Método simples e rápido para obter alta qualidade Tumor DNA de espécimes clínico-patológica usando toque citologia de impressão

Cancer Research

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Summary

Obtenção de DNA genômico de alta qualidade dos tecidos de tumor é um primeiro passo essencial para a análise de alterações genéticas, utilizando a próxima geração de sequenciamento. Neste artigo, apresentamos um método simples e rápido para enriquecer as células do tumor e obter DNA intacto do toque espécimes de citologia de impressão.

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Amemiya, K., Hirotsu, Y., Oyama, T., Omata, M. Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology. J. Vis. Exp. (133), e56943, doi:10.3791/56943 (2018).

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Abstract

É fundamental para determinar o status mutacional no câncer antes de administração e tratamento de drogas de alvo moleculares específicas para pacientes com câncer. Na prática clínica, fixada em formol parafina (FFPE) os tecidos são amplamente utilizados para testes genéticos. No entanto, FFPE DNA geralmente é danificado e fragmentada durante o processo de fixação com formol. Portanto, FFPE DNA não às vezes é adequada para testes genéticos por causa de baixa qualidade e quantidade de DNA. Aqui nós apresentamos um método de citologia de impressão de toque (TIC) para obter o DNA genômico de células de câncer, que pode ser observado sob um microscópio. Número de células de morfologia e câncer de células pode ser avaliado usando amostras TIC. Além disso, a extração de DNA genômico de amostras TIC pode ser concluída dentro de dois dias. O montante total e qualidade de TIC DNA obtido usando esse método foi maior do que a da FFPE DNA. Este método rápido e simples permite que os pesquisadores para obter DNA de qualidade para testes genéticos (por exemplo, análise de sequenciamento na próxima geração, digital PCR e PCR quantitativo em tempo real) e para encurtar o tempo de retorno para relatar os resultados.

Introduction

Próxima geração tecnologia de sequenciamento forneceu pesquisadores avanços significativos na análise da informação do genoma em variações genéticas, doença mendeliana, predisposição hereditária e câncer 1,2,3 . O Atlas de genoma do câncer (TCGA) e International Cancer Genome Consortium (ICGC) têm perseguido a identificação de alterações genéticas em diversos tipos de cancros comuns4. Centenas de genes de condutor essencial do câncer foram identificadas com êxito, e algumas destas moléculas são sendo direcionadas para o desenvolvimento de drogas a1,5,6.

Na prática clínica, espécimes FFPE são comumente usados para diagnóstico patológico e testes moleculares para várias doenças, incluindo câncer. No entanto, durante o processo de fixação com formalina, cross-linking da ADN-proteína ou DNA-DNA ocorre e fragmentação de DNA é induzida. Assim, amostras de DNA FFPE nem sempre são apropriadas para a análise genética por causa da baixa qualidade e quantidade de DNA7,8,9. Além disso, leva vários dias para preparar espécimes FFPE e habilidade técnica é necessária preparar com precisão as seções. Portanto, é desejável desenvolver um método simples e rápido para a obtenção de DNA intacto de alta qualidade.

Citologia é um método alternativo para diagnóstico patológico. Preparação das amostras citológicas é um mais simples, menos cara e mais rápida abordagem comparada com FFPE preparação10. A técnica TIC tem sido realizada em linfonodos sentinela e os tecidos marginais de doentes com cancro da mama para diagnóstico rápido no intra-operatório por alguns anos11,12. No entanto, existem alguns relatórios que têm examinado se o DNA genômico de alta qualidade pode ser extraído amostras TIC e usados para posterior análise genética. Amostras citológicas comumente estão manchadas de Papanicolaou (Pap) ou coloração Giemsa, e informamos anteriormente que a quantidade e a qualidade do DNA extraído de amostras de tique (especialmente amostras manchadas de Giemsa) são superiores para as amostras obtidas da FFPE tecidos13. Em comparação com a coloração de Papanicolau, coloração Giemsa tem uma vantagem em que exigem menos procedimentos de coloração. Na coloração de Papanicolau, depois que as amostras foram fixadas e coradas, eles devem ser montados com montagem médio (por exemplo, Malinol) para distinguir o conteúdo de amostra, tais como as células do tumor, as células normais e células inflamatórias sob um microscópio. Se o espécime de Pap é preparado sem a etapa de montagem, é quase impossível observar as células sob um microscópio, porque a amostra é secada. Em comparação, coloração Giemsa pode ser observado no estado seco, portanto, a etapa de montagem não é necessária para avaliação celular rápida. Por microdissection, coloração Giemsa é mais adequado porque requer espécimes secos.

Neste relatório, apresentamos um método simples e rápido para preparar espécimes TIC com coloração Giemsa e demonstrar que a TIC é uma fonte melhor para DNA, em comparação com espécimes FFPE.

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Protocol

1. TIC preparação para avaliação microscópica rápida usando o vidro Normal desliza

  1. Execute a preparação de TIC logo que possível após materiais clínicos tecido patológico estão disponíveis. Se espécimes TIC não podem imediatamente ser preparados, mantenha os materiais de tecido cobertos com solução salina umedecida gaze estéril e guarde na geladeira para evitar a secagem de tecidos.
  2. Prepare-se 5 mm3 tecido material tais como tumores sólidos (por exemplo, fígado, pulmão e os tecidos da mama) clinicamente obtido por endoscopia ou cirurgia.
    1. Gentilmente Limpe o tecido com gaze estéril-revestido com soro fisiológico e remover o sangue, se a superfície do tecido tem um monte de sangue.
    2. Para amostras microscópicas tais como material de biópsia, manter a amostra umedecida com gaze estéril embebida em soro fisiológico.
  3. Cortar e aparar o tecido normal com uma faca de corte e expor a superfície da lesão tumor, se as massas do tumor não são visíveis grosseiramente.
  4. Toque na superfície do tumor dos espécimes ressecadas numa lâmina de vidro normal várias vezes com as mãos enluvadas. Visualmente, confirme que a área tocada é mais de 80% da lâmina de vidro normal.
  5. Levemente pressione a lâmina de vidro normal contra um slide de membrana polietileno naftalato (caneta) e esfregue suavemente 2 - 3 vezes com as mãos enluvadas. Visualmente, confirme que as células são transferidas da lâmina de vidro normal para o slide de membrana de caneta.
  6. Secar ao ar, o vidro e slides de membrana caneta durante 5 min à temperatura ambiente.
  7. Manche a lâmina de vidro normal para exame citológico direto. Mergulhe as lâminas de vidro com fixador solução para 5 s e em seguida mancha com a solução por 15 a coloração de Giemsa s.
  8. Avaliar e transmitir conteúdo de tumor e celularidade do slide de vidro normal inteiramente com um microscópio para avaliação rápida. Avaliar as células do tumor com base em diversos critérios; alargamento nuclear, cariótipo anormal, cromatina abundante, distribuição desigual de células, a relação do componente citoplasmático/componente nuclear, tamanho da célula e polaridade celular.

2. preparação da película da corrediça de membrana a caneta para testes genéticos

  1. Se a amostra mostra celularidade tumor mais de 60% de avaliação microscópica rápida (passo 1.8), cortar o filme tocou-tumor dos slides membrana caneta para extração de DNA com uma faca e com luvas de mãos. Transferi o filme cortado para um tubo estéril microcentrifuga com um pincette e mãos enluvadas.
  2. Se a celularidade do tumor foi determinada como baixa (menos de 60% do conteúdo do tumor) por avaliação microscópica rápida (passo 1.8), uso laser microdissection de capturar e obter amostras de tumor.
    1. Execute para avaliar as células do tumor usando protocolos padrão de coloração de Giemsa.
    2. Corte o filme do slide PEM membrana por apropriado do laser microdissection de captura.
    3. Transferi o filme cortado para um tubo estéril microcentrifuga com um pincette e mãos enluvadas.
    4. Armazene o tubo microcentrifuga filme contendo a 4 ° C até a extração de DNA (o protocolo pode ser pausado aqui).

3. extração de DNA

  1. Realize a extração de DNA de amostras de tecido da TIC ou FFPE usando um kit de extração de DNA FFPE de acordo com as instruções do fabricante com pequenas modificações. Um kit equivalente está disponível para a etapa de extração de DNA FFPE.
  2. Adicione 180 µ l de tampão de lise de tecido (pH = 8,3) ao tubo contendo filme microcentrifuga com uma pipeta manual 200 µ l. Adicionar 20 µ l de proteinase K, com uma pipeta de 20 µ l manual e misturar vortexing com um misturador de vórtice na velocidade máxima (aproximadamente 2.500 rpm) para 5 s.
  3. Incube as amostras a 56 ° C durante a noite com uma incubadora de ar.
  4. Incube as amostras FFPE e TIC a 90 ° C, em um bloco de calor durante 1 h e 10 min, respectivamente. Brevemente spin para baixo o tubo microcentrifuga a 1.500 x g, durante 5 s na temperatura de quarto com uma mini centrífuga.
  5. Adicione 200 µ l de tampão de Lise para a amostra com uma pipeta de 200 µ l e misturar completamente vortexing na velocidade máxima por 5 s.
  6. Adicionar 200 µ l de etanol (96-100%) com uma pipeta de 200 µ l e homogeneiza vortexing na velocidade máxima por 5 s. brevemente spin para baixo o tubo microcentrifuga a 1.500 x g, durante 5 s na temperatura de quarto com uma mini centrífuga.
  7. Transferir com cuidado todo o lisado para a coluna de rotação com uma pipeta de 1.000 µ l e centrifugar 6.000 x g por 1 min a 25 ° C.
  8. Coloque a coluna de rotação em um tubo limpo 2 mL coleção com as mãos enluvadas e descartar o tubo de coleta contendo o escoamento em uma caixa de plástico de eliminação.
  9. Adicionar 500 µ l de tampão de lavagem para a coluna de rotação com uma pipeta de 1.000 µ l e centrifugar 6.000 x g por 1 min a 25 ° C.
  10. Coloque a coluna de rotação em um tubo limpo 2 mL coleção com as mãos enluvadas e descartar o tubo de coleta contendo o escoamento em uma caixa de plástico de eliminação.
  11. Adicionar 500 µ l de tampão de lavagem para a coluna de rotação com uma pipeta de 1.000 µ l e centrifugar 6.000 x g por 1 min a 25 ° C.
  12. Descarte o tubo de coleta contendo o escoamento em uma caixa de plástico de eliminação. Coloque a coluna de rotação em um tubo de 1,5 mL limpa microcentrifuga com as mãos enluvadas e centrifugar a 20.000 x g, durante 3 min a 25 ° C para secar a membrana.
  13. Coloque a coluna de rotação em um tubo de ligação do DNA-baixo com as mãos enluvadas.
    1. Adicione 40-50 µ l de tampão de eluição para o centro da membrana de uma pipeta de 100 µ l.
    2. Incubar a temperatura ambiente por 5 min e centrifugar 20.000 x g por 1 min a 25 ° C.
    3. Armazene as amostras a-20 º C até o próximo passo (o protocolo pode ser pausado aqui).

4. avaliação da qualidade do DNA por PCR quantitativo em tempo Real

  1. Preparar a mistura mestre em um tubo estéril microcentrifuga com uma pipeta, como segue: 10 µ l de 2 x real-time PCR Master Mix, 1 µ l de 20 x RNase P Primer-sonda Mix (amplicon tamanho: 87 bp) e 8 µ l de água estéril livre de nuclease.
  2. Preparar a mistura de mestre segunda em um tubo estéril microcentrifuga da seguinte forma: 10 µ l de 2 x real-time PCR Master Mix, 1 µ l de 20 x RNase P Primer-sonda Mix (amplicon tamanho: 268 bp) e 8 µ l de água estéril livre de nuclease.
  3. Realizar diluições em série de DNA genômico de controle humano (fornecida no kit) 4 vezes para uma curva padrão de cinco pontos e determinar o absoluto de concentrações de DNA13.
  4. Adicione 19 µ l das duas misturas mestre preparadas (preparado na etapa 4.1 e 4.2) em separado poços de uma placa de reação óptica de 96 poços, com uma pipeta de 20 µ l.
  5. Adicione 1 µ l de FFPE ou o ADN TIC para separar poços contendo a mistura de reação com uma pipeta 2 µ l. Adicione 1 µ l de água livre de nuclease num poço separado contendo a mistura de reação para o controle de nenhum modelo.
  6. Segure o lado não-adesivas de uma película adesiva óptico e retirar o protetor de apoio no centro do filme. Delicadamente, arraste o aplicador sobre o filme e selar o filme sobre a placa de 96 poços.
  7. Misture suavemente a placa de 96 poços, utilizando um misturador de placa de 96 poços para 10 s na temperatura de quarto a 2.000 rpm. Centrifugue a placa brevemente a 1.000 x g, durante 3 min à temperatura ambiente.
  8. Ligue o instrumento PCR em tempo real e inserir a placa de 96 poços. Executar as reações de PCR usando o seguinte protocolo: 95 ° C por 20 s, seguido de 45 ciclos de 95 ° C por 1 s e 60 ° C durante 20 s. uso "curva" e "modo rápido".
  9. Avaliar fragmentação de DNA com a proporção de DNA (quantificação relativa; RQ) obtidos para o amplicon longo (268 bp) para o amplicon curto (87 bp). RQ é o valor médio da média amplicon/o tempo dos amplicons curto13.

5. preparação da biblioteca de sequenciamento de próxima geração

  1. Prepare a biblioteca de sequenciamento para sequenciamento de geração seguinte de acordo com as instruções do fabricante.
  2. Prepare a mistura PCR multiplex mestre em um tubo estéril microcentrifuga por amostra do seguinte modo: 4 µ l de 5 x solução de reação de PCR Multiplex, 4 µ l de 5 x piscina de cartilha, µ l de ≤6 TIC ou DNA FFPE (1-100 ng) e adicione água nuclease-livre até 20 µ l.
    1. Adicione a mistura de mestre de PCR multiplex para um tubo PCR e misture suavemente tocando o tubo.
    2. Brevemente spin para baixo o tubo microcentrifuga a 1.500 x g, durante 5 s na temperatura de quarto com uma mini centrífuga.
  3. Executar as reações de PCR usando o seguinte protocolo: 99 ° C por 2 min, seguido por 20 ciclos de 99 ° C por 15 s e 60 ° C por 4 min e exploração passo 10 ° C. Brevemente, girar para baixo o tubo PCR com uma mini centrífuga a 1.500 x g por 5 s à temperatura ambiente.
    Nota: Determine o número de ciclos com base no número de pares da primeira demão.
  4. Abra a tampa do tubo do PCR e adicionar 2 µ l da enzima de restrição com uma pipeta 2 µ l. Feche a tampa do tubo do PCR e misture suavemente tocando o tubo do PCR. Brevemente, girar para baixo o tubo PCR com uma mini centrífuga a 1.500 x g por 5 s à temperatura ambiente.
  5. Executar as reações de PCR usando o seguinte protocolo: 50 ° C por 10 min, a 55 ° C por 10 min, 60 ° C por 20 min, e exploração passo a 10 ° C. Brevemente, girar para baixo o tubo PCR com uma mini centrífuga a 1.500 x g por 5 s à temperatura ambiente.
  6. Adicione a mistura de mestre de ligadura com adaptador para o cada bem que contém os amplicons PCR digerido com uma pipeta da seguinte forma: 4 µ l da solução de ligadura do adaptador, 0,5 µ l do código de barras, 0,5 µ l de adaptador, 2 µ l de água livre de nuclease e 2 µ l de DNA ligase. Feche a tampa do tubo do PCR e misture suavemente tocando. Brevemente, girar para baixo o tubo PCR com uma mini centrífuga a 1.500 x g por 5 s à temperatura ambiente.
  7. Executar as reações de PCR usando o seguinte protocolo: 22 ° C por 30 min, 68 ° C por 5 min, 72 ° C por 5 min, e exploração passo a 10 ° C.
  8. Purifica a biblioteca de sequenciamento com grânulos magnéticos de acordo com as instruções do fabricante.
  9. Transferi a solução de biblioteca adaptador-ligado para o tubo de baixo-ligação de DNA de 1,5 mL. Adicione 45 µ l de grânulos magnéticos dentro do tubo de baixo-ligação de DNA para a purificação dest 1. Misture suavemente tocando o tubo e incubar durante 5 min à temperatura ambiente.
  10. Coloque o tubo de ligação do DNA-baixa em um rack magnético e, em seguida, incubar por 2 min à temperatura ambiente até que a solução é clara. Cuidadosamente, desprezar o sobrenadante com uma pipeta de 200 µ l sem perturbar os grânulos magnéticos.
  11. Adicionar 150 µ l de etanol a 70% acabadas com uma pipeta de 200 µ l e, em seguida, mover o tubo ao lado do íman para lavar os grânulos. Cuidadosamente, desprezar o sobrenadante sem perturbar os grânulos magnéticos.
  12. Repita a etapa 5.11 para uma segunda lavagem.
  13. Brevemente, girar para baixo o tubo com mini centrifugar 1.500 x g por 5 s à temperatura ambiente. Coloque o tubo de baixo-ligação de DNA em um rack magnético e cuidadosamente descartar as gotas com uma pipeta de 10 µ l de etanol.
  14. Adicione 50 µ l de TE baixo dentro do tubo de baixo-ligação de DNA contendo o pellet de grânulos magnético para dispersar os grânulos. Incube durante 2 min à temperatura ambiente.
  15. Coloque o tubo de baixo-ligação de DNA em um rack magnético e incubar a temperatura ambiente por 2 min, até que a solução é clara.
  16. Transferir a 50 µ l do sobrenadante no tubo de ligação baixa novo DNA e adicione 75 µ l de grânulos magnéticos com uma pipeta de 100 µ l para a purificação de 2nd . Misture suavemente tocando o tubo e incubar durante 5 min à temperatura ambiente.
  17. Coloque o tubo de baixo-ligação de DNA em um rack magnético e, em seguida, incubar por 2 min à temperatura ambiente até que a solução é clara. Cuidadosamente, desprezar o sobrenadante com uma pipeta de 200 µ l sem perturbar os grânulos magnéticos.
  18. Adicionar 150 µ l de etanol a 70% acabadas com uma pipeta de 200 µ l e, em seguida, mover o tubo ao lado do íman para lavar os grânulos. Cuidadosamente, desprezar o sobrenadante sem perturbar os grânulos magnéticos.
  19. Repita a etapa 5,18 para uma segunda lavagem.
  20. Brevemente, girar para baixo o tubo com uma mini centrífuga a 1.500 x g por 5 s à temperatura ambiente. Coloque o tubo de baixo-ligação de DNA em um rack magnético e cuidadosamente descartar as gotas com uma pipeta de 10 µ l de etanol.
  21. Adicione 50 µ l de TE baixo dentro do tubo de baixo-ligação de DNA contendo o pellet de grânulos magnético para dispersar os grânulos. Incube durante 2 min à temperatura ambiente.
  22. Coloque o tubo de baixo-ligação de DNA em um rack magnético e incubar a temperatura ambiente por 2 min, até que a solução é clara.
  23. Transferi o 45 µ l do sobrenadante contendo biblioteca purificada para o tubo de baixo-ligação DNA novo com uma pipeta de 100 µ l.

6. quantificar a concentração de biblioteca por PCR quantitativo em tempo Real

  1. Determine a concentração de cada biblioteca de acordo com instruções13 as indicações do fabricante.
    1. Prepare uma solução de 20-fold de diluição do seguinte modo: Misture 2 µ l de biblioteca purificada e 38 µ l de água nuclease livre em um tubo de baixo-ligação de DNA com uma pipeta 2 µ l e 100 µ l.
    2. Armazene as bibliotecas não diluídas a-20 º C até o passo 7.3.
  2. Preparar uma solução de 200-fold diluição da seguinte forma: misturar 5 µ l de 20-fold diluída purificada biblioteca (preparada na etapa 6.1) e 45 µ l de água nuclease livre em um tubo de baixo-ligação do DNA.
  3. Preparar uma solução de 2,000-fold diluição da seguinte forma: misturar 5 µ l de 200-fold diluída purificada biblioteca (preparada no passo 6.2) e 45 µ l de água nuclease livre em um tubo de baixo-ligação do DNA.
  4. Prepare a mistura de reação mestre do seguinte modo: misture 10 µ l de 2 x solução de mistura de mestre e 1 µ l de solução de ensaio da primeira demão-sonda em tubo estéril microcentrifuga de 20x com uma pipeta e, em seguida, misture tocando o tubo. Adicione 11 µ l do mix mestre reação nos poços de reação óptica de 96 poços.
  5. Adicione 9 µ l de 2,000-fold biblioteca diluída, 9 µ l de cada controle padrão ou 9 µ l de água livre de nuclease para cada poço com uma pipeta de 10 µ l.
  6. Segure o lado não-adesivas de película adesiva óptico e retirar o protetor de apoio no centro do filme.
    1. Delicadamente, arraste o aplicador sobre o filme e selar o filme sobre a placa de 96 poços.
    2. Misture suavemente a placa de 96 poços, utilizando um misturador de placa de 96 poços para 10 s à temperatura ambiente.
    3. Centrifugue a placa brevemente a 1.000 x g, durante 3 min à temperatura ambiente.
  7. Ligue o instrumento PCR em tempo real e inserir a placa de 96 poços. Executar as reações de PCR usando o seguinte protocolo: 50 ° C por 2 min, 95 ° C por 20 s, seguida de 40 ciclos de 95 ° C por 1 s e 60 ° C durante 20 s. uso "curva" e "modo rápido".
  8. Calcule a concentração de biblioteca não diluído multiplicando a concentração determinada com qPCR por 2.000.

7. na próxima geração de sequenciamento

  1. Plano a condição de execução e definir o parâmetro de execução dentro do software.
    1. Clique em [guia de plano] e [modelo] e selecione o método de execução apropriado.
    2. Selecione o aplicativo e o tipo de técnica e clique em [Next].
    3. Selecione o instrumento, kit de preparação de amostra (opcional), tipo de biblioteca de kit, kit de modelo, kit de sequenciamento, base do modo de calibração, tipo de chip, conjunto de sequência (opcional) e código de barras de controle e clique em [Next].
    4. Selecione os plugins e clique em [Next].
    5. Selecione o projeto e clique em [Next].
    6. Selecione a referência padrão e arquivos de cama da região de destino.
    7. Digite o nome de amostra, selecione o código de barras e clique em [executar plano].
  2. Executar a preparação de modelo e chip de carregamento em um instrumento automatizado de acordo com as instruções do fabricante. Descongele o cartucho de reagente à temperatura ambiente durante 45 min antes do uso.
  3. Diluir a biblioteca não diluída com água nuclease-livre de acordo com a concentração de biblioteca calculada na etapa 6,8 e fazer 20 bibliotecas de pM.
    1. Prepare uma biblioteca em pool para sequenciamento e loja no gelo.
    2. Adicione 25 µ l da biblioteca em pool com uma pipeta de 100 µ l para o fundo do tubo de amostra. Use a biblioteca em pool dentro de 48 h.
  4. Poder e abra a tampa do instrumento automatizado.
    1. Coloque o chip de sequenciamento, adaptador de chip, cartucho de enriquecimento, cartucho de ponta, placa PCR, PCR quadro selo, tubo de recuperação, cartucho de solução e cartucho de reagente para a posição apropriada do instrumento automatizado.
    2. Toque em [configurar execução] e [passo a passo] na tela.
    3. Feche a tampa e toque em [Iniciar verificação] na tela.
    4. Após o baralho o processo de digitalização, toque em [Next] na tela.
    5. Verifique o conteúdo do visor (tipo de jogo, tipo de chip, chip planos de ID, identificação da amostra,), definir a hora e toque em [Okey] na tela.
  5. Depois de terminar o carregamento da microplaqueta:
    1. Toque em [Next] na tela e abra a tampa.
    2. Descarregado o chip de sequenciamento do adaptador de chip com as mãos enluvadas.
    3. Coloque o chip dentro do recipiente de microplaqueta, rap com parafilm e loja a 4 ° C até a reação de sequenciamento.
    4. Removido o cartucho de enriquecimento, placa PCR, PCR quadro selo, tubo de recuperação, cartucho de solução e cartucho de reagente a posição apropriada do instrumento automatizado com as mãos enluvadas.
    5. Transferi um cartucho vazio-dica para a posição de resíduos da ponta do instrumento automatizado com as mãos enluvadas.
    6. Toque em [Next] e feche a tampa.
    7. Toque em [Iniciar] e limpar o instrumento automatizado por raios ultravioletas para 4 min.
  6. Dissolva um comprimido de clorito de sódio em 1.000 mL de água ultrapura e solução do filtro com uma unidade de filtro de fluxo de filtro de 0,22 µm.
    1. Ligue o instrumento de sequenciamento.
    2. Toque em [Clean] e [próximo] na tela do instrumento sequenciamento.
    3. Limpe o aparelho de sequenciamento com 250 mL de solução de clorito de sódio filtro esterilizados e posteriormente a 250 mL de água ultrapura.
  7. Toque em [inicializar] e selecione o kit de sequenciamento adequado na tela.
    1. Instale um carregador cinzento no local apropriado com as mãos enluvadas.
    2. Inicialize o instrumento de sequenciamento com a solução de lavagem (fornecido no kit), a solução de ajuste de pH (contendo 350 µ l de hidróxido de sódio de 100 mM) e a solução padrão de pH (fornecido no kit).
  8. Adicione 20 µ l de dATP, dGTP, dCTP e dTTP nucleotídeos (fornecida no kit) em tubos de 50 mL (fornecidos no kit) com uma pipeta de 100 µ l.
    1. Instale um carregador cinzento no local apropriado com as mãos enluvadas.
    2. Carrega o tubo de 50 mL e o parafuso do instrumento de sequenciamento.
    3. Toque o [próximo] na tela para começar a etapa de inicialização, que leva cerca de 25 min.
  9. Depois de concluir a etapa de inicialização:
    1. Toque em [executar] na tela e selecione o instrumento de preparação de biblioteca apropriada.
    2. Digitalize o código de barras bidimensional do chip.
    3. Inserir o chip de sequenciamento na posição apropriada.
    4. Feche a porta de grampo e instrumento de chip.
    5. Touch [seleção de Chip], [seguinte] e [Okey] na tela para começar a correr de sequenciamento.
  10. Após a reação de sequenciamento, transferir os dados e executar o pipeline de análise de dados sobre o servidor de sequenciamento13,17.

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Representative Results

A Figura 1 mostra todo o processo de preparar espécimes TIC para extração de DNA. Notavelmente, o procedimento leva apenas dois dias para obter o DNA genômico de amostras TIC. Nós avaliamos quaisquer efeitos do armazenamento do tumor antes do processamento do slide. Nós achamos que as células tumorais foram anexadas a lâmina de vidro quando as amostras de tecido foram tocadas imediatamente para o slide, e quando os tecidos foram mantidos em salina umedecido-gaze esterilizada por 1h (Figura 2). No entanto, quando os tecidos foram mantidos em temperatura ambiente, as células do tumor não foram bem anexadas ao slide. Slides preparados poderiam ser armazenadas a 4 ° C, durante três meses. Portanto, é importante não permitir que os espécimes secar.

Nós examinou a utilidade do nosso método e compará-lo com espécimes adquiridos usando FFPE. Amostras TIC e FFPE foram preparadas a partir de 14 amostras do tumor, e confirmamos que a pureza e conteúdo de tumor podem ser avaliadas dos espécimes TIC. Depois realizamos coloração Giemsa, o número de células tumorais e a morfologia do tumor poderia ser avaliado por microscopia. Assim, fomos capazes de avaliar rotineiramente as células do tumor e posteriormente executar uma verificação de qualidade de DNA.

A quantidade de DNA e a qualidade foram estimados por1514,13,do PCR quantitativo em tempo real. Determinamos as quantidades de DNA absolutas e o valor RQ, que é um indicador do nível de degradação do DNA genômico. Os resultados mostraram que um maior rendimento de DNA foi conseguido usando os espécimes TIC em comparação com os espécimes FFPE (tabela 1). Além disso, os valores RQ do DNA TIC foram significativamente superior em relação ao DNA FFPE (Figura 3, p = 2.3 x 10-8, testes de t de Student bicaudal). Também foram avaliados os valores RQ das TIC e FFPE DNA extraído de tipos diferentes de tumor e descobriu que o DNA de TIC foi superior em qualidade em comparação com o DNA de FFPE (Figura 3). Estes resultados indicam que o DNA de TIC foi menos fragmentado que o DNA FFPE.

Em seguida foram avaliados se o DNA de TIC poderiam ser usado para análise de sequenciamento na próxima geração. FFPE e TIC DNA foram preparados a partir de câncer colorretal primário e metastático câncer de fígado obtidos de um paciente (Figura 4A). Amplificação por PCR e preparação da biblioteca foram realizados utilizando o painel de Hotspot de câncer e posteriormente alvo de sequenciamento foi realizado. Como resultado, APC Q1367 * foi identificado em FFPE e TIC DNA extraído do Site 1 (tabela 2). Além disso, APC S1356 *, G12D KRAS e TP53 M237I foram detectados em ambos FFPE e TIC DNA extraído do Site 2, 3 e 4 (tabela 2). Estes resultados sugerem que as mutações somáticas idênticas foram identificadas em amostras FFPE e TIC DNA emparelhadas, preparadas a partir do mesmo site do tumor (Figura 4B e tabela 2). Notavelmente, as mesmas mutações somáticas foram detectadas entre câncer colorretal primário (Site 2, não Site 1) e duas amostras de câncer metastático de fígado, sugerindo que os clones do tumor do local 2 metastatizam para o fígado (Figura 4B e tabela 2). Juntos, estes achados sugerem que o DNA de TIC é de alta qualidade e é apropriado para uma ampla gama de testes genéticos, incluindo a próxima geração de sequenciamento.

Figure 1
Figura 1. esquema para obtenção de DNA de uma preparação de amostra TIC. O tecido do tumor é tocado no vidro do slide para preparar a amostra TIC. Após a avaliação da morfologia do tumor e conteúdo sob um microscópio, o DNA do tumor pode ser extraído e usado para testes genéticos. Com o uso de TIC, o tumor DNA pode ser obtida numa amostra clínica e patológica no prazo de dois dias. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2. Preparação de amostras TIC. Amostras de tumor Resected foram imediatamente tocou numa lâmina de vidro normal (painel esquerdo), mantidos em salina umedecido-gaze esterilizada por 1h (médio) e mantidas à temperatura ambiente durante 1 h (à direita). Exemplo #1 foi carcinoma hepatocelular e amostra #2 foi o câncer de mama. Fotos microscópicas foram capturadas usando uma câmera digital montada a um microscópio. Barra de escala: 100 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3. Verificação de qualidade de DNA estimado pela análise PCR quantitativo em tempo real. TIC e FFPE DNA foram extraídos de 14 tecidos de tumor do colo-rectal (n = 8), estômago (n = 4) e câncer de fígado metastático (n = 2). Comparação das pontuações quantificação relativa entre amostras de TIC-Giemsa e FFPE-HE. RQ valores TIC DNA foram significativamente maiores do que a do DNA FFPE. Realizou-se análise estatística entre os dois grupos e p-valores foram calculados pelo teste de t de Student não pareado bicaudal usando o Excel. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4. Próxima geração análise de dados de sequenciação usando TIC e DNA FFPE. (A) macroscópica e microscópicas imagens. Imagens representativas de TIC-Giemsa e FFPE-ele mancha do câncer colorretal (site 1 e 2) e carcinoma metastático de fígado amostras (site 3 e 4). Barra de escala em imagens macroscópicas: 1cm, barra de escala em imagens microscópicas: 100 µm. (B) calor mapa mostrando a distribuição das mutações somáticas para cada local do tumor (n = 8). Mutações idênticas foram detectadas entre amostras emparelhadas de TIC e FFPE DNA. Valores de frações alélicas são indicadas na escala de cores de graduação do 1% (rosa claro) para 100% (rosa). Colunas cinza não mostraram nenhuma mutação identificada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

TIQUE-Giemsa (n = 14) FFPE-HE (n = 14)
DNA total (ng) DNA total (ng)
Amostra Local do tumor Curta Longas RQ Curta Longas RQ
Site1 Dois pontos 1495 1247 0,83 939 349 0,37
Site2 Dois pontos 991 1057 1,07 556 204 0,37
Site3 Fígado 467 511 1,09 130 39 0.3
Site4 Fígado 2172 2115 0,97 488 127 0,26
Site5 Dois pontos 749 598 0.8 529 205 0,39
Site6 Estômago 330 286 0.86 211 98 0.46
Site7 Estômago 73W 499 0,78 154 84 0.55
Site8 Estômago 27 27 1.01 135 81 0.6
Site9 Dois pontos 1986 1611 0,81 476 163 0,34
Site10 Dois pontos 280 218 0,78 209 83 0,39
Site11 Dois pontos 1546 575 0,37 366 159 0,43
Site12 Estômago 1501 1200 0.8 274 132 0,48
13 Dois pontos 1556 1404 0.9 326 179 0.55
Site14 Dois pontos 1565 1210 0,77 680 295 0,43
Mean±SD 1093±682 897±600 0.85±0.18 391±253 157±86 0.42±0.10

Tabela 1. Dados de qualidade do DNA. TIC emparelhado (n = 14) e FFPE espécimes (n = 14) foram preparados a partir do cólon, fígado e câncer de estômago. Amostras TIC foram coradas com Giemsa, e amostras FFPE foram coradas com hematoxilina e eosina (HE). Amostras de DNA foram extraídas e quantificadas por PCR quantitativo em tempo real com dois pares da primeira demão, amplificando o locus RNaseP (amplicon longo (268 bp) e curto amplicon (87 bp)). RQ valores foram calculados como segue: o valor médio de longo amplicon dividido poro valor médio de amplicons curto. SD, desvio-padrão; RQ, quantificação relativa

Nome da amostra Localização Preparação Símbolo do gene Mutação Posição Referência Variante Codificação Cobertura Fração alélica
Câncer colorretal primário Local 1 FFPE APC Q1367 * chr5:112175390 C T c.4099C > T 1999 45%
Câncer colorretal primário Local 1 TIQUE APC Q1367 * chr5:112175390 C T c.4099C > T 1011 72%
Câncer colorretal primário Local 2 FFPE APC S1356 * chr5:112175358 C A c.4067C > A 1968 77%
Câncer colorretal primário Local 2 FFPE KRAS G12D chr12:25398284 C T c.35g > A 1993 52%
Câncer colorretal primário Local 2 FFPE TP53 M237I chr17:7577570 C A c.711G > T 1991 73%
Câncer colorretal primário Local 2 TIQUE APC S1356 * chr5:112175358 C A c.4067C > A 1967 89%
Câncer colorretal primário Local 2 TIQUE KRAS G12D chr12:25398284 C T c.35g > A 1994 56%
Câncer colorretal primário Local 2 TIQUE TP53 M237I chr17:7577570 C A c.711G > T 1995 86%
Câncer metastático de fígado Site 3 FFPE APC S1356 * chr5:112175358 C A c.4067C > A 1974 92%
Câncer metastático de fígado Site 3 FFPE KRAS G12D chr12:25398284 C T c.35g > A 1995 62%
Câncer metastático de fígado Site 3 FFPE TP53 M237I chr17:7577570 C A c.711G > T 1296 91%
Câncer metastático de fígado Site 3 TIQUE APC S1356 * chr5:112175358 C A c.4067C > A 1964 97%
Câncer metastático de fígado Site 3 TIQUE KRAS G12D chr12:25398284 C T c.35g > A 1993 64%
Câncer metastático de fígado Site 3 TIQUE TP53 M237I chr17:7577570 C A c.711G > T 1998 95%
Câncer metastático de fígado Local 4 FFPE APC S1356 * chr5:112175358 C A c.4067C > A 1965 93%
Câncer metastático de fígado Local 4 FFPE KRAS G12D chr12:25398284 C T c.35g > A 1992 60%
Câncer metastático de fígado Local 4 FFPE TP53 M237I chr17:7577570 C A c.711G > T 1993 92%
Câncer metastático de fígado Local 4 TIQUE APC S1356 * chr5:112175358 C A c.4067C > A 1960 94%
Câncer metastático de fígado Local 4 TIQUE KRAS G12D chr12:25398284 C T c.35g > A 1992 62%
Câncer metastático de fígado Local 4 TIQUE TP53 M237I chr17:7577570 C A c.711G > T 1995 95%

Tabela 2. Comparação de mutações em emparelhados FFPE e TIC DNA detectado pela análise de sequência alvo. TIC emparelhado e FFPE amostras foram preparadas a partir de 2 primários cancros colo-rectais (Site 1 e 2) e 2 cânceres de fígado metastático (Site 3 e 4). Alvo de sequenciamento foi realizado com estas amostras de DNA e mutações somáticas foram identificadas. Perfis de mutação eram idênticas entre pares de TIC e DNA FFPE exemplos.

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Discussion

Neste estudo, apresentamos um método alternativo para obtenção de tumor DNA de amostras clínicas patológicas, usando TIC. Preparação de TIC é muito simples e precisa de menos tempo em comparação com métodos FFPE, sem a exigência de instrumentos especiais10. Todos os procedimentos de preparação da TIC para extração de DNA podem ser concluídos dentro de dois dias (Figura 1). Esse método, portanto, encurta o tempo de retorno para a realização de testes genéticos. Notavelmente, isso fornece uma vantagem significativa na redução do número de dias necessário para análise molecular. Este tempo de retorno de curto nos permite oferecer imediatamente uma terapia apropriada para pacientes com câncer progressivo que necessitam de drogas de alvo molecular. Assim, este método fornece benefícios para análises de alterações genéticas em tumores e administração de drogas molecularmente orientadas para a terapia do câncer.

Existem alguns pontos-chave para o sucesso do uso de TIC DNA para análise genética. Tecidos de tumor podem ser necróticos por causa do tratamento, como quimioterapia ou outros tratamentos. Assim, cautela é necessária em preparar espécimes TIC para evitar amostragem das seções necróticas no tumor tanto quanto possível. Além disso, a avaliação microscópica inicial é muito importante para os procedimentos subsequentes. Além disso, impedindo a secagem de tecidos de tumor é necessária para a preparação de amostra TIC bem sucedida. Se os tecidos de tumor são secas, isso resulta em menos anexadas células sobre a lâmina de vidro. Também será difícil de observar a celularidade do tumor e a morfologia, porque leva a degeneração dos tecidos de tumor de secagem.

Existem alguns benefícios potenciais para usando o DNA de TIC. Em primeiro lugar, podemos verificar a celularidade do tumor na primeira avaliação com microscopia. Se as células normais, como linfócitos e células estromais, eram abundantes nas amostras de tecido, a contaminação dessas células normais impediria a capacidade de detectar mutações somáticas nas células do tumor. Rápida avaliação microscópica das amostras pode ajudar na avaliação da celularidade do tumor e estimativa de se amostras de DNA do tumor adequada foram obtidas as amostras TIC antes da extração de DNA. Em segundo lugar, nossos resultados mostraram que o DNA de TIC é ambos ricos em qualidade e quantidade. FFPE DNA tem sido utilizado para análise de sequenciamento próxima geração incluindo sequenciamento alvo exome sequenciamento e genoma inteiro sequenciamento16,17,18,19,20. Arquivamento FFPE DNA rotineiramente também é usado para análise genética21,22, porém FFPE DNA podem ser fragmentado durante a fixação de formol. Isso pode resultar em problemas na amplificação por PCR ou extração de DNA, causando a falta de cobertura de sequência, uniformidade em regiões-alvo e aumentar o risco de erro de sequência23,24. Em contraste, DNA de TIC não é fragmentado, que pode ser devido a fixação de álcool que tem menos influência sobre o ácido nucleico. Como o DNA de TIC não é fragmentado como o DNA FFPE, estas amostras será mais adequadas para análise de sequenciamento na próxima geração, PCR em tempo real e digital do PCR. De fato, mostramos anteriormente que TIC DNA de uma amostra do tumor pode ser usado na análise de sequenciamento de nova geração, um método chamado "TIC-seq", e os resultados precisamente poderiam capturar o tumor mutações somáticas13. Em terceiro lugar, esta técnica é aplicável para uma ampla gama de materiais. No relatório atual, usamos espécimes cirúrgicos. Além de tecidos cirúrgicos, linfonodo metastático, biópsia brônquica ou endoscópica pode ser usada para a preparação de DNA de TIC.

Em conclusão, apresentamos um método simples e rápido para a preparação de DNA do tumor de alta qualidade usando amostras TIC. Este método irá expandir novas possibilidades no campo da análise genética e ajudar a promover a medicina de precisão na prática clínica.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgements

Agradecemos a todo o pessoal médico e auxiliar do hospital e os pacientes para consentir a participar. Agradecemos a Gabrielle White Wolf, PhD, do grupo de Emilia (www.edanzediting.com/ac) para a edição de um projecto deste relatório. Este estudo foi suportado por um subsídio para o projeto de pesquisa do genoma da província de Yamanashi (YH e modus operandi) e uma subvenção da Fundação médica de The YASUDA (YH).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FINE FROST white20 micro slide glass Matsunami Glass ind, Ltd SFF-011
Arcturus PEN Membrane Glass Slides Thermo Fisher Scientific LCM0522
Cyto Quick A solution Muto Pure Chemicals 20571
Cyto Quick B solution Muto Pure Chemicals 20581
May-Grunwald Solution Muto Pure Chemicals 15053
Giemsa solution Muto Pure Chemicals 15002
QIAamp DNA FFPE tissue kit Qiagen 56404
TaqMan Fast Advanced Master Mix Thermo Fisher Scientific 4444557
TaqMan RNase P Detection Reagents Kit Thermo Fisher Scientific 4316831
TaqMan Assay from FFPE DNA QC Assay v2 Thermo Fisher Scientific 4324034
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate  Thermo Fisher Scientific 4346907
MicroAmp optical Adhesive Film Thermo Fisher Scientific 4311971
MicroMixer E36 TITEC 0027765-000
ViiA 7 Real-Time PCR System Thermo Fisher Scientific VIIA7-03
Himac CF16RXII Hitachi-koki CF16RII
Ion Library TaqMan Quantitation Kit Thermo Fisher Scientific 4468802
Ion AmpliSeq Cancer Hotspot Panel v2 Thermo Fisher Scientific 4475346
Ion AmpliSeq Library Kit 2.0 Thermo Fisher Scientific 4480442
Ion Xpress Barcode Adapters 1-16 Kit Thermo Fisher Scientific 4471250
Ion PGM Hi-Q View Sequencing Kit (200 base) Thermo Fisher Scientific A30044
Ion Chef System Thermo Fisher Scientific 4484177
Veriti 96-well Thermal Cycler Thermo Fisher Scientific Veriti200
Ion 318 Chip Kit v2 BC Thermo Fisher Scientific 4488150
Ion PGM System Thermo Fisher Scientific PGM11-001
Ion PGM Wash 2 Bottle kit Thermo Fisher Scientific A25591
Agencourt™ AMPure™ XP Kit Beckman Coulter A63881
16-position Magnetic Stand Thermo Fisher Scientific 4457858
Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL (Low binding tube) Thermo Fisher Scientific AM12450
Nuclease-free water Thermo Fisher Scientific AM9938
MicroAmp™ Optical 96-well Reaction Plates Thermo Fisher Scientific 4306737
MicroAmp™ Clear Adhesive Film Thermo Fisher Scientific 4306311
Agencourt™ AMPure™ XP Kit Beckman Coulter A63881
Ethanol(99.5) Nacalai Tesque 08948-25
Sodium hydroxide (10M) Sigma 72068
DTU-Neo TAITEC 0063286-000
E-36 TAITEC 0027765-000
ECLIPSE Ci-L Nikon 704354
Pipet-Lite LTS Pipette L-2XLS+ METTLER TOLEDO 17014393
Pipet-Lite LTS Pipette L-10XLS+ METTLER TOLEDO 17014388
Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+ METTLER TOLEDO 17014392
Pipet-Lite LTS Pipette L-100XLS+ METTLER TOLEDO 17014384
Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+ METTLER TOLEDO 17014391
Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+ METTLER TOLEDO 17014382
petit-change WAKEN MODEL8864 Mini centrifuge
petit-incubator WAKEN WKN-2290 Air incubator
SensiCare Powder-free Nitrile Exam Gloves MEDLINE SEM486802
Sterile gauze Osaki 11138
Refrigerator MediCool SANYO MPR-312DCN-PJ
FEATHER TRIMMING BLAD FEATHER No.130
FEATHER TRIMMING BLAD FEATHER No.260
FEATHER S FEATHER FA-10
Vortex Genius 3 IKA 41-0458 Vortex mixer
Pincette NATSUME A-5
1.5 mL microtube BIOBIK RC-0150

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