A., Varma, D. Combining Mitotic Cell Synchronization and High Resolution Confocal Microscopy to Study the Role of Multifunctional Cell Cycle Proteins During Mitosis. J. Vis. Exp. (130), e56513, doi:10.3791/56513 (2017).

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Abstract

Étude sur les divers événements de régulation du cycle cellulaire en fonction de la phase fournit une compréhension claire de la division et la croissance des cellules. La synchronisation des populations cellulaires à des stades spécifiques du cycle cellulaire s’est avérée pour être très utile dans ces efforts expérimentaux. Synchronisation des cellules par un traitement avec des produits chimiques qui sont relativement moins toxique peut être avantageuse sur l’utilisation de médicaments inhibiteurs pharmacologiques pour l’étude des événements de cycle de cellules qui en résulte et obtenir l’enrichissement spécifique de certains stades mitotiques. Nous décrivons ici le protocole de synchronisation des cellules humaines à des stades différents de la cellule du cycle, comprenant à la fois en phase S et phase M avec un bloc double thymidine et libérer la procédure pour l’étude de la fonctionnalité des protéines mitotiques dans l’alignement des chromosomes et la ségrégation. Ce protocole a été extrêmement utile pour étudier les rôles mitotiques des protéines multifonctionnelles qui possèdent des fonctions interphase établies. Dans notre cas, le rôle mitotique de Cdt1, une protéine essentielle pour la réplication origine licences en phase G1, peut être étudié efficacement que lorsque Cdt1 G2/M-spécifiques peuvent être épuisés. Les auteurs décrivent le protocole détaillé pour épuisement des Cdt1 G2/M-spécifique à l’aide de la synchronisation de la thymidine double. Aussi, nous expliquer le protocole de la fixation de la cellule et vivre l’imagerie cellulaire à l’aide de la microscopie confocale haute résolution après la sortie de la thymidine. La méthode est également utile pour analyser la fonction des protéines mitotiques sous des conditions physiologiques et perturbées comme pour Hec1, une composante de la Ndc80 complexe, car elle permet d’obtenir de grands échantillons de taille des cellules mitotiques pour fixe et de cellules vivantes l’analyse que nous montrons ici.

Introduction

Dans le cycle cellulaire, les cellules subissent une série d’événements fortement réglementées et contrôlées dans le temps pour la reproduction exacte de leur génome et leur multiplication. Chez les mammifères, le cycle cellulaire se compose de l’interphase et de la phase M. En interphase, qui se compose de trois phases G1, S et G2, la cellule duplique son génome et subit une croissance qui est nécessaire à la progression de cycle cellulaire normal1,2. Dans la phase M, qui se compose de la mitose (prophase prométaphase, métaphase, anaphase et télophase) et la cytocinèse, une cellule parentale produit deux cellules filles génétiquement identiques. Lors de la mitose, sœur de chromatides-sœurs de génome dupliqué sont condensée (prophase) et sont capturés à leurs kinétochores par des microtubules du fuseau mitotique assemblé (prométaphase), qui pousse leur alignement à la plaque métaphasique (métaphase), suivie de leur égale à ségrégation lorsque sœur chromatides sont divisés vers et transportés vers l’axe opposé de polonais (anaphase). Les deux cellules filles sont physiquement séparées de l’activité d’un anneau contractile axée sur l’actine (télophase et cytocinèse). Le kinétochore est une structure spécialisée de nature protéique qui assemble dans la région centromérique des chromatides et servent de sites de fixation pour les microtubules du fuseau. Sa fonction principale est de conduire la capture de chromosome, alignement et aide à corriger une mauvaise broche microtubule pièce jointe, tandis que la médiation du point de contrôle Assemblée broche pour maintenir la fidélité du chromosome ségrégation3,4.

La technique de synchronisation de la cellule est un outil idéal pour comprendre les événements moléculaires et structurales impliqués dans la progression du cycle cellulaire. Cette approche a été utilisée pour enrichir les populations cellulaires à des phases spécifiques de différents types d’analyses, y compris le profilage de l’expression génique, analyses de processus biochimiques cellulaires et détection de localisation sous-cellulaire des protéines. Des cellules de mammifères synchronisés peuvent être utilisés non seulement pour l’étude des produits des gènes individuels, mais aussi des approches mettant en cause l’analyse des génomes entiers, y compris l’analyse de microarray de gene expression5, miRNA expression patterns6, régulation traductionnelle7et l’analyse protéomique de protéine modifications8. Synchronisation peut également être utilisée pour étudier les effets de l’expression des gènes ou des protéines précipitation ou knock out, ou de produits chimiques sur la progression du cycle cellulaire.

Les cellules peuvent être synchronisés aux différents stades du cycle cellulaire. Méthodes physiques et chimiques sont largement utilisés pour la synchronisation de la cellule. Les critères les plus importants pour la synchronisation de la cellule sont que la synchronisation soit photo-effet et réversible. En raison des conséquences indésirables potentiels cellulaires de synchroniser des cellules par des agents pharmacologiques, les méthodes chimiques peuvent être avantageuses pour l’étude des événements de cycle de cellules clés. Par exemple, hydroxyurée, amphidicolin, mimosine et lovastatine, peuvent être utilisés pour la synchronisation des cellules en phase G1/S mais, en raison de leurs effets sur les voies biochimiques, qu'ils inhibent, ils activer des mécanismes de contrôle de cycle cellulaire et de tuent un important fraction des cellules9,10. En revanche, rétro-inhibition de la réplication de l’ADN en ajoutant thymidine dans les milieux de croissance, appelé « bloc de la thymidine », peuvent arrêter le cycle cellulaire à certains points11,12,13. Cellules peuvent aussi être synchronisés en phase G2/M en traitant avec la nocodazole et RO-33069,14. La nocodazole, qui empêche l’assemblage des microtubules, a une cytotoxicité relativement élevée. En outre, arrêté à la nocodazole cellules peuvent retourner au interphase précocement par glissement mitotique. Double thymidine bloc arrestation des cellules en phase G1/S et après la sortie du bloc, les cellules se trouvent à procéder de façon synchrone par le biais de G2 et en mitose. La progression normale du cycle cellulaire des cellules provenant du bloc de la thymidine peut être observée en microscopie confocale haute résolution par fixation cellulaire ou imagerie live. L’effet d’une perturbation des protéines mitotiques peut être étudiée précisément lorsque les cellules entrer et passer par mitose après la sortie de bloc double thymidine. Cdt1, une protéine multifonctionnelle, participe à l’origine de réplication ADN licence en phase G1 et est également nécessaire pour les pièces jointes de microtubules kinétochores durant la mitose,15. Pour étudier la fonction des Cdt1 durant la mitose, on a besoin d’adopter une méthode qui évite l’effet de son appauvrissement sur l’autorisation de réplication au cours de la phase G1, alors qu’en même temps effectuer son appauvrissement spécifiquement au cours de la phase G2/M seulement. Nous présentons ici des protocoles détaillés basés sur le bloc de thymidine double pour étudier le rôle mitotique des protéines des fonctions multiples au cours des différentes étapes du cycle cellulaire par l’imagerie fixe et cellules vivantes.

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Protocol

1. double bloc de Thymidine et libération : préparations de réactif

  1. Faire 500 mL que Dulbecco modified Eagle moyen (DMEM) additionné avec 10 % FBS, la pénicilline et la streptomycine.
  2. Faire le stock de 100 mM de la thymidine dans l’eau stérile et magasin en aliquotes à-80 ° C.

2. protocole d’imagerie cellulaire fixe de Progression mitotique (Figure 1 a)

  1. Jour 1, semence ~ 2 x 105 les cellules HeLa dans les puits d’une plaque de 6 puits avec une lamelle couvre-objet (stérilisé avec l’éthanol à 70 % et l’irradiation UV) et 2 mL de milieu DMEM. Cultiver les cellules dans un incubateur humidifié pendant 24 h à 37 ° C et 5 % de CO2.
  2. 1 bloc de thymidinest : au jour 2, mélanger soigneusement le volume requis de la thymidine dans les supports neufs de DMEM (100 mM stock, 2 mM concentration finale).
  3. Ajouter 2 mL de thymidine contenant plaque de médias aux cellules dans chaque puits de la 6 puits et incuber pendant 18 heures.
  4. Le jour 3, aspirer le milieu et laver les cellules deux fois avec 2 mL de solution 1 PBS x et une fois avec frais DMEM préchauffée ; la croissance de cellules dans un milieu DMEM préchauffée frais pendant 9 h libérer les cellules du bloc.
  5. 2nd thymidine bloc : encore une fois ajouter 2 mL de thymidine contenant médias (concentration finale de 2 mM) pour les cellules dans chaque puits de la plaque 6 puits.
  6. Incuber pendant encore 18 h.
  7. Jour 4, aspirer le milieu et laver les cellules deux fois avec 2 mL de solution 1 PBS x et une fois avec frais DMEM préchauffée.
  8. Réactif de transfection dans un milieu de croissance libre sérique séparément pendant environ 10 minutes et siRNAs diluée (contrôle et Cdt1) mélangez-les ensemble et incuber pendant 20 min à température ambiante. La concentration finale de siARN utilisé dans chaque transfection était de 100 nM. Ajouter le mélange réactionnel aux cellules qui ont été lavés de Thymidine.
  9. Incuber à 37 ° C pendant 9-10 h libérer de bloquer et de fixer les cellules sur les feuillets de la couverture avec 4 % des cellules PFA pendant 20 min à température ambiante.
    ATTENTION : PFA est toxique, portez une protection appropriée.
  10. Cellules réagissent, après perméabiliser avec du détergent de 0,5 % (v/v) pendant 10 min à RT et laver les cellules deux fois avec du PBS 1 x de 5 min chacun.
    1. Bloquer des cellules avec BSA 1 % (p/v) en solution de 1 PBS x pendant 1 h à RT suivie en traitant les cellules avec 50 µL d’anticorps primaires (anticorps de souris anti-α-tubuline dilué au 1 / 1 000, anticorps anti-Zwint1 de lapin dilué à 1 : 400 et la souris anti-phospho-ɣ H2AX dilué au 1 : 300) à 1 % (p/v) BSA dans du PBS 1 x pendant 1 h à 37 oC.
    2. Après avoir lavé les cellules avec solution 1 PBS x trois fois, traiter les cellules avec 50 µL d’anticorps secondaires pour chaque lamelle couvre-objet (Alexa 488 et Rhodamine Red à des dilutions de 1/250 à 1 % (p/v) : BSA en solution 1 PBS x) pendant 1 h à température ambiante.
    3. Après avoir lavé les cellules avec du PBS 1 x deux fois de 5 min chacun, traiter les cellules au DAPI (0.1µg / mL dans du PBS 1 x) pendant 5 min à température ambiante.
    4. Après avoir lavé les cellules avec du PBS 1 x deux fois de 5 min chacun, placez le couvre-objet face à des cellules pour les supports de montage approprié sur une lame microscopique clair.
  11. Image les cellules pour les protéines de l’immunomarquage avec 60 X ou objectif à immersion à huile 100 X 1,4 NA Plan-apochromatique DIC montés sur un microscope confocal inversé de haute résolution équipé d’un appareil approprié, nécessaire à la qualité des images requises.
  12. Acquisition d’images à température ambiante comme z-piles de 0,2 µm d’épaisseur à l’aide de logiciels appropriés pour le microscope.

3. le protocole pour l’imagerie de cellules vivantes de Progression mitotique (Figure 3 a)

  1. Jour 1, graines d’environ 0,5 à 1 x 105 cellules HeLa exprimant de manière stable mCherry-H2B et GFP-α-tubuline (légèrement variable basé sur le type de cellules et les protéines qu’ils expriment) en 35 mm verre fond plats avec 1,5 mL de milieu DMEM et cultivez-les dans une humidifié incubateur à 37 oC et 5 % de CO2pendant 24 h.
  2. 1 bloc de thymidinest : au jour 2, ajouter 1,5 mL thymidine contenant des médias aux cellules dans le plat (thymidine 100 mM, concentration finale de 2 mM,).
  3. Incuber pendant 18 heures.
  4. Le jour 3, aspirer le milieu contenant la thymidine et laver les cellules trois fois, deux fois avec 2 mL de PBS 1 x et une fois avec frais DMEM préchauffée.
  5. Réactif de transfection avec milieu de culture libre de sérum séparément pendant environ 10 minutes et siRNAs diluée (contrôle et Hec1) mélangez-les ensemble et incuber pendant 20 min à température ambiante. La concentration finale de siARN utilisé dans chaque transfection était de 100 nM. Ajouter le mélange réactionnel aux cellules qui ont été lavés de Thymidine.
  6. La croissance de cellules dans 1,5 mL d’un milieu DMEM préchauffée frais pendant 8 h libérer les cellules du bloc.
  7. 2nd thymidine bloc : ajouter 1,5 mL thymidine contenant des médias (concentration finale de 2 mM) pour les cellules dans le plat.
  8. Incuber pendant encore 18 h.
  9. Jour 4, aspirer le milieu et laver les cellules trois fois, deux fois avec 2 mL de PBS 1 x et une fois avec frais DMEM préchauffée. Puis la croissance de cellules en frais Leibovitz préchauffée de médium (L-15) additionné de 10 % FBS et 20 mM HEPES à pH 7,0 pendant 8 h libérer les cellules du bloc.
  10. Placer le plat dans la chambre de contrôle de température dans le microscope confocal de haute résolution, qui a déjà été réglé au moins 30 min avant de commencer l’imagerie afin de stabiliser les températures sur scène et expérimentales.
  11. Point dans le champ lumineux avec 60 x, objectif jusqu'à ce que les cellules soient visibles, puis tamiser manuellement la sur scène dans la région de choix.
  12. Mettre en place la lumière et laser puissance/exposition, paramètres d’acquisition image et durée de l’expérience en utilisant le logiciel d’acquisition image microscope de choix. Utiliser des filtres pour GFP (excitation 488 ; émission à 385 nm) et mCherry (561 nm excitation et 385 nm d’émission) pour acquérir des images.
  13. Réaliser l’expérience Time-lapse en acquérant séparément pulsée lumière transmise et fluorescence images toutes les 10 min pour une période allant jusqu'à 16 h.
  14. Acquisition d’images comme douze 1,0 µm séparées z-avions à 9 h après la sortie du bloc double thymidine à l’aide de logiciels appropriés au microscope.
  15. Analyser les images de progression mitotique des cellules individuelles de suivi et enfin assembler le film correspondant avec le logiciel de source Fidji/ImageJ.

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Representative Results

Étude de la progression mitotique et de la stabilité des microtubules dans les cellules fixées après la sortie de double bloc de thymidine
Cdt1 est impliqué dans les licences des origines de réplication de l’ADN en phase G1. Elle est dégradée au cours de la phase S mais re-s’accumule en phase G2/M. Afin d’étudier son rôle lors de la mitose, la Cdt1 endogène doit être épuisé spécifiquement à la phase de G/M en utilisant la technique de synchronisation de cellule plus appropriée, la thymidine double bloc15. Cellules ont été transfectées avec des siARN immédiatement après la sortie du bloc 2nd thymidine, lorsque les cellules sont dans le S de phase et la date à laquelle les licences des origines de réplication dans le G1, qui requiert également la fonction Cdt1, sont depuis longtemps terminée. L’appauvrissement de la couche de Cdt1 après 9 h de la transfection siCdt1 et double distribution thymidine en bloc a été validé par Western Blot (Figure 1 b). Fixation des cellules 9 h après que la sortie du bloc double thymidine montre que la plupart des cellules sont au stade de la métaphase en contrôle et Cdt1 siARN transfectés cellules. Mais la fixation des cellules 10 h après la sortie du bloc double thymidine montre que la plupart Cdt1 imprégnées sur les siARN des cellules sont toujours arrêtées à prométaphase tardivement et hématies entrer l’anaphase et normalement séparer leurs chromosomes comme prévu (Figure 1 ). Pour comprendre l’effet d’épuisement Cdt1 sur la stabilité du kinétochore-microtubule (kMT), les cellules ont été fixées à 9 h après la sortie de double bloc de thymidine suivie du traitement par le froid, qui conserve seulement kinétochore-microtubules stables (kMTs). Les kMTs de cellules Cdt1 appauvri sont relativement moins robustes après traitement par le froid par rapport à celle des cellules témoins (Figure 1). Ainsi, en utilisant cette approche, la progression des cellules mitotiques normales après la perturbation de la fonction des protéines mitotiques d’intérêt peut être étudiée efficacement, même sans l’utilisation de l’imagerie de cellules vivantes.

La figure 2 montre que la licence d’origine de réplication de l’ADN est perturbée pas lorsque les cellules sont épuisées de Cdt1 au cours de la phase G2/M en utilisant notre protocole, qui a été également observé dans les cellules de contrôle. Cellules appauvries en Cdt1 au cours de la phase G2/M n’induisent pas d’accumulation de ɣH2AX phosphorylé, un marqueur des dommages à l’ADN, au cours de la phase G2 ultérieure ; considérant que la transfection de siARN de cultures asynchrones pour épuiser Cdt1 induit l’accumulation de foyers phospho-ɣH2AX-positifs, probablement en raison de l’altération de l’ADN induite par la licence de réplication ADN incorrecte.

Étude de progression mitotique des cellules après la sortie de bloc double thymidine par imagerie de cellules vivantes
Après la rupture de l’enveloppe nucléaire (NEB), les cellules normales (en l’absence de perturbation par une protéine fonctionnelle mitotique) Entrez la mitose et subissent l’apparition de l’anaphase pour sortir de la mitose dans environ 30 à 60 min (Figure 3 b). Mais par l’ARN-knockdown de Hec1, une protéine clé kinétochore qui est nécessaire pour la formation de fixation robuste kMT, se trouve à retarder la progression mitotique normale. Dans ce scénario, la plupart des cellules dans la mitose après l’ONÉ, mais ne subissent une apparition de l’anaphase ou sortie de la mitose, même après plusieurs heures de retard lors de la mitose (Figure 3). De même, l’effet de la précipitation par l’ARN-de toute autre protéine qui localise aux kinétochores ou ayant une fonction au cours de la mitose peut ainsi observer efficacement en utilisant l’imagerie de cellules vivantes après la sortie de blocs de thymidine double. En plus d’étudier la nature de progression mitotique, delay et arrestation, les autres phénomènes mitotiques clés qui peuvent être analysés à l’aide de cette méthode parmi l’alignement du chromosome, formation du fuseau mitotique et positionnement de l’activation et silencieux de la checkpoint de broche de l’Assemblée.

Figure 1
Figure 1 : analyse de la progression mitotique et la stabilité des microtubules kinétochores dans les cellules fixes après double synchronisation de thymidine. (A) A représentation schématique de la synchronisation de la cellule, la fixation et immunofluorescence. (B) la tache occidentale pour la précipitation de Cdt1 après 9 h de la sortie du 2ème bloc de thymidine. (C) les micrographies Immunofluorescence pour montrer les cellules mitotiques fixe les 9 et 10 h après la sortie de bloc double thymidine et traitement à la commande (en haut) ou Cdt1 siARN (en bas). Coloration de α-tubuline est en rouge, l’ADN est en vert comme cellules expriment GFP-Histone H2B. Echelle = 10 µm. cellules Prometaphase et métaphase sont indiqués à l’aide de jaune et blanc respectivement les pointes de flèches. (D) HeLa cellules après traitement avec des siARN contrôle (panneau supérieur) et après épuisement de Cdt1 (panneau inférieur) pendant 9 h après la sortie de double bloc de thymidine suivi du traitement par glacee Leibovitz (L-15) support et fixation. Les cellules sont colorées immunitaire pour broche MT (vert) et un marqueur du kinétochore, Zwint1 (rouge) et DAPI pour ADN en noir et blanc. Echelle = 5 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Cdt1-épuisement au cours de la phase G2/M ne perturbe pas la réplication licence. Les cellules HeLa asynchrones traitement avec luciférase contrôle (panneau supérieur) ou siRNAs cdt1 (panneau central) ou double thymidine synchronisées HeLa cellules traitées avec les siARN cdt1 au cours du 2nd thymidine lavage suivi par fixation à 10 h après la libération (panneau inférieur) ont été colorées au DAPI (pseudo-couleur vert) et les anticorps anti-phospho-ɣH2AX (rouge). Echelle = 10 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : analyse de progression mitotique par l’imagerie de cellules vivantes synchronisé cellules. (A) A la représentation schématique de la synchronisation de la cellule et l’imagerie de cellules vivantes. Les cellules HeLa exprimant de manière stable mCherry-Histone H2B et GFP-α-tubuline ont été libérés de blocs de thymidine double pendant 8 h pour les laisser passer à la phase G2/M de l’arrestation de phase S. L’imagerie Live a été réalisée à l’aide d’un microscope confocal de haute résolution à partir de 8 h après avoir libéré les cellules du bloc de thymidine puis continuer jusqu'à 16 h, à partir de là. Montré ici sont les images fixes de la vidéo capturée toutes les 10 min pour les cellules contrôles sans perturbation de toute protéine mitotique (B) ou pour les cellules épuisées de la sous-unité de Hec1 de la Ndc80 complexe (C). Barres d’échelle = 10 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

L’avantage essentiel de la synchronisation de la thymidine double, c’est qu’il fournit un échantillon accrue des cellules mitotiques dans une fenêtre de peu de temps avec plusieurs de ces cellules entrant dans la mitose à l’unisson, également permettant ainsi des analyses de l’alignement du chromosome, bipolaire avec un rendement beaucoup plus élevé d’axe formation et la ségrégation des chromosomes.

De nombreux complexes de protéine régulatrice et voies de signalisation sont consacrés à assurer une progression normale par mitose et déréglementation de ce processus peut conduit à la tumorigenèse. Vivre l’imagerie cellulaire des cellules HeLa stablement exprimant mCherry-H2B et GFP-tubuline et libéré de la thymidine double bloc montre que la plupart des cellules de contrôle séparer leurs chromosomes en anaphase dans environ 60 min après NEB (Figure 3 b). En revanche, vivent l’imagerie cellulaire des cellules HeLa perturbées avec Hec1 fonction montre que la plupart des cellules restent dans la phase mitotique pendant une longue période avec des chromosomes mal alignées, suivies par l’apparition de l’anaphase ou apoptose (Figure 3).

Thymidine excessive inhibe la synthèse de l’ADN au cours de la phase S, bloquant ainsi les cellules G1/S phase11. Bien que la synchronisation de thymidine double bloc est la méthode la plus couramment utilisée dans l’étude du cycle cellulaire et la progression mitotique, il faut être critique de certaines limitations de cette méthode. Ce qui est important, il faut s’assurer que le produit chimique a été délavé (pendant 7-8 h) pour que l’effet est complètement réversible et cellules peuvent procéder normalement à travers le reste du cycle cellulaire. Cellules ne peuvent autrement entrer le second cycle, provoquant une mauvaise progression cependant la mitose. La proportion de cellules synchrones n’est peut-être pas suffisamment élevée avec un bloc unique de thymidine et un bloc de thymidine double peut être nécessaire d’augmenter le nombre de cellules synchrones, surtout si l'on s’intéresse à l’étude un stade particulier de la mitose. La durée du traitement thymidine doit être optimisée en raison de la sensibilité différente parmi les types de cellules selon la durée d’une génération. Par exemple, les cellules de hamster ont 16 h de temps de génération et sont traitées avec de la thymidine à 11 h pour une synchronisation optimale17. Dans cette étude, nous avons traité les cellules HeLa pendant 16-18 h avec de la thymidine. En outre, la thymidine excessive non seulement empêche la synthèse de l’ADN mais également peut tuer des fractions importantes des cellules11,12,18 et fermer attention devra être payé pour surveiller cette perte. La solution mère de thymidine utilisée dans cette étude devrait être établie dans l’eau distillée stérile et doit être bien mélangée dans les milieux de culture cellulaire pour éviter sa précipitation après que ajoutant aux médias des siARN transfectés cellules et aussi pour assurer son homogène distribution dans les cellules cultivées.

Pour l’étude de la fonction d’une protéine mitotique de la cible durant la progression mitotique, les cellules seraient idéalement traités avec siARN pour défiant les niveaux de la protéine d’intérêt pendant le bloc de thymidine 1st ou lors de la publication du 1 er bloc de thymidine, selon le temps nécessaire pour obtenir la protéine efficace knockdown19,20,21. En revanche, pour étudier le rôle des protéines multifonctionnelles comme Cdt1 durant la mitose, il est nécessaire de traiter les cellules avec siCdt1 au cours de la libération par le bloc de thymidine 2nd pour obtenir l’appauvrissement spécifique de G2/M. Cdt1 est un joueur essentiel dans l’attribution de licences de réplication de l’ADN origines15. Pour comprendre son rôle spécialisé au cours de la mitose sans interférer avec son rôle dans la délivrance de licences, Cdt1 doit être épuisé spécifiquement à la phase G2/M, qui peut être réalisé efficacement par double synchronisation de thymidine, évitant ainsi la nécessité de recourir à d’autres approches de perturbation de la mitose spécifiques qui sont difficiles à exécuter. Appauvrissement de la couche de Cdt1 dans les cultures asynchrones induire la réponse aux dommages de l’ADN en raison de l’interruption de la licence de départ de la duplication de l’ADN qui serait à leur tour ont embrouillé l’analyse d’une fonction possible pour cette protéine au cours de la mitose. Ainsi, la technique de synchronisation de thymidine double offre une approche expérimentale unique pour générer des cellules qui ont subi une phase G1 et S normale mais manquaient Cdt1 fonction au cours de la phase G2 et M. La signification particulière de notre protocole de synchronisation réside dans l’inhibition des protéines multifonctionnelles à la phase spécifique (G2/M) pour étudier leurs nouvelles fonctions au cours de la mitose. Ainsi, cette méthode sera utile non seulement pour étudier le rôle des protéines qui ont des fonctions multiples au cours des étapes du cycle de cellules différentes, mais aussi de celle de n’importe quelle protéine mitotique dans le processus d’alignement de chromosome, pièces jointes kMT et ségrégation des chromosomes.

Pour l’imagerie de cellules vivantes, après la sortie du bloc double thymidine, les cellules doivent être incubés en pré chauffé Leibovitz (L-15) additionné de 10 à 20 % FBS jusqu’au début de l’imagerie. Les cellules entrez mitose à temps variable après la sortie de bloc de thymidine selon le type de cellule. L’heure de début de la capture d’image ou de la fixation doit être optimisée selon le type de cellule. Pour l’imagerie de cellules vivantes, l’utilisation de la microscopie confocale classique peut causer photoblanchiment pendant la formation image à long terme. En revanche, la microcopy confocale haute résolution donne une image claire et haute résolution avec la moins étendue des effets de photoblanchiment.

Les étapes critiques du présent protocole sont la durée du traitement de la thymidine, lavage correcte de la thymidine, le timing de la transfection des siARN et la date de début de l’imagerie.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrente.

Acknowledgements

Nous sommes reconnaissants à m. Kozo Tanaka du Tohoku University, Japon pour le partage des cellules HeLa exprimant de manière stable mCherry-Histone H2B et GFP-α-tubuline. Ce travail a été soutenu par une subvention NCI à DV (R00CA178188) et par des fonds de démarrage de la Northwestern University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM (1x) Life Technologies 11965-092 Store at 4 °C
DPBS (1x) Life Technologies 14190-144 Store at 4 °C
Leibovitz’s (1x) L-15 medium Life Technologies 21083-027 Store at 4 °C
Serum reduced medium (Opti-MEM) Life Technologies 319-85-070 Store at 4 °C
Penicillin and streptomycin Life Technologies 15070-063 (Pen Strep) 1:1,000 dilution
Dharmafect2 GE Dharmacon T-2002-02 Store at 4 °C
Thymidine MP Biomedicals LLC 103056 Dissolved in sterile distiled water
Cdt1 siRNA Life Technologies Ref 10
Hec1 siRNA Life Technologies Ref 13
HeLa cells expressing GFP-H2B
HeLa cells expressing GFP-α-tubulin and mCherry H2B Generous gift from Dr. Kozo Tanaka of Tohoku university, Japan
Formaldehyde solution Sigma-Aldrich Corporation F8775 Toxic, needs caution
DAPI Sigma-Aldrich Corporation D9542 Toxic, needs caution
Mouse anti-α-tubulin Santa Cruz Biotechnology Sc32293 1:1,000 dilution
Rabbit ant-Zwint1 Bethyl A300-781A 1:400 dilution
Mouse anti-phospho-γH2AX (Ser139) Upstate Biotechnology 05-626, clone JBW301 1:300 dilution
Alexa 488 Jackson ImmunoResearch 1:250 dilution
Rodamine Red-X Jackson ImmunoResearch 1:250 dilution
BioLite 6 well multidish Thermo Fisher Scientific 130184
35 mm Glass bottom dish MatTek Corporation P35GCOL-1.5-14-C
Nikon Eclipse TiE inverted microscope Nikon Instruments
Spinning disc for confocal Yokagawa CSU-X1
Ultra 888 EM-CCD Camera Andor iXon Ultra EMCCD
4 wave length laser Agilent Technologies
Incubation System for Microscopes Tokai Hit TIZB
NIS-elements software Nikon Instruments

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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