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Un modello del ratto di orthotopic del trapianto del fegato usando una tecnica novella dell'anastomosi magnetico per la ricostruzione della Vena Cava Suprahepatic

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Summary

La ricostruzione della vena cava suprahepatic (SHVC) rimane un passo difficile nel trapianto orthotopic del fegato del ratto. In questo articolo, vi mostriamo un protocollo passo-passo per la ricostruzione di SHVC in ratti facendo uso di una tecnica di anastomosi magnetico romanzo.

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Yang, L., Lu, J., Wang, Y., Zhang, M., Shi, Y., Wei, S., Liu, P., Wu, Z., Lv, Y., Wu, R. A Rat Model of Orthotopic Liver Transplantation Using a Novel Magnetic Anastomosis Technique for Suprahepatic Vena Cava Reconstruction. J. Vis. Exp. (133), e56933, doi:10.3791/56933 (2018).

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Abstract

Modello del ratto di trapianto orthotopic del fegato (OLT) è essenziale per la ricerca di trapianto. È un modello animale molto sofisticato e richiede una curva di apprendimento ripida. L'introduzione della tecnica polsino per anastomosi della vena portale (PV) e infrahepatic della vena cava (IHVC) ha notevolmente semplificato la procedura di trapianto in ratti. Tuttavia, a causa della breve parete anteriore della vena cava (SHVC) per i destinatari suprahepatic, la tecnica di polsino è molto difficile da utilizzare per la ricostruzione della SHVC. Maggior parte dei ricercatori in questo campo ancora utilizza la tecnica di sutura a mano per ricostruzione SHVC, che lo rende il passo di collo di bottiglia nel trapianto orthotopic del fegato del ratto. La tecnica di anastomosi magnetico (cioè, magnamosis) è un metodo di connessione due pescherecci che utilizzano la forza di attrazione tra due magneti. Il nostro studio recente ha dimostrato che la tecnica di anastomosi magnetico è superiore per la tecnica di sutura a mano per la ricostruzione di SHVC in ratti. In questo articolo, vi mostriamo un protocollo passo-passo per la ricostruzione di SHVC in ratti utilizzando la tecnica di anastomosi magnetico romanzo. In questo modello, la ricostruzione del PV e IHVC è stata effettuata con la tecnica del bracciale standard, mentre la ricostruzione del dotto biliare (BD) è stata effettuata mediante una tecnica di stent. Il re-arterialization epatico non è stato eseguito. La tecnica di anastomosi magnetico ha reso più facile ricostruzione SHVC e accorciata significativamente la fase di anphepatic. Dopo una curva di apprendimento ragionevole, anche ricercatori senza competenze avanzate di microsurgical possono produrre risultati affidabili e riproducibili utilizzando questo modello del ratto di OLT.

Introduction

Modello del ratto di trapianto orthotopic del fegato (OLT) è essenziale per trapianto ricerca1,2. Il primo ratto OLT è stato descritto da Lee et al. 1973,3. In tale modello, tutte le navi sono state ricostruite mediante la tecnica di sutura a mano. La tecnica di sutura a mano richiede competenze avanzate microsurgical, che limita notevolmente la sua utilizzazione. Da allora, varie modifiche al protocollo originale del ratto OLT sono state segnalate. Fra loro, la tecnica di polsino per anastomosi della vena portale (PV) e infrahepatic della vena cava (IHVC) segnalato da Kamada et nel 1979 è considerata un importante miglioramento per questo modello, come esso notevolmente semplificato le procedure di ricostruzione4 . Tuttavia, a causa della breve parete anteriore della vena cava (SHVC) per i destinatari suprahepatic, la tecnica di polsino è molto difficile da utilizzare per la ricostruzione della SHVC. Maggior parte dei ricercatori in questo campo ancora utilizza la tecnica di sutura a mano per ricostruzione SHVC, che lo rende il passo di collo di bottiglia nel ratto OLT5,6,7.

La tecnica di anastomosi magnetico (cioè, magnamosis) è un metodo di connessione due navi o altre strutture tubolari utilizzando la forza di attrazione tra due magneti8,9,10,11. La forza magnetica gradualmente comprime e rimodella il tessuto in un forte, sutureless anastomosi12,13. Questa anastomosi di compressione ha dimostrato di essere efficace in esseri umani14,15. Abbiamo progettato un paio di anelli magnetici in particolare per l'anastomosi di SHVC in ratti. Il nostro studio recente ha dimostrato che la tecnica di anastomosi magnetico è superiore per la tecnica di sutura a mano per la ricostruzione di SHVC nel ratto OLT16. Lo scopo di questo articolo è quello di fornire un protocollo dettagliate per ricostruzione SHVC in ratti utilizzando la tecnica di anastomosi magnetico romanzo.

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Protocol

Il protocollo è stato effettuato in conformità con le linee guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio ed è stato approvato dal Comitato per l'etica di esperimenti di animale di Xi ' an Jiaotong University, Xi ' an, provincia dello Shaanxi, Cina.

Nota: Nessuna delle procedure in questo protocollo è stata effettuata sotto un microscopio chirurgico.

1. preparazione preoperatoria

  1. Il Design e la forma degli anelli magnetici (Figura 1)
    1. Assemblare il dispositivo magnetico anastomosi abbinando un paio di anelli magnetici al neodimio-ferro-boro.
    2. Progettare gli anelli secondo i parametri del ratto SHVC con diametro di asse maggiore, asse minore diametro, spessore e peso di 8 mm, 5,5 mm, 1 mm, 0,5 g, rispettivamente.
    3. Curva gli anelli nella forma desiderata da una tecnica di taglio filo-elettrodo e quindi rivestire gli anelli ottenuti con un aerografo di ossido di titanio e sterilizzare con ossido di etilene di 500 mg/L a 55-60 ° C per 6 h.
  2. I polsini (Figura 2)
    1. Preparare il bracciale per anastomosi del IHVC e PV tagliando il tubo in polietilene. Assicurarsi che il corpo di polsino è 5 mm lungo con un'estensione di polsino di 2 mm.
      Nota: I diametri interni ed esterni del bracciale PV sono 1,8 e 2,1 mm, mentre quelle del bracciale IHVC sono 2.6 e 2.8 mm, rispettivamente.
  3. Lo Stent (Figura 2)
    1. Preparare lo stent per anastomosi della BD cannula endovenoso di 24 G di taglio con una lunghezza di 5 mm per produrre inclinazione ad entrambe le estremità.
  4. Animali da esperimento
    1. Utilizzare i ratti maschii di Sprague Dawley pesano tra 250 e 280 g come donatori e riceventi. Assicurarsi che il destinatario sia la stesso peso o leggermente più pesante (< 10 g) rispetto al donatore.
    2. Mantenere i ratti in camere climatizzate con accesso gratuito per cibo e acqua prima della chirurgia.

2. donatore operazione

  1. Iniettare buprenorfina (0,05 mg/kg) per via sottocutanea come analgesico 1 ora prima dell'operazione.
  2. Anestetizzare il ratto del donatore per inalazione isoflurane. Uso 5 vol % isoflurane ad una portata di 1,5 L/min in una scatola di Plexiglas per l'induzione dell'anestesia e 2 vol % isoflurane ad una portata 0,6-0,8 L/min su un cono di maschera per il mantenimento dell'anestesia. Confermare la profondità dell'anestesia eseguendo una punta e un pizzico di pelle.
  3. Radere l'intera pelle addominale del ratto utilizzando un rasoio elettrico per consentire un'esposizione più pulita. Disinfettare la pelle corrispondente con una soluzione di povidone-iodio.
  4. Aprire la cavità addominale attraverso un'incisione a forma di croce utilizzando forbici chirurgiche dalla radice del pene che si estende per 1 cm sopra il xiphisternum lungo linea alba, allungabile dal punto medio dell'incisione longitudinale alla linea medioascellare. Esternare il tratto gastrointestinale a sinistra e coprire con garza umida.
  5. Morsetto e tirare la xiphisternum verso la testa utilizzando una pinza emostatica. Sezionare il legamento falciform e il tessuto connettivo intorno al fegato. Isolare e legare la vena frenica inferiore sinistra con una sutura in seta 6-0.
  6. Inserire lo stent nel dotto biliare.
    1. Bloccare il BD appena sopra il punto dove la vena gastroduodenal si unisce la vena portale e tirare per mantenere un po' di tensione utilizzando una pinza a coccodrillo. Quindi eseguire un intaglio a "V" della lunghezza di 1 mm sulla parete anteriore circa 5 mm prossimale alla confluenza biliare da un micro-forbici.
    2. Inserire lo stent nel lume del dotto biliare, utilizzando una pinza a coccodrillo curvo. Assicurarsi che almeno la metà del stent si trova di fuori del dotto biliare.
    3. Fissare lo stent con una sutura in seta 6-0. Tagliare un'estremità della sutura. Tenere l'altra a tenere durante la successiva anastomosi. Transetto dotto biliare sotto lo stent e assicurarsi che la bile può venire fuori lo stent.
  7. Isolare il IHVC fino al livello della vena renale di sinistra. Libero il IHVC da anteriori e laterali dei tessuti circostanti tramite la dissezione del germoglio di cotone fino a quando il IHVC è scheletrato. Separare e legare la vena destra suprarenal e la vena renale di destra con una sutura in seta 6-0.
  8. Eparinizzare il ratto di iniettare 50 U di eparina diluito in 2 mL di soluzione salina normale attraverso la vena dorsale del pene.
  9. Irrorare il fegato.
    1. Isolare l'aorta addominale sotto la vena renale di sinistra. Inserire un catetere 22-G nell'aorta.
    2. Eseguire una toracotomia, morsetto aorta toracica utilizzando una pinza a coccodrillo.
    3. Irrorare il fegato del donatore attraverso il catetere in aorta con 20 mL di soluzione salina normale contenente 25 U di eparina (4 ° C) al ritmo di 3 mL/min con una pompa per infusione. Nel frattempo, tagliare la vena cava sotto la vena renale di destra per consentire la soluzione di perfusione di fluire fuori del fegato.
    4. Quando il fegato di donatore è diventato pallido, transetto SHVC insieme a parte del diaframma e IHVC a livello della vena renale sinistra.
  10. Sezionare il tessuto connettivo che circonda il PV da due micro forcipe. Legare e dividere le vene pilorica con una sutura in prolene 8-0. Transetto il PV a livello della vena splenica. Asportare il fegato di donatore e sciacquarlo con soluzione salina normale freddo. Posto in una soluzione salina fredda del bagno 4 ° C.

3. preparazione dell'innesto

Nota: Tutte le procedure per la preparazione dell'innesto del fegato sono eseguite in un freddo bagno salino a 4 ° C.

  1. Allegare un polsino a IHVC del donatore (Figura 3).
    1. Inserire il IHVC nel suo polsino con l'estensione del polsino che punta verso il fegato. Posizione l'estensione polsino sulla parete posteriore del IHVC. Difficoltà l'estensione del polsino e la IHVC con un Micropinze curvo se fissato utilizzando una clip di file per il contenitore di vasca.
    2. Evert l'estremità distale del IHVC sopra il corpo di polsino utilizzando due micro forcipe.
    3. Fissare il bordo con una sutura in seta 6-0. Assicurarsi che il IHVC non sia attorcigliata durante il processo.
  2. Ripetere il passaggio 3.1 sul PV per collegare un polsino a PV del donatore.
  3. Collegare un anello magnetico SHVC del donatore (Figura 4).
    1. Tirare il diaframma attraverso le quattro pinze e tagliare il SHVC.
    2. Passare il SHVC attraverso l'anello magnetico usando il forcipe micro in lega di titanio.
    3. Evert l'estremità distale della SHVC sopra l'anello.
    4. Fissare l'anello con una sutura in seta 6-0. Assicurarsi che il SHVC non sia attorcigliata durante il processo.
    5. Rimuovere il diaframma in eccesso intorno al fegato.
  4. Immergere il fegato del donatore in un bagno salino normale freddo e conservare a 4 ° C.

4. operazione destinatari

Nota: Lo schema dell'impianto dell'innesto nel ratto destinatario è illustrato nella Figura 5.

  1. Iniettare buprenorfina (0,05 mg/kg) per via sottocutanea come analgesico 1 ora prima dell'operazione. Anestetizzare il ratto del donatore per inalazione isoflurane. Uso 5 vol % isoflurane ad una portata di 1,5 L/min in una scatola di Plexiglas per l'induzione dell'anestesia e 2 vol % isoflurane ad una portata 0,6-0,8 L/min su un cono di maschera per il mantenimento dell'anestesia.
  2. Radere l'intera pelle addominale del ratto. Disinfettare la pelle corrispondente con una soluzione di povidone-iodio.
  3. Aprire la cavità addominale attraverso un'incisione mediana di 4 cm. Posizionare i divaricatori addominali. Tirare le costole più lontano possibile dalla linea mediana.
  4. Morsetto e tirare la xiphisternum verso la testa utilizzando una pinza emostatica. Sezionare i tessuti connettivi ed i legamenti intorno al fegato. Legare e dividere il legamento epato-esofageo. Legare e dividere l'arteria epatica con una sutura in prolene 8-0.
  5. Isolare il dotto biliare comune dal primo portale epatico. Collocare una sutura seta 6 / 0 intorno il dotto biliare comune appena sotto la sua divisione e legare il dotto biliare comune.
  6. Sezionare il IHVC giù per la vena renale di destra. Legare e dividere la vena surrenalica destra. Posto un cinturino in SHVC del fegato.
  7. Morsetto IHVC appena sopra la vena renale di destra con le clip del microvessel. Morsetto del PV a livello della vena pilorica con clip del microvessel.
    1. Per svuotare il sangue dal fegato, iniettare lentamente 2 mL di soluzione fisiologica normale attraverso il PV. Trascinare verso il basso il fegato tirando la cinghia precedentemente posizionata. Serrare il SHVC e parte del diaframma con una pinza di Satinsky.
    2. Transetto la IHVC vicino il parenchima e il PV ai hepatis di porta. Asportare il fegato transecting SHVC appena sopra il fegato. Rimuovere rapidamente il fegato destinatario.
  8. Allegare un anello magnetico per SHVC del destinatario.
    1. Inserire SHVC rimanenti del destinatario in un anello magnetico.
    2. Fissare l'anello magnetico su una pinza di Satinsky attrazione magnetica.
    3. Evert il SHVC sopra l'anello magnetico fino a quando la nave copre il bordo dell'anello.
  9. Collocare il donatore dell'innesto del fegato orthotopically e coprirlo con una garza umida fredda.
  10. Riempire il lume del SHVCs del donatore e del destinatario con normale soluzione salina. Rimuovere le bolle d'aria accuratamente per evitare l'embolia. Finire la ricostruzione SHVC accoppiando gli anelli magnetici incorporati in SHVC del donatore e del destinatario, insieme con la forza magnetica.
  11. Ricostruire il PV.
    1. Tratto il ramo destro e sinistro del PV del destinatario tirando una sutura in prolene 8-0 per mantenere la tensione del PV.
    2. Spostare il morsetto del PV del destinatario giù dalla vena piloro vena splenica per esporre la vena completamente.
    3. Incidere la parete anteriore del destinatario. Riempire il lume del PV con normale soluzione salina.
    4. Tenere l'estensione del polsino del PV del donatore con una pinzetta.
    5. Inserire il corpo del polsino del PV del donatore PV del destinatario mentre continuate a vampate di calore il lume di PV con normale soluzione salina.
    6. Fissarlo con un circonferenziale legatura seta 6-0. Rilasciando i morsetti sul PV e SHVC, ristabilire il flusso di sangue al fegato dell'innesto.
  12. Ripetere il passaggio 4,11 su IHVC per ricostruire il IHVC.
  13. Ricostruire il dotto biliare da una tecnica di stent.
    1. Incise una "V" sulla parete anteriore del dotto biliare comune destinatario.
    2. Inserire lo stent di donatore nel lumen del destinatario BD e fissarlo con una sutura seta della circonferenza di 6-0. Tirare le suture insieme i due dotti biliari e suturare per portare la BD vicino a vicenda.
    3. Avvolgere del tessuto omento sito anastomotico per prevenire la perdita della bile.
  14. Irrigare la cavità addominale con soluzione salina normale calda. Chiudere l'incisione dell'addome in due strati con un continuo sutura chirurgica non assorbibile 3-0.
  15. Somministrare immediatamente cefuroxime 16 mg/kg (un antibiotico) e buprenorfina (un analgesico) di 0,05 mg/kg per via sottocutanea dopo l'operazione.
  16. Posizionare il ratto in una gabbia pulita e consentire cibo e acqua ad libitum.
  17. Iniettare cefuroxima (16 mg/kg) e buprenorfina (0,05 mg/kg) nella cavità addominale ogni 12 ore per 3 giorni.

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Representative Results

Dopo circa 10 tentativi, la tecnica di anastomosi magnetico per SHVC ricostruzione è stata masterizzata correttamente da un ricercatore che non aveva alcuna preparazione preventiva microsurgical. La ricostruzione della SHVC ha preso meno di 2 min. La fase anhepatic per i ratti destinatari era circa 10 min. Nessuna trombosi, sanguinamento o angiostegnosis è stata osservata al sito anastomotic SHVC 1, 5 e 30 giorni dopo riperfusione. La cavografia della vena inferiore è stato effettuato a 2 settimane dopo il trapianto. Come illustrato nella Figura 6, gli anelli magnetici erano intatti, e il flusso di sangue era brevetto attraverso l'anastomosi SHVC. Il tasso di sopravvivenza post-trapianto era 95% al giorno 1, giorno 3, il 90% e 85% ai giorni 7 e 30 (Figura 7).

Figure 1
Figura 1 : La progettazione (A) e foto (B) dell'anello magnetico per l'anastomosi del SHVC.
SHVC: suprahepatic della vena cava.  Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 : Le manette e lo stent per anastomosi di IHVC (A), PV (B) e BD (C).
IHVC: infrahepatic della vena cava; PV: vena portale; BD: dotto biliare. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3 : Schema dell'anastomosi polsino del IHVC e PV. Inserire il IHVC o il PV di un polsino (A); Evert l'estremità distale del IHVC o PV sopra il corpo di polsino utilizzando due Micropinze (B); Fissare il bordo con una sutura in seta 6-0 (C); Inserire il corpo di polsino del IHVC del donatore o PV IHVC PV (D) o del destinatario.
IHVC: infrahepatic della vena cava; PV: vena portale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4 : Schema dell'anastomosi magnetico del SHVC. Passare il SHVC attraverso un anello magnetico usando la lega di titanio Micropinze (A); Evert l'estremità distale del SHVC sopra l'anello (B); Fissare l'anello con una sutura in seta 6-0 (C). Coppia anelli magnetici incorporati in SHVC del donatore e del destinatario, insieme con la forza magnetica (D).
SHVC: suprahepatic della vena cava. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5 : Schema dell'impianto dell'innesto nel ratto destinatario. Ricostruzione della SHVC: anastomosi magnetico; Ricostruzione del IHVC e del PV: polsino anastomosi; Ricostruzione della BD: stent anastomosi. Ricostruzione dell'HA: non eseguita.
SHVC: vena cava suprahepatic; IHVC: infrahepatic della vena cava; PV: vena portale; BD: dotto biliare; ETTARI: arteria epatica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6 : Della vena inferiore cavografia del ratto a 2 settimane dopo il trapianto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7 : Cura di rappresentante sopravvivenza dopo trapianto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Molti clinici progredisce nel trapianto del fegato possono essere attribuiti a studi sugli animali. Ratto OLT è un modello ampiamente usato e ben accettato nella ricerca di conservazione di organi, immunologia del trapianto, fisiologia e patologia. Tuttavia, è anche una procedura molto complicata e richiede abilità avanzate di microsurgical. Nonostante molti miglioramenti nella procedura di ratto OLT, l'anastomosi SHVC rimase un passo impegnativo. In questo articolo, descriviamo una tecnica novella anastomosi magnetico per SHVC ricostruzione nel ratto OLT. L'applicazione di questa tecnica è ridotto il tempo per la ricostruzione di SHVC a meno di 2 min e la fase anhepatic del ratto OLT a circa 10 min. Crediamo che questa tecnica ha grandi implicazioni nella ricerca di trapianto.

Il passaggio fondamentale in questa tecnica di anastomosi magnetico per la ricostruzione della SHVC consiste nel connettersi gli anelli magnetici SHVC del donatore e del destinatario. Ogni cautela per evitare che si attorcigli il SHVC. Inoltre, collegando i due anelli magnetici, bolle d'aria nella SHVC dovrebbe essere rimosso completamente.

Ci sono alcune limitazioni nell'uso di questa tecnica. Alcuni ceppi di ratti come ratti Fischer-344 e ratti di Buffalo hanno un SHVC estremamente breve. È Impossibile connettersi l'anello magnetico al loro SHVC. Così, non sono adatti per questa tecnica. Tuttavia, questa tecnica può essere applicata facilmente per OLT nella maggior parte dei ceppi di ratti tra cui topi Sprague Dawley, ratti Lewis e marrone Norvegia ratti. Anelli magnetici possono interferire con la scansione di risonanza magnetica (MRI). Pertanto, questa tecnica anastomosi magnetico non può essere utilizzata se un esame di MRI è necessario per l'esperimento.

In sintesi, la tecnica di anastomosi magnetico rende facile e veloce ricostruzione SHVC in ratti possibili. Dopo una curva di apprendimento ragionevole, anche ricercatori senza competenze avanzate di microsurgical possono produrre risultati affidabili e riproducibili utilizzando questo modello del ratto di OLT.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal Ministero dell'educazione innovazione Team sviluppo programma della Cina (No. IRT16R57), Fondazione nazionale di scienze naturali della Cina (No. 81470896) e una ricerca di fondi per giovani talenti reclutamento piani di Xi ' an Jiaotong University (RW).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anesthesia Machine Harvard  tabletop Animal anaesthesia
PLX7000B HF Mobile Digital C-arm System Perlong Medical PLX7000B It is mainly used for the angiography and photography of various operations
Syringe Pump Mindray BeneFusion SP5 intravenous infusion
Isoflurane RWD life Science Co. anesthetic:for the induction and maintenanceof anesthesia
iohexol Shanghai General Pharmaceutical Co  intravascular contrast media  
heparin sodium injection SPH No.1 Biochemical & Pharmaceutical Co., LTD   prevent the formation of thrombosis 
cefuroxime  Glaxo Operations UK Limited  an antibiotic
buprenorphine  TIPR Pharmaceutical Responsible Co.,Ltd an analgesic
curved microforceps Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. W40350 surgical tool
hemostatic forceps(straight) Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. J31010 surgical tool
hemostatic forceps(curved) Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. J31020 surgical tool
Satinsky clamp Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. XEC050 surgical tool
needle holder Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. J32010 surgical tool
microneedle holder Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. WBA040 surgical tool
notched forceps Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. J42010 surgical tool
tissue forceps(with hook) Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. J41010 surgical tool
tissue scissor Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Y00040 surgical tool
surgical scissors Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Y00030 surgical tool
micro scissors Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. MR-S121T surgical tool
microvessel clips Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. XEC240 surgical tool
straight microforceps(titanium alloy) Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. WCC010 surgical tool
curved microforceps  (titanium alloy) Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. WCC020 surgical tool

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References

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