תהליכי ייצור ומדידות שבירה כפולה עבור תכנון יון לנתניד דיסקות מגיב Chelating פוספוליפיד להרכבות

Engineering

Your institution must subscribe to JoVE's Engineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

נהלי ייצור יון לנתניד קשוב מאוד דיסקות chelating הרכבות polymolecular מוצגים. התגובה מגנטי מוכתב על ידי גודל ההרכבה, אשר מותאם על ידי ההבלטה דרך ממברנות nanopore. של ההרכבות alignability מגנטיות, טמפרטורה-induced שינויים מבניים המפוקחים על-ידי שבירה כפולה מדידות, טכניקה ללא תשלום תהודה מגנטית גרעינית, פיזור ניוטרון זווית קטנה.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Isabettini, S., Baumgartner, M. E., Fischer, P., Windhab, E. J., Liebi, M., Kuster, S. Fabrication Procedures and Birefringence Measurements for Designing Magnetically Responsive Lanthanide Ion Chelating Phospholipid Assemblies. J. Vis. Exp. (131), e56812, doi:10.3791/56812 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Bicelles הם מכלולים polymolecular דמוי דיסק tunable נוצר מגוון רחב של תערובות השומנים. מגוון יישומים ממחקרים קרום חלבונים מבניים על ידי תהודה מגנטית גרעינית (NMR) להתפתחויות nanotechnological כולל היווצרות של ג'לים האקטיביות דיסקות להחלפה שטיחות. לטכנולוגיות אלו דורשים שליטה גבוהה של גודל ההרכבה, תגובה מגנטית התנגדות תרמית. תערובות של 1, 2-dimyristoyl -sn- glycero-3-phosphocholine (DMPC) ויון לנתניד שלה (בעוד3 +) chelating פוספוליפיד המספר המשלים, 1, 2-dimyristoyl -sn(triaminepentaacetate - glycero-3-פוספו-ethanolamine-דיאטילן DMPE-DTPA), להרכיב לתוך הרכבות קשוב מאוד מגנטית כגון DMPC/DMPE-DTPA/בתוך3 + (יחס טוחנת 4:1:1) bicelles. הקדמה של כולסטרול (חול-OH) ונגזרות סטרואידים בתוצאות bilayer בערכת אחר מכלולים מציעים מאפיינים ייחודיים הכימי פיזיקלי. עבור הרכב השומנים נתון, alignability מגנטי הוא יחסי לגודל bicelle. Complexation של Ln3 + תוצאות בתגובות מגנטי חסר תקדים מבחינת סדר הגודל והיישור כיוון. קריסת זאזא תרמו הדיסק-מבני לתוך שלפוחית על חימום ומאתגרות של הממדים של ההרכבות על ידי ההבלטה דרך ממברנה מסננים עם גדלים נקבובית מוגדרים. Bicelles מגנטית alignable נוצרות על ידי קירור עד 5 מעלות צלזיוס, והתוצאה היא מכלול המידות שמגדיר את מבשרי שלפוחית. במסמך זה, הליך ייצור זה מבואר, alignability המגנטי של ההרכבות הוא לכמת על ידי שבירה כפולה המידות תחת שדה מגנטי T 5.5. בהמשך, האות שבירה כפולה, שמקורם bilayer פוספוליפיד, מאפשר מעקב אחרי polymolecular שינויים המתרחשים bilayer. טכניקה פשוטה זו היא משלימה ולניסויים NMR, זה בדרך כלל המועסקים לאפיין bicelles.

Introduction

Bicelles הם מכלולים כמו דיסק polymolecular המתקבל תערובות השומנים רבים. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 הם נמצאים בשימוש נרחב עבור אפיון מבניים ממברנה מולקולות על ידי NMR ספקטרוסקופיה. 6 , 7 . עם זאת, מאמצי שואפים להרחיב בתחום היישומים האפשריים. 5 , 8 , 9 מערכת bicelle הכי נחקרות מורכבת תערובת של 1, 2-dimyristoyl -sn- glycero-3-phosphocholine (DMPC), המהוות את החלק מישוריים של ההרכבה, 1, 2-dihexanoyl -sn- glycero-3-phosphocholine (DHPC) פוספוליפיד המכסים את הקצה. 1 , 2 , 3 מבנה מולקולרי של פוספוליפידים להלחין את bilayer להכתיב את הארכיטקטורה של המבנה שהורכב עצמית polymolecular. 4 , 5 החלפת DHPC עם DMPE-DTPA מייצרת מערכות מאוד דיסקות עדיב וחברותי tunable bicelle. 10 , 11 DMPC/DMPE-DTPA/בתוך3 + (יחס טוחנת 4:1:1) bicelles לקשר עם רבים יותר לנתניד פאראמגנטיים יונים (בעוד3 +) על פני השטח של bilayer, וכתוצאה מכך מענה מגנטי משופרת. זאת ועוד 10 , החלפת מולקולות DHPC מסיסים במים עם DMPE-DTPA/בעוד3 + מאפשרת היווצרות של דילול עמידים bicelles. 11

Alignability מגנטי מכלולים polymolecular מישורי היא מוכתבת על ידי אנרגיה מגנטית הכולל שלהם,

Equation 1(1)

כאשר B הוא עוצמת שדה מגנטי, Equation 2 מגנטי קבוע, n המספר צבירת ו Equation 3 חיזקו הרגישות דיאמגנטית מולקולרית של ליפידים להלחין את bilayer. לכן, התגובה של DMPC/DMPE-DTPA/בעוד3 + bicelles לשדות מגנטיים המותאמות לפי גודל שלהם (n מספר צבירה) Δχ חיזקו את הרגישות דיאמגנטית מולקולרית. האחרון ברצון מושגת על ידי שינוי אופי chelated בעוד3 +. 12 , 13 , 14 , 15 החדרת כולסטרול (חול-OH) או נגזרות סטרואידים אחרים ב- bilayer מציעה את האפשרות של כוונון של n מספרים צבירה והן את Δχ המגנטית של ההרכבות. 11 , 16 , 17 , 18 , 19 עבור הרכב השומנים נתון, מכלולים גדולים יותר מכילים יותר שומנים מסוגל לתרום Eמג (גדול צבירה מספר n), וכתוצאה מכך מינים יותר alignable. לדוגמה, בגודל של bicelles DMPC/DHPC, כמקובל נשלטת באמצעות אופטימיזציה של ההלחנה השומנים יחס או סך הריכוז. 20 , 21 , 22 למרות שזה אפשרי ב- DMPC/DMPE-DTPA/בעוד3 + bicelles, וטרנספורמציה התרמו-הפיך מן bicelle אל שלפוחית על חימום מציע להוסיף אפשרויות ולביא. מכונות פירושו כגון הבלטה דרך ממברנה מסננים מאפשרת עיצוב של השלפוחיות המוגלתיות. Bicelles מגנטית alignable נוצרות מחדש לאחר הקירור עד 5 מעלות צלזיוס, מידות שלהם מוכתבים של סימנים מקדימים שלפוחית. 11 שעל זה, אנו נתמקד על הפוטנציאל של תהליכי ייצור מכני עם DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (יחס טוחנת 4:1:1) או DMPC/חול-הו/DMPE-DTPA/Tm3 + (יחס טוחנת 16:4:5:5) כמו מערכות יחוס. התהליך עובד באנלוגיה בעת עבודה עם אחרים בתוך3 + 3 +Tm. המגוון הרחב של האפשרויות המוצעות על ידי טכניקות אלה מודגש באיור 1, בהרחבה במקום אחר. 23

Figure 1
איור 1: סקירה סכמטי של ההליכים פבריקציה נוספת אפשרית. למדה מגנטית alignable Ln3 + chelating polymolecular ההרכבות מורכבים או DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (יחס טוחנת 4:1:1) או DMPC/חול-הו/DMPE-DTPA/Tm3 + (יחס טוחנת 16:4:5:5). הסרט השומנים יבש הוא להתייבש באמצעות בופר פוספט 50 מ מ על ערך ה-pH של 7.4, ריכוז השומנים הכולל 15 מ מ. הידרציה יעיל של הסרט השומנים דורש גם להקפיא שהביקושים מחזורים (FT) או חימום וקירור מחזורים (H & C). H & מחזורי C יש צורך להתחדש דגימות לאחר אחרונה ההקפאה מפשיר שלב או להתחדש דגימות המשיך קפוא על פני תקופה ממושכת של זמן אם הם רוצים לשמש ללא נוסף ההבלטה. שלבים אלה נידונות בהרחבה על-ידי Isabettini et al. 23 polymolecular alignable מקסימאלית הרכבות מושגות, אספקת ארכיטקטורות הרכבה שונים בהתבסס על הרכב השומנים. Alignability מגנטי וגודל bicelle הוא tunable על ידי ההבלטה (Ext) דרך מסננים הממברנה nanopore. גורמים Af היישור הציג חושבו דפוסי הפיזור (SAN) נויטרון 2D זווית קטנה של מדגם3 + (יחס טוחנת 16:4:5:5) DMPC/חול-הו/DMPE-DTPA/Tm extruded דרך 800, 400, 200, או 100 ננומטר נקבוביות. SANS המידות הם אמצעי משלים לכמת יישור bicelle זה לא יכוסה באופן מפורט במסמך זה. 11 , 16 Af נע מ-1 (פיזור ניוטרון מקבילים או יישור אנכי bicelles ביחס לכיוון השדה המגנטי) כ- 0 עבור פיזור isotropic.אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

המבנה של bicelles נחקרה בהרחבה על-ידי מגוון רחב של שיטות אפיון. 13 יש כבר לכמת את היישור של bicelles נחשף לשדה מגנטי באמצעות NMR ספקטרוסקופיה או זווית קטנה ניוטרון פיזור (SAN) ניסויים. 5 , 10 , 11 , 12 , 13 , 16 , 17 , 18 , 19 , 24 , 25 . אולם, המשמרת מרחיבה פסגות NMR, המתרחשת בנוכחות בעוד3 + הם מגבלות רציניות לשיטה. 15 , 26 , 27 , 28 SANS למרות ניסויים אינם סובלים מ מגבלה זו, אלטרנטיבית, טכניקות נגיש יותר רצוי על כימות שגרתית של יישור דיסקות המושרה מכלולים בפתרון. שבירה כפולה המידות הן חלופה מעשית ופשוטה יחסית. באנלוגיה כדי הניסויים NMR, מדידות שבירה כפולה לחשוף מידע חשוב על השומנים rearrangements, השומנים שלבים המתרחשים bilayer. יתר על כן, שינויי צורה גיאומטריים המתרחשים מכלול polymolecular עם שינוי תנאים סביבתיים כגון טמפרטורה מנוטרים. 11 , 12 , 13 , 16 Δn′ מגנטית המושרה שבירה כפולה שימש ללמוד סוגים שונים של מערכות פוספוליפיד. 13 , 29 , 30 מדידות שבירה כפולה המבוססת על טכניקת אפנון פאזה של השדה המגנטי היא שיטה מעשית כדי לזהות את הכיוון של bicelles. 12 , 16 , 18 , 29 , 31 , 32 האפשרות של חוקרים bicelles עם שבירה כפולה בשדות מגנטיים גבוהה עד 35 T הודגם גם על ידי מ Liebi. et al. 13

כאשר אור מקוטב מזין של חומר אנאיזוטרופי, זה להיות נשברת בגל (אקסטרא). 11 הגלים שני יש במהירויות שונות, יוזזו בשלב על ידי אלפא פיגור. מידת פיגור אלפא נמדדים וישנה להמיר אות שבירה כפולה Equation 5 לכמת את מידת חיזקו באמצעות חומרים

Equation 6(2)

איפה λ הוא אורך הגל של הלייזר ו- d הוא העובי של המדגם. פוספוליפידים הם אניסוטרופי אופטים, ציר אופטי שלהם עולה בקנה אחד עם צירים מולקולריות ארוכות שלהם, במקביל הזנב של פחמימנים. 11 , 12 . אין פיגור נמדד אם פוספוליפידים הם חוקיים באופן אקראי בפתרון. פיגור נמדד כאשר פוספוליפידים המיושרים במקביל אחד לשני. שבירה כפולה דיסקות המושרה Equation 5 יכול לקבל סימן חיובי או שלילי בהתאם הכיוון של המולקולות בתוך השדה המגנטי; ראה איור 2. פוספוליפידים המיושרים במקביל ציר ה-x תגרום שלילי Equation 5 , ואילו התוצאה האלה מסודרים לאורך ציר z חיובי Equation 5 . אין שבירה כפולה הוא ציין מתי לציר האופטי עולה בקנה אחד עם הכיוון של הפצת אור כפי פוספוליפיד יישור במקביל ציר ה-y.

Figure 2
איור 2: יישור של פוספוליפידים, המתאימים סימן שבירה כפולה דיסקות המושרה Equation 12 . סימן נמדד Equation 12 תלוי בכיוון פוספוליפיד בשדה מגנטי. קווים מקווקווים מציינים את הציר האופטי של המולקולה. האור הוא מקוטב-45° והפצת בכיוון y. השדה המגנטי B נמצאת בכיוון z. איור זה השתנה מ מ Liebi. 11 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

במקרה ראש צמיגי איזוטרופיות של bicelles, כיוון המושרה על ידי הסידור של פוספוליפידים ב- bilayer תהיה אבודה, מכוונת את אלפא פיגור. Bicelles עליך ליישר גם על מנת להתמצא פוספוליפידים שטיחות פעיל ב- bilayers שלהם, גורם של אלפא פיגור של אור מקוטב. כתוצאה מכך, שבירה כפולה הוא כלי רגיש לכמת את alignability מגנטי מכלולים polymolecular. Bicelles יישור מאונך השדה המגנטי תניב דבר חיובי Equation 5 , בעוד אלה המיושרים במקביל תניב תוצאה שלילית Equation 5 . השלט תלויה היישור של ההתקנה, ייתכן ניתן לבדוק באמצעות דגימת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ייצור נוהל DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (יחס טוחנת 4:1:1) וההרכבות DMPC/חול-הו/DMPE-DTPA/Tm3 + (יחס טוחנת 16:4:5:5) polymolecular

