Yalıtım Protokolü fare monosit kaynaklı dendritik hücreler ve onların sonraki Vitro harekete geçirmek ile tümör bağışıklık kompleksleri

* These authors contributed equally
Cancer Research

Your institution must subscribe to JoVE's Cancer Research section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Monosit kaynaklı DC (MoDC) tehlike ilişkili molekülleri küçük miktarlarda hissi olabilir ve bu nedenle kolayca astarlanmalıdır. MoDC yalıtım kan ve tümörleri ve onların harekete geçirmek bağışıklık kompleksleri ile onların erken harekete geçirmek önlemek için düşünülmesi gereken önemli önlemler vurgulayarak süre için detaylı bir protokol sağlar.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Santana-Magal, N., Rasoulouniriana, D., Saperia, C., Gutwillig, A., Rider, P., Engleman, E. G., Carmi, Y. Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes. J. Vis. Exp. (135), e57188, doi:10.3791/57188 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Dendritik hücreler (DC) onların hücre zarı işaretleyicileri, geçiş desen ve dağıtım ve antijen sunumu ve T hücre harekete geçirmek kapasiteleri farklı türdeş olmayan hücre popülasyonlarının vardır. Deneysel tümör modellerin çoğu aşıları DC milyonlarca gerektiren bu yana, dalak ve kemik iliği yaygın olarak izole edilmiştir. Ancak, bu DC önemli ölçüde farklı kan ve tümör verdikleri yanıtlara DC bağışıklık kompleksleri (IC) ve muhtemelen diğer Syk birleştiğinde lektin reseptörleri. Önemlisi, DC duyarlılığını tehlike ilişkili moleküllerin göz önüne alındığında, endotoxins veya crosslink harekete geçirmek reseptörleri birinde yalıtma, adım adım yol gösteren antikor varlığı neden DC astar içinde ve böylece Parametreler etkiler ya da en azından Dozaj, onları harekete geçirmek için gerekli. Bu nedenle, burada biz onların erken harekete geçirmek kaçınırken kan ve tümör oluşmuş MoDC izole için detaylı bir protokol tanımlamak. Buna ek olarak, bir protokol ile tümör IC MoDC harekete geçirmek ve onların daha sonraki analizler için sağlanır.

Introduction

Onların keşif beri dendritik hücreler (DC) kapsamlı bir araştırma T hücre farklılaşması1eğriltmek için benzersiz yetenekleri nedeniyle bir odak noktası olmuştur. Son birkaç on yıl içinde bir kapsamlı bir araştırma çaba tümör ilerleme ve bağışıklık 2sırasında çeşitli DC alt kümeleri ve işlevleri tanımlamak araştırmıştır. DCs onların örüntü tanıma reseptörleri, doku dağıtım, birbirinden farklı türdeş olmayan hücre popülasyonlarının oluşan ve göçmen ve antijen sunumu yetenekleri3,4,5. Diğer DC alt kümeleri için karşılaştırıldığında, monosit kaynaklı DC (MoDC) tümörleri içinde çok daha bol ve döngüye girmesini kolayca oluşturulabilir veya tümör infiltre monosit6,7. Bu nedenle, onların göreceli yaygınlık yararlanmak isteyen birçok klinik T hücre bağışıklık 8,9temin için otolog MoDC vivo içinde ve ex vivo manipülasyon temel alır.

Benzer şekilde, DC-esaslı aşı deneysel tümör modelleri 2-3 seri enjeksiyon, 5-7 gün arayla 1-2 x 10 gerektirir harekete geçirmek DC geniş puls tümör antijenleri ile6 . Bu nedenle, bu sayıda DC elde etmek için çoğu fare çalışmalar öncelikle 7-9 gün (IL-4 Fare ayarlarında gerekli değildir) kemik iliği (BM) GM-CSF kara filmin tarih öncesi gelen kültürlü MoDC kullandım10,11. Yine de, bu GM-CSF nakavt fareler var genel olarak normal DC yuvası 12,13ve o kültürü, elde edilen karışık nüfus göz önüne alındığında14 bu DC fizyolojik alaka soru içine çağrıldı.

Alternatif olarak, DC dalak hücrelerden rutin olarak izole olabilir. Ancak, DC oluşturan yaklaşık 0,3-%0,8 Toplam dalak hücre (yaklaşık 7 x 105 ' te DC/dalak kaynaklanan) ve bu hücreler, sadece CD103+ DC ve MoDC lenfoid organlar için geçiş. Dalak DC nüfusu15,16yaklaşık % 10-15 MoDCs oluşturan beri çoğu yalıtım protokolleri yaklaşık 1 x 10-5 MoDC dalak verim. MoDC genişleme GM-CSF, dalak MoDC17100-fold bir artış sonuçlanan salgılar transfected B16 hücreleri enjekte edilerek elde edilebilir. Bu yordamı insanlar ve elde edilen mümkün değil ancak, DC aşı geliştirmek için MoDC kullanımı sınırlı vardır MoDC zaten çok aktif.

Yeterli adet DC elde etmek ek olarak, otolog kanser hücrelerine karşı etkili DC aşı geliştirmek için başka bir sorun tam olarak DC etkinleştirmek için yeterli tehlike sinyalleri tümör ortamda eksikliği içerir. İndüksiyon co-stimulatory sinyal genellikle örüntü tanıma reseptörleri (PRR) veya c tipi lektin sinyal yolları18,19,20,21aktivasyonu ile elde edilir. DC etkinleştirmek için başka bir yaklaşım yeteneklerini antijenleri yüzey Fcγ reseptörleri (FcγR) ile etkileşimleri aracılığıyla almak için kullanır. Gerçekten de, bir dizi önemli el yazmaları göstermiştir MoDC enjeksiyon BM öncüleri harekete geçirmek ile gelen tümör-IC IgG ki tümör büyüme profilaktik ayarlarında engelleyebilir ve kurulan tümörler22,23 ortadan kaldırılması için yol açabilir .

İki son gazetelerde Carmi BMDC ve dalak DC aksine, MoDC kan ve tümör ek uyaranlara karşı IgG IC yanıt veremiyor keşfetti. Bu FcγR24,25sinyal düzenleyen Tirozin fosfatazlar yüksek hücre içi düzeyde varlığı nedeniyle bulundu. DC'de kritik bir denetim noktası tanımlayarak, bu eser başarılı DC-esaslı aşı için gereksinimleri önemli bir içgörü sağladı. Sinyal ve muhtemelen benzer bir fosforilasyon çağlayan kullanan diğer lektin reseptörleri sinyal FcγR etkinleştirmek ek bir çekim gücü gereksinimini böylece DC astar onların yalıtım sırasında kaçınmak gereğini vurgular.

Bu nedenle, mevcut protokol MoDC yalıtım kan ve belirgin BM ve dalak DC farklı, tümör açıklar ve önlemler işlemi sırasında dikkate değer vurgulamaktadır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Fare MoDC yalıtım için aşağıdaki protokolleri bakın, henüz genel ilkeleri diğer DC alt kümeleri hücreleri için de geçerli olabilir. 12 - 16-hafta-yaşlı C57Bl/6j fareler bir Amerikan Derneği Akreditasyon laboratuvar hayvan bakımı-akredite hayvan tesisi için muhafaza. Tüm iletişim kuralları Stanford Üniversitesi ve Tel-Aviv Üniversitesi Kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi tarafından kabul edildi.

1. yalıtım tümör monosit kaynaklı DC ilişkili

  1. Laminar akış başlıklı tümörler CO2 ötenazi fareler kaldırmak ve fetal Sığır serum (FBS) olmadan RPMI orta tümör yer.
    Not: Fareler tıraş ve onları potansiyel contaminations kürk üzerinden en aza indirmek için tümörleri, kaldırmadan önce % 70 etanol ile sprey için önerilir. Daha büyük tümörler genellikle kırılgan ve hücre ölümü geçmesi eğilimli daha az DC beri tümör 25-40 mm2 geçmediği emin olun. Daha büyük adet DC gerekiyorsa, her fare tümör hücreleri birden çok site ile enjekte edilebilir.
  2. Steril bir laminar başlık altında küçük parçalar halinde (yaklaşık 1 x 1 mm2) cerrahi makas kullanarak tümör doğrayın.
    1. 5 mL Hank'in de içeren bir 30 mL steril düz-alt tüp manyetik heyecan çubuklarla içine bir fare tüm tümör parçalardan dengeli tuz solüsyonu (HBSS), 2 mg/mL collagenase IV ve 0.01 mg/mL DNaz ekleyin ben.
      Dikkat: Myeloid hücrelerin glikozilasyon, kararlı duruma altında bile yoluyla enerji üretmek. Bu nedenle, 10-15 dk kadar az glukoz açlık olarak glikoz (örneğin HBSS, RPMI ve DMEM) içeren tek kullanım medya hücre ölümü ve Apoptozis 24 h sadece düşük endotoksin collagenase IV, collagenase gram-pozitif tarafından üretilen kullanım içinde neden olur bakteri (Clostridium histolyticum).
  3. Yaklaşık 200-400 rpm 37 oC kuluçka 20-30 dk için manyetik bir karıştırıcı ile karıştırın.
  4. 5 mL tam medya ekleyin ve şiddetle yeniden askıya.
  5. Hücreleri bir 70 µm hücre süzgeç aracılığıyla filtre. 4 oC 400 rcf hücreleri cips için 5-10 dakika için santrifüj kapasitesi.
    Dikkat: bazı tümör nekrotizan ve hücre artıkları veya hücre dışı matriks nispeten büyük miktarda içerir enzimatik sindirim, doğrudan aşağıdaki hücreleri izole girişiminde bulunmaz. Hücreler yalnızca hücreleri elde etmek için % 15 yoğunluk gradient medyada geçerlidir.
  6. Yoğunluk gradient orta 9 mL 10 x PBS osmolalite ayarlamak için ve % 100 Percoll hisse senedi çözüm elde etmek için 1 mL ile askıya alma. Mix 1.5 mL yoğunluk gradient orta çözüm 8,5 mL HBSS ile stok ve kuvvetle tümör türetilmiş hücre Pelet ile karıştırın. Yavaşça DMEM 2 mL % 15 yoğunluk gradient orta ve oda sıcaklığında 20 dakika için 400 rcf, santrifüj üst katman. Hücreleri bir Pelet tüpün dibinde oluşturacak gibi supernatants atın.
    1. Pelleted hücreleri iki kez onları 10 mL %2 FBS, % 1 penisilin/streptomisin ve 10 mM EDTA (yalıtım arabellek) ve santrifüj 4 oC 400 rcf 5-10dk için hücreleri cips için içeren HBSS yeniden askıya tarafından yıkayın.
    2. Trypan ışık mikroskop altında mavi kullanarak bir hemasitometre üzerinde hücreleri hesaplama.
  7. 1 x 108 hücrelerde yeniden askıya 1 mL yalıtım tampon ve onları 4 oC ile CD11b 30 μL, kuluçkaya+ Birleşik 15dk için manyetik boncuklar.
    Uyarı: Bu DC etkinleştirmek ve hücre ölümüne neden gibi boncuk, CD11c Birleşik kullanmaktan kaçının. FcγRII ve FcγRIII anti-CD16/32 antikorlar ile engelleme girişiminde bulunmaz. Antikorlar engelleme FcγR ligate ve harita kinaz güçlü fosforilasyon teşvik ve DC Başbakan.
    1. 4oC. 5-10 dakika için 400 rcf, yalıtım arabellek ve santrifüj hücre 9 mL ekleyerek fazla ilişkisiz boncuk kaldırmak
  8. Süpernatant Aspire edin ve 1 mL yalıtım arabellek hücrelerde yeniden askıya alma. Hücreleri alışım manyetik sütun üzerinde geçerlidir. Sütun iki kez yalıtım arabellek 3 mL ile yıkayın.
    1. Sütunu mıknatıs kaldırın. Yalıtım arabellek sütuna 6 mL pipet ve pistonu iterek bir steril toplama tüp manyetik olarak etiketli hücrelere dışarı floş. 4 oC. 5-10 dakika için 400 rcf santrifüj hücreleri
    2. Senaryo Özeti 100 μL başına 1 x 107 hücre yeniden askıya alma ve leke aşağıdaki fluorophore Birleşik antikorlar ile: hiza negatif (TCRb, Siglec F, B220, CD19, FceRI ve Ly6G), MHCII, Ly - 6 C.
  9. Hücreleri yan dağılım (SSC) kullanarak küçük hücreler çoğunluğuna göre sıralamak ve ileri dağılım (FSC) ve kültür tam orta 5 ng/mL ile GM-CSF desteklenmiştir. 1 saat 3 7 hücreleri kuluçkaya makrofajlar plaka uygun izni vermesi için oC. O zaman, transferi gevşek ve yeni bir kültür tabak yapışık olmayan hücrelere.
    Not: Fare MoDC CD11b tanımlanır+/CD11c+/MHCIIMerhaba/Ly6Clo/int 7,26,27. Tümör modelleri arasında ve bazı modellerde (örneğin LMP) ifade Ly6C önemli ölçüde değişebilir MoDCs tamamen Ly6C ifade eksikliği. Genel olarak, bir 100 mm3 B16F10 tümör genellikle yaklaşık 4-5 x 106 toplam hücreleri sonuçlanan DC, 5 x 104 içerir. Bu hücrelerin % 10-15 bağışıklık hücreleri ve % 8-10 MoDC. DC sayıları artan tümör birden çok site ile farelere enjekte edilerek elde edilebilir. Sıralama yalnızca küçük SSC/FCS hücreleri, işaretleri CD11c ve Ly6C gibi diğer myeloid hücre olarak ifade edebilir.
    İsteğe bağlı: tümör infiltre monosit Ly6CMerhaba ifade ve MHCII için negatif olan küçük SSC/FSC hücreler olarak sıralayın. Daha sonra monosit vitro 50 ng/DC elde etmek için mL GM-CSF ile kültür.

2. izolasyon monosit kaynaklı DC'den periferik kan

Not: Olgun MoDCs fare kanıyla nispeten nadir olduğundan, aşağıdaki protokol için onların türetme vitro sıralanmış monosit anlamına gelir.

  1. Monosit kan düzeylerini artırmak için fare ile % 4 isoflurane anestezi ve subkutan enjekte (SC) GM-CSF 50 μL PBS içinde 1 μg ile.
  2. 1-2 h sonra CO2kullanarak fare kurban.
    Dikkat: Bu iç kanama neden olur gibi fareler tarafından servikal yerinden çıkması, kurban değil.
  3. Hemen euthanization sonra fareyi % 70 etanol ile sprey ve steril laminar akış başlık altında cerrahi makas kullanarak kalp kapakları deri kaldırmak. Etanol makasla temiz ve kalbin sağ atrium kesti. Yavaş yavaş, 20 mM EDTA bir 10 mL şırınga ve 25-G iğne kullanarak HBSS ile sağ ventrikül kalbine sifonu çek.
    1. Kan ile steril enjektör heparan sülfat ve EDTA içeren bir steril tüpe plevral boşluğundan toplamak. Kalp karaciğer ve haline akciğerleri pembe veya beyaz kadar temizlemek devam edin.
  4. 15 dakika oda sıcaklığında 400 rcf adlı bir yoğunluk degrade mediumand santrifüj kan düşük tut ile uygulanır.
    Uyarı: Kullanım yoğunluğu endotoksin-Alerjik degrade Orta (genellikle az 0,12 EU mL başına).
    1. Mononükleer hücreler yeni bir tüp içine toplamak. Hücreleri 10 ml %2 FBS, % 1 penisilin/streptomisin ve 10 mM EDTA (yalıtım arabellek) ve sonra 4 ocentrifuging içeren HBSS C 400 rcf hücreleri cips için 5-10 dakika için yeniden askıya tarafından yıkayın.
      Uyarı: en az 1 g/M glikoz içeren medya kullanın.
  5. CD11b pozitif seçim için 1 x 108 hücre 1 mL yalıtım arabelleği yeniden askıya almak ve onları CD11b Birleşik manyetik boncuklar 4 oc de 15 dakika 50 μL ile kuluçkaya
    1. Aşırı boncuk yalıtım arabelleği 9 mL ekleme ve 5-10 dk 4 oC. aspiratı az için 400 rcf adlı supernatants centrifuging yıkama ve 1 mL yalıtım arabellek hücrelerde yeniden askıya alma. Hücreleri alışım manyetik sütun üretici yönergelerine göre uygulayın.
    2. Sütunu mıknatıs kaldırın, yalıtım arabellek sütuna 6 mL pipet ve pistonu iterek bir steril toplama tüp manyetik olarak etiketli hücrelere dışarı floş. Senaryo Özeti için 5-10 dk 4 oC. yıkama az 400 rcf santrifüj kapasitesi iki kez ile 3 mL yalıtım arabellek sütun.
    3. 1 x 107 hücreler/100 μL yalıtım arabellek ve aşağıdaki fluorophore Birleşik antikorlar ile leke hücreleri yeniden askıya alma: 0,1 μg CD115, 0,25 μg MHCII ve 0,1 μg Ly-6 C/1 x 106 hücreler.
  6. Hücreleri küçük yan dağılım (SSC) ve küçük ileri dağılım (FSC) hücreleri çoğunluğuna göre sıralayın.
    Not: Fare inflamatuar monosit genellikle CD115 tanımlanan+/MHCIIlo/neg/Ly6CMerhabave monosit devriye CD115 tanımlanan+/MHCIIlo/neg/Ly6Cnegatif 4,5. İki alt kümeleri arasında hiçbir ayrım gerekli olan nerede durumlarda, SSClo/FCSlo/CD115 toplam+/MHCIIlo hücre sıralanır. Naif ve tümörü taşıyan fareler içeren yaklaşık 5-8 x 104 MoDC 1 mL kan ve ilâ başına 4-5 x 105 MoDC şu GM-CSF enjeksiyon. Biri, yaklaşık % 70'i inflamatuar monosit vardır ve % 30 monosit devriye.
  7. 1 x 106 hücre/mL 20 ng/mL ile GM-CSF takıma tam bir medya bir konsantrasyon hücreleri plaka. 1 gün sonra yapışık olmayan ve gevşek yapışık hücreleri transfer için bir yeni plaka ve kültür için ek bir 4-5 gün.
    Dikkat: DC medya pyruvate ile takıma değil.

3. bağışıklık kompleksleri tümör IgG hazırlanması

  1. 75 cm2 kültür şişesi % 70 izdiham tam DMEM medyada için kültür tümör hücreleri.
    1. 2 mL % 0.25 tripsin/EDTA aşırı trypsinization önlemek için hafif bir mikroskop altında kültür şişesi ve monitör hücre morfolojisi hücrelerden ayırmak için ekleyin.
    2. 8 mL (başına tripsin 2 mL) tam kültür ortamının tripsin sindirim inhibe ve, 4 oC, hücreleri cips için 5-10 dakika için 400 rcf santrifüj kapasitesi için ekleyin.
      Not: ticari bir PCR kiti kullanarak Mycoplasma için tümör hücreleri kontrol ettiğinizden emin olun. Ayagin Gram-negatif bakteri ve mantar endotoxins Limulus Amebocyte Lysate (LAL) kullanarak varlığı için test tahlil28). Serum 0,22 mikron filtre ve 9 kod Federal Düzenlemeler virüsler için test gerekir. Ayrıca, test Kültür Medya ve serumlar 37 oC. günde 2 için 100-200 μL LB agar veya et suyu ve kültür üzerine bırakarak
    3. Yıkama hücreleri tekrar Aspire edin onları yeniden 10 mL PBS ve 400 rcf, santrifüj 5-10 dakika süreyle askıya tripsin ve serum kalır dan süpernatant ve yıkama 2 kez daha tekrarlayın.
  2. Arabelleğe alınan % 1.8 paraformaldehyde oda sıcaklığında 10 dakika hücrelerde düzeltmek.
    1. Hücreleri onları 10 mL PBS ve 5-10dk için 4 oC 400 rcf, santrifüj yeniden askıya tarafından yıkayın.
    2. Aspire edin supernatants ve tekrar iki kez daha yıkayın.
      İsteğe bağlı: tümör alımını deneyleri için hücreleri onları 37 oC 1 mikron carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) içeren PBS, 5 min için kuluçka etiketli. CFSE sonra buz 10 min için komple medya ile söndürülür. Hücreleri PBS %2 serum içeren kalan boya kaldırmak için kapsamlı bir şekilde yıkanmalıdır.
  3. FACS arabellek (PBS takıma % 2 FCS ile + 5 mM EDTA) ve anti-CD16/32 0.5 μg/mL hücrelerinde potansiyel non-spesifik protein-protein etkileşimleri engellemek için yeniden askıya alma. Bir U-şekil 96 kuyu/plaka 100 μL başına 1 x 105 hücre bir konsantrasyon, plaka.
    1. Tümör-bağlama antikorların 5 μg - 5 ng/1 x 105 hücreleri arasında değişen farklı dilutions eklemek. Plaka 15-20 dk için buz üzerinde kuluçkaya.
      Not: IgG antikorlar saf 20-24 hafta yaşlı kadın fareler üzerinde protein A sütunları, serum açıklanan24olarak yalıtılmış.
  4. PBS 150 μL ekleyip 5-10 dk 4 oC 400 rcf plaka centrifuging hücreleri yıkayın.
    1. Supernatants atmak ve yıkama iki kez tekrarlayın. 100 μL FACS arabellek fluorophore Birleşik ikincil antikor içeren hücrelerde yeniden askıya alma. Plaka 20 dk için buz üzerinde kuluçkaya.
    2. Yıkama hücreleri 200 μL FACS arabelleği ekleyerek ve 5-10 dakika süreyle 400 rcf plaka centrifuging supernatants atın ve yıkama yineleyin.
    3. Tümör bağlama akış sitometresi tarafından analiz ve hücreleri kat için gerekli en az konsantrasyonu belirlemek.
      Not: ortalama floresans yoğunluğu (MFI) tarafından lekeli tümör hücrelerinin en az beş üzerinde izotip kontrol artırmayın antikorlar sonraki fonksiyonel deneyleri kullanılmamalıdır.

4. MoDC IC tümör IgG ile aktivasyonu

  1. 3.1 3.4.3 aracılığıyla bölümlerde açıklandığı gibi tümör hücreleri en az düzeyde IgG konsantrasyon ile kat
    1. MoDC IC, tümör ile aktive önce bir gün GM-CSF içerir MoDC kültür ortamı değiştirin. Bunu yapmak için yavaşça medya Aspire edin ve hücreleri bir kez önceden ısıtılmış tam kültür medya ile yıkayın.
      Not: İzole olgun tümör ilişkili MoDC en az 2-3 h (veya hatta bir gecede) sıralama sonra GM-CSF olmadan tam medya ve onları IC ile aktive önce kültürlü.
    2. Tümör alımını analizleri, CFSE etiketli tümör IC MoDC için bir oranı 1:5 (IC:MoDC) ekleyin ve gecede 12-16 saat 1 ml 1 x 106 DC başına komple medya için kuluçkaya.
    3. FACS analizleri MoDC harekete geçirmek deneyler için 1:1 (IC:MoDC) oranında tümör-BM ekleyin ve gecede 12-16 saat için kuluçkaya.
      Not: Oldukça iyi, olumlu bir denetimini eklemek için tavsiye edilir hangi MoDC içinde 1 μg/mL ile LPS veya diğer TLR agonistler teşvik vardır.
    4. Gecede harekete geçirmek, takip Aspire supernatants ve yıkama hafifçe üç kez hücreleri yalıtım arabellek veya 10 mM EDTA HBSS.
    5. DC plaka ayırmak için 2-3 dk 1 ml HBSS 10 mM EDTA içeren hücreleri kuluçkaya ve dinç pipetting hücreler bağlantısını kesin.
    6. Senaryo Özeti 400 rcf santrifüj kapasitesi ve 1 x 106 DC ' 90 μL PBS % 2 FCS, 5 mM EDTA (FACS arabellek) ve antikorlar engelleme 0.5 μg takıma yeniden askıya alma. 5-10dk için buz üzerinde kuluçkaya.
    7. Hücreleri antikorları karışıma boyama 10 μL ekleyin ve 15 dakika buz üzerinde kuluçkaya.
    8. Hücreleri ve 5-10dk için 4 oC 400 rcf, santrifüj 2 mL FACS arabellek ekleyin.
  2. Hücreleri 200 μL FACS arabelleği yeniden askıya alma.
    1. 0,5 - eklemek DAPI 1 μg/mL 1-2 dk analizleri ölü hücreleri dışlamak için örnekleri, çalıştırmadan önce. MoDC bu 10-15 dk içinde almak gibi DAPI, aşırı kuluçkaya değil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Biz başlangıçta tümör hücreleri bağlamak için saf syngeneic ve allojenik fareler gelen antikorlar kapasitesine göre. Bu amaçla, B16F10 ve LMP tümör hücre hatları paraformaldehyde içinde sabit ve kapsamlı bir şekilde yıkanmış. B16F10 C57Bl/6 farelerde akciğer Metastazlari üzerinden aslında izole bir melanom hücre çizgi var. LMP olduğunu KrasG12D izole bir pankreas tümörü hücre / + LSI-Trp53R172H / + ve Pdx-1-Cre fare ve giderek 129F1 farelerde büyür. IC elde etmek için tümör hücreleri başına 1 x 105 tümör hücreleri syngeneic veya allojenik IgG buz 2 μg ile 20 dakika inkübe. IgG ve IgM antikorları saf dolaşımdan izole protein A boyutu-dışlama Kromatografi ardından, 20-24-hafta-yaşlı fareler açıklanan24. Hücreleri sonra yıkanmış ve PE-Birleşik fare Anti-fare IgG ikincil antikor ile lekeli ve ortalama floresan yoğunluğu bir akış sitometresi analiz edildi. Şekil 1Aile gösterildiği gibi IgG antikorlar C57Bl/6 allojenik fareler gelen LMP tümör hücreleri ex vivo 129S1 syngeneic fareler antikorlar çok daha etkili bir şekilde bağlı. Benzer şekilde, 129S1 allojeneik IgG ile sabit B16F10, boyama daha yüksek, saf C57Bl/6 fare syngeneic IgG ile boyama için göre on kat daha fazla. İlginçtir, B16 tümörler taşıyan fareler antikorlar ile benzer bağlama kapasitesi buna allojeneik farelerin bile tümör gelişimi sırasında (Şekil 1B) üretmek başarısız oldu.

Sonraki dalak ve BM MoDC DC olan için IC yanıt kan ve tümör karşılaştırmak aradı. MoDC tümör ilişkili yalıtmak için B16F10 tümör enzimatik tek hücre süspansiyonlar elde etmek için ayrışmış. Bağışıklık hücreleri zenginleştirilmiş CD45 manyetik boncuklar kullanılarak ve MoDC daha fazla SSClo/FSClo/CD11c sıralanır+/MHCII+/Ly6Clo tarafından FACS (Şekil 2A). Bu dikkat çekicidir farklı tümörü DC onları tanımlamak farklı işaretleri olabilir. MoDC kandan ayırmaya, dolaşımdaki monosit CD11b Birleşik manyetik boncuklar tarafından zenginleştirilmiş ve daha fazla SSClo/FSClosıralanır / CD115+/MHCIInegatif/lo. Hücreleri sonra GM-CSF 1 günde için kültürlü ve yapışık olmayan ve gevşek yapışık hücreleri yeni bir tabak içine ve kültürlü MoDC (Şekil 2B) elde etmek ek bir 4-5 gün için transfer edildi. Biz BMDC olarak "altın standart" DC birçok fonksiyonel deneyleri yanı sıra dalak MoDC, hizmet, kullanılan bir referans noktası olarak hangi daha fizyolojik bir DC alt yansıtmak. BMDC BM pro-monosit sıralayarak elde (CD11b+/Ly6CMerhaba/CD115Merhaba/MHCIInegatif), GM-CSF, açıklanan24olarak 7 gün boyunca onların kültürü çalışmalarının ardından. Dalak MoDC dalak bir hücre süzgeç aracılığıyla ezme tarafından elde edilen tek hücre süspansiyon yalıtılmış (collagenase ile ön kuluçka dalak MoDC için gerekli değildir), zenginleştirme CD11b Birleşik manyetik boncuklar ile izledi. Hücreleri sonra SSClo/B220negatif/NKp46negatif/CD3negatif/Gr1negatif/F4/80negatif/MHCIIMerhaba/CD11cMerhaba olarak sıralanmış ve 1 saat içinde 37oC için de tam RPMI için kültürlü temel faaliyet geri.

IgG IC etkisi MoDC aktivite araştırmak için izole DC alt kümeleri gecede sabit tümör hücreleri veya allojenik IgG ile ön kaplamalı sabit tümör hücreleri ile inkübe. MoDC veya MoDC (Şekil 3A) tümör ilişkili aksine artan CD86 ve MHCII ifade BMDC veya dalak DC IC ile aktivasyonu sonuçlandı. Alımı CFSE lekeli tümör kaynaklı proteinler, veya allojenik IgG, olmadan yeteneği de karşılaştırıldı. Tarafından confocal mikroskobu gözlemlediği gibi dalak DC tümör kaynaklı proteinler (Şekil 3B) içselleştirmesi için üstün yetenek gösterdi.

Birlikte ele alındığında, bu sonuç tümör DC ve MoDC dalak DC ve BMDC'den farklı alloIgG-BM ile harekete geçirmek için yanıt öneririz. Bu nedenle, aşı stratejileri tümör DC sadece BMDC harekete geçirmek desenlerini üzerinde temel harekete geçirmek istedin.

Figure 1
Şekil 1: Allojeneik fareler var doğal olarak meydana gelen tümör bağlayıcı IgG antikorlar onların tedavülde: A. floresan yoğunluğu (MFI) syngeneic (129S1) ve allojenik (C57Bl/6) saf fareler kandan izole IgG antikorlar ile lekeli LMP tümör hücrelerinin demek. B. syngeneic tümörü taşıyan fareler (C57Bl/6) veya allojenik (129S1) saf fareler dolaşımdan izole IgG antikorlar ile inkübe B16F10 tümör hücreleri floresan yoğunluğu (MFI) demek. Bu rakam genişletilmiş veri 2A ve 2B'yi Karmi Y arkdeğiştirildi. Doğa 521 7550:99-104, 201524.

Figure 2
Şekil 2: sıralama düzeni fare MoDC kan ve B16 tümörleri. A. yalıtım ve fare monosit kültürlü MoDC sıralama düzeni. Confocal mikroskobu DIC görüntüsü enflamatuar ve devriye monosit Kültür (x400) 4 gün sonra. B. yalıtım ve tümör ilişkili MoDC B16 tümörler üzerinden sıralama düzeni. Gecede Kültür (x400) sonra B16 tümörler izole MoDC temsilcisi confocal mikroskobu DIC görüntüsü. Bu rakam ek Şekil 1 Karmi Y ve ark. JCI fikir 1:18:e89020, 201625değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: dalak üzerinden MoDC ve BM etkinleştirme tümör daha farklı desenleri görüntüler ve kuluçka IC ile takip MoDC kan. A. MHCII ve CD86 ifade gecede ile inkübe DC tarafından akış sitometrik Analizi tümör-IgG IC. B. Confocal immünhistokimya tümör alımı (yeşil) ve MHCII ifade (kırmızı) DC tarafından bir gecede CFSE etiketli tümör IC ile inkübe. Bu rakam rakamlar 3A ve 3DCarmi Y ve ark. değiştirildi AKT ve SHP-1 için tümör bağışıklık DC-iç denetim noktaları vardır. JCI fikir 1:18:e89020, 2016 yılında25. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Fareler telkih için gerekli DC çok sayıda göz önüne alındığında (yaklaşık 2-4 x 106 DC bir fare başına), farelerde stratejileri yalıtım DC BM ve onların ex vivo harekete geçirmek tarafından takip dalak dayalı aşılamanın en. Ancak, saldırılara tümör DC in vivodalak ve BM DC etkinleştirmek için aynı koşullar kullanarak, etkinleştirmek kez etkili bağışıklık üretiminde başarısız oldu. İki sonraki yayınlarda Karmi ve ark. Onlar doğal olarak yüksek iç Tirozin fosfataz düzeyleri ayı ve priming önce harekete geçirmek ile IC24,25gerektirir verilen bu kan ve tümör MoDC önemli ölçüde dalak ve BM DC, farklılık bulduk. Ayrıca, bu sonuçlar daha fazla stres daha iyi bir harekete geçirmek durum DC'de sağlamak için ek önlemler almak gereğini fizyolojik durumları yansıtır. Bu nedenle, mevcut Protokolü tümörler ve dolaşım MoDC yalıtım işleminin ayrıntılı bir açıklama sağlamak için ve onların erken harekete geçirmek içinde neden olabilir adımları vurgulamak için çalışmaktadır.

İlk olarak, kan ve tümör yeterli adet DC elde etmek için bir gerek yoktur bu BMDC izole için iletişim kurallarının göre fareler çok daha fazla sayıda için. DC verimini artırmak için daha büyük kan birimleri var 16-hafta-yaşlı fareler kullanın ve genel hücre sayar. Biz düzenli olarak almak 5-8 x 104 MoDC başına 1 mL enjeksiyon GM-CSF ve 4-5 x 105 MoDC Şu kansız enjeksiyon. Tümör DC için yaklaşık 6-8 x 10 elde4 MoDC den 100 mm3 tümör, sayı bireysel fareler arasında tümör modelleri arasında değişiklik gösterebilir. 1000 mm3 tümör sadece yaklaşık 5000 olacak gibi tümör boyutu sonuçları daha düşük bir DC verim artan DC. Bunun yerine, biz böylece 4 x 10-5 MoDC fare alma farelerde tümör hücreleri birden çok site (tipik olarak 4-6) ile enjekte.

Ayrıca, öneririz önce onların deneysel kullanım, antikor, hücre hatları, tüpler ve genel laboratuvar kimyasalları endotoxins için LAL tahlil ve AC bakteriyel agar medyada kaplama test edilmesi. Tümör hücre hatları kez Mycoplasma ile bulaşmış ve bu nedenle PCR tarafından onların kuluçka DC ile önce test edilmelidir. Ham collagenase hazırlıklar, tip 1 ve 4, gibi kullanımı endotoxins Clostridium histolyticumüzerinden collagenases yalıtım nedeniyle birincil kaynağıdır. Collagenase standart hazırlıkları endotoxins, yaklaşık olarak 10 EU/mg içeriyor olabilir endotoksin sindirim karışımı mL başına 1-2 ng. Jahr vd. 2.7-6,7 ng/mL endotoxins içeren collagenase hazırlıklar 1,415 3,967 ng/mL IL-1β neden bulduk kültür PBMC29ile takip. Gerçekten, astar DC düzenli olarak 1 ile yapılırsa LPS ng mL medya henüz kadar az 100 EAG'yi/mL başına30,31,32Başbakan için yeterli. Başka bir potansiyel endotoxins FBS, 25 EU/mL veya endotoxins daha fazlasını içerebilir veya az 10 EU/mL kaynağıdır. Kültür ortamı % 10 içeren varsayarak FBS, endotoksin yük DC Başbakan için yeterli olduğu 0,5 ng/mL, ulaşabilir.

Buna ek olarak, birçok iletişim kuralları anti-CD16/32 antikorlar Fc reseptörü sıralama önce onların antikor paneli özgüllüğü artırmak için bir yol olarak kullanarak engelleyin. Yine de, FcγRIII (CD16) cross-linking Syk/ZAP-70 ve PLC-γ, intrasellüler Ca2 + 33sürümü ve fosforilasyon P38 ve ERK1/2 inç fosforilasyon için her iki insan34 ve fare monosit35yol açar. Bizim ellerde anti-CD16/32-MoDC kültür ilavesi sürekli DC P38 ve ERK1/2 kinaz güçlü bir fosforilasyon maruz kalma bir dakika içinde neden olmaktadır. Biz, bu nedenle, ne zaman MoDC vitro fonksiyonel deneyleri için izole anti-CD16/32 kullanımı kaçınarak öneririz.

DC zenginleştirme onların FACS tarafından sıralama öncesinde CD11c manyetik boncuklar tarafından başka bir ortak iletişim kuralı kullanır. CD11c bir türü olduğunu ben ligandlar, fibrinojen, LPS, dahil olmak üzere çeşitli tanır transmembran glikoprotein tip ı kollajen ve Inaktif C3b alt birim. Rezzonico vd. CD11c o ligasyonu antikorlar ile göstermiştir güçlü NFκB harekete geçirmek ve kemokinler36salgılanmasını neden olmaktadır. FACS sıralama içinde çözünür onların form kullanımını fosforilasyon P38 veya ERK1/2 teşvik değil iken deneyim, immobilize anti-CD11c antikorlar hücre aktivasyonu ve apoptosis, neden.

Genel olarak, böylece onların sonraki harekete geçirmek içinde vitro vivo içindeonların harekete geçirmek için gerekli koşulları yansıtır bu protokolü MoDC yalıtım, mümkün olduğu kadar az harekete geçirmek ile elde etmek için tasarlanmıştır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Tüm yazarlar onlar hiçbir çıkar çatışması ve onlar ifşa etmek hiçbir şey olduğunu bildirin.

Acknowledgments

Hiçbiri

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ficoll-Paque PREMIUM GE-Healthcare 17-5442-02
OptiPrep StemCell Technologies 07820
CD45 MicroBeads Miltenyi 130-052-301
EasySep Monocyte Isolation Kit StemCell Technologies 19861
Collagenase IV Sigma C9697-50MG Test each lot for endotoxin
DNase I Sigma DN25-10MG
HBSS ThermoFisher 14025092
FBS ThermoFisher 16140071 Test each lot for endotoxin
PE-CD11c Biolegend 117307
APC-CD11b Biolegend 101211
Brilliant Violet 650 MHCII Biolegend 107641
AF48- CD86 Biolegend 105017
APC/Cy7-Ly-C6 Biolegend 108423
PE/Cy7-CD15 Biolegend 135523

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Steinman, R. M., Banchereau, J. Taking dendritic cells into medicine. Nature. 449, (7161), 419-426 (2007).
  2. Palucka, K., Banchereau, J. Dendritic-cell-based therapeutic cancer vaccines. Immunity. 39, (1), 38-48 (2013).
  3. Mildner, A., Jung, S. Development and function of dendritic cell subsets. Immunity. 40, (5), 642-656 (2014).
  4. Merad, M., Sathe, P., Helft, J., Miller, J., Mortha, A. The dendritic cell lineage: ontogeny and function of dendritic cells and their subsets in the steady state and the inflamed setting. Annual review of immunology. 31, 563-604 (2013).
  5. Guilliams, M., et al. Dendritic cells, monocytes and macrophages: a unified nomenclature based on ontogeny. Nature reviews. Immunology. 14, (8), 571-578 (2014).
  6. Spitzer, M. H., et al. Systemic Immunity Is Required for Effective Cancer Immunotherapy. Cell. 168, (3), 487-502 (2017).
  7. Guilliams, M., et al. Unsupervised High-Dimensional Analysis Aligns Dendritic Cells across Tissues and Species. Immunity. 45, (3), 669-684 (2016).
  8. Anguille, S., Smits, E. L., Lion, E., van Tendeloo, V. F., Berneman, Z. N. Clinical use of dendritic cells for cancer therapy. Lancet Oncol. 15, (7), e257-e267 (2014).
  9. Wimmers, F., Schreibelt, G., Skold, A. E., Figdor, C. G., De Vries, I. J. Paradigm Shift in Dendritic Cell-Based Immunotherapy: From in vitro Generated Monocyte-Derived DCs to Naturally Circulating DC Subsets. Front Immunol. 5, 165 (2014).
  10. Banchereau, J., Palucka, A. K. Dendritic cells as therapeutic vaccines against cancer. Nature reviews. Immunology. 5, (4), 296-306 (2005).
  11. Inaba, K., Swiggard, W. J., Steinman, R. M., Romani, N., Schuler, G. Isolation of dendritic cells. Curr Protoc Immunol. Chapter 3 Unit 3 7 (2001).
  12. Greter, M., et al. GM-CSF controls nonlymphoid tissue dendritic cell homeostasis but is dispensable for the differentiation of inflammatory dendritic cells. Immunity. 36, (6), 1031-1046 (2012).
  13. Vremec, D., et al. The influence of granulocyte/macrophage colony-stimulating factor on dendritic cell levels in mouse lymphoid organs. Eur J Immunol. 27, (1), 40-44 (1997).
  14. Helft, J., et al. GM-CSF Mouse Bone Marrow Cultures Comprise a Heterogeneous Population of CD11c(+)MHCII(+) Macrophages and Dendritic Cells. Immunity. 42, (6), 1197-1211 (2015).
  15. Dong, M. B., Rahman, M. J., Tarbell, K. V. Flow cytometric gating for spleen monocyte and DC subsets: differences in autoimmune NOD mice and with acute inflammation. J Immunol Methods. 432, 4-12 (2016).
  16. Drutman, S. B., Kendall, J. C., Trombetta, E. S. Inflammatory spleen monocytes can upregulate CD11c expression without converting into dendritic cells. J Immunol. 188, (8), 3603-3610 (2012).
  17. Hanada, K., Tsunoda, R., Hamada, H. GM-CSF-induced in vivo expansion of splenic dendritic cells and their strong costimulation activity. J Leukoc Biol. 60, (2), 181-190 (1996).
  18. Gilboa, E. DC-based cancer vaccines. J Clin Invest. 117, (5), 1195-1203 (2007).
  19. Melief, C. J., van der Burg, S. H. Immunotherapy of established (pre)malignant disease by synthetic long peptide vaccines. Nat Rev Cancer. 8, (5), 351-360 (2008).
  20. Palucka, K., Banchereau, J. Cancer immunotherapy via dendritic cells. Nat Rev Cancer. 12, (4), 265-277 (2012).
  21. Bol, K. F., Schreibelt, G., Gerritsen, W. R., de Vries, I. J., Figdor, C. G. Dendritic Cell-Based Immunotherapy: State of the Art and Beyond. Clin Cancer Res. 22, (8), 1897-1906 (2016).
  22. Rafiq, K., Bergtold, A., Clynes, R. Immune complex-mediated antigen presentation induces tumor immunity. J Clin Invest. 110, (1), 71-79 (2002).
  23. Schuurhuis, D. H., et al. Immune complex-loaded dendritic cells are superior to soluble immune complexes as antitumor vaccine. J Immunol. 176, (8), 4573-4580 (2006).
  24. Carmi, Y., et al. Allogeneic IgG combined with dendritic cell stimuli induce antitumour T-cell immunity. Nature. 521, (7550), 99-104 (2015).
  25. Carmi, Y., et al. Akt and SHP-1 are DC-intrinsic checkpoints for tumor immunity. JCI Insight. 1, (18), e89020 (2016).
  26. Kenkel, J. A., et al. An Immunosuppressive Dendritic Cell Subset Accumulates at Secondary Sites and Promotes Metastasis in Pancreatic Cancer. Cancer Res. 77, (15), 4158-4170 (2017).
  27. Salmon, H., et al. Expansion and Activation of CD103(+) Dendritic Cell Progenitors at the Tumor Site Enhances Tumor Responses to Therapeutic PD-L1 and BRAF Inhibition. Immunity. 44, (4), 924-938 (2016).
  28. Roslansky, P. F., Novitsky, T. J. Sensitivity of Limulus amebocyte lysate (LAL) to LAL-reactive glucans. J Clin Microbiol. 29, (11), 2477-2483 (1991).
  29. Jahr, H., Pfeiffer, G., Hering, B. J., Federlin, K., Bretzel, R. G. Endotoxin-mediated activation of cytokine production in human PBMCs by collagenase and Ficoll. J Mol Med (Berl). 77, (1), 118-120 (1999).
  30. Zhang, X., Morrison, D. C. Lipopolysaccharide-induced selective priming effects on tumor necrosis factor alpha and nitric oxide production in mouse peritoneal macrophages. J Exp Med. 177, (2), 511-516 (1993).
  31. Hirohashi, N., Morrison, D. C. Low-dose lipopolysaccharide (LPS) pretreatment of mouse macrophages modulates LPS-dependent interleukin-6 production in vitro. Infect Immun. 64, (3), 1011-1015 (1996).
  32. Deng, H., Maitra, U., Morris, M., Li, L. Molecular mechanism responsible for the priming of macrophage activation. J Biol Chem. 288, (6), 3897-3906 (2013).
  33. Cella, M., et al. A novel inhibitory receptor (ILT3) expressed on monocytes, macrophages, and dendritic cells involved in antigen processing. J Exp Med. 185, (10), 1743-1751 (1997).
  34. Kramer, P. R., Winger, V., Reuben, J. PI3K limits TNF-alpha production in CD16-activated monocytes. Eur J Immunol. 39, (2), 561-570 (2009).
  35. Rose, D. M., et al. Fc gamma receptor cross-linking activates p42, p38, and JNK/SAPK mitogen-activated protein kinases in murine macrophages: role for p42MAPK in Fc gamma receptor-stimulated TNF-alpha synthesis. J Immunol. 158, (7), 3433-3438 (1997).
  36. Rezzonico, R., Imbert, V., Chicheportiche, R., Dayer, J. M. Ligation of CD11b and CD11c beta(2) integrins by antibodies or soluble CD23 induces macrophage inflammatory protein 1alpha (MIP-1alpha) and MIP-1beta production in primary human monocytes through a pathway dependent on nuclear factor-kappaB. Blood. 97, (10), 2932-2940 (2001).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics