להמחיש ליקוציט מתגלגל והצמדות אנגיוטנסין II חדורים עכברים: טכניקות ואת החסרונות

Immunology and Infection
 

Summary

כתב יד זה מתאר את השימוש העכברים הטרנסגניים הכתב ואת נתיבי ממשל שונים של צבעי פלורסנט באנגיוטנסין II-induced יתר לחץ דם באמצעות מיקרוסקופ וידאו intravital של כלי הדם כדי להעריך את ההפעלה של תאים חיסוניים שלהם היכולת לגלגל, לדבוק אנדותל.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lagrange, J., Kossmann, S., Kiouptsi, K., Wenzel, P. Visualizing Leukocyte Rolling and Adhesion in Angiotensin II-Infused Mice: Techniques and Pitfalls. J. Vis. Exp. (131), e56948, doi:10.3791/56948 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Epifluorescence intravital וידאו מיקרוסקופ (IVM) של כלי הדם היא שיטה הוקמה כדי להעריך את ההפעלה של תאים חיסוניים והיכולת שלהם תפקיד וציות על שכבת אנדותל. ויזואליזציה של מחזורי תאים על ידי זריקה של צבעי פלורסנט או נוגדנים מצמידים fluorophore נמצא בשימוש נפוץ. לחלופין, ניתן להשתמש כתב פלורסנט עכברים. אינטראקציות של לויקוציטים, ב מסוים ליזוזים M+ (LysM+) ומונוציטים, עם הקיר כלי משחק תפקיד מרכזי בקידום בתפקוד כלי הדם, יתר לחץ דם. אנו מציגים כאן את הטכניקה כדי להמחיש ולכמת ליקוציט מתגלגל והצמדות בעורקים באנגיוטנסין II (AngII)-induced יתר לחץ דם אצל עכברים מאת IVM.

ההשתלה של קטטר נזקים לקיר כלי הדם ומוביל אל תאי הדם שינו תגובות. השווינו הזרקה שונים וטכניקות ניהול נתיבים להמחיש לויקוציטים ב LysMCre+IRG+ עכבר עם ביטוי נרחב של חלבון פלואורסצנטי אדום, ביטוי מותנה של חלבון פלואורסצנטי ירוק ב- LysM + תאים. ללמוד הפעלת תא LysM+ , השתמשנו AngII חדורים עכברים מתגלגל, הידבקות של לויקוציטים כדי אנדותל גדל. אנחנו גם מוזרק acridine כתום של וריד הצוואר באמצעות קטטר או ישירות למרות הזנב הווריד לעומת הכמות מתגלגל והקפדה תאים. מצאנו כי הצנתר צוואר השרשה כשלעצמה גדל המספר של גלגול, הקפדה LysM+ בתאים המזויפים חדורים LysMCre+עכברים IRG+ לעומת שולט. הפעלה זה היה מרובדת בעכברים חדורים AngII. מעניין, הזרקת acridine כתום ישירות דרך הזנב וריד לא גדלה LysM+ תא אדהזיה או מגלגלים בעכברים חלוטים המזויפים. אנחנו ובכך הראו את החשיבות של העכברים הטרנסגניים כתב המבטאים חלבונים פלורסנט לא להתערב בתהליכים ויוו במהלך ניסויים. יתר על כן, הזרקה וריד הזנב של המשדרים פלורסנט עשויה להיות אלטרנטיבה אפשרית זריקות צוואר קטטר.

Introduction

יתר לחץ דם מגביר את הסיכון למחלות לב וכלי דם ומוות ומקדמת ההתפתחות של טרשת עורקים, מחלת לב כלילית, עורקי או ורידי thromboembolisms1. התפתחות יתר לחץ דם תלוי האינטראקציה של גורמים סביבתיים, גנטי, האנדוקרינית ו בגרימת. כיום, חסינות ודלקת הקשורים יתקבלו בברכה לשחק תפקיד חשוב האטיולוגיה של יתר לחץ דם2.

בין תאים חיסוניים, נמצאו לימפוציטים מסוג T, כמו גם ומונוציטים ו מקרופאגים להיות מעורב סיבתי AngII-induced דלקת כלי דם, יתר לחץ דם, הקשורים באופן חלקי ביכולתם לעורר מינים חמצן תגובתי3. מקרופאג המושבה-מגרה גורם לקוי עכברים הראה מופחתת בתגובה AngII בנוגע עלייה בלחץ הדם, דלקת כלי דם4. בעבודה קודמת, נוכל להראות כי LysM + ומונוציטים לנהוג בתפקוד כלי דם ודלקת AngII-induced יתר לחץ דם5. לאחרונה, אנחנו תיאר את מסלול הרומן ב אילו קרישה פקטור XI משתפת פעולה עם טסיות ועל הקיר כלי כדי לגרום דלקת כלי הדם תרומבין תלוית6. לאחרונה, הידע הנוכחי על תפקידה של מערכת החיסון אצל יתר לחץ דם היה מסוכם, נבדקו על ידי רודריגז-Iturbe ואח. 7

מאז המעורבות של תאים חיסוניים להתפתחות יתר לחץ דם התברר, מודלים וטכניקות את האינטראקציה בין הכלי לבין תאים חיסוניים הפך הכרחי. IVM Epifluorescence של כלי דם הוא כלי שימושי כדי להתבונן ויוו האינטראקציות בין במחזור הדם והתאים אנדותל8,9,10. בטכניקה זו, הזרקה של צבעי intercalating עם ה-DNA (כגון כתום acridine) יכולה לדמיין תאים nucleated (מחזורי וכן מ של אנדותל). טסיות הדם מבודדים צבעונית שמחוץ עם rhodamin - 6 G או dichlorofluorescein (DCF) יכול להיות מוזרק להמחיש טסיות דם עשיר כגון פגיעה בעורקים. או מודלים.

בדרך כלל, קטטר ומוחלף להזרקת המשדרים או מסומן טסיות. שינוי אנדותל והפעלה עוקבות של המפל קרישה שניהם ידועים להיות השפעות על מונוציט הפעלה. פציעה אנדותל מיד מוביל טסיות הפעלה באמצעות מטריקס subendothelial מולקולות לאטום את הרקמה, שהתפתח מונוציט המשיכה והפעלה11. להפך, אנדותל שלם הוא ידוע כבעל מאפיינים קרישה (למשל, באמצעות רקמות גורם מסלול מעכב או thrombomodulin)12 ו ישיר מעכבות ההשפעות על מונוציט, למשל, באמצעות הפרשת חוץ-תאית שלפוחית המכילה מיקרו Rna13. ומונוציטים ידועים כדי לייצר גורם רקמות, activator החיצוניים של קרישת הדם בהתאם להירארכיית הקשרים, אקספרס מופעל פרוטאז קולטנים (PARs) יכול להיות מופעל על ידי תרומבין ולהשתתף מונוציט הפעלה14,15 . לכן, כל הפעלה של טסיות או של המפל קרישה עקב פגיעה בכלי הדם יכול להיות תופעות בלתי צפויות על ההפעלה מונוציט ומשבשים את התופעה נצפתה. עם העזרה של IRG הטרנסגניים LysM Cre העכברים הטרנסגניים, עכבר כתב Cre כפול-פלורסנט (LysMCre+IRG+), אנו מציעים ללמוד בפירוט את השפעת זריקות עם קטטר ושיטות אלטרנטיבית על LysM+ תאים myelomonocytic במודל של עכברים של יתר לחץ דם16.

Protocol

הניסויים נערכו על עכברים זכר גיל 8 עד 12 שבועות תחת האישור של ועדת האתיקה על ניסויים בבעלי חיים של ריינלנד-פאלץ (אישור מספר 23 177-07/G12-1-002 ו 23 177-07/G15-1-051).

1. עכבר הכנה ניתוח והרדמה

  1. לפני הניתוח, לוודא את בריאות טובה ואת מצבם של בעלי החיים. לפני הניתוח, לפקח על בעלי חיים פעם אחת ביום למשך 2-3 ימים על מצבם הכללי (מראה, תנוחות, התנהגות ספונטנית) כמו גם משקל הגוף, המזון וצריכת מים.
  2. להכין את תערובת הבסיס עבור הרדמה עם midazolam (5 מ"ג/ק"ג משקל גוף), medetomidine (0.5 מ"ג/ק"ג משקל גוף) של פנטניל (0.05 מ"ג/ק"ג משקל גוף) intraperitoneally (i.p.) להזריק 200 העכבר µL/30 גרם ב 1 מ"ל מזרק עם מחט 26 גרם.
  3. משאבת osmotic השרשה והכנת בעלי חיים לניסויים IVM מבוצעות על שדה הפעולה ב- C ° 39 ההתחממות פלטפורמה. לחטא את כל הכלים באמבט חיטוי ולחטא את הפלטפורמה התחממות כדור הארץ.
  4. במהלך ההליכים, להגן על העיניים בעלי חיים עם משחה העין. הסר את הפרווה עם סכיני גילוח לפני המשאבה osmotic השרשה. השתמש להסרת שיער קרם ספוגיות כותנה עבור בידוד של לעורק הראש, צוואר קטטר השרשה בניסויים IVM. לחיטוי עור החיה באמצעות שני אמצעי חיטוי העור: אחד מחטא וקוטל המכיל povidone יוד ואחד העור מחטא המכיל octenidine בפתרון מבוסס-אלכוהול.
  5. להכין את תערובת הבסיס להרגיז את ההרדמה ("מיקס antisedan") עם atipamezol (0.05 מ"ג/ק"ג משקל גוף), פלומאזניל (0.01 מ"ג/kgbody משקל), ולהכין µL 200/עכבר במזרק 1 מ"ל עם מחט 26 גרם להיות subcutaneously (ש) מוזרק.

2. osmotic משאבת והכנה השרשה

הערה: עירוי תת-עורי AngII באמצעות משאבות osmotic תוארה בפירוט על ידי Lu. et al. 17

  1. להכין את AngII על-ידי לשחזר את האבקה lyophilized עם סליין סטרילי ולהתאים את הריכוז עם המשקל בעלי חיים ואת קצב משלוח של המשאבה. שמור את AngII משוקם צינורות פלסטיק (אל תשתמש צינורות זכוכית).
  2. למלא את המשאבות הפתרון AngII כדי לספק 1 mg/(kg·d) במשך 7 ימים. לאחר ההכנה, לשמור את המשאבות מלח סטרילית עבור 4-6 שעות מינימום ב 37 º C.
  3. הבדיקה בהרדמה מלאה של העכבר לאחר הזרקה של המיקס הרדמה עם אחורי רגל רפלקסים ומניחים אותו על המגרש מבצע חם. הרדמה אינדוקציה לוקח 10-15 דקות, עובד טוב יותר אם חיות ממוקמים בסביבה חשוכה.
  4. לגלח את הגב התחתון העכבר ולחטא אותו עם חיטוי אלכוהולי העור.
  5. עושים חתך 1 ס מ בניצב לעמוד השדרה באמצעות מספריים. ליצור כיס עבור המשאבה באמצעות עוצר דימום מצר ולהוסיף את המשאבה (זרימה מנחה קודם). הכיס לאפשר תנועה חופשית של המשאבה עם אין לחץ על הפצע.
  6. לסגור את הפצע עם התפרים, לא קליפים, על מנת להגביל את דלקת; לאחר מכן לחטא עם חיטוי העור.
  7. הקטנטנים של ההרדמה בזריקה ספורטינג של 200 µL של המיקס antisedan וחוזרים העכבר בכלוב.
  8. לבצע נגד כאבים לאחר הניתוח עם הבופרנורפין (0.075 ק מ"ג/ק"ג ספורטינג) פעם אחת לאחר הניתוח, על פי דרישה בהתאם להתנהגות בעלי חיים.

3. צוואר קטטר השרשה והכנות לעורק הראש

  1. הבדיקה בהרדמה מלאה של העכבר לאחר הזרקה של ההרדמה לערבב עם מזון אחורי רפלקסים, למקם את החיה anesthetized recumbence הגבי בצלחת כירורגי 39 ° C עם מכשיר בדיקה רקטלית על מנת לשמור על הטמפרטורה, לשים את המשחה על העיניים כדי להגן עליהם במהלך ההליך.
  2. להסיר שערות הצוואר השימוש בקרם להסרת שיער. השתמש ספוגית כותנה כדי להפיץ ומרח את הקרם למשך 2 דקות עד שהשערות מתחיל לנשור. לאחר 2 דקות נוספות, להסיר את קרם ואת שערות עם מרית, לחטא את העור עם העור אלכוהוליים חיטוי.
  3. לבצע את הניתוח תחת stereomicroscope. עושים חתך ארוך 1 – 1.5 ס"מ בעור longitudinally בצוואר, 1 ס מ ליד קנה הנשימה. ואז להפוך אחרים שני חתכים בניצב כדי בשני הגפיים החתכים הראשונים.
  4. בזהירות להסיר רקמות לצד העור ולהסיר את פיסת העור כיסוי ומוחלף השמאלי על קנה הנשימה.
  5. בזהירות לבודד את בלוטת הפרוטיד; בלוטות sublingual, submaxillary מאזור עניין עם מלקחיים מעוקל 2. לא לחתוך או נזק הבלוטות, למקם אותם כדי לאפשר את הגישה הטובה ביותר ומוחלף על וכדי לעורק הראש.
  6. כדי לבודד את ומוחלף, להשתמש מלקחיים דק לאט ולפתוח ולסגור אותו לשחרר בעדינות את הכלי מן הרקמה שמסביב. פעם אחת הווריד נקייה לגמרי, מקם את המלקחיים תחת הכלי ומניחים התפרים 7-0 שני של 10 ס מ כל אחד מתחת.
  7. סגור את התפר מקורב לראש עם שני קשרים. התפר אחרים, להכין קשר אחד אך אינו סגור.
  8. . תחזיק את הקטטר (0.28 מ מ בתוך הקוטר החיצוני 0.61 מ מ, קוטר) מלא מלח סטרילית 37 ° C עם מלקחיים עם יד אחת; בזמן עם היד השנייה, עושים חתך קטן לתוך הכלי עם מספריים דק או מחט 26 גרם מעוקל. לאחר מכן להכניס את הצנתר ומוחלף על, וסגרי את הקשר פעמיים. סגור את התפר מקורב לראש על הצנתר על מנת להבטיח הנייח מלאה.
  9. כדי לבודד ולהכין בעורקים, לנתח המשתרע על קנה הנשימה באמצעות מלקחיים מעוקל דק.
  10. לאחר לעורק הראש חינם מן הרקמות הסובבות, להסיר את העצב התועה (זה נראה כמו פס לבן צמוד בעורק) מכלי הקיבול (אבל זה לא מספיק). המלקחיים דק יכול להיות סגור ופתח לאט לגייס בעדינות את העצב.
  11. לאחר שני העורקים נקיים לגמרי, מקום המלקחיים תחת העורק הראשי הראשון ולמקם קטן שחור 3 מ מ רוחב x 2.5 ס מ אורך פלסטיק חתיכה תחת הכלי. חשוב מאוד לא overstretch את הכלי, כדי לבדוק זרימת הדם נוכחת ברגע בעל כלי השיט ממוקם. מקם את העורק השני מעל בעל כלי השיט. אם העכבר אינם ממוקמים ישירות מתחת למיקרוסקופ, תחזיר את הבלוטות מעל קנה הנשימה ולהחיל מלח סטרילית 37 ° C כדי למנוע ייבוש של האזור.

4. הערכה של גלגול והקפדה לויקוציטים / LysM + תאים עם IVM

  1. להכין acridine כתום פתרון מניות 2 מ"ג/מ"ל המאוחסנים ב-20 ° C, למהול אותו 1:4 במלח סטרילית (ריכוז סופי 0.5 מ"ג/מ"ל) במזרק 1 מ"ל.
להגן על המזרק מפני האור ושימוש µL 200 לכל עכבר אחד.
  1. בדיקת מצבים שונים: (1) הזרקה של acridine כתום עם הצנתר צוואר; (2) הזרקה של acridine כתום ישירות לתוך הווריד לרוחב של הזנב (עם מצב זה שהושתל צנתר צוואר אין); (3) מדידה מבלי acridine כתום באמצעות קרינה פלואורסצנטית את LysMCre+IRG+ עכברים (כאן שוב קטטר צוואר לא הושתל).
  • ברגע הקטטר נמצא במקום שני לעורק הראש מבודדים, מיקום העכבר מתחת למיקרוסקופ. לבצע מדידות עם מיקרוסקופ פלורסצנטיות שדה רחב במהירות גבוהה תוך שימוש הקבל למרחקים של 10 X (NA 0.3) המטרה טבילה במים עם monochromator, מפצל קרן מצלמה תשלום מצמידים מכשיר. בצע ייבוא תמונות וניתוח מערכת הדמיה בזמן אמת.
  • פוקוס המטרה מיקרוסקופ באמצע העורק הראשי על פני אנדותל. לאט לאט להחדיר 50 µL של acridine כתום (0.5 mg/mL) (קח בחשבון נפח מת של הצנתר על הזריקה הראשונה). להגדיר את התוכנה כדי להקליט תמונות 100 עם זמן חשיפה בלתי המילישניות 120 לכל תמונה.
  • להפוך ארבעה קטעי וידאו לפי העורק הראשי (ימין ושמאל) במקומות שונים על העורק עבור כל קליפ. אם האות פלורסצנטיות יורדת, להזריק עוד 50 µL של acridine כתום.
  • לאחר הקלטת כל קטעי וידאו להרדימו על ידי נקע בצוואר הרחם.
  • להגדיר את מהירות וידאו-10 תמונות בשנייה, לכמת את התאים מתגלגל, חסיד בתצוגה מיקרומטר 200 x 250 מיקרומטר מלבן במרכזו את הכלי עבור כל קליפ. ספירת תאים מתגלגל, חסיד; תאים חסיד מוגדרים תאים לא לזוז או להתנתק מהתכונה אנדותל בתוך הוידאו s 10. כדי לפשט כמת, להסיר את הערוץ עם פלואורסצנטי אדום ולהשתמש רק את הירוק פלורסצנטיות לספור תאים מתגלגל, והקפדה.
  • לניסויים באמצעות acridine כתום, להפוך את הסף ידנית של זריחה כדי להסיר את הרקע שנעשו על ידי תאי אנדותל.
  • Representative Results

    לעורק הראש של LysMCre+IRG+ נצפו עכברים רווי AngII באמצעות IVM. Acridine תפוז היה מוזרק באמצעות צנתר צוואר. כיוונו להסתכל על היחס של תאים LysM+ בקשר עם הקיר וסקולרית לעומת כל התאים במחזור nucleated (אשר יכול גם לקיים אינטראקציה עם כלי הקיבול מאז אפליה של סוג התא אינטראקציה עם הכלי נשאר פתוח שאלה מן העבודות הקודמות שלנו). בנקודת ההתחלה, הנוכחות של קטטר צוואר גורמת הידבקות של תאים LysM+ (איור 2 א, יח). לאחר ההזרקה acridine כתום, אותם התאים היו פלורסנט, אבל גם תאי אנדותל היו פלורסנט (איור 2B, E). לאחר ההפחתה של הרקע כדי להגביל אנדותל הקשורים פלורסצנטיות, הנתונים מצביעים על כי כל התאים adhering nucleated הם LysM+ (איור 2C, F); תוצאות אלו נכונה לאחר אינפוזיה AngII המאשרת את התוצאות הקודמות שלנו, הממחיש LysMCre+IRG+ הוא מודל טוב כדי לבחון את השפעת AngII על LysM+ תא ההפעלה.

    הערכנו את התפקיד של נתיבי ממשל של תפוז על ההפעלה תא LysM+ לאחר אינפוזיה AngII ב LysMCre+IRG+acridine. אחרי שבוע אחד AngII אינפוזיה, ליקוציט אנדותל אינטראקציות בתוך עורק של LysMCre+IRG+ היו עכברים עם תמונה, דמיינו ידי IVM עם או בלי הזרקת acridine כתום דרך קטטר צוואר או דרך הווריד של הזנב. ללא קטטר או הזרקה, מתגלגל של תאים LysM+ היה משמעותי מוגברת לאחר אינפוזיה AngII לעומת עכברים שלא טופלו, והצמדות הראו עלייה (איור 3). הזרקה של acridine כתום ועם אדהזיה קטטר צוואר מוגברת של גילגולים AngII מטופלים עכברים במידה רבה יותר בהשוואה עכברים ללא קטטר (איור 3). הזרקה של תפוז את תקחי את הזנב acridine מוביל המסוכן דומה, מתגלגל לעומת עכברים זה לא קיבלה זריקה של acridine כתום (איור 3).

    Figure 1
    איור 1. ערכת אינפוזיה אנגיוטנסין II, הערכה של LysM+ תאים מתגלגל והצמדות בעכברים. LysMCre+IRG+ עכברים היו חדורים 7 ימים עם AngII, הקפדה, כמו גם מתגלגל LysM+ תאים מעל לעורק הראש היו לכמת עם או בלי הזרקת acridine כתום דרך קטטר צוואר או על-ידי וריד הזנב זריקה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

    Figure 2
    באיור 2. הערכה של LysM+ תא אדהזיה מתגלגל בעורקים של LysMCre+עכברים IRG+ . אדהזיה LysM+ תאי LysMCre+עכברים IRG+ (A, D) לפני ואחרי הזרקת acridine (B, E) באמצעות צנתר צוואר. קרינה פלואורסצנטית אדום וירוק נרשמו, תאים LysM+ (בירוק) ותאי שריר חלק (באדום) היו גלויים. לאחר ההזרקה של תפוז acridine, תאי אנדותל גלויים גם בירוק אבל הסרת רקע זריחה מאפשר רק במחזור nucleated תא ויזואליזציה (C, F). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

    Figure 3
    איור 3. הערכה של נתיבי ממשל של צבעי פלורסנט באנגיוטנסין II חדורים LysMCre+עכברים IRG+ . כימות של גלגול (A) והקפדה (B) LysM+ תאים המזויפים המופעל או חלוטים AngII חיות, עם או בלי זריקה של תפוז acridine באמצעות צנתר צוואר או בזריקה וריד הזנב. תמונות נציג של התנאים שונים (C). התוצאות הן זאת אומרת ± שגיאת התקן של הממוצע. 2-way ANOVA בוצעה ובדיקה של Bonferroni פוסט הוק , n = 3-12/קבוצות; p < 0.05. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

    Discussion

    LysM+ ומונוציטים הוצגו בעבר כדי להיות מעורב בפיתוח של יתר לחץ דם5. הנה אנחנו מראים כי תאים חיסוניים LysM+ רול, לדבוק שכבת אנדותל בתגובה AngII אינפוזיה. ממצא זה הושג באמצעות LysMCre+IRG+ עכברים ממחקרים קודמים שלנו לחקור את התפקיד של תאים חיסוניים יתר לחץ דם ויוו דמיין לויקוציטים עם הזרקה של6,acridine כתום10. לפיכך, אפליה של סוגי תאים והקפדה אנדותל איננה אפשרית.

    IVM הוא כלי מאוד שימושי עבור כלי הדם מחקרים ותצפיות ויוו של תאים ישירות להערכת, אבל ההשפעה של הזרקת צבע בעזרת קטטר בניתוח שנוסף על רקע דלקתי של יתר לחץ דם אינו ידוע. כדי להעריך את השפעת פוטנציאל קטטר, acridine כתום הזרקת אנחנו ניצל LysMCre+עכברים IRG+ . AngII אינפוזיה גדל המספר לגלגל LysM+ תאים אנדותל. החדרת צנתר לווריד הצוואר הגביר את האפקט, לויקוציטים יותר מתגלגל והקפדה אותרו בעכברים חדורים AngII שעברו אינסטרומנטציה עם קטטר לעומת עכברים ללא קטטר שתלים. אפשרות זו מציינת את השרשת צנתר לעורק הצוואר גורם לתגובה דלקתית מערכתית בהקשר של פצע ריפוי המהווה שכבת-על התגובה החיסונית אצל יתר לחץ דם18. בנוסף, מהקרבה של ומוחלף על העורק הראשי ייתכן שאירעה הפעלה חיסוניים נוספים מאת המשפיעים ומוחלף. מאז את האפקט הזה לא היה נוכח בעת זריקות נעשו ישירות לווריד הזנב, אנחנו יכולים להניח שזה היעד לא לצבוע אלא הליך החדרת הקטטר. אנחנו כאן הפגין את החשיבות של העכברים הטרנסגניים כתב המבטאים חלבונים פלורסנט לא להתערב בתהליכים ויוו במהלך ניסויים. יתר על כן, הזרקה וריד הזנב של המשדרים פלורסנט עשויה להיות אלטרנטיבה אפשרית זריקות צוואר קטטר.

    צעד קריטי של ההליך הוא החדרת AngII. הזנב הערכה השרוול של לחץ הדם יכולה להיעשות כדי לקבוע את היעילות של AngII משלוח באמצעות המשאבה. לחץ הדם צריך להגדיל לאחר 2−3 ימי אינפוזיה. כדי להגביל את דלקת יכולה להשפיע על הפעלת תאי LysM+ , סגירת החתך שבו המשאבה הוא מושתל צריכה להיעשות עם התפרים במקום קליפים. מגבלה אחת יש לציין לגבי הזרקת וריד הזנב: כדי להפוך את רכישת המידע האפשרי הטוב ביותר, 4 סרטונים נלקחים בדרך כלל עבור כל עורק הצוואר. אם האות פלורסנט יורדת, µL 50 acridine כתום מוזרקים אך עם הזרקת הזנב זה יותר קשה לבצע מספר זריקות וכדי לשמור לעורק הראש יציב תחת המטרה מיקרוסקופ. משך הזמן של הנוכחות של צנתר בווריד הצוואר אולי גם לווסת את ההפעלה תאים חיסוניים מאז. זה משפיע על הפעלת קרישה בפלסמה טסיות דם עשיר מוכן 4 שעות לאחר ההשתלה קטטר19. היבט זה של קטטר השרשה זקוק בהמשך החקירה.

    בסופו של דבר, גם אם אנחנו מעריכים את ההשפעה של קטטר צוואר השרשה על ההפעלה תא LysM+ לאחר AngII אינפוזיה, אנחנו לא יכול באופן מלא להעריך את התפקיד של הכנה, הסרת העור, בידוד העורק על פוטנציאל תא LysM+ הפעלה. אנו מסיקים כי השימוש של קרינה פלואורסצנטית כתב עכברים אוהבים LysMCre+IRG+ עכבר מומלץ כדי למנוע הפרעה של כלי תקינות במהלך הכנת בעלי חיים עבור הדמיה ויוו .

    Disclosures

    המחברים אין לחשוף

    Acknowledgements

    עבודה זו נתמכה על ידי משרד גרמני לחינוך ולמחקר (BMBF 01EO1003, BMBF 01EO1503).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Midazolam Ratiopharm GmbH Anesthesia mix
    Medetomidine Pfizer Deutschland GmbH Anesthesia mix
    Fentanyl Janssen-Cilag GmbH Anesthesia mix
    Alzane Zoetis Antisedan mix
    Flumazenil Hikma pharma Antisedan mix
    Braunol B Braun
    Octeniderm Schülke
    Osmotic pumps Alzet 1007D Osmotic pump implantation
    Angiotensin II Sigma-Aldrich Osmotic pump implantation
    7-0 prolene suture Ethicon Osmotic pump implantation
    Acridine orange Sigma-Aldrich
    Catheter Smiths Medical Deutschland GmbH Inside diameter, 0.28 mm; outer diameter, 0.61 mm
    Microscope Olympus BX51WI fluorescence microscope
    Beam Splitter Photometrics CMR-DV2-SYS - DualView2 MicroImager
    Objective Olympus UMPLFLN10X Water immersion objective with a monochromator
    Camera Hamamatsu Photonics ORCA-R2
    Image acquisition and analysis software Olympus Realtime Imaging System eXcellence RT
    Mice The Jackson Laboratory Jax 008705 B6.Cg-Tg(CAG-DsRed,-EGFP)5Gae/J
    Mice The Jackson Laboratory Jax 004781 LysM Cre (B6.129P2-Lyz2tm1(cre)Ifo/J )

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Lewington, S., et al. Age-specific relevance of usual blood pressure to vascular mortality: a meta-analysis of individual data for one million adults in 61 prospective studies. Lancet. 360, 1903-1913 (2002).
    2. Harrison, D. G. The mosaic theory revisited: common molecular mechanisms coordinating diverse organ and cellular events in hypertension. J Am Soc Hypertens. 7, 68-74 (2013).
    3. Guzik, T. J., et al. Role of the T cell in the genesis of angiotensin II induced hypertension and vascular dysfunction. J Exp Med. 204, 2449-2460 (2007).
    4. De Ciuceis, C., et al. Reduced vascular remodeling, endothelial dysfunction, and oxidative stress in resistance arteries of angiotensin II-infused macrophage colony-stimulating factor-deficient mice: evidence for a role in inflammation in angiotensin-induced vascular injury. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25, 2106-2113 (2005).
    5. Wenzel, P., et al. Lysozyme M-positive monocytes mediate angiotensin II-induced arterial hypertension and vascular dysfunction. Circulation. 124, 1370-1381 (2011).
    6. Kossmann, S., et al. Platelet-localized FXI promotes a vascular coagulation-inflammatory circuit in arterial hypertension. Sci Transl Med. 9, (2017).
    7. Rodriguez-Iturbe, B., Pons, H., Johnson, R. J. Role of the Immune System in Hypertension. Physiol Rev. 97, 1127-1164 (2017).
    8. Masedunskas, A., et al. Intravital microscopy: a practical guide on imaging intracellular structures in live animals. Bioarchitecture. 2, 143-157 (2012).
    9. Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. Intravital microscopy: a novel tool to study cell biology in living animals. Histochem Cell Biol. 133, 481-491 (2010).
    10. Wenzel, P., et al. Heme oxygenase-1 suppresses a pro-inflammatory phenotype in monocytes and determines endothelial function and arterial hypertension in mice and humans. Eur Heart J. 36, 3437-3446 (2015).
    11. Pawelski, H., Lang, D., Reuter, S. Interactions of monocytes and platelets: implication for life. Front Biosci (Schol Ed). 6, 75-91 (2014).
    12. Hinsbergh, V. W. Endothelium--role in regulation of coagulation and inflammation. Semin Immunopathol. 34, 93-106 (2012).
    13. Njock, M. S., et al. Endothelial cells suppress monocyte activation through secretion of extracellular vesicles containing antiinflammatory microRNAs. Blood. 125, 3202-3212 (2015).
    14. Colognato, R., et al. Differential expression and regulation of protease-activated receptors in human peripheral monocytes and monocyte-derived antigen-presenting cells. Blood. 102, 2645-2652 (2003).
    15. Schaffner, A., Rhyn, P., Schoedon, G., Schaer, D. J. Regulated expression of platelet factor 4 in human monocytes--role of PARs as a quantitatively important monocyte activation pathway. J Leukoc Biol. 78, 202-209 (2005).
    16. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
    17. Lu, H., et al. Subcutaneous Angiotensin II Infusion using Osmotic Pumps Induces Aortic Aneurysms in Mice. J Vis Exp. (2015).
    18. Koh, T. J., DiPietro, L. A. Inflammation and wound healing: the role of the macrophage. Expert Rev Mol Med. 13, e23 (2011).
    19. Dargaud, Y., et al. Proposal for standardized preanalytical and analytical conditions for measuring thrombin generation in hemophilia: communication from the SSC of the ISTH. J Thromb Haemost. (2017).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics