성인 남성 마우스 transurethral 주입 절차

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Immunology and Infection

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Summary

Transurethral 점 도전 절차 이며 문학에서 잘 설명 되어 있다. 이 원고의 목적은 transurethral 방광 및/또는 성인 남성 생쥐에서 전립선으로 활성 물질과 액체의 intravesical 전달 카 테 터 삽입에 대 한 기술을 설명 하는 것입니다.

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Lee, S., Carrasco Jr., A., Meacham, R. B., Malykhina, A. P. Transurethral Instillation Procedure in Adult Male Mouse. J. Vis. Exp. (129), e56663, doi:10.3791/56663 (2017).

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Abstract

Transurethral 점 방광 pathologies의 동물 모델을 유도 하거나 평가 방광에 로컬 활성 성분 (예를 들어, 약물, 화학 물질, 박테리아 및 바이러스)와 다른 솔루션을 제공 하 고 사용할 수 있는 intravesical 치료의 효과입니다. 더 낮은 요로 (LUT) pathologies의 설치류 모델 가장 여성 요도 통해 물질의 intravesical 기지의 용이성을 인해 여성 쥐에 유도 됩니다. 그러나, 여성 및 남성 LUT 사이 해 부 차이 남성 마우스에서 transurethral 점 간주 되었습니다 매우 어려운 절차 그리고 그것 이전 설명 하지는. 이 원고는 남성 마우스의 요도에 후속 삽입을 위한 폴 리 에틸렌 (PE) 관을 준비 하는 방법에 대 한 자세한 설명을 제공 합니다. 또한, 우리 PE 튜브 접종의 원하는 위치에 따라 사용할 수 이상적인 유형의 토론. 또한, 우리 포인트 포인트 요도에 부상을 방지 하 고 원하는 위치에는 솔루션의 제공을 보장 하는 성공적인 transurethral 문제에 대 한 동물을 준비 하는 방법을 설명 합니다. 절차는 축소는 포 피와 귀 두 요도 도관의 개통을 표시 하 여 시작 됩니다. 다음, 귀 두는 음와 PE 튜브 안정 무딘 분쇄 비 집게에 의해 파악 된다. PE 튜브 처음 동물의 시체를 병렬 요도 도관 삽입 후 각도 요도의 자연 곡률을 따라 그것을 책략을 카 테 터를 기울이기에 의해 조정 됩니다. 이 기술은 방광 pathologies의 유도 murine 모델 하는 데 사용 될 수 있습니다 또는 남성 쥐에서 intravesical 치료의 효과 평가.

Introduction

Transurethral 문제 접근은 이전 연구에서로 사용 방법 중 하나 방광 병 리1,2,,34 의 설치류 모델을 만들 고 평가 하는 데 사용 될 수는 마우스에 로컬로 배달 된 치료의 효과입니다. 동물 모델은 인간의 병 리 정리 완전 수 없습니다, 비록 동물 연구에서 기본 메커니즘의 간 질 성 방광염/방광 통증 증후군, neurogenic 등 인간의 LUT 장애의 더 나은 이해 제공 방광염, 자가 면역 질환 방광염 및 전립선 염증5.

성인 남성 마우스에 수행 transurethral 주입 절차는 성인 여성 마우스6intravesical 점 보다 더 기술적으로 도전 합니다. 그것의 작은 직경 함께 남성 요도의 자연스럽 게 곡선된 해부학 어렵게 기술적으로 카 테 터의 transurethral 삽입을 수행 하. 따라서, 자세한 마우스 요로 감염6 및 LUT 염증7,,89,10,11 transurethral 유도 대 한 지침 , 12 , 13 , 14 , 방광에 삽입 된 카 테 터를 통해 15 만 여성 쥐에 대 한 이전 설명 했다. 이 원고는 비디오 클립, 이미지, 일러스트 등 남성 쥐에서 물질의 transurethral 문제에 대 한 기술에 대 한 단계별 설명을 제공을 목표로 한다. 변수는 성인 남성 마우스에 절차를 수행할 수 있습니다 transurethral 점 접종 이전 여성 마우스7 에서 설명 하 고 치십시오 녹음 같은 추가 기술을 병합 비슷합니다. visceromotor 응답 (VMR)16.

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Protocol

동물, 방법 및 마 취, 수술 후 치료의 기간을 포함 하 여 모든 절차는 수 의사와 함께 논의 되었고 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인 된 제휴 기관입니다. 이 원고에서 모든 절차 15 주 된 C57BL/6 남성 쥐 8 수행한 및 프로토콜 승인 콜로라도의 대학에 IACUC에 의해 동물 보호 지침을 따릅니다.

1. 튜브 준비

참고:는 inoculum을 주입 하는 바늘 폴 리 에틸렌 (PE) 관 ( 그림 1A) 또는 작은 계기에 연결 된 (< 24 G) angiocatheter 사용된 (수 있습니다 그림 1G)입니다. angiocatheter 사용 하 여 70% 에탄올 (EtOH) 살 균 이외의 아무런 준비가 필요합니다. inoculum 얻은/주입/입금 요로는 물질 이다.입니다. 이 박테리아, 바이러스, 또는 화학 물질을 포함 하는 솔루션을 수 있습니다. 이것은 연구 프로토콜 및 미리 준비. 예를 들어 연구 더 낮은 요로 대장균 감염의 효과 평가 하는 것을 목표로, 경우 연구원 준비 해야 합니다 inoculum 포함 하는 더 낮은 요로 주사/주입 될 수 있는 박테리아.

  1. PE 튜브에 부착 된 바늘의 준비 간단 하 고 다음의 구성: 대상 기관 및 동물의 나이에 따라 PE 배관의 크기를 선택 하십시오. 12 주 미만 동물에 대 한 PE 10 튜브를 사용 하 여 (외부 직경 0.024 인치 이며 안쪽 직경 0.011 인치). PE 10 튜브는 inoculum 앞쪽 전립선 (AP) 및 정액 소포 (SV)의 (1) 기본 시드 또는 inoculum 젊은 나이의 12 주 보다 동물의 방광에서의 기본 (2)는 시드 적용할 수 있도록 제안 했다. 더 큰 직경의 크기 (외경 0.038 인치 및 0.023 인치 최대 내경) PE 50 사용할 수 있습니다 오래 된 동물의 방광에 inoculum의 기본 시드 PE 튜브.
  2. PE 튜브의 약 2.5 인치 컷.
  3. 바늘을 사용할 수 선택한 PE 직경에 맞는 것을 선택 합니다. 27 G 바늘 PE 10 튜브의 루멘으로 들어갈 수 있는 그리고 22 G 바늘 맞는 PE-50 튜브의 루멘.
  4. 준비 상용 기름 돌에 바늘의 날카로운 가장자리를 문 지르고 하 여 PE 튜브에 삽입 전에 바늘
      ( 그림 1A -B), 또는 상업적으로 사용할 수 있는 둔 기를 사용 하 여 바늘.
  5. PE 튜브의 루멘으로 무딘 바늘 ( 그림 1C)을 소개. 루멘의 중심에서 바늘 남아 함으로써 루멘 또는 틀린 루멘을 손상을 하지 마십시오. ( 그림 1D -E). PE 튜브 무딘 바늘의 삽입 하는 동안 손상 되 면 손상 된 끝 자르고 프로세스를 다시 시작.
  6. 장소 바늘 연결 된 PE 튜브 70 %EtOH 절차에 대 한 그것의 사용까지 살 균. 플러시 70 %EtOH 바늘-PE 튜브를 통해 루멘을 소독 하 고 거기에서 PE 튜브에서 누설은 바늘 삽입의 과정에서 손상. 누설이 있는 경우에, 삭제 바늘-PE 튜브.
    참고: PE 튜브의 팁 catheterization 이전 될 필요가 있다. 요도에 PE 튜브를 소개와 함께 문제를 방지 하려면 ( 그림 1 층) catheterization 직전 PE 튜브의 끝을 잘라 하는 것이 좋습니다. PE 튜브의 제안된 최소 길이 1.5 인치 바늘을 둘러싼 부분을 포함 하.

2. 도관 법 절차

  1. 마 취의 유도, 이전 마우스의 방광 비.
    1. 부드러운 압력을 적용 하 고 마우스의 더 낮은 복 부를 마사지. 이러한 훈련은 일반적으로 자발적인 voiding 이어질. 방광이 어떤 instilled inoculum 희석 또는 즉시 누설에 발생할 수 있습니다.
      참고: 추가 옵션 마우스에 빈 방광을 transurethral 주입 절차의 시작 전에 적어도 1 시간 정도 물의 동물을 박탈 하는. 물 부족 동물 프로토콜의 일환으로 교육 기관에 의해 승인을 받아야 한다.
  2. Isoflurane 흐름 (2%)와 마 취 기계를 사용 하 여 마 취를 유도 하는 것.
    1. 일단 동물 마 취는 따뜻한 난방 담요에 배치 하 고 연속 마 취의 유지 보수에 대 한 nosecone 안에 그것의 코를 가진 블루 패드와 함께 커버.
    2. 확인 동물 마 취 페달 반사 (발가락 핀치)을 선택 하 여.
  3. 페달 반사 결 석 되는 포 피 제거에 의해 진행.
    1. 보도 엄지 및 집게 손가락 한 손으로의 음모 지역 ( 그림 2A 2B), 엄지와 다른 손 (검지 손가락을 사용 하 여 땀 샘 성 기를 꺼내 그림 2C)입니다. 때이 올바르게, 포 피, 귀 두 남 근, 음 경 몸 노출 남아 있습니다. ( 그림 2D 그리고 그림 2F). 이 조직에 손상에서 발생 땀 샘 성 기를 꺼내 집게를 사용 하지 마십시오.
  4. 기름칠을 하는 카 테 터와 카 테 터의 삽입 전에 메 마른 외과 윤활제와 귀 두의 끝. 이 PE 튜브의 삽입을 용이 하 게 합니다.
    참고: 개별적으로 포장 된 사각형 하나의 큰 튜브 대신 외과 윤활제의 멸 균 상태를 유지 하기 위해 각 사용에 대 한 권장.
  5. 부드럽게 둔 집게를 사용 하 여 성 기의 끝을 잡고 고 부드럽게 여 요도 도관을 귀 두를 짠 다.
  6. 주사기 바늘 연결 된 PE 튜브 또는 PE 튜브 자체와 함께 누른 요도 도관을 통해 PE 튜브 삽입.
    참고: 삼각대 그립 주사기 바늘 연결 된 PE-튜브 또는 PE 튜브, 인덱스, 엄지와 중간 손가락을 사용 하 여 자체의 안정성에 대 한 좋습니다.
    참고: 도관 법의 경로 그림 3A 그림 3B와 같이 성인 남성 마우스에 관해 선 몸과 귀 두 남 근에 의해 포위 하는 요도의 자연 곡률으로 인해 곡선 해야 합니다. Catheterized PE 튜브 도관 법 동안 저항을 만날 수 있습니다, 그리고 따라서, 대상 기관 더 PE 튜브 튜브 또는 도움말 사전 아래로 기울이기로 각도 조정 하 것이 좋습니다. 필요한 경우, PE 튜브 요도의 다양 한 예리한 회전을 통해 책략 수 있도록 약간 회전할 수 있습니다. 너무 많은 저항 때 튜브 철수 해야 하 고 최소한의 압력으로 다시 전진. PE 튜브를 당겨 완전히 밖으로 및 더 많은 윤 활을 사용 하 여 도움이 될 수 있습니다.
  7. PE 튜브 inoculum (5-200 µ L 볼륨 제안)의 원하는 볼륨을 주입 하 바늘 플런저를 밀어 원하는 기관에 도달 했습니다 일단은 inoculum의 기지를 수행.
    1. 오 줌 방광에는 inoculum의 기지 사전 PE 튜브의 약 0.75 인치까지 PE 튜브에 삽입 됩니다 ( 그림 3A).
      AP와 SV, 일반적으로, 일에 inoculum의 기지에 대 한 참고:전자 삽입 튜브 앞쪽 전립선으로 개통의 지점에 도달 하면 저항을 만난다. 위로 또는 아래로 튜브를 기울이기로 각도 조정 하 여 PE 튜브 미리 추가 PE 튜브의 약 1 인치까지 ( 그림 3B) 삽입.

3. Vivo에서 더 낮은 요로 신장 이미징

참고: vivo에서 화상 진 찰이이 원고에의 목적은: (1) inoculum;의 공간 지역화를 확인 하 고 (2) 하 inoculum의 역류 성 식도 염의 발병 률을 평가 하는 신장입니다. 이 마 취 또는 안락사 마우스 사용할 수 있습니다.

  1. 시각화 성인 남성 마우스의 더 낮은 요로, 방광, 전립선, 정액 소포 노출에 더 낮은 복 부 중간 개복 술 수행.
    1. 음모 뼈 바로 아래가 위를 사용 하 여 칼 과정에서에서 중간에 피부 incise.
    2. 피하 조직에서 피부 상승.
    3. Avascular 교육 알바는 중간에 위치를 식별 하 고 모든 장기 있는 복 막 구멍 입력이 incise.
    4. 파란 염료 또는 다른 적합 한 추적 에이전트의 시각화 하 여 공간 지역화를 확인.

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Representative Results

PE 50 튜브를 통해 파란 염료의 transurethral 점 각각 (그림 4A), 오 줌 방광 그리고 PE 10 SV와 AP (그림 4B)의 색에 튜브를 통해 염료의 주입 결과. 수행된 transurethral 주입 하면 신장에 inoculum의 인스턴트 역류 또는 하지 여부를 평가 하 고 신장 ureter 관찰 되었다 파란 염료 및 형광 염료 (그림 4A-B) 100 µ L의 주입에 의해 따라. PE 튜브와 두 개의 서로 다른 염료의 2 개의 다른 크기를 사용 하 여 주입 절차의 결과 ureters 또는 신장의 색.

Figure 1
그림 1: 22 G 바늘 튜브 50 폴 리 에틸렌 (PE)에 삽입에 대 한 준비. 날카로운 바늘 (A)는 grinded 오일 스톤 (B)에 대 한 날카로운 가장자리 (C)를 둔. 일단 바늘이 무딘, 바늘 PE 튜브 (D)의 루멘에 삽입 이며 좋은 집게 (E)와 바늘을 통해 고급. 튜브는 약 1.5 인치 (F) 다음 잘라입니다. 24 G angiocath (G)도 사용할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: 남성 마우스 포 커버는 귀 두와 포 피 귀 두 수의 약간의 견인으로 요도 도관 (A), (B), 노출 및 귀 두 (C)의 약간의 견인, 전체 포 수 (D)에, 따라서 철회 요도 도관 및 요도에 쉽게 액세스할 수 있도록. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: 그림의 더 낮은 요로 기관; 오 줌 방광, 전립선, 그리고 정액 소포 (SV) transurethral 점 각각 방광과 SV/앞쪽 전립선의 기본 시드를 위한 PE 50 튜브 (A)와 PE 10 튜브 (B)를 사용 하 여 보여주는. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4: 이미지의 위와 더 낮은 요로 기관; 신장, 방광, 전립선, 및 PE 50 튜브 (A)와 PE 10 튜브 (B)를 사용 하 여 transurethral 주입 후 정액 소포 (SV). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

이 원고는 성인 남성 마우스 transurethral 주입 하는 방법을 자세하게에서 설명합니다. 차동 주 시드 지역 다른 직경의 PE 튜브를 사용 하 여 도달할 수 있습니다. PE-50 성공적으로 PE 10 AP와 SV (그림 3A-B)를 도달 하는 더 큰 직경 동안 방광 루멘을 도달 하기 위한 것이 좋습니다. PE 튜브 및 접종에 대 한 대상 장기의 크기의 선택, 이외에 얻은 inoculum의 볼륨 등 다른 요인 또한 역할 끝 위치와 솔루션의 배포에. 우리의 실험 입증 블루의 100 µ L의 그 transurethral 점 중 PE-10를 사용 하 여 염색 또는 PE 50 신장에 염료의 인스턴트 퇴조를 트리거하지 않습니다. 그러나, 신장에 소변의 역류 주입 후 기간 동안 발생할 수 있습니다 및 이전 성인 여성 쥐8에 표시 된 것 처럼 신장 감염 될 수 있습니다. 따라서, 신장의 조직학 평가 좋습니다 transurethral instillations에서 신장의 간접 오염의 부재를 확인 하.

inoculum의 성공적인 transurethral 주입을 수행 하기 위해 몇 가지 중요 한 핵심 단계가 있습니다. 첫째, PE 튜브는 충분 한 길이의 이어야 한다-적어도 2.5 인치. 이 튜브 길이의 추가 조정에 대 한 필요한 경우, 튜브 준비 과정 또는 허용 transurethral 주입 절차에 따라. 여러 시도이 프로토콜의 9 단계 실패 체액 PE 튜브의 삽입된 끝의 장애가 발생할 수 있습니다. 이 경우 후속 시도 대 한 명확한 끝을 밖으로 PE 튜브의 끝을 잘라 되어야 합니다. PE 튜브의 끝을 잘라 일단 외과 윤 활 유 다시 적용 해야 합니다. 둘째, 적절 한 그립 주사기 또는 PE 튜브 자체의 성공률을 증가지 않습니다. 셋째, 충분 한 길이의 PE 튜브를 삽입 해야 합니다 그리고는 포 피, 귀 두 남 근, 몸과 성 기 해야 될 엄격 하 게 줄지어 핸드 그립 없이 도관 법의 과정. 그렇지 않으면, 역류는 inoculum의 주사기 플런저를 누를 때 발생할 수 있습니다.

Transurethral 주입 절차에 대 한 더 나은 결과 절차 동안 요도 및 대상 기관에 손상을 방지 하 여 함께 하는 실천의 결과 수 있습니다. 성능 결과 inoculum 기본 지역화 및 신장에 퇴조의 징후가 확인 절차로 착 색된 염료 나 형광 염료를 사용 하 여 유효성 수 있습니다.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

저자는 어떤 승인 필요가 없습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BD INTRAMEDIC Polyethylene Tubing/ PE 10 BD Medical 63019-004
BD INTRAMEDIC Polyethylene Tubing/ PE 50 BD Medical 63019-048
BD Insyte-N Autoguard/ Angiocath BD Medical 311411
Ethanol (EtOH) Fisher Scientific BP2818500
BD Needle Only 22 Gauge (G) 1 inch Becton Dickson 205155
BD Needle Only 27 Gauge (G) 1/2 inch Becton Dickson 305129
Luer stub, 22 G X 0.5 in / Blunt Needle Instech LS22
Luer stub, 27 G X 0.5 in / Blunt Needle Instech LS27
6" Long x 2" Wide x 1" Thick, Aluminum Oxide Sharpening Stone / Oil Stone Norton 40204034
Surgical Lubricant Sterile Bacteriostatic Folilpac Surgilube 281020543
Isoflurane Fluriso 13985-528-60
SomnoSuite Low-Flow Anesthesia System Kent Scientific SS-01
Dissecting Forceps, Curved vwr 82027-392
BD 1 ml Syringe BD Medical 309626
India Ink Solution., 0.2% in PBS buffer Alfa Aesar J61007
8~12 weeks old male C57B/6 Mice Jackson Lab #000664

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References

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