पूर्व वीवो मानव लसीकावत् ऊतक और मादा जननांग म्यूकोसा के मानव इम्यूनो वायरस 1 और Histoculture के साथ संक्रमण

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Immunology and Infection

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Summary

मानव इम्यूनो वायरस (एचआईवी) के साथ मानव ऊतकों के संक्रमण पूर्व vivo वायरस रोगजनन का एक मूल्यवान 3d मॉडल प्रदान करता है । यहां, हम प्रक्रिया के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन और मानव tonsils और एचआईवी के साथ मादा जननांग म्यूकोसा से ऊतक नमूनों को संक्रमित-1 और उंहें संस्कृति में बनाए रखने के तरल हवा अंतरफलक पर ।

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Introini, A., Vanpouille, C., Fitzgerald, W., Broliden, K., Margolis, L. Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture. J. Vis. Exp. (140), e57013, doi:10.3791/57013 (2018).

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Abstract

Histocultures मानव ऊतकों के भीतर परस्पर संपर्क का अध्ययन करने की अनुमति है, और वे मॉडल मेजबान को नियोजित किया जा सकता है नियंत्रित प्रयोगशाला शर्तों के तहत रोगज़नक़ बातचीत । मानव इम्यूनो वायरस के साथ मानव ऊतकों के पूर्व vivo संक्रमण (एचआईवी), अन्य वायरस के बीच, सफलतापूर्वक प्रारंभिक रोग रोगजनन की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, साथ ही एंटीवायरल दवाओं की प्रभावकारिता और विषाक्तता का परीक्षण करने के लिए एक मंच. वर्तमान प्रोटोकॉल में, हम कैसे प्रक्रिया और एचआईवी के साथ संक्रमित-1 मानव tonsils और गर्भाशय की श्लेष्मा झिल्ली से explants ऊतक, और उंहें के बारे में दो सप्ताह के लिए तरल हवा अंतरफलक पर जिलेटिन स्पंज के शीर्ष पर संस्कृति में बनाए रखने की व्याख्या । यह गैर-ध्रुवीकरण संस्कृति की स्थापना संस्कृति मध्यम और ऑक्सीजन में पोषक तत्वों तक पहुंच को अधिकतम, हालांकि ऊतक अखंडता और कार्यात्मक वास्तुकला के प्रगतिशील नुकसान इसकी मुख्य सीमा बनी हुई है । इस विधि एचआईवी-1 प्रतिकृति और immunoassays, qPCR, और प्रवाह cytometry सहित कई तकनीकों, का उपयोग कर रोगजनन की निगरानी की अनुमति देता है । महत्व के, ऊतक दाताओं के बीच शारीरिक परिवर्तनशीलता, के रूप में अच्छी तरह के रूप में एक ही नमूना के विभिंन क्षेत्रों से explants के बीच, काफी प्रयोगात्मक परिणामों को प्रभावित कर सकते हैं । परिणाम reproducibility सुनिश्चित करने के लिए, यह explants की एक पर्याप्त संख्या का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है, तकनीकी प्रतिकृति, और दाता-मिलान नियंत्रण शर्तों प्रयोगात्मक उपचार के परिणामों को सामान्य करने के लिए जब कई प्रयोगों से डेटा संकलन (यानी ., विभिंन दाताओं से ऊतक का उपयोग कर आयोजित) सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए ।

Introduction

Monotypic द्वि-आयामी सेल संस्कृतियों, यहां पारंपरिक रूप में संदर्भित, कोशिका प्रकार की बड़ी विविधता है कि ऊतकों और अंगों की रचना के बीच स्थानिक और कार्यात्मक संचार के लिए खाते में नहीं है । इस पहलू रोग के प्रयोगात्मक मॉडल के लिए सर्वोपरि महत्व का है, समस्थिति सेलुलर बातचीत के साथ हस्तक्षेप के रूप में सभी विकृतियों के ड्राइविंग कारक है । ऊतक explants मानव में मॉडलिंग स्वास्थ्य और रोग के लिए प्रमुख लाभ प्रदान करते हैं क्योंकि वे cytoarchitecture और अंगों के कई महत्वपूर्ण कार्यात्मक पहलुओं को बनाए रखने के रूप में वे vivo मेंहैं, हालांकि समय की एक सीमित राशि के लिए1. उदाहरण के लिए, जैसे डिप्थीरिया टोक्शहॉइड या टिटनेस टोक्शहॉइड के रूप में याद प्रतिजनों के साथ पूर्व vivo चैलेंज पर, tonsillar ऊतक प्रतिजन-विशिष्ट एंटीबॉडी2का एक जोरदार उत्पादन के साथ प्रतिक्रिया करता है । किसी भी अंय पूर्व vivo मॉडल की तरह, histoculture अपनी सीमाओं: अंतर दाता परिवर्तनशीलता, ऊतक ध्रुवीकरण, सीमित ऊतक अस्तित्व, और फोकल माइक्रोस्कोपी1की गहराई से परे कोशिकाओं की निगरानी में कठिनाई है । फिर भी, मानव ऊतक explants की पसंद का एक मॉडल रहने के लिए समस्थिति और मानव में रोगजनक प्रतिरक्षा प्रक्रियाओं का अध्ययन, सहित मेजबान-रोगज़नक़ बातचीत और संभावित चिकित्सकीय हस्तक्षेप3

एचआईवी-1 रोगजनन की महत्वपूर्ण घटनाओं के ऊतकों में जगह ले । सभी एचआईवी के बहुमत के लिए जननांग म्यूकोसा खातों के संक्रमण-1 दुनिया भर में संचरण की घटनाओं4. लसीकावत् ऊतक तीव्र संक्रमण के दौरान वायरस प्रतिकृति के प्रमुख स्थल है और अव्यक्त-संक्रमित5कोशिकाओं का एक महत्वपूर्ण पूल बंदरगाह, और उनके हठ मुख्य बाधा एक इलाज6को प्राप्त करने के लिए प्रतिनिधित्व करता है । संस्कृति और मानव लसीकावत् और श्लैष्मिक के ऊतकों के पूर्व vivo चैलेंज एचआईवी के अध्ययन के लिए अलग कोशिकाओं के आधार पर पारंपरिक प्रणालियों पर कुछ लाभ-1 प्रदान करते हैं । उदाहरण के लिए, ऊतक निवासी कोशिकाओं exogenous सक्रियण के अभाव में एचआईवी-1 संक्रमण का समर्थन कर सकते हैं, के रूप में परिधीय रक्त mononuclear कोशिकाओं1का विरोध किया । लसीकावत् ऊतक explants के उपयोग के कुछ प्रमुख CD4 टी सेल कमी, यानीअंतर्निहित तंत्र की एक बेहतर समझ की अनुमति दी है, गैरा प्रभाव7, जो तीव्र संक्रमण की पहचान है । लसीकावत् ऊतक में बी कोशिका कूप की तरह संरचनाओं के संरक्षण8 और मादा जननांग म्यूकोसा explants9 में उपकला इन साइटों पर एचआईवी-1 संक्रमण के स्थानिक और कार्यात्मक सुविधाओं को एकीकृत करने के लिए अद्वितीय अवसर प्रदान करता है. अंत में, histocultures सफलतापूर्वक मॉडल और अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया एचआईवी-1 और herpesvirus सह संक्रमण10,11, के रूप में अच्छी तरह के रूप में antiretrovirals और multitarget माइक्रोबाइसाइडों12के पूर्व नैदानिक परीक्षण के लिए, 13 , 14 , 15.

यहां, हम मानव ऊतक explants की संस्कृति के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन कम मादा जननांग पथ (गर्भाशय ग्रीवा) से tonsils और श्लैष्मिक ऊतक से प्राप्त की, एक गैर में explant चुनौती के लिए ऊतक विच्छेदन-1 से कवर-एक तरह से ध्रुवीकरण । तरल हवा अंतरफलक पर ऊतक explants की संस्कृति, एक समर्थन के रूप में जिलेटिन स्पंज का उपयोग, वायु ऑक्सीजन के लिए जोखिम को अधिकतम जबकि स्पंज केशिकाओं के माध्यम से संस्कृति मध्यम पोषक तत्वों तक पहुंच प्रदान करने, इस प्रकार उनके प्राकृतिक क्षय में देरी । हमारे सिस्टम में एचआईवी-1 प्रतिकृति के मूल्यांकन का सबसे तत्काल तरीका immunoassay या qPCR द्वारा समय के साथ explant संस्कृति माध्यम में जारी वायरस की मात्रा को मापने के लिए है । एचआईवी-1 संक्रमण और रोगजनन (जैसे, CD4 टी सेल कमी) भी थोक आरएनए द्वारा ऊतक explants में मूल्यांकन किया जा सकता/डीएनए निष्कर्षण और qPCR, में सीटू धुंधला, या एक सेल-विश्लेषण द्वारा ऊतक पाचन पर प्रवाह cytometry.

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Protocol

मानव ऊतकों के संग्रह के लिए प्रोटोकॉल स्थानीय सक्षम अधिकारियों द्वारा नैतिक अनुमोदन की आवश्यकता हो सकती है । इस तरह के tonsillectomy और गर्भाशय के रूप में संकेत सर्जरी के मामले में, नमूनों अनुसंधान प्रयोजन के लिए विशेष रूप से एकत्र नहीं कर रहे है और अध्ययन मानव विषयों अनुसंधान (स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान नहीं माना जाता है । मानव विषयों पर शोध । https://humansubjects.nih.gov/walkthrough-investigator#tabpanel11) । हालांकि, प्राप्त ऊतक दाताओं ' निजी और चिकित्सा डेटा (जैसे, सेक्स, उंर, वर्तमान दवा का उपयोग करें, संक्रमण का इतिहास, आदि) है कि मदद कर सकता है प्रयोगात्मक परिणाम की व्याख्या, सूचित सहमति और गोपनीयता के बारे में चिंताओं बन गया है कि होना चाहिए ऊतक संग्रह के लिए प्रोटोकॉल में संबोधित किया ।

चेतावनी: पूरी प्रक्रिया एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में किया जाना चाहिए । ' स्वस्थ ' व्यक्तियों सहित सभी मानव नमूनों, संक्रामक एजेंटों बंदरगाह सकता है । ऑपरेटर के लिए रक्त जनित रोगजनकों के साथ काम करने के लिए सुरक्षित रूप से ऊतक नमूनों को संभाल प्रशिक्षण प्राप्त करना चाहिए, भले ही प्रयोगों एचआईवी का उपयोग शामिल नहीं है । ऊतक विच्छेदन और एचआईवी के साथ संक्रमण की प्रक्रिया के जोखिम का आकलन प्रशिक्षित कर्मचारियों द्वारा किया जाना चाहिए ऑपरेटर और सहकर्मियों की सुरक्षा सुनिश्चित करने के लिए । संक्रामक एचआईवी के उपयोग के लिए समर्पित जैव सुरक्षा स्तर पर देश और संस्थान के आधार पर 2 या 3 वातावरण खतरनाक जैव तार्किक और रक्त जनित रोगजनकों पर विशेष नियमों की आवश्यकता है ।

1. जिलेटिन स्पंज की तैयारी

नोट: हालांकि यह कड़ाई से ऊतक विच्छेदन से पहले जिलेटिन स्पंज तैयार करने के लिए आवश्यक नहीं है, यह अधिक सुविधाजनक है यहां उल्लिखित आदेश का पालन करें, विशेष रूप से जब ऊतक की एक बड़ी राशि से निपटने और/

  1. संस्कृति मध्यम (सेमी) तैयार करने और CMT (सामग्री की तालिका) बनाने के लिए उपयोग करने से पहले एंटीबायोटिक समाधान (Tircacillin-क्लेव्यूलेनेट मिश्रण) के साथ पूरक । किसी भी बचे हुए एंटीबायोटिक समाधान त्यागें ।
    नोट: CMT में Ticarcillin और क्लेव्यूलेनेट खराब हैं । यदि आवश्यक हो, तो तैयारी से लगभग 24 घंटे के बाद एंटीबायोटिक समाधान के साथ पुन: पूरक CMT । यह explant माध्यम हर 24 ज संस्कृति के दौरान एंटीबायोटिक समाधान जोड़ने के लिए आवश्यक नहीं है ।
  2. CMT के लगभग 20-30 मिलीलीटर के साथ एक १०० mm x 20 mm पेट्री डिश भरें ।
    नोट: इस सेटिंग के लिए पर्याप्त जिलेटिन स्पंज दो 6-अच्छी तरह से प्लेटें या समय पर १ १२-well प्लेट के लिए तैयार करने के लिए इष्टतम है । कई प्लेटों की आवश्यकता होती है, तो तैयारी को गति देने के लिए एक व्यापक पेट्री डिश और बड़ा CMT मात्रा का उपयोग करें ।
  3. पेट्री पकवान बाँझ संदंश का उपयोग कर में जिलेटिन स्पंज (एस) स्थानांतरण । गीला दोनों पक्षों पर स्पंज और स्पंज के लिए मध्यम सोख करने की अनुमति 1 min. के बारे में 2 मिनट के लिए पेट्री डिश के नीचे के खिलाफ स्पंज प्रेस एक बाँझ रंग का उपयोग कर ।
    नोट: यह कदम महत्वपूर्ण महत्व का है क्योंकि स्पंज में हवा के बुलबुले की उपस्थिति केशिकाओं ब्लॉक के माध्यम से जो संस्कृति मध्यम पोषक तत्वों ऊतक तक पहुंच जाएगा । जिलेटिन स्पंज अत्यंत भंगुर जब निर्जलित हैं । धीरे रंग के साथ स्पंज पर नीचे पुश, शुरुआत में विशेष रूप से, स्पंज तोड़ने से बचने के लिए ।
  4. के बारे में 1 सेमी2के बराबर आकार के टुकड़ों में rehydratेड जिलेटिन स्पंज कटौती बाँझ कैंची का प्रयोग करें । स्थानांतरण 1 स्पंज एक संस्कृति की थाली की एक अच्छी तरह से संदंश का उपयोग कर टुकड़ा । एक 6-अच्छी तरह से थाली (tonsils) और एक अच्छी तरह से एक 12-अच्छी तरह से थाली (गर्भाशय ग्रीवा) में प्रति 1 मिलीलीटर के प्रत्येक कुआं में CMT के 3-4 मिलीलीटर जोड़ें । मशीन में प्लेटें प्लेस, ३७ ° c, 5% CO2, ≥ ९०% आर्द्रता पर सेट करें, जब तक ऊतक explants स्पंज पर लोड करने के लिए तैयार हैं ।
    नोट: CMT की मात्रा प्लेट में जोड़ने के लिए स्पंज की मोटाई को समायोजित किया जाना चाहिए तरल हवा अंतरफलक पर explants रखने के लिए ।

2. मानव Tonsillar ऊतक का विच्छेदन

नोट: tonsils सर्जरी के बाद जितनी जल्दी हो सके संसाधित किया जाना चाहिए, आदर्श सर्जरी के उसी दिन । वैकल्पिक रूप से, नमूनों रातोंरात छोड़ दिया जा सकता है 4 डिग्री सेल्सियस पर CMT में जलमग्न ।

  1. मुख्यमंत्री पर्याप्त समय कमरे के तापमान (आरटी) तक पहुंचने के लिए या एक पानी स्नान पूर्व में डाल दिया ३७ डिग्री सेल्सियस पर गर्म की अनुमति दें । उपयोग करने से पहले एंटीबायोटिक समाधान (CMT) के साथ मुख्यमंत्री के पूरक । किसी भी एंटीबायोटिक समाधान को छोड़ दें । एक साफ कंटेनर में ७०% इथेनॉल समाधान डालो संदंश और स्केलपेल भिगोना जब भी जरूरत विच्छेदन प्रक्रिया के दौरान । उपकरण साफ और विभिंन दाताओं से नमूनों की विच्छेदन के बीच स्केलपेल ब्लेड बदल जाते हैं ।
  2. एक १०० मिमी-पेट्री पकवान बाँझ संदंश का उपयोग CMT के 10-20 मिलीलीटर युक्त में परिवहन कंटेनर से tonsils स्थानांतरण.
    नोट: cauterized, खूनी, या गल ऊतक के व्यापक क्षेत्रों के साथ नमूनों को छोड़ दिया जाना चाहिए ।
  3. काटना ऊतक के लिए एक काटने की सतह के रूप में पेट्री डिश के ढक्कन का प्रयोग करें । संदंश के साथ धीरे ऊतक पकड़े, कई बड़े बाँझ स्केलपेल और ब्लेड का उपयोग टुकड़ों में प्रत्येक tonsil में कटौती.
    चेतावनी: मानव नमूनों काटना करने के लिए तेज उपकरण हैंडलिंग चोट और संदूषण का खतरा बढ़ जाता है । ऑपरेटर धातु, मेष, अतिरिक्त सुरक्षा के रूप में कटौती प्रतिरोधी दस्ताने पहनने पर विचार करना चाहिए ।
  4. cauterized, खूनी, और रेशेदार ऊतक, और tonsilloliths (calcified सामग्री) और/या हरे-भूरे रंग के साथ संदंश और स्केलपेल का उपयोग करने वाले किसी भी भाग को निकालें ।
    नोट: ऊतक के एक टुकड़े पर काम करते समय, यह ऊतक सुखाना से बचने के लिए मध्यम में जलमग्न ऊतक के बाकी रखने के लिए महत्वपूर्ण है ।
  5. प्रत्येक ऊतक टुकड़ा मोटाई में के बारे में 2 मिमी के स्लाइस में काटें । पिछले चरण के रूप में किसी भी अवांछित भाग को निकालें । ऊतक स्लाइस को 2 mm-मोटी स्ट्रिप्स में काट लें । ऊतक स्ट्रिप्स में कटौती 2 मिमी-मोटी ब्लॉकों. यह लगभग 8 मिमी3के ऊतक explants में परिणाम चाहिए ।
  6. एक नया १०० mm पेट्री डिश में explants स्थानांतरण 10 – CMT के 20 मिलीलीटर ऊतक सुखाना से बचने के लिए जबकि विच्छेदन के साथ आगे बढ़ने । विच्छेदन के अंत में, explant वितरण यादृच्छिक करने के लिए थाली भंवर । एक 6-खैर प्लेट में संदंश का उपयोग कर, उन दोनों के बीच अंतरिक्ष की अनुमति में प्रत्येक जिलेटिन स्पंज के शीर्ष पर 9 ऊतक explants प्लेस । मशीन के लिए प्लेटें लौटें ।
    नोट: आमतौर पर, explants रात भर संस्कृति और एचआईवी के साथ संस्कृतियों के टीका-1 अगले दिन किया जाता है । यह सुनिश्चित करना है कि कोई जीवाणु या कवक संदूषण संस्कृति में विकसित करता है । इसके अलावा, कोशिकाओं विच्छेदन के बाद tonsillar ऊतक explants निकास करने के लिए करते हैं । यह प्रक्रिया मुख्यतः1संस्कृति के पहले 24 ज के भीतर पूरा हो गया है ।
  7. apposite कंटेनरों में सभी जैविक अपशिष्ट का निपटान खतरनाक जैव-तार्किक हैंडलिंग और विशिष्ट जोखिम मूल्यांकन पर संस्थान के नियमों के अनुसार ।

3. एचआईवी के साथ Tonsillar ऊतक Explants का संक्रमण-1

नोट: स्वतंत्र प्रयोगों के बीच परिणाम परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए, एक ही वायरस तैयारी एक पूरे अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए. वायरस exogenously सक्रिय परिधीय रक्त mononuclear कोशिकाओं में प्रचारित किया जा सकता है और फिर संस्कृति supernatant-८० ° c दोहराया ठंड और गल (सामग्री की तालिका) से बचने के लिए भंडारण के लिए aliquoted किया जा सकता है ।

  1. एक पानी स्नान पूर्व में सेमी ३७ डिग्री सेल्सियस पर गर्म रखो । उपयोग करने से पहले एंटीबायोटिक समाधान (CMT) के साथ मुख्यमंत्री के पूरक । किसी भी बचे हुए एंटीबायोटिक समाधान त्यागें ।
  2. एक पिपेट के साथ 6-well प्लेट (s) में मध्यम महाप्राण और इसे संक्रमित समाधान के साथ एक कंटेनर में छोड़ दें । थाली झुकाव और धीरे से ऊपर के ऊपरी भाग के लिए जिलेटिन स्पंज धक्का करने के लिए मध्यम तल पर इकट्ठा करने की अनुमति है, और महाप्राण और इसे त्यागें । प्रत्येक अच्छी तरह से CMT के 3-4 मिलीलीटर जोड़ें ।
  3. ३७ ° c पर पानी स्नान में एचआईवी-1 वायरस तैयारी गल । यदि आवश्यक हो, तो सेमी (तालिका 1) के साथ वायरस स्टॉक को पतला करें ।
    नोट: वायरस स्टॉक को पतला किया जाना चाहिए ताकि चयनित इनोक्युलम 5 – 8 µ l (Table 1) की मात्रा में समाहित हो । एक कुशल संक्रमण के लिए, यह न्यूनतम एचआईवी-1 तैयारी और संक्रमित ऊतक explants के बीच आवश्यक समय का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है ।
  4. पिपेट वायरस इनोक्युलम सीधे एक जिलेटिन स्पंज पर 9 explants में से प्रत्येक के शीर्ष पर । प्लेट (ओं) के रूप में जल्द ही संक्रमण पूरा हो गया है मशीन के लिए लौटें । किसी भी अवशिष्ट वायरस तैयारी त्यागें । धारा 5 तक जारी रखें ।
    नोट: सही वायरस इनोक्युलम ऑपरेटर एक रिवर्स pipetting तकनीक का उपयोग कर और हर अच्छी तरह के लिए टिप बदलने पर विचार करना चाहिए उद्धार करने के लिए । यह पिपेट पिस्टन धक्का शामिल है (दूसरा बंद) के लिए वायरस इनोक्युलम आकर्षित करने के लिए, और पहले बंद करने के लिए इनोक्युलम, जो बुलबुला गठन और छोटे के दोहराया नमूना के साथ जुड़े त्रुटि को कम करने में मदद करता है उद्धार करने के लिए । खंड, अर्थात्, 5 – 8 µ l.

4. गर्भाशय ग्रीवा म्यूकोसा के विच्छेदन और संक्रमण

नोट: इष्टतम परिणामों के लिए, ग्रीवा म्यूकोसा के explants और संसाधित किया जाना चाहिए सर्जरी के बाद जितनी जल्दी हो सके संक्रमित, आदर्श सर्जरी के उसी दिन । वैकल्पिक रूप से, नमूनों CMT में 4 डिग्री सेल्सियस रात भर में जलमग्न संग्रहीत किया जा सकता है, और विच्छेदन के बाद तुरंत संक्रमित ।

  1. आरटी तक पहुंचने के लिए मुख्यमंत्री पर्याप्त समय की अनुमति दें या यह एक पानी स्नान पूर्व में डाल दिया ३७ डिग्री सेल्सियस पर गरम । उपयोग करने से पहले एंटीबायोटिक समाधान (CMT) के साथ मुख्यमंत्री के पूरक । किसी भी बचे हुए एंटीबायोटिक समाधान त्यागें । एक साफ कंटेनर में ७०% इथेनॉल समाधान डालो संदंश और स्केलपेल भिगोना जब भी जरूरत विच्छेदन प्रक्रिया के दौरान । उपकरण साफ और कई दाताओं से नमूनों की विच्छेदन के बीच स्केलपेल ब्लेड बदल जाते हैं ।
  2. बाँझ संदंश का प्रयोग, एक १०० मिमी पेट्री डिश में परिवहन कंटेनर से नमूने हस्तांतरण 10 – 20 CMT की मिलीलीटर.
  3. ऊतक काटना करने के लिए एक काटने की सतह के रूप में पेट्री डिश के ढक्कन का प्रयोग करें । संदंश के साथ धीरे से ऊतक पकड़े, ectocervix और/या endocervix की श्लेष्मा झिल्ली के नीचे stromal और मांसपेशियों के ऊतकों (एक स्केलपेल और ब्लेड के साथ म्यूकोसा के स्ट्रिप्स प्राप्त करने के लिए) से अलग है ।
    नोट: ऊतक के एक टुकड़े पर काम करते समय, यह ऊतक सुखाना से बचने के लिए मध्यम में जलमग्न ऊतक के बाकी रखने के लिए महत्वपूर्ण है ।
  4. 2 मिमी चौड़ा स्ट्रिप्स में म्यूकोसा में कटौती, हटाने के लिए और जितना संभव हो उतना म्यूकोसा त्याग, ऊतक की केवल एक 2 मिमी मोटी परत छोड़ने. 2 मिमी मोटी ब्लॉकों में स्ट्रिप्स काटें । यह लगभग 8 मिमी3के ऊतक explants में परिणाम चाहिए ।
    चेतावनी: मानव नमूनों काटना करने के लिए तेज उपकरण हैंडलिंग चोट और संदूषण का खतरा बढ़ जाता है । ऑपरेटर धातु, मेष, अतिरिक्त सुरक्षा के रूप में कटौती प्रतिरोधी दस्ताने पहनने पर विचार करना चाहिए ।
  5. स्थानांतरण ऊतक explants एक नया १०० मिमी पेट्री डिश से युक्त 10 – 20 CMT के एमएल के लिए ऊतक सुखाना से बचने जबकि विच्छेदन के साथ आगे बढ़ने । विच्छेदन के अंत में, explant वितरण यादृच्छिक करने के लिए थाली भंवर ।
  6. बाँझ संदंश के साथ, explants में बाँझ १.५-एमएल शंकु ट्यूब (s) (अधिकतम 16 explants प्रति ट्यूब) हस्तांतरण. एक पिपेट का उपयोग कर ट्यूब में किसी भी माध्यम निकालें ।
  7. ३७ ° c में एक पानी स्नान में एचआईवी-1 तैयारी गल । यदि आवश्यक हो, तो CM के साथ वायरस स्टॉक को पतला करें । explants युक्त ट्यूब (ओं) में वायरस हस्तांतरण. किसी भी अवशिष्ट वायरस तैयारी त्यागें ।
    नोट: वायरस स्टॉक को पतला किया जाना चाहिए ताकि चयनित इनोक्युलम न्यूनतम ०.५ मिलीलीटर (तालिका 1) की मात्रा में निहित हो. स्वतंत्र प्रयोगों के बीच परिणाम परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए, एक ही वायरस तैयारी एक पूरे अध्ययन (सामग्री की तालिका) के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
  8. एक थर्मामीटर में ट्यूबों स्थानांतरण-शेखर और 2 के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस ३०० rpm पर कमाल की मशीन । धीरे ट्यूबों पलटना कई बार हर 30-60 मिनट ।
    नोट: एक कुशल संक्रमण के लिए, यह ंयूनतम एचआईवी-1 तैयारी के बीच आवश्यक समय का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है और ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए ट्यूबों के हस्तांतरण ।
  9. बाँझ फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) के प्रति अच्छी तरह से 3-4 मिलीलीटर के साथ एक 6-अच्छी तरह से थाली भरें । एचआईवी के साथ मशीन की-1, ट्यूब (ओं) में एक पिपेट का उपयोग कर संक्रमित समाधान के साथ एक कंटेनर में सभी वायरस तैयारी त्यागें । संदंश का उपयोग करते हुए पंजाब के साथ 6-अच्छी प्लेट में explants स्थानांतरण ।
  10. explants को 1 मिनट के लिए आर टी में आराम करने की अनुमति दें, और फिर उंहें धीरे से धो pipetting अप-और पंजाब में अच्छी तरह से 2-3 बार । एक पिपेट का उपयोग कर संक्रमित समाधान के साथ एक कंटेनर में पंजाबियों को त्यागें । नए पंजाबियों के 3-4 मिलीलीटर प्रत्येक अच्छी तरह से जोड़ें । तीन धुल के कुल के लिए दो बार दोहराएं । सिर्फ explants को स्पंज के लिए स्थानांतरित करने से पहले पंजाबियों को छोड़ ऊतक सुखाना से बचने के लिए ।
    नोट: ग्रीवा म्यूकोसा के Explants, और विशेष रूप से endocervix में, संक्रमण के दौरान बलगम की महान मात्रा जारी । यह महत्वपूर्ण है धोने और जितना संभव हो उतना बलगम निकालें क्योंकि explants और संस्कृति supernatant में वायरस के बाद रिलीज पर विशिष्ट प्रतिधारण वायरस प्रतिकृति मुखौटा कर सकते हैं ।
  11. संदंश का प्रयोग, एक 12 अच्छी तरह से थाली में प्रत्येक जिलेटिन स्पंज के शीर्ष पर 5-8 explants हस्तांतरण । मशीन के लिए थाली लौटें ।
  12. apposite कंटेनरों में सभी जैविक अपशिष्ट का निपटान खतरनाक जैव-तार्किक हैंडलिंग और विशिष्ट जोखिम मूल्यांकन पर संस्थान के नियमों के अनुसार ।

5. Histoculture

  1. 12 दिन तक संक्रमण के समय से शुरू हर 3 दिन में मुख्यमंत्री बदलें-संक्रमण के बाद 15. सेमी और/explants संस्कृति समय में नियमित अंतराल पर नमूने के लिए एचआईवी-1 प्रतिकृति, अंय मापदंडों के बीच का आकलन कर सकते हैं ।
  2. एक पानी स्नान पूर्व में सेमी ३७ डिग्री सेल्सियस पर गर्म रखो ।
    नोट: यह इस स्तर पर एंटीबायोटिक समाधान के साथ मुख्यमंत्री के पूरक करने के लिए आवश्यक नहीं है ।
  3. एक पिपेट के साथ मुख्यमंत्री का एक नमूना ले लीजिए और यह बाँझ १.५ या 2 मिलीलीटर पेंच कैप ट्यूब (ओं) में भंडारण के लिए-८० डिग्री सेल्सियस में स्थानांतरण ।
    नोट: दोहराने कुओं से मुख्यमंत्री संग्रह में परित हैं ।
  4. फसल बाँझ संदंश के साथ ऊतक explants, explants पर उन्हें कागज के एक टुकड़े पर रखकर अतिरिक्त माध्यम निकालें (वैकल्पिक), और बाँझ १.५ या 2 मिलीलीटर पेंच कैप ट्यूब (ओं) में explants हस्तांतरण. प्रक्रिया या प्रयोग द्वारा आवश्यक के रूप में ऊतक के नमूनों की दुकान ।
    नोट: प्रवाह cytometry के लिए, explants तुरंत एक एंजाइमी कॉकटेल के साथ एक एकल सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए पचा रहे है (अधिक जानकारी के लिए संदर्भ 1, 9, 16, और 17 देखें) । आरएनए निष्कर्षण के लिए, explants-८० डिग्री सेल्सियस पर उन्हें भंडारण से पहले रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर एक आरएनए स्थिरीकरण समाधान में रखा जाता है । डीएनए निष्कर्षण के लिए या में सीटू धुंधला (गर्भाशय ग्रीवा), explants हो सकता है स्नैप-जमे हुए तरल नाइट्रोजन या सूखी बर्फ में/इथेनॉल घोल और पर संग्रहीत-८० ° c. वैकल्पिक रूप से, tonsillar explants पंजाबियों के समाधान में डुबकी द्वारा तय किया जा सकता है और 4% paraformaldehyde के लिए सीटू धुंधला में
  5. एक पिपेट के साथ अच्छी तरह से में अवशिष्ट सेमी महाप्राण और यह संक्रमित समाधान के साथ एक कंटेनर में छोड़ दें । थाली झुकाव और धीरे के ऊपरी भाग के लिए जिलेटिन स्पंज धक्का अच्छी तरह से मध्यम नीचे इकट्ठा करने के लिए अनुमति देने के लिए, और फिर महाप्राण और इसे त्यागें ।
  6. एक अच्छी तरह से सेमी की 3-4 मिलीलीटर जोड़ें । बाँझ संदंश का उपयोग करना, किसी भी ऊतक explants कि जिलेटिन स्पंज करने के लिए माध्यम में गिरा दिया । मशीन के लिए थाली लौटें ।
  7. संस्कृति के अंत में, खतरनाक जैव तार्किक हैंडलिंग और विशिष्ट जोखिम मूल्यांकन पर संस्थान के नियमों के अनुसार apposite कंटेनरों में सभी जैविक अपशिष्ट के निपटान ।

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Representative Results

कई तकनीकों ऊतक explants में एचआईवी-1 प्रतिकृति का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । हमारे मानक पढ़ने के बाहर एचआईवी की राशि-1 p24झूठ एक immunoassay18के साथ समय पर मुख्यमंत्री में जारी की माप है ।

टिशू explants विभिन्न दानदाताओं से संक्रमित, एक ही एचआईवी-1 शेयर की एक ही इनोक्युलम के साथ, विभिन्न मात्रा में वायरस (Table 1) की उपज हो सकती है । यह कई कारकों की वजह से है, जैसे संख्या और एचआईवी की स्थिति-1 लक्ष्य कोशिकाओं और सह की उपस्थिति-ऊतक में संक्रमित रोगजनकों16,19चित्रा 1में, हम उत्पादक और सत्तासीन एचआईवी के एक उदाहरण प्रदान-1 ग्रीवा म्यूकोसा explants के संक्रमण के रूप में p24झूठ की राशि दाता-मिलान explants एंटीरेट्रोवाइरल दवा lamivudine (3TC) के साथ इलाज के मुकाबले में जारी की तुलना में परिभाषित कि पूरी तरह से एचआईवी-1 प्रतिकृति को रोकता है । हालांकि यह नियंत्रण एक में दाता से ऊतक explants के संक्रमण के लिए अनावश्यक रूप से प्रकट होता है, यह (ख) explants में उत्पादक संक्रमण (सी) से है कि एचआईवी-1 प्रतिकृति के कम स्तर उपज भेदभाव में मदद करता है ।

एक नियंत्रण शर्त के रूप में एक एंटीरेट्रोवाइरल दवा के उपयोग के ऊतकों में एचआईवी-1 संक्रमण का अध्ययन करने के लिए उपयोगी हो सकता है कि बंदरगाह लक्ष्य कोशिकाओं की कम संख्या, ग्रीवा म्यूकोसा की तरह, और जब का उपयोग कर धीमी-नकल एचआईवी-1 वेरिएंट, जैसे कुछ प्राथमिक अलग । इसके अलावा, इस तरह के वायरस से संक्रमित ऊतकों के लिए, यह महत्वपूर्ण है के लिए और अधिक संवेदनशील जांच तरीकों का उपयोग कर विचार, उदाहरण के लिए qPCR ।

Figure 1
चित्रा 1 : एचआईवी-1 की प्रतिकृति ग्रीवा म्यूकोसा explants तीन अलग ऊतक दाताओं से । गर्भाशय ग्रीवा के ऊतकों explants वायरस स्टॉक में डुबकी द्वारा एचआईवी-1बाल के समान इनोक्युलम से संक्रमित थे और एंटीरेट्रोवाइरल दवा lamivudine (3TC) की उपस्थिति या अनुपस्थिति में 15 दिनों के लिए संस्कृति के 10 µ एम की एकाग्रता में । कल्चर मीडियम का नमूना लिया गया हर 3 दिन और नमूनों से दोहराने कुओं एचआईवी के विश्लेषण के लिए संग्रह में जमा थे-1 एचआईवी द्वारा प्रतिकृति-1 p24चुप immunoassay । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

ऊतक प्रकार वायरस इनोक्युलम प्रति explant (एचआईवी के स्नातकोत्तर-1 p24झूठ) नहीं. explants के कल्चर मीडियम वॉल्यूम (mL) नहीं. कुओं की (तकनीकी प्रतिकृति) एचआईवी-1 p24ढकोसला उत्पादन (एनजी/
Tonsillar एचआयव्ही-१बाळ 350 – 500 9 3-4 २ – ३ १ – १०
पिडित-१लाइ. ०४ 9 3-4 २ – ३ 1 – 100
ग्रीवा एचआयव्ही-१बाळ 1500 – 2000 8 1 2 1 – 5
पिडित-१लाइ. ०४ 8 1 2 Undetectable

तालिका 1: ऊतक explants और वायरस के उत्पादन के संक्रमण के लिए एचआईवी-1 इनोक्युलम के संदर्भ मूल्यों । व्यक्तिगत ऊतक explant प्रति एचआईवी-1 इनोक्युलम के मूल्य 50 की एकाग्रता में वायरस शेयरों को संदर्भित करता है-70 एनजी/एमएल: undilute वायरस स्टॉक के 7 µ एल की एक मात्रा एक जिलेटिन स्पंज के शीर्ष पर प्रत्येक tonsillar explant को संक्रमित करने के लिए प्रयोग किया जाता है; पतला वायरस स्टॉक के ५०० µ एल की मात्रा एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में डुबकी द्वारा 16 ग्रीवा explants को संक्रमित करने के लिए प्रयोग किया जाता है । ग्रीवा explants बड़े पैमाने पर उंहें जिलेटिन स्पंज पर स्थानांतरित करने से पहले पंजाब में धोया जाता है । एचआईवी के मूल्य-1 ऊतक explants द्वारा उत्पादन p24झूठ की संचई राशि 1 मिलीलीटर (गर्भाशय ग्रीवा) में 8 explants द्वारा जारी की, या 9 explants में 3-4 मिलीलीटर (tonsils) संस्कृति मध्यम (सेमी) की संस्कृति के 12-15 दिन से अधिक हर 3 दिन के नमूने के लिए संदर्भित करता है । दोहराने कुओं से मुख्यमंत्री प्रत्येक समय बिंदु के लिए संग्रह में यह ताजा मुख्यमंत्री के साथ जगह से पहले परित है । p24ढकोसला 3 दिन में मापा एकाग्रता का मूल्य विश्लेषण से बाहर रखा गया था क्योंकि यह आंशिक रूप से explants पर वायरस के अवशोषण के लिए खातों और मुख्यमंत्री, यानी, इनोक्युलम ले पर जारी है । आमतौर पर, एचआईवी के साथ गर्भाशय ग्रीवा के ऊतकों के संक्रमण-1लाइ. 04 हमारे प्रायोगिक प्रणाली16में detectable एचआईवी-1 प्रतिकृति करने के लिए नेतृत्व नहीं करता है ।

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Discussion

एचआईवी के अध्ययन के लिए मानव ऊतक explants के उपयोग-1 संक्रमण पारंपरिक द्वि-आयामी और monotypic प्रयोगात्मक प्रणालियों, प्राथमिक कोशिकाओं या सेल लाइनों के रूप में लाभ प्रदान करता है, उनके बेहतर सेलुलर बातचीत को पुन: पेश करने की क्षमता के कारण और सेलुलर कार्यों (जैसे, cytokine उत्पादन) के रूप में वे vivo मेंहैं । फिर भी, tonsillar और गर्भाशय ग्रीवा के ऊतकों संख्या सहित कई पहलुओं में अलग, और एचआईवी लक्ष्य कोशिकाओं के phenotypic और कार्यात्मक विशेषताओं1,16। इसी कारण से, एचआईवी-अलग सह रिसेप्टर tropism के साथ 1 वेरिएंट (जैसे, CCR5-रेखा एचआईवी-1बाल बनाम CXCR4-रेखा एचआईवी-1लाइ. 04) दोनों tonsils और गर्भाशय ग्रीवा (1 तालिका) में अलग प्रदर्शन । प्रतिरक्षा आगमनात्मक और प्रभाव करनेवाला साइटों पर लक्ष्य कोशिकाओं पर एचआईवी coreceptors का वितरण केवल आंशिक रूप से संक्रमण के लिए स्थानीय संवेदनशीलता के लिए खातों: CD4 टी CXCR4 ले जाने कोशिकाओं tonsillar ऊतक में CCR5-व्यक्त कोशिकाओं की तुलना में अधिक प्रचुर मात्रा में हैं, इस प्रकार एचआईवी के उच्च प्रतिकृति स्तर समझा-1लाइ. 04 से एचआईवी-1बाल, लेकिन रिसेप्टर्स समान रूप से ग्रीवा म्यूकोसा में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं16. फिर भी, हम शायद ही कभी एक एचआईवी के साथ चुनौती दी गर्भाशय ग्रीवा के ऊतकों में उत्पादक वायरस प्रतिकृति का पता चला-1लाइ. 04, जो व्यक्तिगत एचआईवी के तरजीही संचरण के साथ लाइन में है-1 CCR5-रेखा वेरिएंट vivo20 में मनाया . यह पता चलता है कि भेदभाव और एचआईवी के सक्रियकरण स्थिति-1 लक्ष्य कोशिकाओं अंततः अपने को एचआईवी-1 प्रतिकृति16का समर्थन करने की क्षमता का निर्धारण कर सकते हैं ।

जिलेटिन स्पंज hemostatic शुद्ध सुअर का त्वचा से प्राप्त उपकरणों (कोलेजन), जो पूरी तरह से एक कुछ हफ्तों के बाद मानव शरीर द्वारा अवशोषित करने के लिए डिज़ाइन कर रहे हैं । हम उत्पादों है कि संस्कृति में धीमी गिरावट दर दिखाने के रूप में वे बेहतर 2-3 सप्ताह के लिए तरल हवा अंतरफलक पर ऊतक explants को बनाए रखने के उद्देश्य से सूट का उपयोग करने की सलाह देते हैं । हम भी explant संस्कृति में लगातार प्रदर्शन का आकलन करने के लिए एक ही उत्पाद के विभिन्न बैचों परीक्षण की सिफारिश.

इसी तरह, भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के प्रकार और बहुत एचआईवी-1 प्रतिकृति स्तर को प्रभावित कर सकते हैं । हम मुख्यमंत्री अनुकूलन के लिए FBS के कई बहुत से परीक्षण की सलाह और एक पूरे अध्ययन के लिए FBS का एक ही बहुत का उपयोग करें । हम नियमित रूप से 10 दाताओं से ऊतक explants पर FBS परीक्षण और बहुत है कि सबसे अधिक एचआईवी-1 प्रतिकृति देता है का चयन करें ।

प्रयोगों के अधिकांश के लिए, हम endocervix और ectocervix से पूल explants प्रयोगात्मक शर्तों की संख्या को अधिकतम करने के लिए । एक उंहें रखने पर विचार कर सकते है क्योंकि उनके अलग संरचनात्मक और immunologic21सुविधाओं के अलग । इसके अलावा, endocervical explants जारी है और संस्कृति है कि बहाव विश्लेषण के साथ हस्तक्षेप हो सकता है में बलगम की एक बड़ी राशि का उत्पादन जारी है । endocervix द्वारा कवर क्षेत्र के रूप में देखना बहुत ectocervix से छोटा है, यह endocervical म्यूकोसा पर विशेष रूप से एचआईवी संक्रमण के प्रयोगों का संचालन करने के लिए चुनौतीपूर्ण है explants और तकनीकी की एक पर्याप्त संख्या का उपयोग कर प्रतिकृति ।

गर्भाशय ग्रीवा explants के डुबकी द्वारा एचआईवी-1 संक्रमण प्रदर्शन CD4 टी लसीकावत् ऊतक के साथ तुलना में म्यूकोसा में मौजूद कोशिकाओं की कम संख्या के कारण एक उत्पादक संक्रमण प्राप्त करने की संभावना को अधिकतम करता है । एक ही कारण के लिए, गर्भाशय ग्रीवा के ऊतकों को और अधिक रात के भंडारण के प्रति संवेदनशील है और पैदावार उच्च एचआईवी-1 प्रतिकृति जब शीघ्र ही सर्जरी के बाद संक्रमित और तुरंत विच्छेदन के बाद । वायरस स्टॉक में डुबकी द्वारा संक्रमण हालांकि वायरस के लिए explants के समान जोखिम सुनिश्चित करने के लिए tonsillar ऊतक के लिए भी प्रदर्शन किया जा सकता है, इस दृष्टिकोण जिलेटिन स्पंज पर explants के संक्रमण से अधिक ऊतक हेरफेर और कोशिका हानि जरूरत पर जोर देता के रूप में वर्णित प्रोटोकॉल में ।

एचआईवी-1 चुनौती और श्लैष्मिक ऊतकों की संस्कृति का ध्रुवीकरण मौजूद है और वर्तमान में अंय प्रयोगशालाओं में उपयोग किया जाता है3,22,23,24,25। हालांकि इन प्रणालियों एचआईवी के एक मूल्यवान मॉडल-1 प्रवेश और म्यूकोसा में प्रवेश कर रहे हैं, उनकी स्थापना की आम तौर पर अधिक समय लेने वाली है और व्यापक ऊतक हेरफेर की आवश्यकता हो सकती है । श्लैष्मिक ट्रांसमिशन/रोगजनन के गैर-ध्रुवीकरण मॉडल अभी भी एचआईवी के विनियमन-1 प्रतिकृति और अंतर्जात और exogenous कारकों9,17 द्वारा एचआईवी संक्रमित कोशिकाओं के स्थानीय पूल की जांच करने के लिए एक वैध मंच की पेशकश , 26, ड्रग्स सहित12,13,14,15.

अंतर-दाता परिवर्तनशीलता कई दाताओं से नमूनों का उपयोग किए गए स्वतंत्र प्रयोगों के बीच परिणाम reproducibility के लिए एक प्रमुख मुद्दा प्रतिनिधित्व कर सकते हैं । सेलुलर संरचना में परिवर्तनशीलता भी एक ही नमूना है, यानी, अंतर दाता परिवर्तनशीलता के भीतर क्षेत्रों को प्रभावित कर सकते हैं । परिवर्तनशीलता को कम करने और ठीक से परिणामों की व्याख्या करने के लिए, यह एक ही दाता (दाता-मिलान शर्तों) से प्राप्त explants की एक पर्याप्त संख्या का उपयोग कर एक प्रयोग के भीतर सभी शर्तों को स्थापित करने के लिए महत्वपूर्ण है । परिणाम एक आंतरिक नियंत्रण करने के लिए सामान्यीकृत किया जा सकता है जब सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए कई प्रयोगों से डेटा संकलन. अंतर दाता परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए, हम एक प्रयोगात्मक स्थिति के लिए, एक कुल के 18 explants tonsillar ऊतक (9/अच्छी तरह से), और 10-16 explants ग्रीवा की श्लेष्मा झिल्ली (5-8/अच्छी तरह से) (तालिका 1) के लिए के लिए 2 तकनीकी प्रतिकृतियां सहित अनुशंसा करते हैं । चिकित्सा अभिलेखों की उपलब्धता और रोगी सामग्री और/या प्रयोगात्मक शर्तों के अतिरिक्त विश्लेषण का समावेश, उदाहरण के लिए एक नमूना की सूजन की स्थिति को संबोधित करने के लिए, काफी परिणाम व्याख्या में सुधार हो सकता है (के लिए संदर्भ 9 देखें एक उदाहरण) ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम फाउंडेशन Blanceflor Boncompagni Ludovisi nee Bildt (http://blanceflor.se/), एड्स के खिलाफ फाउंडेशन स्वीडिश चिकित्सकों (http://www.aidsfond.se/, रेफरी. FOa2014-0006), और Fondazione Andrea ई लिबी Lorini (http से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया ://fondazionelorini.it/) to Andrea Introini.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gelfoam 12-7 mm Absorbable gelatin sponge  Pfizer NDC:  0009-0315-08 Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue.
SPONGOSTAN Standard 70 × 50 × 10 mm Absorbable haemostatic gelatin sponge Ferrosan Medical Devices MS0002 Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue.
RPMI 1640 with phenol red and glutamine ThermoFisher Scientific 21875034 To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).
Modified Eagle's medium (MEM) non-essential aminoacids (100x) ThermoFisher Scientific 11140035 To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).
Sodium pyruvate, 100 mM (100x)  ThermoFisher Scientific 11360070 To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).
Gentamicin 50 mg/mL (1000x)  ThermoFisher Scientific 15750037 To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).
Amphotericin B 250 μg/mL (100x)  ThermoFisher Scientific 15290018 To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).
Fetal bovine serum (FBS)  To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).
Ticarcillin disodium salt Sigma-Aldrich T5639-1G Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3 g) and potassium clavulanate (100 mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT.
Potassium clavulanate Sigma-Aldrich 33454-100MG Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3 g) and potassium clavulanate (100 mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT.
Sterile phosphate buffer saline (PBS) pH 7.4 w/o calcium, magnesium and phenol red To use for storage and transportation of surgical specimens. PBS can be replaced with another isotonic solution with physiologic pH. Culture medium is best for overnight storage. 
Sterile cell culture grade water
Sterile transportation container
70% ethanol solution
Disinfectant solution for biological waste disposal
Sterile metal forceps or tweezers
Sterile metal scissors
Sterile flat weighing metal spatula
Sterile scalpels and blades
6-well cell culture plates
12-well cell culture plates
Sterile Petri dish, 100 mm × 20 mm
Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1BaL NIH AIDS Reagent Program 510 The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 °C. Avoid repeated freezing and thawing.
Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1LAI.04 NIH AIDS Reagent Program 2522 The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 °C. Avoid repeated freezing and thawing.
Lamivudine (3TC) NIH AIDS Reagent Program 8146 Resuspend in DMSO at 10 mg/mL, aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing.
Biological safety cabinet
Water-jacketed CO2 incubator, set at 37 °C, 5% CO2, ≥ 90% humidity
Water bath set at 37 °C
Sterile 1.5 and 2mL screw cap tubes
Dry bath shaker with heating block for 1.5 mL tubes, set at 37 °C, 300 rpm

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References

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Comments

2 Comments

  1. Hello, I want to make a Timentin solution (Ticarcillin sodium and potassium clavulanate) for use it in cell culture. I see that you prepare it in sterile cell culture grade water BUT the safety information of the product for Potassium clavulanate says: "Reacts violently with water., Risk of explosion if heated under confinement." So How can I make the solution? Your indications are: To resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3 g) and potassium clavulanate (100 mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. Did you have some problems with the Potassium clavulanate and the water?
    Thank you so much. Paula

    Reply
    Posted by: Paula L.
    October 29, 2018 - 3:22 PM
  2. Dear Paula
    Thank you for bringing this up. As you mentioned in your comment Timentin is the trademark name of a mixture of tircacillin disodium and potassium clavulanate that is reconstituted in water as per manufacturer instructions. This mix has been the antibiotic of choice for tonsil culture in the Margolis’ lab for many years, and it was also used by reconstituting individual antibiotics in water, as indicated in the material table, at the Karolinska Institutet to effectively control bacterial contamination in culture. I recommend that you check with the manufacturer about specific instructions for reconstituting potassium clavulanate, although I have never experienced a problem by preparing a solution of tircacillin disodium in water and then using that to reconstitute potassium clavulanate.
    In general, you may want to optimize your explant culture system by testing a number of antibiotics and select that is more convenient to use and works well for your specimens, depending on their nature, e.g. tonsillectomy for recurrent infection vs obstructive pathology, how clean the specimen is handled after surgery, etc. Be aware that you may experience seasonal variations in the rate of culture contamination through the year, especially with specimens from kids. Good luck!
    Andrea Introini

    Reply
    Posted by: Andrea I.
    November 2, 2018 - 12:53 PM

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