Ex Vivo Infección de la Mucosa Genital tejido linfoide humano y mujer con Virus de inmunodeficiencia humana 1 y Histoculture

Immunology and Infection

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Summary

Infección de tejidos humanos con virus de inmunodeficiencia humana (VIH) ex vivo proporciona un valioso modelo 3D de la patogenesia virus. Aquí, describimos un protocolo e infectar a los especímenes del tejido de las amígdalas humanas y de la mucosa genital femenina con HIV-1 y mantener en la cultura en la interfase líquido-aire.

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Introini, A., Vanpouille, C., Fitzgerald, W., Broliden, K., Margolis, L. Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture. J. Vis. Exp. (140), e57013, doi:10.3791/57013 (2018).

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Abstract

Histocultures permite estudiar interacciones intercelulares en tejidos humanos, y emplearon a huésped-patógeno modelo bajo condiciones controladas de laboratorio. Infección ex vivo de tejidos humanos con virus de inmunodeficiencia humana (VIH), entre otros virus, se ha utilizado con éxito para investigar la patogénesis de la enfermedad temprana, así como una plataforma para probar la eficacia y la toxicidad de los fármacos antivirales. En el presente Protocolo, se explica cómo procesar e infectar con VIH-1 explantes de tejido de las amígdalas humanas y de la mucosa cervical y mantenerlas en cultivo sobre esponjas de gelatina en la interfase aire-líquido durante unas dos semanas. Esta configuración no polarizado cultura maximiza acceso a nutrientes en el medio de cultivo y oxígeno, aunque la pérdida progresiva de la integridad del tejido y arquitecturas funcionales sigue siendo su principal limitación. Este método permite el control de la replicación del VIH-1 y la patogenesia usando varias técnicas, incluyendo las immunoassays, qPCR y citometría de flujo. De importancia, la variabilidad fisiológica entre los donadores de tejidos, así como explantes de diferentes áreas de la misma muestra, puede afectar significativamente los resultados experimentales. Para asegurar la reproducibilidad del resultado, es fundamental utilizar un número adecuado de explantes, repeticiones técnicas y condiciones de control donantes emparejados para normalizar los resultados de los tratamientos experimentales al compilar datos de múltiples experimentos (es decir, ., realizado con tejido de donantes diferentes) para el análisis estadístico.

Introduction

Cultivos de células bidimensionales monotypic, mencionados aquí como convencionales, no tienen en cuenta la comunicación espacial y funcional entre la gran variedad de tipos celulares que componen los tejidos y órganos. Este aspecto es de suma importancia para los modelos experimentales de enfermedad, como interferir en las interacciones intercelulares homeostáticas es el factor de manejo de patologías de todos. Explantes de tejido ofrecen grandes ventajas para el modelado de salud y enfermedad en los seres humanos porque conservan la Citoarquitectura y muchos importantes aspectos funcionales de los órganos como lo son en vivo, aunque para una cantidad limitada de tiempo1. Por ejemplo, en ex vivo reto con antígenos de recuerdo, como toxoide diftérico o toxoide tetánico, tejido amigdalino responde con una vigorosa producción de anticuerpos antígeno específicos2. Como cualquier otro ex vivo modelo, histoculture tiene sus propias limitaciones: variabilidad entre donante, polarización de tejido, tejido limitada supervivencia y dificultad en el seguimiento de células más allá de la profundidad de la microscopia confocal1. No obstante, los explantes de tejidos humanos siguen un modelo de elección para el estudio de procesos inmunológicos homeostáticos y patógenos en los seres humanos, incluyendo las interacciones huésped-patógeno y posibles intervenciones terapéuticas3.

Los eventos críticos de la patogénesis del VIH-1 tienen lugar en los tejidos. Infección de la mucosa genital representa para la mayoría de los VIH-1 transmisión eventos en todo el mundo4. Tejido linfoide es el principal sitio de replicación del virus durante la infección aguda y alberga una piscina significativa de células infectadas latente5, y su persistencia representa el principal obstáculo para lograr una curación6. El reto de cultura y ex vivo de tejidos linfoides y de la mucosas humanos ofrecen algunas ventajas sobre sistemas convencionales basados en células aisladas para el estudio del VIH-1. Por ejemplo, las células residentes del tejido pueden apoyar la infección HIV-1 en ausencia de activación exógena, a diferencia de las células mononucleares de sangre periférica1. El uso de explantes de tejido linfoide ha permitido una mejor comprensión de algunos mecanismos claves subyacentes T CD4 célula agotamientoes decir, el efecto espectador7, que es el sello de la infección aguda. La preservación de estructuras como folículos de células B en tejidos linfoides8 y el epitelio en explantes de mucosa genital femenina9 ofrece la oportunidad única de integrar características espaciales y funcionales de la infección VIH-1 en estos sitios. Finalmente, histocultures fueron utilizados con éxito al modelo y estudio de10,de coinfección VIH-1 y herpesvirus11, así como para ensayos preclínicos de antirretrovirales y multitarget microbicidas12, 13 , 14 , 15.

Aquí, describimos un protocolo detallado para el cultivo de explantes de tejido humano Obtenido de las amígdalas y mucosas del tracto genital femenino inferior (cuello uterino), cubriendo la disección del tejido para explante desafío con HIV-1 en una forma no polarizada. El cultivo de explantes de tejido en la interfase líquido-aire, utilizando esponjas de gelatina como soporte, maximiza la exposición al oxígeno de aire mientras que proporciona acceso a los nutrientes del medio de cultivo a través de la esponja capilares, retrasando así su descomposición natural. La más inmediata forma de evaluar la replicación del VIH-1 en nuestro sistema es medir la cantidad de virus liberado en el medio de cultivo de explantes con el tiempo por inmunoensayo o qPCR. Infección por VIH-1 y la patogenesia (e.g., depleción de células T CD4) también puede evaluarse en explantes de tejido por la masiva extracción de ARN/ADN y qPCR en situ tinción y análisis de célula única a digestión de tejido mediante citometría de flujo.

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Protocol

El protocolo para la recogida de los tejidos humanos puede requerir aprobación ética de las autoridades locales competentes. En el caso indicadas cirugías como histerectomía y amigdalectomía, los especímenes no se recoge específicamente para el propósito de la investigación y el estudio no se considera la investigación de sujetos humanos (institutos nacionales de salud. Investigación en seres humanos. https://humansubjects.nih.gov/Walkthrough-Investigator#tabpanel11). Sin embargo, obtener datos personales y médicos de los donadores de tejidos (por ej., sexo, edad, uso de drogas actual, historia de infecciones, etc.) que pueden ayudar a interpretar los resultados experimentales, plantea preocupaciones sobre el consentimiento informado y la privacidad que debe ser abordados en el protocolo para la recolección de tejido.

PRECAUCIÓN: Todo el procedimiento debe llevarse a cabo en un gabinete de seguridad biológica. Todas las muestras humanas, los de individuos 'sanos', incluidos pueden albergar a agentes infecciosos. El operador debe recibir formación para trabajar con patógenos de la sangre para manejar en forma segura muestras de tejido, incluso si los experimentos no implican el uso del VIH. Una evaluación del riesgo del procedimiento de disección del tejido y la infección con el VIH debe ser realizada por personal capacitado para garantizar la seguridad del operador y compañeros de trabajo. El uso de VIH infecciosa requiere bioseguridad dedicado entornos de nivel 2 o 3 dependiendo del país y el Instituto específico Reglamento sobre productos biológicos peligrosos y patógenos de la sangre.

1. preparación de esponjas de gelatina

Nota: Aunque no es estrictamente necesario preparar esponjas de gelatina antes de disección del tejido, es más conveniente seguir el orden que se indica aquí, especialmente al manejar una gran cantidad de tejido o de muchos donantes.

  1. Preparar medio de cultivo (CM) y suplemento antibiótico solución (mezcla de Tircacillin-clavulanate) antes de utilizarla para hacer CMT (Tabla de materiales). Deseche cualquier solución antibióticos sobrante.
    Nota: Ticarcilina y Clavulanato en CMT son poco estables. Si es necesario, complementar a CMT con solución antibiótica después de aproximadamente 24 horas desde la preparación de. No es necesario añadir antibiótico solución para explante medio cada 24 h durante el cultivo.
  2. Llene un 100 x 20 mm caja de Petri con unos 20-30 mL de CMT.
    Nota: Esta configuración es óptima para preparar bastantes esponjas de gelatina para dos placas de 6 pocillos o una placa de 12 pozos en el momento. Si muchas placas son necesarias, utilizar un plato de Petri más amplio y mayor volumen CMT para acelerar la preparación.
  3. Transferencia de la sponge(s) de la gelatina en el plato de Petri utilizando pinzas estériles. Mojar las esponjas en ambos lados y deje que las esponjas absorber mediano para 1 minuto de la prensa las esponjas contra el fondo de la caja Petri por unos 2 min con una espátula estéril.
    Nota: Este paso es de vital importancia porque la presencia de burbujas de aire en la esponja bloquea los capilares a través de que medio de cultivo nutrientes al tejido. Esponjas de gelatina son muy frágiles cuando deshidratado. Suavemente empuje hacia abajo la esponja con la espátula, especialmente al principio, para evitar romper la esponja.
  4. Uso de tijeras estériles cortar las esponjas de gelatina rehidratado en trozos de igual tamaño de alrededor de 1 cm2. Transferencia de 1 pedazo de esponja con unas pinzas en cada pocillo de una placa de cultivo. Añadir 3-4 mL de CMT en cada pocillo de una placa de 6 pozos (amígdalas) y 1 mL por pozo en una placa de 12 pozos (cuello uterino). Coloque las placas en la incubadora, situado en 37 ° C, 5% CO2, ≥ 90% de humedad, hasta que los explantes de tejido están listos para ser cargados en las esponjas.
    Nota: El volumen de CMT a insertar en la placa debe ajustarse al grosor de la esponja para mantener los explantes en la interfase líquido-aire.

2. disección del tejido amigdalino humano

Nota: Las amígdalas deben procesarse lo más pronto posible después de la cirugía, idealmente el mismo día de la cirugía. Alternativamente, las muestras pueden dejarse durante la noche sumergida en el CMT a 4 ° C.

  1. Deje el CM tiempo suficiente para alcanzar la temperatura ambiente (RT) o ponerlo en un baño de agua previamente calentada a 37 ° C. Suplemento el CM con la solución antibiótica (CMT) antes de su uso. Deseche cualquier solución antibióticos sobrado. Vierta la solución de etanol 70% en un recipiente limpio para absorber pinzas y bisturí cuando sea necesario durante el procedimiento de disección. Limpiar las herramientas y cambiar la hoja de bisturí entre las disecciones de muestras procedentes de diferentes donantes.
  2. Transferir las amígdalas de los contenedores de transporte en un 100 mm-placa de Petri que contiene 10-20 mL de CMT utilizando pinzas estériles.
    Nota: Las muestras con áreas generalizadas de cauterizar, sangre o tejido necrótico debe ser desechado.
  3. Utilice la tapa de la caja Petri como superficie de corte para disecar el tejido. Sujeta suavemente el tejido con pinzas, corte cada amígdala en varios pedazos grandes, utilizando cuchilla y bisturí estéril.
    PRECAUCIÓN: Manejo herramientas afiladas para disecar los especímenes humanos incrementa el riesgo de lesiones y contaminación. El operador debe considerar uso de metal, malla, guantes resistentes a los cortes como protección adicional.
  4. Quitar cauteriza, sangrienta y tejido fibroide y partes que contienen tonsilloliths (material calcificado) o con color verde-amarronado usando pinzas y bisturí.
    Nota: Mientras trabajaba en una sola pieza de tejido, es importante mantener el resto del tejido sumergido en medio para evitar la desecación del tejido.
  5. Cortar cada pieza de tejido de unos 2 mm de espesor. Retire cualquier parte no deseada al igual que en el paso anterior. Cortar las rebanadas de tejido en franjas de 2 mm de espesor. Cortar las tiras de tejido en 2 bloques de la mm de espesor. Esto debe resultar en explantes de tejido de aproximadamente 8 mm3.
  6. Transferencia de los explantes en una nueva placa de Petri de 100 mm que contiene 10-20 mL de CMT para evitar la desecación del tejido al mismo tiempo de continuar con la disección. Al final de la disección, agitar la placa para aleatorizar la distribución del explante. Lugar 9 tejidos de explantes encima de cada esponja de gelatina en una placa de 6 pozos con unas pinzas, dejando espacio entre ellos. Devolver las placas en la incubadora.
    Nota: Normalmente, los explantes se cultivan durante la noche y la inoculación de cultivos con HIV-1 se realiza al día siguiente. Esto es para asegurarse de que no hay contaminación bacteriana o por hongo se desarrolla en la cultura. Además, las células tienden a salida de explantes de tejido amigdalino después de la disección. Este proceso se completa en gran parte dentro de las primeras 24 h de cultivo1.
  7. Deseche todos los residuos biológicos en contenedores oportuno normativas del Instituto sobre el manejo de productos biológicos peligrosos y la evaluación del riesgo específico.

3. infección del tejido amigdalino explantes con HIV-1

Nota: Para reducir la variabilidad de resultados entre experimentos independientes, la misma preparación de virus puede usarse para un estudio completo. Virus puede ser propagado en células mononucleares de sangre periférica activada de forma exógena y luego la cultura sobrenadante puede ser alícuotas para el almacenamiento a-80 ° C evitar la repetida congelación y descongelación (Tabla de materiales).

  1. Poner los CM en un baño de agua previamente calentado a 37 ° C. Suplemento el CM con la solución antibiótica (CMT) antes de su uso. Deseche cualquier solución antibióticos sobrante.
  2. Aspirar el medio de la placa de 6 pozos con una pipeta y deséchelo en un recipiente con solución desinfectante. Inclinación de la placa y empuje suavemente las esponjas de gelatina en la parte superior del pozo para permitir que el medio reunir en la parte inferior y aspirar y deséchela. Añadir 3-4 mL de CMT a cada pocillo.
  3. Descongelar la preparación del virus VIH-1 en el baño de agua a 37 ° C. Si es necesario, diluir el stock de virus con CM (tabla 1).
    Nota: El stock de virus debe ser diluido para que el inóculo seleccionado está contenido en un volumen de 5 – 8 μl (tabla 1). Para una infección eficiente, es fundamental utilizar el tiempo mínimo requerido entre descongelar la preparación del VIH-1 y que infecta tejidos de explantes.
  4. Pipeta el inóculo de virus directamente encima de cada uno de los 9 explantes en una esponja de gelatina. Vuelva la placa a la incubadora tan pronto como se termina la infección. Deseche cualquier preparación de virus residual. Continuar a la sección 5.
    Nota: Para proporcionar con precisión el inóculo de virus el operador debe considerar usando una técnica de pipeteo inversa y cambiar la punta para cada pozo. Se trata de empujar el émbolo de la pipeta a la posición de purga (la segunda parada) para elaborar el inóculo de virus, y empujar hasta el primer tope para entregar el inóculo, que ayuda a reducir al mínimo la formación de burbujas y el error asociado con muestreo repetitivo de pequeños volúmenes, es decir, 5 – 8 μl.

4. disección e infección de Mucosa Cervical uterina

Nota: Para obtener resultados óptimos, explantes de mucosa cervical deben ser procesados e infectados tan pronto como sea posible después de la cirugía, idealmente el mismo día de la cirugía. Alternativamente, las muestras se pueden almacenar sumergida en el CMT a 4 ° C durante la noche e infectadas inmediatamente después de la disección.

  1. Deje el CM tiempo suficiente para llegar a RT o ponerlo en un baño de agua previamente calentada a 37 ° C. Suplemento el CM con la solución antibiótica (CMT) antes de su uso. Deseche cualquier solución antibióticos sobrante. Vierta la solución de etanol 70% en un recipiente limpio para absorber las pinzas y bisturí cuando sea necesario durante el procedimiento de disección. Limpiar las herramientas y cambiar la hoja de bisturí entre las disecciones de las muestras de donantes múltiples.
  2. Utilizando pinzas estériles, transferir la muestra desde el contenedor de transporte en un 100 mm plato de Petri con 10 – 20 mL de CMT.
  3. Utilice la tapa de la caja Petri como superficie de corte para disecar el tejido. Sosteniendo el tejido suavemente con unas pinzas, separar la mucosa de la ectocérvix y endocérvix debajo estroma y tejido muscular (submucosa) con un bisturí y hoja para obtener tiras de mucosa.
    Nota: Mientras trabajaba en una sola pieza de tejido, es importante mantener el resto del tejido sumergido en medio para evitar la desecación del tejido.
  4. Cortar 2 tiras de mm de ancho de la mucosa, retire y deseche tanto submucosa como sea posible, dejando sólo una capa de espesor mm 2 de tejido. Cortar las tiras de 2 mm de espesor bloques. Esto debe resultar en explantes de tejido de aproximadamente 8 mm3.
    PRECAUCIÓN: Manejo herramientas afiladas para disecar los especímenes humanos incrementa el riesgo de lesiones y contaminación. El operador debe considerar uso de metal, malla, guantes resistentes a los cortes como protección adicional.
  5. Transferencia de explantes de tejido en una nueva placa de Petri de 100 mm que contiene 10-20 mL de CMT para evitar la desecación del tejido al mismo tiempo de continuar con la disección. Al final de la disección, agitar la placa para aleatorizar la distribución del explante.
  6. Con pinza estéril, transfiera los explantes en estériles tubos cónicos de 1,5 mL (máximo 16 explantes por tubo). Retire cualquier medio en el tubo con una pipeta.
  7. Descongelar la preparación del VIH-1 en un baño de agua a 37 ° C. Si es necesario, diluir el stock de virus con CM. transmisión del virus en los tubos que contienen los explantes. Deseche cualquier preparación de virus residual.
    Nota: El stock de virus debe ser diluido para que el inóculo seleccionado está contenido en un volumen de 0.5 mL mínimo (tabla 1). Para reducir la variabilidad de resultados entre experimentos independientes, puede usarse la misma preparación de virus para un estudio completo (Tabla de materiales).
  8. Transferir los tubos a un termo agitador e incubar por 2 h a 37 ° C, oscilando a 300 rpm. Invertir suavemente los tubos algunas veces cada 30 – 60 min.
    Nota: Para una infección eficiente, es fundamental utilizar el tiempo mínimo requerido entre el VIH-1 preparación de descongelar y transferir los tubos a 37 ° C.
  9. Llenar una placa de 6 pozos con 3-4 mL por pocillo de solución salina tampón estéril de fosfato (PBS). En el de la incubación con HIV-1, deseche toda preparación de virus en los tubos en un recipiente con solución desinfectante con ayuda de una pipeta. Transferencia de los explantes en la placa de 6 pozos que contiene PBS utilizando fórceps.
  10. Permite los explantes descansar en PBS durante 1 min a temperatura ambiente y luego lavarlos transfiriendo suavemente hacia arriba y abajo el PBS en el pozo 2 - 3 veces. Descartar el PBS en un recipiente con solución desinfectante con ayuda de una pipeta. Añadir 3-4 mL de PBS nueva a cada pocillo. Repita dos veces más para un total de tres lavados. Descartar el PBS antes de transferencia de los explantes a las esponjas para evitar la desecación del tejido.
    Nota: Explantes de mucosa cervical y en particular endocervix, liberan grandes cantidades de moco durante la infección. Es fundamental lavar y quitar tanta mucosidad como sea posible porque retención inespecífica en explantes y posterior liberación del virus en el sobrenadante de cultivo puede enmascarar la replicación del virus.
  11. Con unas pinzas, transferencia de explantes de 5-8 en la parte superior cada esponja de gelatina en una placa de 12 pozos. Vuelva la placa a la incubadora.
  12. Deseche todos los residuos biológicos en contenedores oportuno normativas del Instituto sobre el manejo de productos biológicos peligrosos y la evaluación del riesgo específico.

5. Histoculture

  1. Cambiar el CM cada 3 días a partir del momento de la infección hasta el día 12 – 15 post infección. El CM o explantes pueden probarse a intervalos regulares a lo largo del tiempo de la cultura para evaluar la replicación del VIH-1, entre otros parámetros.
  2. Poner los CM en un baño de agua previamente calentado a 37 ° C.
    Nota: No se requiere para complementar el CM con solución de antibióticos en esta etapa.
  3. Recoger una muestra de CM con una pipeta y transferir a estéril 1.5 o 2 tubos de tapón de rosca de mL para almacenamiento a-80 ° C.
    Nota: El CM de repetición pozos están agrupados en la colección.
  4. Cosecha los explantes de tejido con pinzas estériles, quitar el exceso medio de explantes, colocando en un pedazo de papel (opcional) y transferencia de los explantes en estéril 1.5 ó 2 mL tubos de tapón de rosca. Procesar o almacenar las muestras de tejido como sea necesario por el experimento.
    Nota: Para citometría de flujo, los explantes son digeridos inmediatamente con un cóctel enzimático para obtener una suspensión unicelular (para más detalles ver referencias 1, 9, 16 y 17). Para la extracción de RNA, los explantes se mantienen en una solución de estabilización de RNA a 4 ° C durante la noche antes de almacenarlas a-80 ° C. Para la extracción de ADN o en situ tinción (cuello uterino), explantes pueden ser complemento congelado en nitrógeno o hielo seco y etanol líquido de la mezcla y almacenados a-80 ° C. Alternativamente, pueden ser fijo tonsillar explantes por inmersión en una solución de PBS y un 4% de paraformaldehído en situ tinción.
  5. Aspirar el CM residual en el pozo con una pipeta y deséchelo en un recipiente con solución desinfectante. Inclinación de la placa y empuje suavemente las esponjas de gelatina en la parte superior del pozo para permitir que el medio de que se reúnen en la parte inferior y luego aspirar y deséchelo.
  6. Añadir 3-4 mL de CM a cada pocillo. Utilizando pinzas estériles, devolver que los tejidos de explantes que cayó en el medio de la esponja de gelatina. Vuelva la placa a la incubadora.
  7. Al final de la cultura, elimine todos los desechos biológicos en contenedores oportuno normativas del Instituto sobre el manejo de productos biológicos peligrosos y la evaluación del riesgo específico.

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Representative Results

Varias técnicas se pueden utilizar para evaluar la replicación del VIH-1 en tejidos de explantes. Nuestra lectura estándar es medir la cantidad de HIV-1 p24gag publicado en CM en el tiempo con un inmunoensayo18.

Explantes de tejido de donantes diferentes, infectados con el mismo inóculo del mismo stock de VIH-1, pueden producir diferentes cantidades de virus (tabla 1). Esto es debido a varios factores, como el número y estado de las células de la blanco HIV-1 y la presencia de co infección de patógenos en el tejido16,19. En la figura 1, nos proporcionan un ejemplo de infección por VIH-1 productivo y abortiva de explantes de mucosa cervical tal como se define por la cantidad de p24gag publicado en CM comparado con explantes emparejó a donantes tratados con el fármaco antirretroviral del lamivudina (3TC) completamente suprime la replicación del VIH-1. Aunque este control parece superfluo para la infección de explantes de tejido del donante en el A, ayuda a discriminar abortiva (B) de la infección productiva (C) en explantes que producen bajos niveles de replicación del VIH-1.

El uso de un medicamento antirretroviral como una condición de control puede ser útil para el estudio de infección por VIH-1 en tejidos que albergan números bajos de células blanco, como la mucosa cervical y cuando se utiliza replicación lenta variantes VIH-1, como algunos aislamientos primarios. Además, para los tejidos infectados por estos virus, es importante considerar el uso de métodos de detección más sensibles, por ejemplo qPCR.

Figure 1
Figura 1 : Replicación de VIH-1 en la mucosa cervical de explantes de tres donantes de tejido diferentes. Se muestreó el tejido cervical explantes fueron infectados con el mismo inóculo de HIV-1BaL por inmersión en la acción de virus y cultivados durante 15 días en la presencia o ausencia del droga antiretroviral del lamivudina (3TC) a la concentración 10 μm. de medio de cultivo cada 3 días y las muestras de pozos replicadas se agruparon en colección de análisis de la replicación del VIH-1 por inmunoensayo degag p24 de VIH-1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tipo de tejido Virus de la Inóculo por explante (pg de HIV-1 p24gag) No. de los explantes Volumen de medio de cultivo (mL) No. de pozos (técnica replica) Producción degag p24 de VIH-1 (ng/mL)
Tonsillar HIV-1BaL 350 – 500 9 3-4 2 – 3 1-10
VIH-1LAI.04 9 3-4 2 – 3 1 – 100
Cervical HIV-1BaL 1.500 – 2.000 8 1 2 1 – 5
VIH-1LAI.04 8 1 2 indetectable

Tabla 1: valores de HIV-1 inóculo para la infección de explantes de tejido y producción de virus de referencia. El valor de VIH-1 inóculo por explante tejido individual se refiere a las poblaciones de virus en la concentración de 50-70 ng/mL: se utiliza un volumen de 7 μl de caldo puro virus para infectar cada explante tonsillar encima de una esponja de gelatina; un volumen de 500 μl del stock de virus no diluido se utiliza para infectar 16 explantes cervicales por estar sumergido en un tubo de 1,5 mL. Explantes cervicales extensivamente se lavan en PBS antes de transferirlas a esponjas de gelatina. El valor de la producción de VIH-1 de explantes de tejido se refiere a la cantidad acumulada de p24gag publicado por 8 explantes en 1 mL (cuello uterino), o 9 explantes en 3-4 mL (amígdalas) de medio de cultivo (CM) muestreado cada 3 días durante 12-15 días de la cultura. CM de pozos replicadas se agruparon en colección para cada punto de tiempo antes de reemplazar con CM fresco. El valor de p24gag la concentración medida en el día 3 se excluyó del análisis porque es parcialmente responsable del absorción del virus en explantes y posterior liberación en CM, es decir, el remanente de inóculo. Típicamente, la infección de tejido cervical con VIH-1LAI.04 no conduce a la replicación de VIH-1 perceptible en nuestro sistema experimental16.

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Discussion

El uso de tejido humano explantes para el estudio de la infección VIH-1 proporciona ventajas sobre los tradicionales sistemas experimentales bidimensional y monotípicos, como células primarias o líneas celulares, debido a su capacidad superior para reproducir las interacciones intercelulares y celular (p. ej., producción de citoquinas) funciona como en vivo. Sin embargo, tejido tonsillar y cervical difieren en muchos aspectos incluyendo el número y características fenotípicas y funcionales de VIH objetivo las células1,16. Por la misma razón, variantes de VIH-1 con tropismo del co-receptor diferentes (por ejemplo, de HIV-1 CCR5-trópicoBaL vs trópico CXCR4 HIV-1LAI.04) realizan diferente tanto en las amígdalas y el cuello uterino (tabla 1). La distribución de los correceptores del VIH en las células Diana en el inductivo inmune y efectoras sitios sólo parcialmente responsable local susceptibilidad a la infección: las células T CD4 que CXCR4 son más abundantes que las células expresan CCR5 en el tejido amigdalino, así explicar mayores niveles de replicación del VIH-1LAI.04 de HIV-1BaL, pero los receptores están igualmente representados en la mucosa cervical16. Sin embargo, rara vez detectamos replicación del virus productivo en el tejido cervical con VIH-1LAI.04, que coincide con la transmisión preferencial de variantes de VIH-1 CCR5-trópico individuales observados en vivo20 . Esto sugiere que el estado de diferenciación y activación de las células de la blanco HIV-1 puede determinar en última instancia su capacidad de soporte de la replicación del VIH-116.

Esponjas de gelatina son dispositivos hemostáticos obtenidos de piel porcina purificada (colágeno), que están diseñados para ser totalmente absorbido por el cuerpo humano después de unas semanas. Se recomienda utilizar productos que muestran la tasa de degradación lenta en la cultura como él se adapta mejor la finalidad de mantener explantes de tejido en la interfase aire-líquido durante 2-3 semanas. También se recomienda probar diferentes lotes del mismo producto para evaluar el desempeño constante en la cultura del explante.

Del mismo modo, el tipo y lote de suero bovino fetal (FBS) pueden afectar niveles de replicación del VIH-1. Aconsejar pruebas de varios lotes de equipos para optimización de CM y use el mismo lote de equipos para un estudio completo. Forma rutinaria prueba FBS en explantes de tejido de 10 donantes y seleccione el lote que da la mayor replicación de VIH-1.

Para la mayoría de los experimentos, la piscina de explantes del endocérvix y exocérvix a maximizar el número de condiciones experimentales. Uno puede considerar mantenerlos separaron debido a sus características estructurales e inmunológicas diferentes21. Además, endocervical explantes liberación y continúan produciendo una gran cantidad de moco en la cultura que pudiera interferir con el análisis de aguas abajo. Ya que el área cubierta por el endocérvix es mucho menor que el exocérvix, es un reto para llevar a cabo experimentos de infección VIH exclusivamente sobre la mucosa endocervical con un adecuado número de explantes y técnica Replica.

Realización de infección por VIH-1 por inmersión de los explantes cervicales maximiza las posibilidades de obtener una infección productiva debido al número bajo de células T CD4 presentes en la mucosa en comparación con el tejido linfoide. Por la misma razón, el tejido del cuello uterino es más sensible al almacenamiento durante la noche y produce mayor replicación de VIH-1 cuando poco después de la cirugía e inmediatamente después de la disección. Aunque la infección por inmersión en la acción del virus puede realizarse también para que el tejido amigdalar asegurar una exposición uniforme de los explantes al virus, este enfoque implica mayor pérdida de tejido célula y manipulación que la infección de los explantes en esponjas de gelatina como se describe en el protocolo.

Sistemas de polarizado de desafío de VIH-1 y la cultura de tejidos mucosa existen y actualmente se utilizan en otros laboratorios3,22,23,24,25. Aunque estos sistemas son un valioso modelo de entrada del VIH-1 y la penetración en la mucosa, su configuración es generalmente más desperdiciadores de tiempo y puede requerir manipulación extensa del tejido. Modelos no polarizados de mucosa transmisión patogenia todavía ofrecen una plataforma válida para investigar la regulación de la replicación del VIH-1 y la piscina local de células infectadas por el VIH por factores endógenos y exógenos9,17 , 26, incluyendo drogas12,13,14,15.

Variabilidad entre donante puede representar un problema importante para la reproducibilidad del resultado entre experimentos independientes llevados a cabo utilizando a muestras de donantes múltiples. Variabilidad en la composición celular también puede afectar a áreas dentro de la misma muestra, es decir, la variabilidad intra-donantes. Para reducir la variabilidad e interpretar correctamente los resultados, es fundamental establecer todas las condiciones dentro de un experimento utilizando un número adecuado de explantes obtenidos del mismo donante (donante emparejado condiciones). Resultados pueden ser normalizados a un control interno al compilar datos de múltiples experimentos para el análisis estadístico. Para reducir la variabilidad intra-donante, recomendamos como mínimo 2 repeticiones técnicas para cada condición experimental, para un total de 18 explantes de tejido amigdalino (9/bien) y 10-16 explantes de mucosa cervical (5-8/bien) (tabla 1). La disponibilidad de registros médicos y la inclusión de análisis adicional de la paciente material y condiciones experimentales, por ejemplo a la dirección el estado inflamatorio de un espécimen, pueden mejorar significativamente la interpretación del resultado (ver referencia 9 un ejemplo).

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación Blanceflor Boncompagni Ludovisi nee Bildt (http://blanceflor.se/), los médicos suecos de la Fundación contra el SIDA (http://www.aidsfond.se/, Ref. FOa2014-0006) y Fondazione Andrea e Libi Lorini (http : / / fondazionelorini.it/) a Andrea Introini.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gelfoam 12-7 mm Absorbable gelatin sponge  Pfizer NDC:  0009-0315-08 Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue.
SPONGOSTAN Standard 70 × 50 × 10 mm Absorbable haemostatic gelatin sponge Ferrosan Medical Devices MS0002 Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue.
RPMI 1640 with phenol red and glutamine ThermoFisher Scientific 21875034 To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).
Modified Eagle's medium (MEM) non-essential aminoacids (100x) ThermoFisher Scientific 11140035 To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).
Sodium pyruvate, 100 mM (100x)  ThermoFisher Scientific 11360070 To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).
Gentamicin 50 mg/mL (1000x)  ThermoFisher Scientific 15750037 To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).
Amphotericin B 250 μg/mL (100x)  ThermoFisher Scientific 15290018 To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).
Fetal bovine serum (FBS)  To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).
Ticarcillin disodium salt Sigma-Aldrich T5639-1G Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3 g) and potassium clavulanate (100 mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT.
Potassium clavulanate Sigma-Aldrich 33454-100MG Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3 g) and potassium clavulanate (100 mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT.
Sterile phosphate buffer saline (PBS) pH 7.4 w/o calcium, magnesium and phenol red To use for storage and transportation of surgical specimens. PBS can be replaced with another isotonic solution with physiologic pH. Culture medium is best for overnight storage. 
Sterile cell culture grade water
Sterile transportation container
70% ethanol solution
Disinfectant solution for biological waste disposal
Sterile metal forceps or tweezers
Sterile metal scissors
Sterile flat weighing metal spatula
Sterile scalpels and blades
6-well cell culture plates
12-well cell culture plates
Sterile Petri dish, 100 mm × 20 mm
Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1BaL NIH AIDS Reagent Program 510 The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 °C. Avoid repeated freezing and thawing.
Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1LAI.04 NIH AIDS Reagent Program 2522 The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 °C. Avoid repeated freezing and thawing.
Lamivudine (3TC) NIH AIDS Reagent Program 8146 Resuspend in DMSO at 10 mg/mL, aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing.
Biological safety cabinet
Water-jacketed CO2 incubator, set at 37 °C, 5% CO2, ≥ 90% humidity
Water bath set at 37 °C
Sterile 1.5 and 2mL screw cap tubes
Dry bath shaker with heating block for 1.5 mL tubes, set at 37 °C, 300 rpm

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References

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Comments

2 Comments

  1. Hello, I want to make a Timentin solution (Ticarcillin sodium and potassium clavulanate) for use it in cell culture. I see that you prepare it in sterile cell culture grade water BUT the safety information of the product for Potassium clavulanate says: "Reacts violently with water., Risk of explosion if heated under confinement." So How can I make the solution? Your indications are: To resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3 g) and potassium clavulanate (100 mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. Did you have some problems with the Potassium clavulanate and the water?
    Thank you so much. Paula

    Reply
    Posted by: Paula L.
    October 29, 2018 - 3:22 PM
  2. Dear Paula
    Thank you for bringing this up. As you mentioned in your comment Timentin is the trademark name of a mixture of tircacillin disodium and potassium clavulanate that is reconstituted in water as per manufacturer instructions. This mix has been the antibiotic of choice for tonsil culture in the Margolis’ lab for many years, and it was also used by reconstituting individual antibiotics in water, as indicated in the material table, at the Karolinska Institutet to effectively control bacterial contamination in culture. I recommend that you check with the manufacturer about specific instructions for reconstituting potassium clavulanate, although I have never experienced a problem by preparing a solution of tircacillin disodium in water and then using that to reconstitute potassium clavulanate.
    In general, you may want to optimize your explant culture system by testing a number of antibiotics and select that is more convenient to use and works well for your specimens, depending on their nature, e.g. tonsillectomy for recurrent infection vs obstructive pathology, how clean the specimen is handled after surgery, etc. Be aware that you may experience seasonal variations in the rate of culture contamination through the year, especially with specimens from kids. Good luck!
    Andrea Introini

    Reply
    Posted by: Andrea I.
    November 2, 2018 - 12:53 PM

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