  1. הכנות ראשוניות
    1. רחיצת כל כלי הזכוכית על ידי שטיפה פעם עם אתנול התייצב כלורופורם (> 99% כלורופורם) ויבש עם אוויר דחוס.
    2. לייצר 2 נפרדים 10 מ"ג/מ"ל מלאי פתרונות של DMPC ו DMPE-DTPA ב כלורופורם מיוצב אתנול (> 99% כלורופורם), 10 מ מ מניות פתרון של חול-OH ב כלורופורם מיוצב אתנול (> 99% כלורופורם) ו- 10 מ מ פתרון מניות של TmCl3 . מתנול.
    3. להכנת בופר פוספט 50 מ מ על ערך ה-pH של 7.4 על ידי ערבוב 0.121 גר' נתרן dihydrogen פוספט וגופרית והרכבו ו- g 0.599 di נטול מים-נתרן מימן פוספט ב- 100 מ של הנדסה גנטית H2O.
  2. הכנת הסרט השומנים יבש
    1. שוקלים את הנדרש כמויות של חומרים פעילי שטח (DMPC, DMPE-DTPA וכאופציה חול-OH) בעוד3 + מלאי פתרונות נפרדים 3 מ"ל snap-כוסות זכוכית עם מזרק זכוכית 2.5 מ.
      1. עבור אמצעי אחסון מדגם 3 מ"ל של DMPC/DMPE-DTPA / Tm3 + (יחס טוחנת 4:1:1, ריכוז השומנים סך של 15 מ מ), שוקל בסול 3.6435 של הפתרון מניות DMPC, 1.4731 g של הפתרון מניות DMPE-DTPA ו- g 0.7126 של הפתרון מניות של3 TmCl.
      2. עבור אמצעי אחסון מדגם 3 מ"ל של DMPC/חול-הו/DMPE-DTPA/Tm3 + (יחס טוחנת 16:4:5:5, ריכוז השומנים סך של 15 מ מ), שוקל גרם 2.9148 של הפתרון מניות DMPC, 1.4731 g של הפתרון מניות DMPE-DTPA, g 1.0749 של פתרון מניות בחול-הו, 0.7126 גר' הפתרון3 TmCl מניות.
        התראה: כלורופורם וב מתנול הינם רעילים נדיפים בטמפרטורת החדר. לעבוד תחת ברדס fume והמשך מיד עם המדידות המוני.
    2. להעביר את התוכן של הצמד-גדלים שונים 25 מ ל עגול בתחתית הבקבוק. ריקון כל snap-כוס לתוך הבקבוק העגול התחתון בערך 2.5 מ של הממס המתאימים.
    3. הסר הממס תחת ואקום המאדה סובב ב 40 º C. הגדר את הלחץ הראשוני 30 000 הרשות הפלסטינית עד רוב הממס יוסר. להפחית את הלחץ עד 100 הרשות הפלסטינית ויבש הדגימה תחת סיבוב למשך תקופה מינימלית של ה 2 לקבל סרט השומנים יבש אחיד על קירות זכוכית + בקבוקי שתייה צידניות.
    4. מקם את הסרט השומנים יבש במשך דקה אחת תחת זרם קבוע של ארגון כדי למנוע חמצון השומנים באוויר ולאחסן את הדגימה במקפיא לפני התייבשות.
  3. הידרציה של הסרט השומנים יבש
    1. להוסיף mL 3 פוספט המאגר הבקבוק העגול התחתון כדי להגיע ריכוז השומנים סך של 15 מ מ.
    2. בנשיאה מחזור (FT) מפשיר הקפאה על ידי צולל. הבקבוק תחת סיבוב של חנקן נוזלי עד זה ביסודיות קפוא (התחנות חנקן נוזלי רותחים), ואז מחממים בחזרה עד 60 ° צלזיוס על ידי הצבת המדגם עבור 5 דקות באמבט מים, מתערבל את הבקבוק ללא הרף כדי סיוע בתהליך ההיתוך. להחיל 30 s של vortexing לפני כל מחזור ההקפאה כאשר המדגם הוא נוזלי כדי לסייע את הידרציה של הסרט שומנים בדם.
      הערה: אין סרט השומנים צריך להיות גלוי על הקירות את הבקבוק לאחר השנייה להקפיא שהביקושים מחזור.
    3. חזור 1.3.2 בסך הכל חמש פעמים. לסגור את הבקבוק עם כובע כדי למנוע אידוי מיותרים של המאגר פוספט כאשר המדגם הוא שווה. אולי ניתן להשהות את הפרוטוקול כאשר המדגם הוא קפוא.
    4. המשך שני חימום וקירור (H & C) מחזורים כדי לייצב את המדגם יוצא מקפיא השלב האחרון, או לשמור קפואים עד חודשיים. מחממים את הדגימה כדי 40 או 60 ° C עבור DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (יחס טוחנת 4:1:1) או DMPC/חול-הו/DMPE-DTPA/Tm3 + (יחס טוחנת 16:4:5:5), בהתאמה, לפני קירור עד 5 ° C-1 ° C לדקה לתחזק את הדגימה 5 דקות מקסימום, מינימום טמפרטורות של המחזור.
    5. עכשיו, גם לקבוע את האות שבירה כפולה של המדגם של שדה מגנטי חיצוני (שלב 2) או נוסף הבלטת הדגימה כדי להתאים את מידות bicelle ואת alignability מגנטי (שלב 1.4).
      הערה: DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (יחס טוחנת 4:1:1) דגימות מורכבים בעיקר bicelles בקוטר hydrodynamic רשע DH של 70 nm כפי התפלגות מספר המתקבלים פיזור אור דינאמי (DLS) מדידות-5 ° C. דגימות אלה מכילים גם גדול יותר polymolecular ההרכבות בעלות רשע DH של 500 ננומטר כפי חלוקת העוצמה. הם DMPC/חול-הו/DMPE-DTPA/Tm3 + (יחס טוחנת 16:4:5:5) דוגמאות מאוד polydisperse בגודל עם הפצות בעוצמה טיפוסי הגילוי של רשע DH של 700 nm, בעוד מספר ההפצות לחשוף אוכלוסיה נשלט על ידי קטן יותר bicelles בטווח גודל של 200 ננומטר. הפצות גודל יותר מפורט ותמונות הקפאה הילוכים מיקרוסקופ אלקטרונים הדוגמאות הללו דווחו על ידי. Isabettini et al. 23
  4. ההבלטה של ההרכבות polymolecular.
    1. להרכיב את מכבש כמוצג באיור3. השתמש בכפפות עור פינצטה עם הגנה על צינורות סיליקה עבור טיפול. רטוב נייר הסינון (5) עם כמה טיפות של המאגר כדי לאפשר מיקום אופטימלי של המסנן ממברנה (6). ודא שהנייר יש אין קפלים לאחר הנחת את o-ring (7) על העליונה.
      הערה: תהליך ההבלטה נבדק על קרום מסננים (6) עם קוטר נקבובית של 100 200, 400, 800 ננומטר; ראה איור 7.
    2. הגדר את המים הרותחים עד 40 ° צלזיוס על DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (יחס טוחנת 4:1:1) דוגמאות או 60 ° C עבור DMPC/חול-הו/DMPE-DTPA/Tm3 + (יחס טוחנת 16:4:5:5) דגימות להבטיח את היווצרות שלפוחית extrudable.
    3. להתחבר. המתקן בקבוק חנקן בלחץ באמצעות צינור PVC בלחץ גבוה (> 4 MPa) מצוידות עם מתאמים serto, הבלטת חומר נוזלי דרך הקרום. MPa 1 לחץ נדרש בדרך כלל לשחול דרך ממברנה מסננים (6) עם קוטר נקבובית של 200 ננומטר ומעלה. 1.5-2.5 MPa נדרשים עבור המסננים קרום קטן (6) עם קוטר נקבובית של 100 ננומטר.
      הערה: לשנות את מסנן ממברנה אם באופן חריג בלחצים גבוהים (> 2.5 MPa) נדרשים הבלטת המדגם (זהו הסימן הראשון של סתימת).
    4. פתח את המכסה (10) והכנס את הדגימה באמצעות פיפטה מזכוכית 2 מ. לאחר מכן סגור את המכסה (10), לפתוח את השסתום לחץ (12) תוך החזקת הצינור לשקע מדגם (2). סגור את השסתום לחץ (12) לאחר סיום מחזור שחול, וונט ולהמשיך עם המחזור הבא.
      הערה: אל תשאירו את הדגימה במגע זמן רב מדי עם הספינה במקטורן חם (8) כדי למנוע אובדן לדוגמה מופרז על ידי אידוי.
30-60 s הוא מספיק זמן עבור מדגם 3 מ ל equilibrate ב. המתקן לפני פתיחת את שסתום הלחץ (12).
  • המשך 10 מחזורים ההבלטה עבור ממד נקבובית נתונה ממברנה כמוצג באיור3. רוב המערכות bicelle הם extruded 10 פעמים דרך ריריות עם קוטר נקבובית של 200 ו עוד 10 פעמים דרך ריריות עם קוטר נקבובית של 100 ננומטר, המבטיח מדגם comparability.
  • עכשיו, לקבוע את האות שבירה כפולה של המדגם של שדה מגנטי חיצוני (שלב 2).
  • Figure 3
    איור 3: מעבדה extruder המשמש ההכנות bicelle, שלפוחית. . המתקן שמתארגנת מלמטה למעלה: הר (1), (2) מדגם איסוף מרחב עם צינור עודפים פלסטיק 2.4 מ מ (קוטר פנימי) o-ring (3) ו (4) גדולים וקטנים ייצוב רשת שינוי, (5) מסנן נייר, מסננים ממברנה (6), (7) o-ring, הכלי המעטפת (8), (9. ) למעלה לכסות עם כניסת וחיבור לחץ כיסוי (10), ברגים (11) פרפר, שסתום לחץ (12). קלסתרון של המתקן שהורכב מוצג ימינה-יד-צד. הגז חנקן (N2) מסופק על-ידי כלי לחץ, הספינה המעטפת (9) מחובר באמבט מים עבור בקרת טמפרטורה. הדגימה עוברת 10 מחזורים ההבלטה עבור כל קוטר נקבובית מסנן נתונה ממברנה (נתיב מדגם מוצג בצבע כחול). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

    2. שבירה כפולה מדידות של DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (יחס טוחנת 4:1:1) ו- DMPC/חול-הו/DMPE-DTPA/Tm3 + (יחס טוחנת 16:4:5:5) polymolecular הרכבות.

    1. לבנות את הכיוונון שבירה כפולה כפי שהוצגו באיור 4 ומקשרים לספק חשמל לרכיבים אלקטרוניים בהתאמה. אין למקם את PEM המדגם, מקטב השני בנתיב לייזר בשלב זה. למנוע גילוי אור לייזר מפוזרים בחזרה על ידי כיסוי משטחים המשקף, למשל אלומיניום מראה מחזיקי, עם נייר שחור.
    2. להתאים את המראות כדי למקסם את עוצמת הלייזר-הגלאי, המיוצגת על ידי עוצמת הזרם ישיר Equation 7 המתקבל למסנן יעברו של איור 4B.
      התראה: לענוד הגנה העין המתאימה בעת כוונון המראות ולהתייעץ עם מדריך בטיחות לייזר אם מניפולציה לייזרים בפעם הראשונה.
    3. להפוך את הראשון מקטב ליניארי מצטלבים (מתוחזק מאונך קרן הלייזר האירוע) על מנת למקסם Equation 7 .

    Figure 4
    איור 4: ייצוג סכמטי של ההתקנה שבירה כפולה, חיבורים עבור אותות אופטי. A) אלקטרומגנט מוליך על ספקי שדה מגנטי T 5.5. אור לייזר דיודה בעומק 635 ננומטר הוא מקוטב על ידי שני polarizers מצטלבים. Photoelastic אפנן PEM-90 הפועלת על 50 קילו-הרץ עם משרעת0 של ראד 2.405 והניח בין שני polarizers. המדגם טמון המגנט בין PEM את מקטב השני. קיטוב ללא מראות להנחות את האור דרך האלמנטים השונים, ומתגלה לבסוף על ידי גלאי צילום. הרמוני הראשון והשני Equation 10 , Equation 11 של האות AC מנוטרים, המתיר את החישוב של האות שבירה כפולה נותנת מידע על alignability המגנטי של Ln3 + chelating הרכבות polymolecular. Cuvette מדגם מחובר אמבט מים חיצוני עבור בקרת טמפרטורה (כחול). הטמפרטורה של המדגם נעשה עם מכשיר בדיקה טמפרטורה (אדום). B) האות גלאי צילום מוזנים לתוך השני סדר Sallen-מפתח יעברו מסנן (ספק כוח V AC 24) עם תדירות ניתוק של הרץ 360 דרך כבל בסגנון צמה אספקת חשמל (3) ±12 V DC. המסנן יעברו מחלץ את הרכיב DC Equation 7 ומוסר אותו לממשק של PC-(4) דרך כבל BNC 50 Ω. האיתות הגלאי התמונה מועברת מגברים הנעילה שני (אשר לחלץ הרמוני הראשון והשני Equation 10 , Equation 11 ) דרך כבל BNC 50 Ω (1) & (2). עוצמות הרמונית מזוהים על ידי זיהוי רגיש שלב. כתוצאה מכך, משמשת האות PEM שידור הפניה עבור מגברים הנעילה (1f-פלט של PEM לתוך מגבר הנעילה הראשונה והפלט 2f לתוך השני, מחובר עם BNC 50 Ω כבלים). אותות הפלט מועברות יחידת ממשק PC באמצעות BNC 50 Ω כבלים. אנלוגי רכישת יחידות cFP-AI-110 ו- cFP-CB-1 digitalize את האות המועבר למחשב דרך כבל RS 232 עבור ניטור. החללית טמפרטורה מסוג K קשורה גם יחידת ממשק PC שבו אנלוגי רכישת יחידות cFP-CB-3 ו- cFP-TC-120 digitalize את האות לפני העברת אותו למחשב דרך כבל RS 232 עבור ניטור. ג) תמונה של ההתקנה סכמטית הציג ברכיבי מפתח ב' מזוהים עם המקביל מספרים מ 1 עד 4. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

    1. מניחים את השני מקטב ליניארי מצטלבים בניצב קרן הלייזר התקרית, כפי שמוצג באיור 4A. למזער Equation 7 על-ידי הגדרת את מקטב השני בזווית של 90 מעלות ביחס הראשון.
    2. המקום אפנן photoelastic (PEM) על 0° בין השני חצה polarizers ליניארית בניצב את קרן הלייזר התקרית כפי שמוצג באיור 4A. התאם את PEM לתדר של 50 קילו-הרץ ו משרעת A0 כדי ראד 2.405 כפי שמוצג באיור 5A. זה הופך את הרכיב DC עצמאית של שבירה כפולה ומגביר Equation 7 .
      הערה: לציר האופטי PEM עשוי להיות מכוון בכמה מעלות כדי לשמור על קבוע Equation 7 באוויר לפני מדידה דוגמה.
    3. המתן 1 h לאחר הפעלת הלייזר וציוד אלקטרוני כדי לייצב את האות.
    . האות יציב כאשר auto-בהדרגה של מגברים הנעילה נשאר קבוע.
  • הכנס את הדגימה cuvette קוורץ מבוקרת טמפרטורה עם נתיב-אורך של 10 מ מ וחבר אותו אמבט מים חיצוני שמוגדר בתחילה ב- 5 ° C.
  • מקום צמד תרמי עבה מסוג K 0.5 מ מ (טמפרטורה העצמית) ישירות הדגימה כדי לפקח על הטמפרטורה של המדגם. ודא כי המכשיר אינו מפריע אור לייזר על ידי הנחת נייר לבן בנתיב לייזר (לאחר cuvette), מחפש צללים הנגרמת על ידי המכשיר.
    הערה: ישנו הבדל 2-3 מעלות צלזיוס בין הקלטה טמפרטורה לאמבט המים והטמפרטורה של המדגם.
  • מקם את cuvette נשא של המגנט, כפי שמוצג באיור 4A. אור הלייזר מפיצה אופקית דרך הדגימה מוסח על ידי מראות ללא מקטב, זוהה על ידי גלאי צילום.
    הערה: הלייזר מכוונת למטה, דרך הדגימה, וכן לגבות אותו נתיב לקחת בחשבון תופעות פאראדיי (כלומר את הסיבוב של המטוס קיטוב האור נגרם על-ידי השדה המגנטי כאשר יורדים מבוטלת כאשר היתה בדרכה חזרה בכיוון ההפוך).
  • להחיל על זרימת אוויר קבועה של אוויר דחוס-בטמפרטורת החדר ל- 10000 הרשות הפלסטינית על cuvette כדי למנוע עיבוי מים על קירות התא, אשר להפחית את עוצמת האות ולהגדיל את הרעש. זה חשוב במיוחד כאשר מודדים ב- 5 ° C.
  • לזהות את הרמוני הראשון והשני Equation 10 , Equation 11 של האות AC עם שני הנעילה מגברים. אוטומטית שלב מגברים את הנעילה על ידי לחיצה על הכפתור (2) המוצגת באיור 5B ולהתאים את הרגישות כפי שמוצג באיור 5B (1). ודא כי יש לא יותר מ-4 ברים אדומה על מגברים כפי שמוצג באיור 5B (3) כדי למנוע עומס יתר של האות. הערה למטה הרגישות מועסקים עבור שני מגברים הנעילה בתוכנית Tesla_Magnet_Const_V092 , כפי שמוצג באיור 5C (8). התוכנית מסופק מידע משלים.
  • כבש השדה המגנטי עד 5.5 T הרציונאלית הנוכחי למגנט דרך התוכנית Tesla_Magnet_Const_V092 , כפי שמוצג באיור 5C (5).
  • להשיג את שבירה כפולה Equation 5 באמצעות משוואה 2, שבו מחושבת על פיגור
    Equation 13(3)
    איפה Equation 14 , Equation 15 הם פונקציות בסל מהסוג הראשון, עם Equation 16 , Equation 17 . 11 , 13 , 18 , 33 , 34 להתוות את פיגור בתוכנית Tesla_Magnet_Const_V092, כפי שמוצג באיור 5C (4).
    הערה: האטה שמספקת התוכנית צריך לשמש כדי לחשב את האות שבירה כפולה אם מגברים הנעילה שני פועלים לא-הרגישות אותו (ראה שלב 2.12). עוצמות הרמונית שנרשמו Equation 10 , Equation 11 צריך להכפיל את הרגישות של מגברים הנעילה כדי לקבל את המידות המתאימות. יתר על כן, חייב להיות מנורמל האות שבירה כפולה שנמדד תחת שדה מגנט על-ידי חיסור האות שבירה כפולה רשע שהושג ב ט 0
  • מפקחים אות של המדגם שבירה כפולה-קבועה או משתנה הטמפרטורה (1 ° C/דקה) על ידי ויסות הטמפרטורה של האמבטיה מים מחובר את cuvette המוצג באיור 4.
  • רישום המידע מהניסוי על ידי מילוי בתיאור ניסיוני ב- 5C איור (8), מתן שם קובץ (9) ולחיצה על לחצן "התחל log" (10).
  • Figure 5
    איור 5: איורים של הגדרות מועסקים, צילומי מסך תוכנית. A) הגדרות PEM: פיגור 2.405 ראד, גל 635 nm, תדירות 50 הרץ. לבן עיגולים לציין באילו הגדרות להפעלה (USR = המשתמש הגדיר פיגור, LOC = במצב מקומי של המבצע). B) הנעילה מגבר הגדרות. הרגישות (1) חייב להיות שנבחרו לפני כל מדידה כנדרש בשלב 2.11. שם לא צריך להיות יותר מ-4 ברים אדומה על התצוגה (3) כדי למנוע עומס אות. עומס יתר מתרחש כאשר האדומים הובילו ב (1) מדליק, ביצוע מדידה בלתי אפשרי. לחץ על לחצן שלב אוטומטי (2) לפני כל מדידה. C) צילומי מסך של התוכנית Tesla_Magnet_Const_V092 סיפק מידע משלים. התוכנית מאפשרת שליטה על השדה המגנטי ורישום של כל האות פלטי כפונקציה של הזמן. עוצמת השדה המגנטי והטמפרטורה מדגם הותוו בסעיף (1). הרמוני הראשון והשני Equation 10 , Equation 11 של האות AC נמדדת מגברים הנעילה שני מותוות בתרשימי (2). עוצמת הזרם ישיר Equation 7 ההתוויה של (3). פיגור החישוב כפי שמתואר בשלב 2.13, ההתוויה של (4). עוצמת השדה המגנטי שוכן (5). מדידה ישירה של הטמפרטורה שהוקלט על ידי צמד תרמי סוג K מוצג (6) ואת אותות הפלט (Equation 23 , Equation 22 ) ב (7). מידע נוסף לדוגמה ייתכן שיוכנס ב (8) כגון רגישות מועסקים מגברים, דוגמת שם, וכו '. הנתונים עשויים להיות מחובר וייצא אל קובץ. txt הניתנים (9). התחל והפסק את רכישת נתונים באמצעות לחצן "התחל log" (10). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    האות שבירה כפולה של הלא-extruded DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (יחס טוחנת 4:1:1) מדגם היה להשגחה תחת שדה מגנטי T 5.5 במהלך חימום וקירור מחזור מ 5 עד 40 מעלות צלסיוס, חזרה בקצב של 1 ° C/min (איור 6). התוצאות שבירה כפולה אישר היישורים מגנטי גבוה ב 5 ° C עם ערך של 1.5 x 10-5, כפליים חזקה לגבי המערכות מעוקם המדווחת. 6 , 7 , 23 מכוונת של האות שבירה כפולה מעל ה Tm של DMPC ב 24 ° C נגרמה היווצרות שלפוחית alignable. הופעת התנועה השלב המתוסבכים נוזלי מופעלות rearrangements הגדולות של ההרכבות polymolecular. Rearrangements אלה הם תרמו-הפיך. מינים alignable היו מחדש לאחר הקירור מתחת Tm , האות שבירה כפולה בעקבות מגמה זהה גם כמו על חימום. הפסגות נפרדים המתרחשים סביב Tm לסמן התחליף של ההרכבות alignable על-ידי שלפוחית alignable. 23 קינטיקה איטי של rearrangements מולקולרית החימום יישומית, קירור שיעור של 1 ° C/דקה להסביר למה הפסגות היו לא חופפים. במקום זאת, שתי הפסגות נחרדה Tm של DMPC, מציע כי ליפידים bilayer חייב להיות מידה מסוימת של סדר לטובת היווצרות של מינים alignable.

    Figure 6
    איור 6: שבירה כפולה סיגנל כפונקציה של הטמפרטורה-extruded DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (יחס טוחנת 4:1:1) דוגמה על חימום (אדום) וקירור (כחול) ב 1 ° C לדקה המדגם הוכן השלבים פרוטוקול 1 כדי 1.3.5. המדידות שבירה כפולה נערכו בעקבות פרוטוקול שלב 2. עוצמת השדה המגנטי היה לשגר אותם עד 5.5 T, המדגם היה ומתוחזק על 5 °, בהשגת אות שבירה כפולה של 1.5 x 10-5 לפני שימשיך חימום וקירור של המחזור. Flatlines אות שבירה כפולה בטמפרטורות מעל 35 ° C איפה ללא יישור נצפתה כמו המדגם היה מורכב אך ורק שלפוחית. לאחר הקירור, bicelles היו מחדש, אות סופית שבירה כפולה של 7.2 x 10-6 הושג ב 5.5 T ו- 5 ° C. עוצמת השדה המגנטי היה לשגר אותם עד 0 T, המדגם ונשתמרה-5 ° C. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

    מדגם DMPC/חול-הו/DMPE-DTPA/Tm3 + (יחס טוחנת 16:4:5:5) היה מהתייבשות בעקבות החימום, הקירור הליך בשלב 1.3.4 extruded לאחר מכן 10 פעמים ב 60 מעלות צלזיוס דרך ממברנה מסננים בגדלים שונים של נקבוביות, ראה שלב 1.4. ב 60 מעלות צלזיוס, מרכיבה התערובת השומנים לתוך שלפוחית, אשר עוצבו על ידי תהליך ההבלטה. 16 , 35 , 36 , 37 לאחר השלמת ההבלטה, bicelles היו מחדש על ידי קירור עד 5 מעלות צלזיוס, הקוטר hydrodynamic DH נמדדה על ידי DLS. Alignability המגנטי של bicelles הוערך ב 5 מעלות צלזיוס על ידי מחשוב Af עם SANS-8 T על ידי מדידת האות שבירה כפולה-5.5 T; ראה איור 7. האות שבירה כפולה היה מתקבל על ידי ramping את השדה עד 5.5 T, בחזרה לבית 0 T כפי שמוצג באיור 7 א. שבירה כפולה השיא התרחש ב- 5.5 T בו רמה גבוהה של יישור הצפוי על פי משוואה 1. קוטר hydrodynamic DH bicelles ירד ל 220, 190, 106 ו- 91 nm על ידי נחושת באקסטרוזיה רצופים דרך ריריות עם גדלים נקבובית של 800, 400, 200, 100 ננומטר בהתאמה. הירידה יישור מגנטי המתאים היה אושר על ידי האות שבירה כפולה הפחתת וצמצום המוחלט שלf , שהגיעה אפס בתוך איור 7 ב. התוצאות אישר את האפשרות של שליטה bicelle גודל ויישור מגנטי דרך תפירה של השלפוחיות המוגלתיות על ידי ההבלטה ב 60 מעלות צלזיוס, קירור עד 5 מעלות צלזיוס.

    Figure 7
    איור 7: יישור מגנטי של מדגם3 + (יחס טוחנת 16:4:5:5) DMPC/חול-הו/DMPE-DTPA/Tm extruded דרך ממברנה מסננים שונים נקבובית ממדים. A) Δn′ אות שבירה כפולה כפונקציה של עוצמת השדה המגנטי B כאשר ramping מעלה ומטה עבור המדגם extruded דרך הנקבוביות 800 nm. שבירה כפולה השיא הושג ב 5.5 T לפי משוואה 1. ערך מקסימלי שבירה כפולה זה הוא דיווח ב- B). באותה דגימת זרע היה extruded דרך הנקבוביות 400 nm. היישור מגנטי הוערך על ידי שתי מדידות שבירה כפולה (ריבועים שחורים) ב- 5.5 T (באנלוגיה כדי מה שנעשה עבור השלב ההבלטה הקודם ב- A) על ידי חישוב של גורמים יישורf (עיגולים אדומים) ב-8 T המותווים כפונקציה של hydrodynamic קוטר DH מתקבל על ידי DLS. היישור מגנטי הוערך באנלוגיה על הדגימה זהה extruded דרך הנקבוביות 200 ננומטר, בפעם האחרונה לאחר הבלטת ממד דרך הנקבוביות 100 ננומטר. כל המדידות בוצעו ב 5 ° C. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    דין וחשבון מפורט איך שבירה כפולה המידות שימשו בשילוב עם SANS ניסויים כדי להעריך את שיטות ליצירת קשוב מאוד דיסקות Ln3 + chelating פוספוליפידים הרכבות נמצא Isabettini. et al. 23 הפרוטוקולים פבריקציה נוספת המוצעת חלים גם עבור הרכבות מורכב יותר DPPC ו- DPPE-DTPA פוספוליפידים או עבור אלה המכילים נגזרות סטרואידים הנדסה כימית ב- bilayer שלהם. 11 , 12 , 17 , 18 , 19 הדרישה היחידה להיות כי המדגם מחומם לטמפרטורות גבוהות מספיק בצעדים 1.3.2, 1.3.3, 1.3.4 1.4.2. הטמפרטורות לאפשר ליפידים bilayer להיכנס לשלב המתוסבכים נוזלי, guarantying לחות אופטימלית של התחדשות הסרט או לטעום השומנים יבש. DPPC/DPPE-DTPA/Tm3 + (יחס טוחנת 4:1:1)-מכלולים, לדוגמה, עליך להיות מחומם מעל הטמפרטורה מעבר פאזה של DPPC-42 ° C, בעוד מערכת מקבילה מבוססי DMPC חייב להיות מחומם מעל 24 מעלות צלזיוס. חום גבוה מספיק נחוץ גם להבטיח את היווצרות שלפוחית extrudable המתרחשים כאשר ליפידית נמצא במצב המתוסבכים בשלב 1.4. מחזורי מפשיר להקפיא בשלב 1.3.2 להחליף באופן מלא על ידי H & C מחזורים. 23 . עם זאת, המדגם בפירוט מלא מימה הסרט ליפיד עם הליך זה, חייב להיות vortexed 20 דקות כאשר ב- 5 ° C ו 2 דקות כאשר ב 60 מעלות צלזיוס. H נוספים & C המחזורים הם להתבצע אם אלמנטים של הסרט יבש השומנים הם עדיין נצפו על קירות זכוכית + בקבוקי שתייה צידניות.

    Tm3 + chelating bicelles הוצג פרוטוקול זה ישר מאונך לכיוון השדה המגנטי. כיוון יישור זה מקורו של הרגישות מגנטי חיובי גדול של Tm3 +. 11 , 14 יונים לנתניד אחרים כגון Dy3 + וי. ב3 + ויכול להיות מיושם גם. 11 , 13 , 19 שונה מגנטי חיזקו בעוד3 + מציע אמצעי נוסף של תפירה יישור מגנטי bicelles. לדוגמה, Dy3 + משפר את הרגישות מגנטי שלילית מיסודה של פוספוליפידים bilayer, והתוצאה היא רמה גבוהה של יישור bicelles מקבילים לכיוון השדה המגנטי. 13 השינוי יישור תזוהה על-ידי שינוי סימן האות שבירה כפולה והן הגורמים יישור שחושב ועד לכרטיסי אניסוטרופי SANS דפוסים. חשוב לציין כי הרגישות מגנטי לא אך ורק מוכתב על-ידי האופי הכימי של Ln3 + אלא על ידי הצורה הגיאומטרית chelate של Ln3 +-פוספוליפיד מורכבים. 19 , 38 הרגישות מגנטי עשוי. ניתן לתכנן על ידי סינתזה שונים בתוך3 + chelating פוספוליפיד headgroups, מגדיר את התגובה מגנטי של ההרכבות וכתוצאה מכך. 38

    בכל דגימה שונה שטיחות בהתאם לאופי ליפידים קונסטיטוטיבי המועסקים. ניטור עכירות של המדגם כפונקציה של הטמפרטורה היא שיטה משלימים כדי להעריך את הטמפרטורה-induced טרנספורמציות מבנית של ההרכבות. למרות מדידות אלה נערכים בדרך כלל בהיעדר שדה מגנטי בספקטרופוטומטר, פיקוח על עוצמת זרם ישיר של הלייזר Equation 7 עם ההגדרה המוצעת במסמך זה מציע מידע זהה בנוכחות מגנטי שדה. 11 , DMPC/DMPE-DTPA/Tm 16 3 + (יחס טוחנת 4:1:1) הם דוגמאות בדרך כלל פחות עכורים יותר חול-הו המכיל DMPC/חול-הו/DMPE-DTPA/Tm3 + (יחס טוחנת 16:4:5:5) מקביליהם-5 ° C. דוגמאות דמוי מים ב 5 ° C הם בדרך כלל לא alignable בשדה מגנטי. בכל חדר טמפרטורה, שתי דגימות מראה שקוף כי DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (יחס טוחנת 4:1:1) הם דוגמאות בשלב המעבר בין bicelles ושלפוחיות ויופיעו חורים גדולים קונצנטריים ב DMPC/חול-הו/DMPE-DTPA/Tm3 + bicelles (יחס טוחנת 16:4:5:5). 11 , 16 , 23 המדינה המעבר של bicelles כדי שלפוחית ב DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (יחס טוחנת 4:1:1) מלווה גם עם עלייה צמיגות של המדגם בטמפרטורת החדר. שינוי זה תלוית טמפרטורה עכירות מקשה בבחירת הרגישות נכון בשלב 2.11. אם הרגישות מכוון גבוה מדי על מדגם עכורים ב 5 ° C, מהות הדגימה על חימום שקוף יותר עלולה לגרום עומס יתר של מגברים. יתר על כן, מאוד עכורים יגדיל משמעותית את הרעש יחס אות ודוגמאות עשוי לא להיות מתאים המידות שבירה כפולה. אור הלייזר חייב להיות מסוגל לעבור את הדגימה כדי להתגלות.

    Non-extruded דגימות הן תמיד יותר עכורים ויש הנטייה להפעיל עליה פונקציית צבירה בעת אחסון לטווח קצר במקרר. ובכל זאת, הדגימות דיסקות מגיב בקלות נוצרות מחדש עם ה & מחזור ג'. גם ניתן לאחסן דגימות extruded שאינם במצב קפוא, ברצון מחדש על ידי H & C מחזורים. דוגמאות מעוקם לשמור במקרר, נמדד בדרך כלל תוך שבוע לאחר ההכנה של המדגם. אין מחקרים מדווחים על אחסון ממושך של מינים עם הבלטה של נוזלי או במצב קפוא. לכן, אין אפשרות להבטיח התפלגות גודל של ההרכבות המתקבל הבלטה על אחסון ממושך.

    באנלוגיה לכל מערכת bicelle, מהרכבות מישורי מגנטית alignable אלה קיימים רק בטווח המוגדר של הרכב השומנים וריכוז. לשנות את יחס שומנים בדם תגרום ארכיטקטורות הרכבה שונים, כולל היווצרות של הקזאין, סרטים, ושלפוחיות. 5 , 11 , 16 , 18 , 20 ריכוז מאגר פוספט ו- pH בשלב 1.1.3 ממלאת תפקיד מכריע בעיצוב של bicelles ובתגובותיהם מגנטי. המאגר מגדיר את האינטראקציות הכימי פיזיקלי המסדירים הידרופילית הסביבה שמקיפה את הרכבות polymolecular. ריכוז נמוך יותר של מאגר לגרום ארכיטקטורות הרכבה שונים, תוך ריכוז גבוה לגרום מדגם מצבור המשקעים עקב ההקרנה תשלום עודף.בתנאים חומציים עם ערכי pH בין 3 ו- 4, moieties חומצה קרבוקסילית הגשה ליגנדים ב DMPE-DTPA/בעוד3 + מורכב הן protonated. התוצאה ההרס של ההרכבות polymolecular מגיב דיסקות, שנצפה על ידי צבירת והמשקעים במדגם. מגיבה דיסקות בעוד3 + polymolecular להרכבות יש התנגדות סבירה כלפי ערכי pH בסיסי יותר. עם זאת, DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (יחס טוחנת 4:1:1) bicelles הוצגו לפרוץ הקזאין-ערכי ה-pH של 12.9. 11 הדגימות חייב לעולם לא ייחשפו מי ברז או מלחים אחרים. כל יון אחרים ההפרעה של Ln3 + chelating תהליך או לגרום מצבור של ההרכבות עקב תשלום ההקרנה. עבור SANS מדידות, המאגר מוכן כפי שמתואר בשלב 1.1.3 D2O במקום הנדסה גנטית H2O. הערה כי קריאת מד pH יהיה 7.0 (תואם לערך pD של 7.4).

    העתקות מבניים המתרחשים polymolecular הרכבות על חימום וקירור מחזור הם תרמו-הפיך. לכן, האות האחרונה שבירה כפולה ב 5 ° C צריך להיות בדיוק כמו לפני מחזור טמפרטורה. 11 , 16 אם האות שבירה כפולה גבוהה לאחר המחזור, המדגם היה לא כראוי מחדש בשלב 1.3.4. הדבר מתרחש בדרך כלל הדגימות המאוחסנים לתקופה ממושכת של זמן. אות שבירה כפולה התחתון לאחר הטמפרטורה מחזור כפי שנצפתה איור 6 מצביעה על בעיה בכיוונון ניסיוני. בדרך כלל, נתיב אור לייזר הייתה מוטרדת בחזרה פיזור או אובייקט אחר. זה בעייתי במיוחד עם החללית טמפרטורה מוכנס ישירות לתוך המדגם (ראה שלב 2.8) אשר יוצבו כדי לא להפריע הנתיב הישיר של אור הלייזר. נתיב אור מופרע גורמת ירידה Equation 7 , אות רועש, ו/או חריגה פסגות ההרים עקומות שבירה כפולה-טמפרטורה. לדוגמה, הפסגה המתרחשים חימום כ 35 ° C באיור 6 נגרם על ידי הרחבת הצינורות water-cooling לתוך הנתיב הישיר של אור הלייזר. האות שבירה כפולה לא יכול להיות מהימן מנקודה זו ואילך. למרות הצורה הכללית של העקומה קירור היה נורמלי, האות שבירה כפולה התחתון שהושג ב 5 ° C נגרמה ההפרעות.

    הערכים שבירה כפולה המתקבל בעקבות פרוטוקול זה אינם מוחלטים, משמשים להשוואה בין דגימות בינם לבין עצמם. לשם השוואה בערכים ספרות, נדרש כיול של מערכת הייחוס. לדוגמה, הסימן של האטה מדודה תלוי היישור של הסידור, עשוי להיות בדק עם טולואן, שבו יש קבוע כותנה-מוטון של 3.27 × 10−9 T−2. 39 , 40

    האות שבירה כפולה שמקורם שינויים במערך מגנטי של המדגם עשוי להיות decoupled האות נגרמת על ידי rearrangements מולקולרית ב- bilayer. יישור גורמים שחושב מתוך SANS 2D אניסוטרופי דפוסי שהושגו תחת שדה מגנטי מושפעים רק היישור בצובר של ההרכבות polymolecular. שתי השיטות הם משלימים ולאפשר סופגת התרומות לאות שבירה כפולה. יכול להיות מושלמות הגדרת שבירה כפולה המוצע על-ידי פיצול קרן לייזר, המאפשר לפיקוח הסימולטניות של דגימות עם וללא חשיפה שדה מגנטי חיצוני. יכול אפשרות לנרמל את התוצאות שבירה כפולה השיג עבור המדגם בשדה מגנטי ע י האות השיג עבור המדגם ב 0 T, החשבונאי ביעילות הרקע.

    שבירה כפולה מדידות אינם מוגבלים לכימות היישור מגנטי של bicelles. רך-חומרים רבים ליצור אות שבירה כפולה בעקבות הזמנה של המבנה הפנימי שלהם. ההגדרה המוצעת מאפשרת לפקח על שבירה כפולה של חומרים כאלה כפונקציה של הטמפרטורה עם או בלי שדה מגנטי חיצוני. Anthracene organogel סיבים, תולעת הקזאין תחת זרימה, תכונות תאית ואת הסיבים4 עמילואיד-Fe3O הם כמה דוגמאות שהתנהגותו שבירה כפולה הוערך בהצלחה עם ההגדרה המוצעת. 29 , 30 , 32 , 41

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    המחברים אין לחשוף.

    Acknowledgments

    המחברים להכיר קרן המדע הלאומית השוויצרית למימון SMhardBi (פרויקט מספר 200021_150088/1). SANS הניסויים בוצעו spallation שוויצרי ניוטרון במקור SINQ, פול Scherrer Instute, Villigen, שוויץ. המחברים מודים בחום ד ר יואכים Kohlbrecher על הדרכתו עם הניסויים SANS. הגדרת מדידה שבירה כפולה תחת שדות מגנטיים גבוה קיבל השראה מן הכיוונון הקיים במעבדה גבוהה-שדה מגנטי HFML, ניימכן, הולנד. אנו מודים ברונו Pfister על עזרתו בפיתוח האלקטרוניקה של ההתקנה שבירה כפולה, יאן Corsano, דניאל Kiechl לבניית מסגרות המתיר יישור בסדר ולא נתיישב לייזר ו ד ר קולר ברנהרד לתמיכה טכנית שוטפת.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) Avanti Polar Lipids 850345P >99%
    1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-ethanolamine-diethylene triaminepentaacetate acid hexammonium salt (DMPE-DTPA) Avanti Polar Lipids 790535P >99%
    Thulium(III) chloride Sigma-Aldrich 439649 anhydrous, powder, 99.9% trace metals basis
    Dysprosium(III) chloride Sigma-Aldrich 325546 anhydrous, powder, 99.9% trace metals basis
    Ytterbium(III) chloride Sigma-Aldrich 439614 anhydrous, powder, 99.9% trace metals basis
    Chloroform Sigma-Aldrich 319988 contains ethanol as stabilizer, ACS reagent, ≥99.8%
    Methanol Sigma-Aldrich 34860 ≥99.9%
    Cholesterol Amresco 433 Ultra pure grade
    D2O ARMAR chemicals 1410 99.8 atom % D
    Ultrapure water Millipore Synergy pak2 (SYPK0SIX2), Millipack GP (MPGP02001)
    electronic pH meter Metrohm 17440010
    Whatmann Nuclepore 25 mm 100nm membrane filter VWR 515-2028
    Whatmann Nuclepore 25 mm 200nm membrane filter VWR 515-2029
    Whatmann Nuclepore 25 mm 400nm membrane filter VWR 515-2030
    Whatmann Nuclepore 25 mm 800nm membrane filter VWR 515-2032
    Whatmann Filter paper VWR 230600
    25 ml round bottom flask VWR 201-1352 14/23 NS
    3 ml glass snap-cup VWR 548-0554 ND18, 18x30mm
    2.5 ml glass syringe Hamilton
    Sodium dihydrogen phosphate dihydrate Merk 1.06342 Salt used to make phosphate buffer
    di-Sodium hydrogen phosphate Merk 1.06586 Salt used to make phosphate buffer
    Liquid Nitrogen Carbagas -
    Pressurized Nitrogen gas Carbagas - 200 bar bottle
    Lipid Extruder 10 ml Lipex - Fully equipped with thermobarrel
    High-pressure PVC tube GR NETUM - must resist more than 4 MPa
    Serto adaptors Sertot -
    Nitrile gloves VWR -
    2 ml glass pipettes VWR 612-1702 230 mm long
    Diode Laser Newport LPM635-25C
    DSP Dual Phase Lock-in Amplifier SRS SR830
    Photodiode Detector Silonex Inc. SLSD-71N5 5mm2, Silicon, photo-conductive
    5.5 T Cryogenic Magnetic Cryogenic/Oerlikon AG - 12 bar He-cooled. RW4000/6000 compressor, RGD 5/100 TA cryo-head
    Second order low pass filter home-built - Linear power supply 24V DC, second order, Sallen Key, cut-off frequency 360 Hz, +/- 12V, max 10 mA
    Photoelastic modulator Hinds instruments PEM-90
    Glan-Thompson Calcite Polarizer Newport 10GT04 25.4mm diameter
    Quartz sample cuvette Hellma 165-10-40 temperature controlled cell, 0.8 ml, 10mm path length
    Temperature probe Thermocontrol - Type K, 0.5mm diameter, Thermocoax
    Non-polarizing mirrors Newport 50326-1002 25.4mm
    RS 232 cables National Instruments 189284-02 For Connecting to the RS-232 Port on the front of Compact FieldPoint Controllers
    BNC 50 Ω cable and connectors National Instruments 763389-01
    cFP-AI-110 National Instruments 777318-110 8-Channel Analog Voltage and Current Input Module for Compact FieldPoint
    cFP-CB-1 National Instruments 778618-01 Integrated Connector Block for Wiring to Compact FieldPoint I/O
    cFP-CB-3 National Instruments 778618-03 Integrated Isothermal Connector Block for Wiring Thermocouples to the cFP-TC-120 Module
    cFP-TC-120 National Instruments 777318-120 8-Channel Thermocouple Input Module for Compact FieldPoint
    cFP-1804 National Instruments 779490-01 Ethernet/Serial Interface for NI Compact FieldPoint
    LabView 2010 National Instruments -
    Industrial power supply Traco Power TCL 060-124 100-240V AC
    Waterbath Julabo FP40-HE refrigerated/Heating Circulator

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Sanders, C. R., Hare, B. J., Howard, K. P., Prestegard, J. H. Magnetically-oriented phospholipid micelles as a tool for the study of membrane-associated molecules. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 26, 421-444 (1994).
    2. Glover, K. J., et al. Structural evaluation of phospholipid bicelles for solution-state studies of membrane-associated biomolecules. Biophys. J. 81, (4), 2163-2171 (2001).
    3. Katsaras, J. H. T. A., Pencer, J., Nieh, M. -P. "Bicellar" lipid mixtures as used in biochemical and biophysical studies. Naturwissenschaften. 92, (8), 355-366 (2005).
    4. Sanders, C. R., Prosser, R. S. Bicelles: a model membrane system for all seasons? Structure. 6, (10), 1227-1234 (1998).
    5. Dürr, U. H. N., Soong, R., Ramamoorthy, A. When detergent meets bilayer: birth and coming of age of lipid bicelles. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 69, 1-22 (2013).
    6. Dürr, U. H. N., Gildenberg, M., Ramamoorthy, A. The magic of bicelles lights up membrane protein structure. Chem. Rev. 112, 6054-6074 (2012).
    7. Ujwal, R., Abramson, J. High-throughput crystallization of membrane proteins using the lepidic bicelle method. J. Vis. Exp. (59), (2012).
    8. Barbosa-Barros, L., et al. Bicelles: lipid nanostructured platforms with potential dermal applications. Small. 6, 807-818 (2012).
    9. Lin, L., et al. Hybrid bicelles as a pH-sensitive nanocarrier for hydrophobic drug delivery. RSC Adv. 6, 79811-79821 (2016).
    10. Beck, P., et al. Novel type of bicellar disks from a mixture of DMPC and DMPE-DTPA with complexed lanthanides. Langmuir. 26, (8), 5382-5387 (2010).
    11. Liebi, M. Tailored phospholipid bicelles to generate magnetically switchable material. ETH Zürich. Switzerland. PhD Thesis n° 21048, ISBN 978-3-905609-55-4 (2013).
    12. Liebi, M., et al. Magnetically enhanced bicelles delivering switchable anisotropy in optical gels. ACS. Appl. Mater. Interfaces. 6, (2), 1100-1105 (2014).
    13. Liebi, M., et al. Alignment of bicelles studied with high-field magnetic birefringence and small-angle neutron scattering measurements. Langmuir. 29, 3467-3473 (2013).
    14. Prosser, R. S., Hwang, J. S., Vold, R. R. Magnetically aligned phospholipid bilayers with positive ordering: a new model membrane system. Biophys J. 74, 2405-2418 (1998).
    15. Prosser, R. S., Bryant, H., Bryant, R. G., Vold, R. R. Lanthanide chelates as bilayer alignment tools in NMR studies of membrane-associated peptides. J. Magn. Reson. 141, 256-260 (1999).
    16. Liebi, M., Kohlbrecher, J., Ishikawa, T., Fischer, P., Walde, P., Windhab, E. J. Cholesterol increases the magnetic aligning of bicellar disks from an aqueous mixture of DMPC and DMPE-DTPA with complexed thulium ions. Langmuir. 28, (29), 10905-10915 (2012).
    17. Liebi, M., et al. Cholesterol-diethylenetriaminepentaacetate complexed with thulium ions integrated into bicelles to increase their magnetic alignability. J. Phys. Chem. B. 117, (47), 14743-14748 (2013).
    18. Isabettini, S., et al. Tailoring bicelle morphology and thermal stability with lanthanide-chelating cholesterol conjugates. Langmuir. 32, 9005-9014 (2016).
    19. Isabettini, S., et al. Mastering the magnetic susceptibility of magnetically responsive bicelles with 3β-Amino-5-Cholestene and complexed lanthanide ions. Phys. Chem. Chem. Phys. 19, 10820-10824 (2017).
    20. De Angelis, A. A., Opella, S. J. Bicelle samples for solid-state NMR of membrane proteins. Nat. Protoc. 2, (10), 2332-2338 (2007).
    21. Son, W. S., et al. "Q-Titration" of long-chain and short-chain lipids differentiates between structured and mobile residues of membrane proteins studied in bicelles by solution NMR spectroscopy. J. Magn. Reson. 214, 111-118 (2012).
    22. Avanti Polar Lipids Inc. Bicelle Preparation. Available from: https://avantilipids.com/tech-support/liposome-preparation/bicelle-preparation (2017).
    23. Isabettini, S., et al. Methods for Generating Highly Magnetically Responsive Lanthanide-Chelating Phospholipid Polymolecular Assemblies. Langmuir. 33, 6363-6371 (2017).
    24. Nieh, M. -P., Glinka, C. J., Krueger, S., Prosser, R. S., Katsaras, J. SANS study on the effect of lanthanide ions and charged lipids on the morphology of phospholipid mixtures. Biophysical Journal. 82, (5), 2487-2498 (2002).
    25. Watts, A., Spooner, P. J. R. Phospholipid phase transitions as revealed by NMR. Chem. Phys. Lip. 57, 195-211 (1991).
    26. Bleaney, B. Nuclear magnetic-resonance shifts in solution due to lanthanide ions. J. Magn. Reson. 8, 91-100 (1972).
    27. Prosser, R. S., Volkov, V. B., Shiyanovskaya, I. V. Solid-state NMR studies of magnetically aligned phospholipid membranes: taming lanthanides for membrane protein studies. Biochem. Cell Biol. 76, 443-451 (1998).
    28. Prosser, R. S., Volkov, V. B., Shiyanovskaya, I. V. Novel chelate-induced magnetic alignment of biological membranes. Biophys. J. 75, 2163-2169 (1998).
    29. Shklyarevskiy, I. O., et al. Magnetic alignment of self-assembled anthracene organogel fibers. Langmuir. 21, 2108-2112 (2005).
    30. Christianen, P. C. M., Shklyarevskiy, I. O., Boamfa, M. I., Maan, J. C. Alignment of molecular materials in high magnetic fields. Physica B: Condens. Matter. 346, 255-261 (2004).
    31. Maret, G., Dransfeld, K. Biomolecules and polymers in high steady magnetic fields. Top. App. Phys. 57, 143-204 (1985).
    32. Gielen, J. C., Shklyarevskiy, I. O., Schenning, A. P. H. J., Christianen, P. C. M., Maan, J. C. Using magnetic birefringence to determine the molecular arrangement of supramolecular nanostructures. Sci. Tech. Adv. Mater. 10, (1), 014601 (2009).
    33. Shklyarevskiy, I. O. Deformation and ordering of molecular assemblies in high magnetic fields. Nijmegen University. The Netherlands. PhD Thesis, ISBN 90-9018956-4 (2005).
    34. Fuller, G. G. Optical rheometry of complex fluids. Oxford University Press. NY. (1995).
    35. Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant vesicles: preparations and applications. ChemBioChem. 11, 848-865 (2010).
    36. Avanti Polar Lipids Inc. Liposome Preparation. Available from: https://avantilipids.com/tech-support/liposome-preparation (2017).
    37. Avanti Polar Lipids Inc. Preparing Large, Unilamellar Vesicles by Extrusion (LUVET). Available from: https://avantilipids.com/tech-support/liposome-preparation/luvet (2017).
    38. Isabettini, S., et al. Molecular engineering of lanthanide ion chelating phospholipids generating assemblies with a switched magnetic susceptibility. Phys. Chem. Chem. Phys. 19, 20991-21002 (2017).
    39. Battaglia, M. R., Ritchie, G. L. D. Molecular magnetic anisotropies from the Cotton-Mouton effect. J. Chem. Soc., Faraday Trans. 2. 73, (2), 209-221 (1977).
    40. Sprunt, S., Nounesis, G., Litster, J. D., Ratna, B., Shashidhar, R. High-field magnetic birefringence study of the phase behavior of concentrated solutions of phospholipid tubules. Phys. Rev. E. 48, (1), 328-339 (1993).
    41. Zhao, J., et al. Continuous paranematic ordering of rigid and semiflexible amyloid-Fe3O4 hybrid fibrils in an external magnetic field. Biomacromolecules. 17, (8), 2555-2561 (2016).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics