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活性酸素・過酸化水素とフラビン含有ミトコンドリア脱水素酵素による NADH 生産の同時測定

Biochemistry

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Summary

ミトコンドリアは、活性酸素種 (ROS) を生成することができますいくつかのフラビン依存型酵素を含まれています。ROS を監視ミトコンドリアの個々 のサイトからのリリースは不要な副反応のために挑戦です。簡単、安価な精製フラビン酵素とマイクロ プレート蛍光分析を使用して、ROS リリース ネイティブ料金を直接評価法を提案します。

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Mailloux, R. J., Young, A., O'Brien, M., Gill, R. M. Simultaneous Measurement of Superoxide/Hydrogen Peroxide and NADH Production by Flavin-containing Mitochondrial Dehydrogenases. J. Vis. Exp. (132), e56975, doi:10.3791/56975 (2018).

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Abstract

それは、ミトコンドリアが活性酸素種 (ROS) の最大 12 酵素源を含めることができます報告されています。これらのサイトの大半には、フラビン依存型呼吸鎖複合体と脱水素酵素活性酸素 (O2● -) と過酸化水素 (H2O2) の混合物を生成するがあります。ミトコンの個々 のサイトの ROS 産生能の定量の正確さは抗酸化防衛システムとO2● -/H2O2を形成するも副反応の存在のために困難なことができます。ミトコンドリアの生体エネルギーを乱すことができる非特異的阻害剤の使用は、生産の他のサイトから ROS のリリースを変更することにより測定を脅かされる可能性も。精製フラビン結合脱水素酵素によって H2O2リリースとニコチン酸アミドアデニンジヌクレオチド (NADH) 生産の同時測定のための簡単な方法を紹介します。我々 の目的はここで、例として精製されたピルビン酸脱水素酵素複合体 (PDHC) と α-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ複合体 (KGDHC) のブタ心臓起源を使いました。このメソッドはネイティブによって生産の個々 のサイトの H2O2解放率の正確な測定のため活性酸素と抗酸化システムの他の潜在的な原因を排除することによってできます。さらに、このメソッドは、H2O2リリースと酵素活性と有効性のスクリーニングと活性酸素産生の阻害の選択性の関係の直接比較のためことができます。全体的に、このアプローチを分離ミトコンドリアやグリセリン筋線維でのより高度な実験を行う前に個々 の酵素の ROS リリースのネイティブ速度の詳細な評価を許可できます。

Introduction

栄養代謝の究極の目標は、アデノシン三リン酸 (ATP) をすることです。哺乳類セルのこれはカーボンで ATP に蓄えられたエネルギーを変換する二重の機能を担った細胞小器官ミトコンドリアで発生します。ATP の生産が始まる炭素がミトコンドリア NADH およびフラビンアデニンジヌクレオチド (FADH2)1の 2 つの電子キャリアを形成によって燃焼させる。NADH および FADH2によって酸化されて複数のサブユニット呼吸鎖複合体 I および II、それぞれ、および解放された電子が複雑な IV1ターミナル電子アクセプター分子酸素 (O2) へフェリーで行きます。熱力学的に有利な「下り坂」電子の移動 O2チェーンの終わりには、intermembrane に陽子の輸出に結合複合体 I、III、および IV スペースします。これは、陽子 (プロトン動機力)、2ATP を作る複雑な V によってタップされてギブス自由エネルギーの一時的な形式の貫通型電気化学的勾配を作成します。ミトコンドリアの電子伝達反応は、ATP の生産に完全には結合されていません。クレブスと呼吸鎖の様々 なポイント、電子途中で O2 ROS3形態にやり取りできます。ミトコンドリアによって生成される最も生物学的に関連する活性酸素は O2● -と H2O2。O2● -ミトコンドリアによって形成された近位の ROS と考えは多くの場合、生産のサイトに対して、自由に関連付けられている O2● -と H2O2の混合物を形成することは明白であります。人工フラビンの根本的な化学グループ4,5です。高いレベルで ROS、危険、酸化遭難6細胞機能に必要な生体成分の損傷です。ただし、低額でミトコンドリア ROS は重要なシグナリングの機能を果たします。例えば、ミトコンドリアから放出される H2O2を制御する T 細胞の活性化、ストレス シグナル (例えば、Nrf2 シグナル伝達経路の誘導)、細胞増殖や分化の誘導に関与しています。インスリン シグナルしリリース、および動作7を供給します。活性酸素のシグナル伝達機能を理解する上でかなりの進歩をしました。ただし、重要な質問はまだ残っているに関してミトコンドリアの酵素として最も重要な源および生産を制御する方法。

いくつかの要因に依存する生産のサイトによって ROS リリース: 1) 濃度の電子の寄付サイト、2) 3) 酸素、および 4) 濃度へのアクセス、電子寄付サイトの酸化還元状態と酸化基板3,の種類8,9. NADH および膜の潜在的な強度の濃度も ROS 生産8,10に影響を与えるようなミトコンドリアの他の要因。たとえば、O2● -/H2O2生産精製 PDHC または KGDHC の率は増加 NADH 可用性5,11に増加します。このシナリオでは、PDHC または KGDHC、O2● -/H2O2生産12サイトの E3サブユニットの流行中心に NADH から電子が逆流です。同様に、NAD+の規定は KGDHC12から ROS リリースを減少、反対の効果を持ちます。したがって、活性酸素産生のサイトからの電子制御の出入りを変更できますどのくらい O2● -/H2O2が形成されます。例えば、PDHC の消費者物価指数-613、アナログ、ほぼ 90% 減少 O2● -/H2O2生産13リポ酸と KGDHC E2サブユニットをブロックします。化学 S glutathionylation 触媒、著者、ジスルフィラム、O2● -/H2O2 PDHC または KGDHC を介して生産の E にグルタチオン抱合をほぼ廃止で同様の結果が得られます2サブユニット14。PDHC の KGDHC E2サブユニットを介して電子の流れをブロックするためのトレードオフ (例えば、複合体 III) の電子輸送鎖によって ROS の生成を減少する NADH の生産の減少であります。これはまた電子輸送鎖によって ATP の出力を減らすことができます。全体的に、活性酸素産生のサイトに電子エントリをブロック O2● -/H2O2生産を制御する非常に効果的な手段をすることができます。

ミトコンドリアは、最大 12 潜在的な O2● -/H2O2ソース6を含めることができます。これらのサイトのほとんどは、フラビン含有 O2● -と H2O2の混合物を生成する酵素。呼吸鎖複合体とミトコンドリアの脱水素酵素機能大容量 O2● -/H2O2のサイトを形成する識別に対して異なる基質と阻害剤の組み合わせの使用を許可しました。異なったティッシュ3。PDHC と KGDHC は、筋肉と肝臓のミトコンドリア13,15発光サイト大容量O2● -/H2O2として示されています。ただし、いくつかの困難のまま O2● -/H2O2異なる基質と阻害剤の組み合わせは、ミトコンドリアと影響の個々 のサイトの潜在的な形成の検討に関して酵素の活動。これは、望ましくない副反応 (例えばO2● -/H2O2興味の酵素以外のサイトでの形成) の存在のために汚染内因性栄養素 (例えば脂肪酸酸) または細胞内小器官 (例えば、ペルオキシソームO2● -/H2O2を形作る)、選択性を欠いている阻害剤の使用や活性酸素産生を完全に抑制しない化合物の使用。特定の阻害剤ミトコンドリアバイオエナジェティックスと電子流れの方向を変更することも、これは生産の他のサイトから ROS リリースを変更し、結果を混同します。O2/H2O2リリース ミトコンドリアの個々 のサイトからのための絶対速度 O2● -と H2O2の高濃度のため定量化することは困難です。行列と intermembrane スペースで酵素を除去します。したがって、O2● -/H2O2リリース測定を妨害することができます任意の競合反応の除去することができます大容量 O2● -/H2O2 を識別します。サイトを形成します。

脱水素酵素フラビン依存型精製によって O2● -/H2O2生産と NADH 形成の同時受験可能にする簡単な方法を紹介します。精製された酵素を使用してに、原産 O2● -/H2O2生産率である個々 のフラビン酵素のためのより正確な測定を可能にすると、不要な ROS 形成側の反応と活性酸素分解酵素を除去ことができます。このメソッドを使用して直接比較、O2● -/H2O2 O2● -/H2O の異なる精製脱水素酵素または画面潜在的な部位特異的阻害剤の容量を形成できます。2リリース。最後に、O2● -/H2O2と NADH 生産を同時に測定、酵素と活性酸素放出能の関係のリアルタイム評価できます。

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Protocol

1. 化学薬品および精製された酵素

  1. 下記材料を調達: PDHC とブタ心臓起源 (または別の精製されたミトコンドリア フラビン); KGDHCH2O2 (30% 溶液)、ピルビン酸、α-ケトグルタル酸は、+NAD、NADH、CoASH、チアミンピロリン酸 (TPP)、マンニトール、HEPES、ショ糖、グリコールエーテルジアミン四酢酸、3-メチル-2-オキソ吉草酸 (KMV)、スーパーオキシドジスムターゼ (SOD)、西洋ワサビペルオキシダーゼ (HRP)10-アセチル-3, 7-dihydroxyphenoxazine 試薬 (AUR) と消費者物価指数-613。

2. アッセイ試薬等の計画

  1. 96 ウェル プレートに表 1に従って分析を設定します。
    注: 各反応の総体積は 200 μ L ストック濃度が調整試薬の 20 μ L を追加できるような各ウェルに。これにより、補因子と基板も分析を開始する前にそれぞれの反応を迅速に追加。
  2. 220 mM マンニトール、70 mM ショ糖、グリコールエーテルジアミン四酢酸、1 mM と 20 mM HEPES (塩酸で pH 7.4) を含む反応バッファーを準備します。
    注: これは異なる精製酵素の物性に応じて変更できます。
  3. Coomassie 染色5または酵素活性アッセイ14,16,17に用いた汚染またはイムノブロットによって浄化された KGDHC または PDHC を確認します。
  4. すべて試薬作業液濃度が1 に従って反応バッファーを準備します。
  5. -20 ° C で 1 mL 因数としてすべての試薬を格納します。ストア ピルビン酸、α-ケトグルタル酸自動酸化と繰り返し凍結融解による自然劣化を防ぐために 100 μ L の因数で-80 ° c。
  6. AUR 試薬 1 ml の DMSO のマスターの在庫を準備し、反応バッファー 100 μ M に希釈しています。光から保護されたストア。
    注: ここでは、100 μ M の作業ソリューションは、すべて 2 〜 3 週間で作った新鮮な光から保護します。

3. 分析テンプレートを設定します。

  1. デュアル測定機能単色マイクロ プレート リーダーの試金プロシージャを設定します。
  2. 読み取り手順を定義するには、「プロトコル」を選択します。「プロシージャ」をクリックします。
  3. 25 の ° C (図 1 a) に「温度」を設定。
  4. (図 1 a) 読み取り条件を設定する「運動を開始」をクリックします。時間と読み取り間隔/実験の数を設定します。
  5. クリックして「読み取り」(図 1 b)。
    注: サンプルは、トップの位置からリード 50 のゲインを持つ。時間: 5 分 30 の間隔で読みます。チャネル 1: ら蛍光の励起/蛍光 = 565 nm:600 nm、波長幅 13.5 nm。チャネル 2: NADH 蛍光の励起/蛍光 = 376 nm:450 nm、波長幅 20 nm。
  6. 「読み取り」、[モニター (例えば、A1 A4、B1 B4) に井戸を選択します。
  7. 「キネティック ・ エンド」を選択します。

4. 標準曲線

  1. 試薬を解凍し、必要になるまで氷の上を格納します。
  2. NADH 標準曲線 (図 2 a)
    1. NADH の反応バッファーに 0.5 ~ 10 mM の濃度範囲で作業ソリューションを準備します。
    2. 井戸 180 μ L 反応バッファーを含む溶液濃度を作業ごとの NADH から 20 μ 因数を追加します。それぞれ NADH の最終濃度じゃ 0.05 1 mM。
    3. 「読む」をクリックし、、励起/蛍光を設定 = 376 nm:450 nm、波長幅 20 nm。
      注: これは読み取り専用エンドポイント - 速度論的パラメーターは必要ではありません。
  3. AUR 標準曲線 (図 2 b)
    1. 反応バッファーにおける過酸化水素の株式を働いているを準備します。ストック濃度 200 4,000 nM の範囲です。
    2. 120 μ L の反応液を各ウェルに追加します。
    3. HRP の 20 μ L を追加 (ストック濃度を作業 = 30 U/mL、井戸に最終濃度 = 3 U/mL) 20、SOD の μ L (ストック濃度を作業 = 250 U/mL、井戸に最終濃度 = 25 U/mL) と AUR の 20 μ L (ストック濃度を作業 = 100 μ M、井戸に最終濃度 = 10 μ M) も含む各反応バッファーにします。
    4. 作業もバッファーとアッセイ試薬を含む各在庫ソリューション各 H2O2の 20 μ L を追加します。最終反応量が 200 μ L と H2O2各ウェル内の最終濃度は 20-400 nM。
    5. 25 ° C でプレート リーダーで 1 分版を孵化させなさい
    6. 「読む」をクリックし、、励起/蛍光を設定 = 565 nm/600 nm、波長幅 13.5 nm。これはエンドポイントは読み取り専用であることに注意してください - 速度論的パラメーターは必要ではありません。

5. O2● - /H2 O2リリースと KGDHC と PDHC NADH 生産の測定

  1. それぞれに追加して各作業ソリューションとボリュームの濃度別の試薬の付加の順序表 1を参照してくださいも。
  2. 各ウェルに 40 μ L の反応バッファーを追加します。KMV または CPI 613 を使用して試金、各ウェルにバッファーの 20 μ L を追加します。
  3. PDHC または KGDHC の 20 μ L を追加 (1 U/mL、ウェルあたり最終濃度の在庫 = 0.1 U/mL) 各ウェルに。
  4. 2 分の 25 ° C で PDHC と KGDHC を孵化させなさい。
  5. KMV の 20 μ L を追加 (在庫 = 100 mM、最終濃度 = 10 mM) または 20 μ L の消費者物価指数-613 (ストック濃度を作業 = 1.5 mM、最終濃度 150 μ M を =) (表 2)。
    注: 試金のための阻害剤が使用されていない場合は、このステップを除外できます。
  6. 25 ° C で 1 分間インキュベートします。
    注: 試金のための阻害剤が使用されていない場合は、このステップを除外できます。
  7. HRP の 20 μ L を追加 (ストック濃度を作業 = 30 台/mL、井戸に最終濃度 = 3 ユニット/mL) と SOD の 20 μ L (ストック濃度を作業 = 250 単位/mL、井戸に最終濃度 = 25 単位/mL) 各ウェルに。
  8. コエンザイム A の 20 μ L を追加 (ストック濃度を作業 = 最終濃度 1 mM = 0.1 mM)、20 TPP の μ L (ストック濃度を作業 = 3 mM、最終濃度 = 0.3 mM)、および NAD+の 20 μ L (ストック濃度を作業 = 10 mM、最終濃度 = 1 mM) 各 wエル。
  9. AUR 試薬を保護のアルミ箔カバーから外し、各ウェルに 20 μ L を追加します。
  10. ピルビン酸の 20 μ L を追加 (ストック濃度 1 〜 100 ミリメートル、試金のための最終的な集中に至る作業 = 0.1 ~ 10 mM) PDHC と α-ケトグルタル酸を含む井戸 (ストック濃度 1 〜 100 ミリメートル、試金のための最終的な集中に至る作業 = 0.1 ~ 10 mM) に井戸は、KGDHC を含みます。
  11. 「読む」運動の測定を開始するをクリックします。

6. データの分析

  1. キーボードの「CTRL」ボタンを押し、チャンネル 1 (図 3 a) に対応するすべての速度論的測定値を含む 1 つグラフを生成する井戸をクリックします。
  2. (図 3 b) 異なる時点で測定される相対的な蛍光ユニット (RFU) の生の値の右上隅で表示アイコンに「データ」をクリックします。
  3. 分析 (表 3) の値をエクスポートします。
  4. 2 蛍光チャネルに関連付けられた RFU の値にアクセスする「グラフ」ドロップ ダウン メニューの右上 (図 3 b) をクリックします。
  5. チャネル 2 の 6.1 に 6.3 の手順を繰り返します。

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Representative Results

図 3 aは、H2O2と NADH 生産の同時測定の間に精製された KGDHC によって収集された RFU の代表的なトレースを提供します。RFU のデータ各時間間隔は、図 3Bで描かれています。RFU の生データは、分析のため、エクスポートされます。図 2に示した標準曲線から外挿により 5 分間測定間隔ごとに形成された NADH と H の2O2の絶対量を決定できます。この計算の例は、表 3に提供されます。NADH と H2O2の量によって形成される KGDHC または異なる間隔で PDHC が決定されている、値をコピーし、さらに分析のグラフ ・統計ソフトウェアに入力します。XY グラフ ・ タイプの解析を使用して、NADH (µmol) および H2O2 (pmol) KGDHC または PDHC によって形成される量は (図 4 a) の時間の関数としてプロットできます。これらの値を使用して、基板の酸化中に NADH と H2O2形成率も計算できます。図 4 bに示すように、KGDHC と PDHC NADH と H2O2形成能力の面で異なる特性が表示されます。

一度、それは、KGDHC と PDHC が酵素によって実行中と NADH と H2O2形成を同時に追跡することができます、ROS リリース プロパティおよび酵素活性を測定することができます確立されています。基本構造は高い相同性、ROS 生産5大容量サイトに記載されているので、KGDHC と PDHC を比較しました。図 5図 6 NADH と H2O2生産基質の濃度依存性を示します。PDHC は簡単に最大 0.1 0.5 で NADH と H2O2の生産率と基板の低量で飽和 mM ピルビン酸。KGDHC、その一方で、増加する (図 5) の α-ケトグルタル酸と NADH と H2O2生産の増加が表示されます。これは、KGDHC と PDHC が基本的な構造で高い相同性がある最大の ROS のリリースを誘発するどのくらいの基板が必要ですの面で異なる運動特性を示します。図 5も KGDHC から H2O2リリースに NADH の生産と基板の可用性と強く関連付けられているを示します。他の PDHC 同じ速度論的特性はありません。KGDHC と PDHC も NADH と O2● -/H2O2 NAD+濃度が変化するときに容量を形成 (図 6) の面で異なります。

NADH と H2O2の同時測定を利用すること、によって潜在的な活性酸素産生部位特異的阻害剤を検査します。これは H2O2リリースの最大の抑制を誘導するために必要な阻害剤の量を決定することができます。また、同時に NADH の生産を測定することにより阻害剤アクションとして ROS のソース サイトを識別できます。以前の研究では、α-ケトグルタル酸アナログ、KMV が KGDHC (≥ 90% 抑制)13,15から活性酸素放出を抑制することで非常に効果的なことを示しています。消費者物価指数-613、ジヒドロリポアミド PDHC の KGDHC、E2サブユニットをブロックするリポ酸アナログの ROS によっていずれかのコンプレックスからリリースを抑制することがもまた示した ~ 9013,14。KMV の CPI 613 アクションのサイトは図 7のとおりです。分子を含む硫黄であり、したがって勧め消費者物価指数-613 そのチオールの豊富な還元剤 (ジチオトレイトール;DTT) または蛋白質 (アルブミン) は手順13から省略されます。図 7は、KMV と消費者物価指数-613 が NADH と H2O2 KGDHC を制限することで高効率の両方を示しています。同様に、消費者物価指数-613 は PDHC (図 7) から H2O2リリースを完全に廃止しました。総称して、これらの結果示す KMV と消費者物価指数-613 H2O2リリースの非常に効果的な阻害剤し、こうして分離ミトコンドリアと実験に適用できます。有効性の直接評価と精製フラビン含有脱水素酵素阻害剤が異なる選択性なために、このような画面は他の潜在的な ROS 形成酵素にとって非常に有益でしょう。NADH の同時測定はまた複雑な酵素内 ROS の潜在的なソースの予備的な識別を行えるという利点を持っています。図 7は、PDHC と高い相同性である KGDHC、触媒機構の描写を提供します。E1および KGDHC の E2サブユニットをブロック、KMV と消費者物価指数-613, ほぼ完全に廃止された H2O2と NADH 生産観察確認、E3サブユニット、可能性の高い流行は ROS ソース18. 消費者物価指数-613 PDHC H2O2リリースの原則サイト E3サブユニット18であることを確認するのに同様の効果を発揮します。同様のアプローチは、他の脱水素酵素に使用できます。これは酵素の複合体のさまざまな部分を介して電子の流れを妨げる阻害剤の同定が必要です。

Figure 1
図 1: アッセイのセットアップのための代表的なスクリーン ショットします。(A) らと NADH 蛍光変化の速度論的測定をセットアップ手順の描写です。(B) パラメーターの設定、蛍光アッセイのため。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: らと NADH 蛍光の代表的な標準曲線。曲線は、NADH および O2● -/H2O2の生産の率を推定する使用されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3: RFU の生データの代表的なトレースは分析中に収集します。(A) アッセイ中に読み取られた各ウェルの曲線。CTL ボタン押しと読み取られる各ウェルをクリックすると、カーブをプレート表示が生成されます。(B) 代表の RFU 値を含むテーブルを生成するビューの下データ エクスポート用データをクリックします。Raw の結果をエクスポートするのにはスプレッドシート エクスポート ボタンをクリックしています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 4
図 4: H2の直接の比較O2KGDHC と PDHC の NADH 形成率 (A) H2O2と KGDHC と PDHC の潜在的な形成 NADH の同時測定。(B) H2O2と KGDHC と PDHC による NADH の生成の速度の計算。両方のフラビン含有酵素によって NADH および ROS の生産の直接の比較は、KGDHC がその高い酵素の容量に関連しているより多くの H2O2を生成することを示します。n = 4、± SEM. を意味この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 5
図 5:H の同時測定2O2や NADH が異なる基質濃度の酸化率 KGDHC と PDHC を形成します。蛍光の変化は、最終的な基質濃度は 0 mM から 10 mM まで変化させた場合を除き、前述のように測定しました。このアプローチは、H2O2発売開始 KGDHC と PDHC の動力学的特性の依存性を確認するために使用されました。n = 4、± SEM. を意味この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 6
図 6: KGDHC と PDHC 表示異なる H2 O2や成形性 NADH と NAD+のレベルが変更されます。NAD+の最終濃度が 1 mm から 0 mM 変化を除いて、前に説明した蛍光の変化を測定しました。このアプローチは、H2O2発売開始 KGDHC と PDHC の動力学的特性の依存性を確認するために使用されました。n = 4、± SEM. を意味この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 7
図 7: NADH と H2異なる部位特異的阻害剤のスクリーニングO2生産。(A) 図は、KGDHC および KMV の CPI 613 アクションのサイトの触媒サイクルを描いたします。KMV ピルビン酸の結合部位と競合しないことを除いて PDHC が相同触媒サイクルを持っていることに注意してください。E1: ピルビン酸、α-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ、E2: ジヒドロリポアミド コレステロールアシルトランスフェラーゼ、E3: ジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼ。 (B) KMV 効果と KGDHC と PDHC NADH と H2O2生産に消費者物価指数-613。サンプルされた KMV (10 mM) または CPI 613 エレクトロポレーション (150 μ M) と NADH と H2O2生産のため、試金されます。n = 4、± SEM. を意味この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

試薬 ワーキング ストック濃度 ボリュームも追加 よく最終濃度
KGDHC または PDHC 1 単位/ml 20 Μ L 0.1 単位/ml
スーパーオキシドジスムターゼ 250 単位/ml 20 Μ L 25 台/mL
西洋わさびペルオキシダーゼ 30 台/mL 20 Μ L 3 単位/ml
チアミンピロリン酸 3 mM 20 Μ L 0.3 mM
コエンザイム A 1 mM 20 Μ L 0.1 mM
NAD+ 10 mM 20 Μ L 1 mM
10-アセチル-3, 7-dihydroxyphenoxazine 100 Μ M 20 Μ L 10 Μ M
基板 1 〜 100 ミリメートル 20 Μ L 0.1-10 mM

表 1:基本的なプロトコルの例の O の測定用セットアップ2 - /H2O2と NADH 生産精製の PDH または KGDH です。各試薬の 20 μ L を追加各ウェルし最終的なボリューム/反応は 200 μ L、各試薬の最終濃度はストック濃度 10 倍未満 (例えば、反応混合物に NAD+の最終濃度が 1 mM).表に示した順序で井戸の中に試薬を追加必要があることに注意してください。

阻害剤 ターゲット
3-メチル-2-オキソ吉草酸 KGDHC の E1 サブユニット
消費者物価指数-613 E2 オキソ酸脱水素酵素のサブユニット

表 2: 阻害剤とそのターゲットの一覧。アクションのサイトも、図 8に示されています。

NADH 蛍光
PDHC KGDHC
時間 T ° 376,450 A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8
0: 00時 04分 24.4 99 99 91 88 85 82 58 88
0: 00時 34分 24.4 128 107 99 108 81 80 77 78
0:1:04 24.4 124 128 117 139 97 88 97 76
0:1:34 24.4 146 142 129 132 91 97 84 78
0:2:04 24.4 161 153 148 146 90 107 95 88
0:2:34 24.4 171 160 156 145 97 103 111 122
0:3:04 24.4 176 176 161 169 109 120 99 116
0:3:34 24.4 186 180 179 167 118 123 121 119
0:4:04 24.4 201 182 187 183 127 124 119 131
0:4:34 24.4 225 190 195 186 136 143 124 132
0:5:04 24.4 227 227 203 197 115 143 121 143
ら蛍光
PDHC KGDHC
時間 T ° 565,600 A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8
0: 00時 00分 24.4 204 178 169 152 148 113 107 90
0: 00時 30分 24.4 224 188 167 152 144 116 124 112
0:1:00 24.4 212 186 178 161 153 114 122 120
0:1:30 24.4 212 188 165 164 160 132 127 116
0:2:00 24.4 222 203 190 169 154 128 133 127
0:2:30 24.4 217 198 193 179 165 129 147 130
0:3:00 24.4 223 218 202 179 183 142 145 137
0:3:30 24.4 239 223 208 188 179 150 155 148
0:4:00 24.4 236 219 202 183 180 163 156 153
0:4:30 24.4 249 220 214 177 199 149 150 167
0:5:00 24.4 251 232 225 196 211 170 169 161

テーブル 3: 実験のセットから収集された結果のスプレッドシート表示します。実験から生成された生の RFU の値は、さらに分析用にスプレッドシートにエクスポートされます。実験の前に生成された標準的なカーブを使用して、スプレッドシートで NADH と H2O2生産率を計算できます。

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Discussion

このプロトコルは有利なので、1) 2 H2O2検出など、抗酸化システム (ROS の他の情報源)、妨げる可能性がありますそうでなければ任意の競合反応を排除) のネイティブ速度の直接評価ROS をフラビン含有ミトコンドリア脱水素酵素、3 によって解放) ネイティブを比較できます ROS リリース 2 つの率またはより精製脱フラビン ベース、4) ROS のリリースと酵素の活性や 5 の率の直接比較が可能)ROS リリースの競争阻害薬のスクリーニングができます。当社グループは、他のユーザーは、以前の出版物で、アロステリックによって ROS の規制を検討する、このメソッドを使用しているし、酸化還元を実施する前にシグナルがミトコンドリアやグリセリン筋14,16、実験 17,19,20

変更とトラブルシューティング:

この手順では、基本的な機材を使用して、ほぼすべての教育機関で。アプローチも低コストで、さまざまなサプライヤーを通じて利用可能な一般的な化学薬品を使用します。グリコールエーテルジアミン四酢酸、マンニトール、HEPES ショ糖から成る基本的な反応バッファーがよくほとんどのアプリケーションで動作することがわかったが、バッファー組成は酵素の性質 - によって異なります。ら蛍光の生の値は、通常約 0.1 U/mL に希釈して酵素を解放 ROS の 50-500 RFU。高い RFU 値 AUR 試薬は、光や繰り返し凍結融解への暴露による自動酸化されている可能性があります。したがって、(使用頻度) によってすべての 2 〜 3 週間に日常的に AUR 作業ソリューションに置き換える必要があります。変性、酵素製剤中の不純物は、通常の ROS と NADH の測定値よりも低い可能性があります。ゲルの電気泳動によって日常的に酵素の純度監視してください。動力学的性質 (Km と Vmax 用基板と NAD+) する必要があります購入または酵素の精製後すぐに評価し、その後定期的に監視します。分析に用いられる試薬のほとんどは安定した、複数の凍結融解を受けることができます。ピルビン酸、α-ケトグルタル酸は、-80 ° c 自動酸化を避けるために 100 μ L の因数で格納する必要があります。O2● -/H2O2直接 PDHC と KGDHC (および可能性のある他のフラビン酵素) におけるラジカル生成17となるので、DTT のような還元剤を使用しないでください。37 ° C でアッセイを行うことができます。しかし、私たちのグループは、25 ° C でこれらの実験を行うことがより一貫性のあるデータを提供するために理想的であるを発見しました。

技術の制限:

この手法に関連付けられている 1 つの大きなハードルは、フラビン含有ミトコンドリアの酵素の精製へのアクセスです。ここでは、直接フラビン含有ミトコンドリア脱水素酵素の ROS リリース容量と酵素活性を比較するこの手法が使えることを実証する、市販の KGDHC と PDHC を使いました。しかし、ほとんどロス フラビン含有酵素の生産は市販されていないと研究室で精製する必要があります。これに挑戦することができますこれらの酵素の一部が膜を考慮したバインドまたはミトコンドリアの内膜に吸収します。ROS を生成する膜結合型フラビン含有酵素の正常な浄化のための新しいプロトコルが利用されます。複雑な浄化方法は、私、複合体 II およびsn-グリセロール-3-リン酸脱水素酵素21,22,23。したがって、にもかかわらず、ほとんどの上場の ROS ジェネレーターは市販できない場合があります、彼らの分離そして浄化のためのプロトコルが存在します。精製のフラビン ベースの酵素を使用して収集した結果の生理学的な関連性も制限です。したがって、精製酵素で収集された結果を分離ミトコンドリアやグリセリンのティッシュを使用してアッセイを追った。5 つの別々 の研究では、このアプローチを使用 KGDHC と PDHC14,16,17,19,20ROS リリースの調節のメカニズムを調査します。予備酸化還元 ROS のリリースを制御するスイッチの役割の結果最初精製 KGDHC と PDHC を使用してテストされ、[制御機構はさらに肝臓と心臓のミトコンドリアと筋線維14、分析しました。 16,17,20

既存のメソッドの意義:

ROS を測定ミトコンドリアで生産の個々 のサイトからのリリースはまたシステムを作り出す O2● -/H2O2と抗酸化につながる可能性がありますそれ以外の場合競合の副反応の有無のために挑戦することができます。ネイティブ率の過小評価。膜電位は、様々 なサイトから ROS 解放率を変更することも、阻害剤の使用は電子の流れ、O2● -/H2O2形成測定を交絡を変更できます。ここで紹介した方法では、同時にネイティブ率 O2/H2O2と酵素活性の関係を査定しながら個々 の酵素活性酸素放出能の直接評価をことができます。この安価な方法は、ミトコンドリア、細胞、または組織をより高度な実験を行う前に個々 のフラビン含有ミトコンドリア酵素のネイティブの ROS の解放率を比較するためのツールとして使用できます。さらに、あらかじめ画面の有効性と分離ミトコンドリアでアッセイを行う前に ROS リリースの阻害の選択性に記載方法を利用できます。

将来のアプリケーション:

ここに記載した方法は、PDHC と KGDHC14,16,17,19,20から ROS リリース制御の調査を目的とした 5 つの別々 の研究で使用されています。これらの研究の阻害剤が上映された ROS を解放し、NADH の生産率は、精製された酵素を用いて評価しました。酵素の精製を収集した結果、確認され分離ミトコンドリアを使用して、筋線維14,16,17,20グリセリン。したがって、このメソッドは、多くのミトコンドリアや細胞、筋線維からネイティブの ROS 解放率の勉強を目的とした将来の研究に適用できます。

プロトコルで重要な手順:

酵素の純度とその動力学的性質を日常的に監視する必要があります。AUR 株式試薬の作業も頻繁に交換する必要があります。これは、収集された結果が一貫して保証されます。試薬の添加順序は、実験が成功 (表 1) を実行するため重要です。阻害剤は、ROS リリースの最大抑制を引き出すために必要な濃度を決定するのに滴定する必要があります。本研究で我々 は 10 ミリメートル KMV を選んだと 150 μ M 消費者物価指数-613 我々 いたこれらの濃度が KGDHC と PDHC13によって ROS リリースの最大の抑制を誘発すると判断されたので。

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Disclosures

開示するものがあります。

Acknowledgments

この作品は、自然な科学および工学研究審議会のカナダ (レベル) によって賄われていた。ビデオ制作は、教育と学習 (CITL) ニューファウンドランドの記念大学のイノベーション センターと共同で実施されました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pyruvate dehydrogenase complex SIGMA P7032-10UN purified flavoenzyme
alpha-ketoglutarate dehydrogenase complex SIGMA K1502-20UN purified flavoenzyme
30% hydrogen peroxide solution SIGMA HX0640-5 reagent, standard curves
NAD+ SIGMA N0632-1G reagent, activity/ROS release assay
NADH SIGMA N4505-100MG reagent, standard curves
pyruvate SIGMA P2256-5G reagent, activity/ROS release assay
alpha-ketoglutarate SIGMA 75892-25G reagent, activity/ROS release assay
CoASH SIGMA C3019-25MG reagent, activity/ROS release assay
thiamine pyrophosphate SIGMA C8754-1G reagent, activity/ROS release assay
mannitol SIGMA M4125-100G buffer component
Hepes SIGMA H3375-25G buffer component
sucrose SIGMA S7903-250G buffer component
EGTA SIGMA E3889-10G buffer component
KMV SIGMA 198978-5G reagent, ROS release inhibitor
CPI-613 Santa Cruz sc-482709 reagent, ROS release inhibitor
SOD SIGMA S9697-15KU reagent, ROS release detection
horseradish peroxidase SIGMA P8375-1KU reagent, ROS release detection
Amplex Ultra Red Thermofisher A36006 reagent, ROS release detection
Biotech Synergy 2 microplate reader BioTek Instruments microplate reader for assays
Gen5 software BioTek Instruments software, used for collection of raw RFU
Graphpad Prism Graphpad software software, data analysis
Microsoft EXCEL Microsoft software, data analysis

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