Bemonsteringsstrategie en verwerking van Biobank weefselmonsters van varkens biomedische modellen

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

De praktische toepassing en de prestaties van methoden voor generatie van representatieve weefselmonsters van varkens diermodellen voor een breed spectrum van downstream analyses in biobank projecten worden gedemonstreerd, waaronder volumetrie, systematische steekproefsgewijze bemonstering, en differentiële verwerking van weefselmonsters voor kwalitatieve en kwantitatieve analyses van morfologische en moleculair typen.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Blutke, A., Wanke, R. Sampling Strategies and Processing of Biobank Tissue Samples from Porcine Biomedical Models. J. Vis. Exp. (133), e57276, doi:10.3791/57276 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Translationeel medisch onderzoek, varkens modellen steeds populairder geworden. Gezien de hoge waarde van individuele dieren, met name van genetisch gemodificeerde varken modellen, en de vaak beperkte aantal beschikbare dieren van deze modellen, oprichting van (biobank) collecties van voldoende verwerkte weefselsteekproeven geschikt voor een breed spectrum van latere analyses methodes, inclusief analyses niet opgegeven op de tijdstip van monsterneming, vertegenwoordigen zinvolle benaderingen ten volle te profiteren van de translationeel waarde van het model. Met betrekking tot de eigenaardigheden van varkens anatomie, zijn onlangs uitgebreide richtsnoeren opgesteld voor gestandaardiseerde generatie representatief, kwalitatief hoogwaardige monsters van andere varkens organen en weefsels. Deze richtsnoeren zijn essentiële voorwaarden voor de reproduceerbaarheid van de resultaten en hun vergelijkbaarheid tussen de verschillende studies en onderzoekers. De opname van basisgegevens, zoals orgel gewichten en volumes, de bepaling van de locaties van de bemonstering en de nummers van weefselmonsters moeten worden gegenereerd, evenals hun geaardheid, grootte, verwerking en trimmen richtingen, zijn relevante factoren het bepalen van de dan en de bruikbaarheid van het model voor moleculaire, kwalitatieve en kwantitatieve morfologische analyses. Hier, een illustratieve, praktische, stapsgewijze demonstratie van de belangrijkste technieken voor generatie van vertegenwoordiger, multifunctionele biobank specimen van varkens weefsels wordt gepresenteerd. De hier beschreven methoden bepaling te omvatten van orgaan/weefsel volumes en dichtheden, de toepassing van een systematische steekproeven volume-gewogen procedure voor parenchymal organen door punt-tellen, bepaling van de omvang van weefsel krimp aan de histologische inbedding van monsters en generatie van willekeurig georiënteerde monsters voor kwantitatieve stereological analyses, zoals isotrope uniforme willekeurige (IUR) secties die zijn gegenereerd door de "Oriënteringsapparaten" en "Isector" methoden en verticale uniform gerelateerde willekeurige (VUR) secties.

Introduction

Translationeel geneeskunde, varkens zijn steeds vaker voorkomende voor gebruik als groot dier1,2,3,4,5, als gevolg van verschillende voordelige overeenkomsten tussen de varkens modellen en menselijke anatomie en fysiologie, en de beschikbaarheid van gevestigde moleculaire biologische methoden toestaan voor generatie op maat, genetisch gemodificeerde varken modellen voor een breed scala van1,4van de voorwaarden van de ziekte.

Ten opzichte van knaagdier modellen, is het aantal dieren van een respectieve varken model dat kan worden voorzien voor experimenten op elk gewenst moment echter beperkt. Dit is te wijten aan de varkens generatie interval van ongeveer een jaar, en de financiële en tijdrovende inspanningen die nodig zijn voor de generatie van varkens modellen en de veehouderij. Daarom, individuele dieren van een varkens model, evenals de voorbeelden die kunnen worden gegenereerd op basis van deze varkens, zijn zeer waardevol, vooral als genetisch gemanipuleerde varkens modellen en/of lange termijn experimentele problemen (bijvoorbeeld, late complicaties van chronische ziekten) worden in leeftijd individuen2,6,7onderzocht.

In de loop van een studie, prestaties van aanvullende analyses die had niet gepland in de eerste opzet van de studie kan later blijken te worden betrokken, bijvoorbeeldnaar adres verschillende vragen die voortvloeien uit eerder ontdekt onverwachte bevindingen. Als geschikt monsters voor dergelijke aanvullende experimenten niet beschikbaar zijn, mogelijk onevenredig hoge kosten en tijdrovende uitgaven noodzakelijk voor het genereren van extra varkens en weefselmonsters worden. Als u wilt worden voorbereid dergelijke, generatie van biobank collecties van geconserveerde reservekopie monsters van de verschillende organen, weefsels of bio-vloeistoffen, kwantitatief als in kwalitatief opzicht geschikt zijn voor een breed scala van latere analyses, wordt beschouwd als een belangrijk 2,6,7te benaderen. Optimale voordelen uit een varkens diermodel voortvloeiende, de beschikbaarheid van voldoende biobank monsters biedt ook de unieke mogelijkheid voor het uitvoeren van een breed spectrum van verschillende analysemethoden op identieke monster materialen op het niveau van een multi-orgel in de precies dezelfde individuele dieren, bijvoorbeelddoor verdeling van de monsters aan wetenschappers van verschillende werkgroepen georganiseerd in een onderzoek netwerk2,6,7. De '' toekomstgerichte '' bemonsteringsstrategie in biobanking draagt bovendien ook bij aan een vermindering van het aantal dieren in een studie nodig. De voordelen van varkens model biobanking zijn onlangs aangetoond in een multi orgel, multiomics onderzoek, onderzoek van orgel cross talk in een genetisch gemanipuleerde varkens model van lange termijn diabetes mellitus, met behulp van specimens van de München MIDY varken Biobank 2.

Er zijn een aantal verplichte eisen biobank monsters in het algemeen voldoen moeten om de betrouwbaarheid en interpretability van de resultatenvan de later uitgevoerde analyses. De monsters moeten reproducibly worden gegenereerd, en ze moet voldoende representatief, dat wil zeggen, als gevolg van de interesse morfologische en moleculaire kenmerken van het weefsel/orgel de monsters werden genomen uit7. Om zijn geschikt voor een breed scala van soorten downstream analyse, moeten de monsters worden genomen in voldoende hoeveelheden en verwerkt volgens de eisen (met inbegrip van tijd- en temperatuurdisplays voorwaarden) van de verschillende analysemethoden, met inbegrip van beschrijvende histopathologische analyses, zoals cryohistology, paraffine en kunststof histologie, immunohistochemistry, in situ hybridisatie, ultrastructurele elektronen microscopische analyses en klinisch laboratorium diagnostische analyses, evenals als moleculaire analyses van DNA, RNA, eiwitten en metabolieten.

Als u wilt toestaan voor de beoordeling van een breed scala aan verschillende kwantitatieve morfologische parameters zoals cijfers, volumes, lengtes, of oppervlakten van verschillende weefsel structuren door kwantitatieve stereological analyses, gerandomiseerde sectie vliegtuigen van de histologische monsters van de respectieve organen/weefsels moeten worden voorbereid7,8,9,10,11. In kwantitatieve morfologische studies, de nauwkeurige bepaling van het totale volume van het weefsel, orgel of orgel compartiment, de monsters werden genomen uit (dat wil zeggen, de verwijzing ruimte) is van cruciaal belang7,9 , 12 om de absolute hoeveelheden van de betrokken parameters binnen de respectieve orgaan, weefsel of organisme te berekenen. Uiteindelijk heeft het effect van insluiten-gerelateerde weefsel krimp tijdens de voorbereiding van de histologische secties te worden bepaald en in rekening13genomen. Daarom, kwantitatieve stereological analyses, met name van gearchiveerde monsters (vaste weefselsteekproeven ingesloten weefsel blokken, histologisch secties, etc.) uit eerdere studies zijn soms ernstig beperkt of zelfs onmogelijk12, met name indien volumetrie van de respectieve organen/weefsels is niet uitgevoerd, als geen passende bemonstering ontwerpen werden toegepast om te rechtvaardigen representatieve monsters, wanneer de aantallen en bedragen van de beschikbare afzonderlijke monsters ontoereikend zijn, of als de verwerking van de monsters is incompatibel met de raming van de kwantitatieve morfologische parameter (s) van belang. Vanwege de vele mogelijke factoren, de geschiktheid van archief-monster materialen voor analyses van afzonderlijke kwantitatieve morfologische parameters ondubbelzinnig kan niet worden beantwoord, maar hangt af van de zorgvuldige beoordeling van ieder individueel geval.

Dus, zoals de locatie, grootte, aantal, verwerking, trimmen richting en afdrukstand van monsters zullen mogelijk van invloed zijn op de resultaten van de latere analyses, deze factoren zijn van groot belang en moeten worden beschouwd in het experimentele ontwerp van een onderzoek. Met betrekking tot deze aspecten en de specificiteit van de varkens anatomie, uitgebreide, gedetailleerde, grootschalige bemonstering richtsnoeren aangepast aan varkens dierlijke modellen zijn onlangs vastgesteld, bieden een robuuste verwijzing naar gestandaardiseerde, reproduceerbare , en efficiënt genereren van redundante, adequaat verwerkt, kwalitatief hoogwaardige monsters van meer dan 50 verschillende varkens organen en weefsels6,7.

De methodologische beschrijvingen en de video-tutorial weergegeven in dit artikel bieden gedetailleerde, illustratieve, begrijpelijk, stap-by stap-instructies voor de praktische uitvoering van een verscheidenheid van technieken voor volumetrie, bemonstering van varkens weefsels en organen, en verwerking van weefselmonsters voor verschillende downstream analysemethoden. De aanbevolen technieken omvatten methoden voor bepaling van orgaan/weefsel volumes en dichtheden gebaseerd op de beginselen van Archimedes en Cavalieri9, met inbegrip van de bepaling van de afmetingen van driedimensionale krimp van weefsel gerelateerde aan de insluiten in verschillende insluiten media14 tijdens de verwerking voor histopathologisch onderzoek, toepassing van uitvoerbaar volume-gewogen systematische steekproeven nadert, verwerking van gesamplede weefsel specimens voor verschillende latere analyses7,,8,,9,15, generatie op passende wijze georiënteerd en verwerkt monsters voor potentiële kwantitatieve stereological analyses7,8, 9,10,11. Naast hun toepassing in varkens biobank projecten zijn de bewezen methoden over het algemeen geschikt voor alle studies kwantitatieve histo-morfologische eigenschappen van organen/weefsels te onderzoeken. Bovendien, systematische steekproeven ontwerpen zijn vooral gunstig voor generatie van representatieve monsters in experimenten moleculaire analysemethoden gebruiken voor het detecteren van overvloed wijzigingen van, bijvoorbeeld, RNAs, eiwitten of metabolieten in verschillende organen en weefsels.

De volgende paragrafen bieden een korte inleiding op deze methoden, terwijl hun praktische prestaties wordt beschreven in de sectie protocol.

Bepaling van orgaan/weefsel volumes
Bepaling van orgel gewichten en volumes is belangrijk in verschillende experimentele instellingen, zoals deze factoren kunnen wijzen op veranderingen, potentieel aan experimenteel gerelateerde onderzocht factoren van belang. Het totale volume van een orgaan/weefsel is ook vaak nodig voor het berekenen van de absolute kwantitatieve parameters (bijvoorbeeld, het nummer van de cel totaal), van stereologically geschatte numerieke volume dichtheden (dat wil zeggen, het aantal cellen per volume-eenheid van weefsel)7,12. Afgezien van technieken met behulp van complexe technische apparatuur, zoals computer tomografie, zijn er in principe drie praktische methoden die gewoonlijk worden gebruikt om te bepalen van het absolute volume van een orgaan of weefsel. Het volume van een orgaan kan worden bepaald door de "directe volumetrische meting" volgens het beginsel van Archimedes, dat wil zeggen, het meten van de hoeveelheid water of zoutoplossing dakloos geraakt door de structuur als volledig ondergedompeld. Voor relatief grote varkens organen zijn deze benaderingen echter onpraktisch en gevoelig voor onnauwkeurigheid, aangezien ze zeer grote volumetrische/meten kolven vereist. Meer gemakshalve, het volume van een orgaan/weefsel kan worden berekend op basis van haar gewicht en dichtheid7,12,16, die efficiënt kan worden bepaald met behulp van de "methode van de onderdompeling"7,12 ,16 (protocol stap 1.1.). Orgaan/weefsel volumes kunnen ook worden geschat met behulp van volumetrie benaderingen gebaseerd op het "principe van Cavalieri" (1598-1647). In eenvoudige termen, het principe van Cavalieri stelt, als twee objecten zijn gesegmenteerd in vlakken evenwijdig aan een massaplaat, en de profielen van de secties door de twee objecten op overeenkomt gesneden afstanden van de massaplaat zijn dezelfde regio's, de twee objecten hetzelfde volume hebben. Dus, het volume van willekeurig gevormde objecten kan worden ingeschat als het product van hun sectie profiel gebieden in parallelle, even verre sectie vliegtuigen en de afstand tussen de vlakken van de sectie. Dit is begrijpelijk met de volgende analogie: overwegen twee stapels bestaande uit hetzelfde aantal identieke munten staan naast elkaar, een stapel met de munten ordelijke gestapeld bovenop elkaar opbrengst van een cilindrische vorm van de munt-stack, en de andere stapel van munten met uit het midden geplaatst munten (figuur 3A). Hoewel de vormen van zowel munt-stapels anders zijn, hun volumes zijn hetzelfde, sinds de gebieden van de munten op overeenkomstige niveaus van beide stapels (dat wil zeggen, het gebied van profielen van parallelle secties snijden door beide stapels van de munt in op gelijke afstand van de gemalen) identiek zijn. Schatting van de volumes van varkens organen en weefsels met behulp van de12,voor Cavalieri principe7,15 wordt beschreven in stap 1,2.

Bepaling van de omvang van weefsel krimp aan histologische insluiten gerelateerde
In analyses van verschillende kwantitatieve morfologische parameters gemeten in histologische weefselsecties, heeft het effect van insluiten-gerelateerde weefsel krimp tijdens verwerking voor histologie weefsel te worden bepaald en in aanmerking genomen. De omvang van insluiten-gerelateerde weefsel krimp variabele kan worden, en is afhankelijk van zowel op het weefsel, de verwerking en het insluiten middellange8,13,17,18,19. In het algemeen, insluiten-gerelateerde veranderingen van het volume van een sample van het weefsel (dat wil zeggen, meestal krimp) optreden in alle drie de dimensies van ruimte, en dus, is van invloed op alle dimensionale parameters geschat door kwantitatieve stereological analyses8 . Kortom, de omvang van insluiten-gerelateerde weefsel krimp, uitgedrukt als de lineaire weefsel krimp factor (fS), kan worden geraamd zoals aangegeven in stap 1.3. en gebruikt voor correctie van de kwantitatieve morfologische parameters (krimp-gevoelig)14.

Volume-gewogen systematische aselecte steekproef van organen/weefsels
Voor vestiging van een biobank collectie van varkens orgel/weefselsteekproeven, hebben systematische steekproeven volume-gewogen benaderingen zoals beschreven in stap 2 bewezen praktische tijdbesparende en efficiënte technieken voor generatie van vertegenwoordiger, multi purpose weefsel monsters7,8,9,15.

Generatie van isotroop uniforme Random secties en verticale uniforme Random secties voor kwantitatieve stereological analyses
Biobank weefselsteekproeven moeten geschikt zijn voor een breed scala van verschillende kwantitatieve stereological analysemethoden voor schatting van een maximum van parameters die kon niet worden vastgesteld zonder een adequaat bereid exemplaar. Bijna alle kwantitatieve stereological parameters kunnen worden bepaald, met behulp van "isotrope (onafhankelijke) uniforme willekeurige (IUR) secties"8,9. In IUR secties, is de driedimensionale oriëntatie van het sectievlak van het weefsel monster gerandomiseerde. Dit kan worden bereikt door randomisatie van de positie van het weefsel monster ten opzichte van de positie van het sectievlak, zoals toegepast in de "Isector" methode11 (protocol stap 3.1), of door randomisatie van de oriëntatie van het sectievlak ten opzichte de weefsel monster, zoals in de "Oriënteringsapparaten" methode10 (protocol stap 3.2). In weefselmonsters, zoals huid of mucosa specimen weergeven een nature aanwezig, of gedefinieerde en goed herkenbaar verticale as, voorbereiding van de "verticale uniforme willekeurige (VUR) secties" (protocol stap 3.3.) gesegmenteerd strikt binnen het vlak van hun verticale as is de voordeligste8,20. Voor een volledige discours van de theoretische grondslagen van IUR/VUR bemonstering en een uitgebreide bespreking van potentiële downstream kwantitatieve stereological analyses, wordt de geïnteresseerde lezer verwezen naar de schoolboeken van kwantitatieve stereology in het leven Wetenschappen8,9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle methoden die worden beschreven hier gebruik van weefselmonsters afgeleid van dode dieren en volledig in overeenstemming zijn met de Duitse wettelijke voorschriften voor het welzijn van dieren.

1. volumetrie

  1. Onderdompeling techniek voor de bepaling van de dichtheid van het weefsel/orgel (Figuur 1 en Figuur 2) 7 , 12 , 16
    1. Bereiden van de materialen: Scalpel messen, papieren handdoeken, fijne pincet, standaard laboratorium Weegschaal, glas of plastic bekers, zoutoplossing 0,9% en zelfgebouwde specimen houders (figuur 2A).
    2. Accijnzen een stukje weefsel (maximale grootte: 2 x 2 x 2 cm-3) van het orgaan/weefsel, specifiek van het orgel compartiment van belang. Kleine organen, zoals de hypofyse of de pijnappelklier, zijn gemeten in toto.
      Let op: Zorg ervoor dat de grootte van de steekproef met name kleiner dan de inwendige diameter van het bekerglas (stap 1.1.5 e.v.), en het niveau van de vulling is toe volledige onderdompeling van het monster zonder contact met de binnenmuren van het bekerglas in stap 1.1.7.
    3. Zorgvuldig swab het monster met een papieren handdoek te verwijderen van de overtollige bloed/weefsel vloeistof.
    4. Wegen van het monster op een schaal van de precisie en het gewicht van het monster (mS). Het bepalen van het gewicht van de kleine weefselsteekproeven met de dichtstbijzijnde mg (figuur 1A).
    5. Plaats een bekerglas gevuld met kamertemperatuur 0,9% zoutoplossing op de schaal. Volledig vult niet het bekerglas, mogelijk te maken voor een onderdompeling van het monster van het weefsel in de daaropvolgende stap zonder overlopen.
      Let op: Gebruik een bekerglas grootte worden de afmetingen en gewicht voor elk weefsel exemplaar te meten en de effectieve meetbereik van de schaal. Voor grotere monsters tot 2 x 2 x 2 cm3, een bekerglas grootte van 50-100 mL is geschikt in combinatie met een schaal meten vanaf ongeveer 100 mg tot 500 g, terwijl voor kleine steekproeven, bekerglazen van 5-10 mL in combinatie te gebruiken met precisie weegschalen met meetbereiken tussen ongeveer 0,1 mg en 20 g.
    6. De monsterhouder (dat wil zeggen, een voldoende stijf lus van dunne draad of iets dergelijks, figuur 2A) in de zoutoplossing dompelen naar een duidelijke positie (pijlen in figuur 1B, figuur 2Ben figuur 2C). Opnieuw (tarra) de weergave van de schaal op nul.
    7. Zorgvuldig hechten het weefsel monster aan de monsterhouder en volledig het monster in de zoutoplossing dompelen totdat het duidelijke standpunt inzake de monsterhouder wordt bereikt (pijlen in figuur 1B, figuur 2Ben figuur 2C).
      Let op: Het verzonken monster en de monsterhouder niet moet contact met de binnenmuren of de bodem van het bekerglas af of het oppervlak van de zoutoplossing.
    8. Houd de monsterhouder en het verzonken staal in die positie, terwijl het opnemen van het gewicht weergegeven op de schaal (mL), verwijzend naar het gewicht zoutoplossing verdrongen worden door het monster weefsel (Figuur 1 C, figuur 2B, en Figuur 2C).
    9. Bereken het volume van het monster (VS) van mL, en de dichtheid van zout bij kamertemperatuur (20 ° C) (ρzoute = 1.0048 g/cm³) = als VS mL/ Ρzoute [g/g/cm³] (Figuur 1).
    10. Bereken de dichtheid van het weefsel monster (ρmonster) van het gewicht (dat wil zeggen, massa) van de steekproef (mS) en het volume (VS): ρmonster = mS /VS[g/cm³] (Figuur 1).
    11. Voor organen gemeten in toto, herhaal de meting driemaal en berekenen van de gemiddelde orgel dichtheid van de waarden van enkele meting. Uitvoeren van herhaalde metingen met verschillende monsters van hetzelfde orgaan/weefsel/orgel compartiment voor grote organen/weefsels, en berekenen van de gemiddelde dichtheid van de enkele metingen, dienovereenkomstig.
    12. Berekenen van het totale volume van het orgaan/weefsel/orgel compartiment van het gewicht en dichtheid (Figuur 1).
  2. Toepassing van de Cavalieri-Method for Determination of varkens orgel Volumes 7
    1. Bereiden van de materialen: heerser, remklauw, mes, schaar, pincet, waterdichte pen, kunststof transparanten, scanner, foto camera, en cross rasters gedrukt op kunststof transparanten.
    2. Plaats het gehele orgaan/weefsel op een platte ondergrond (snijden base) en meet de lengte (l) van het orgel langs de longitudinale as (figuur 3B, figuur 5A).
    3. Snijd het volledige orgaan/weefsel in equidistante parallelle segmenten orthogonale aan de as van de longitudinale orgel (Figuur 3 c, figuur 5B). Kies een afstand d tussen twee secties (dat wil zeggen, de vectorafbeeldingsbestanden interval/sectie dikte, meestal ongeveer 1 cm) voldoende klein zijn om een voldoende aantal weefsel/orgel platen te ontvangen. Willekeurig het standpunt van de eerste sectie in een afstand tussen 0 en het vectorafbeeldingsbestanden-interval van de marge van het orgel. Tijdens het snijden, visueel beoordelen de positie en oriëntatie van elke sectievlak, ongeveer parallel orgaan/weefsel platen van ongeveer uniforme dikte te verkrijgen.
      Opmerking: Het benodigde aantal weefsel/orgel platen is afhankelijk van de vorm en de grootte van de onderzochte orgaan/weefsel. Als kleine organen of monsters worden gesegmenteerd in dunne platen van ≤5 mm moeten, insluiten de monsters in agar voorafgaand aan segmenteren (zie stap 1.3.3.) en een technische apparaat gebruiken voor het snijden van het monster agar-ingesloten. Empirisch aan te bevelen vectorafbeeldingsbestanden intervallen voor meest varkens organen en weefsels, alsmede voorbeelden voor segmenteringshulplijnen apparaten, zijn aangegeven in het aanvullend materiaal van "Weefsel bemonstering gidsen voor varkens biomedische modellen"7.
    4. Plaats alle orgaan/weefsel platen op hetzelfde oppervlak naar beneden op de basis snijden (dat wil zeggen, consequent op het recht of de linker sectievlak van elk orgel slab, figuur 3D, figuur 5C), en tellen van de platen (n).
    5. Sectie profielen van het weefsel platen verkrijgen door een van de volgende methoden:
      1. Zorgvuldig plaats de weefsel platen op adequaat gelabelde kunststof transparanten, met behoud van de oriëntatie van de bovenste en onderste sectie oppervlakken. De contouren van het weefsel platen op de plastic transparanten met een waterdichte pen (3E figuur1-2) te traceren.
      2. Nemen van fotografische beelden van het weefsel platen, vasthouden van de camera verticaal boven de sectie oppervlakken (figuur 3F). Voor kalibratie, plaatst u een liniaal grootte naast de weefsel platen.
      3. Scan de weefsel platen op een flatbed-scanner met behoud van de oriëntatie van de bovenste en onderste sectie oppervlakken (Figuur 3 g). Voor kalibratie, plaatst u een liniaal grootte naast de weefsel platen.
    6. De gebieden van de profielen (overgetrokken, gefotografeerd of gescande) sectie van alle weefsel platen meten door een van de volgende methoden:
      1. Overlay of superponeren de getraceerde orgel plaat profielen met een gepaste afmetingen, gekalibreerde raster van gelijkelijk verdeelde kruisen afgedrukt op een kunststof transparantie en graaf alle kruist het raken van het gebied Profiel (3E figuur3-4; te vergelijken met Figuur 5D). Bereken de oppervlakte van de profiel sectie van elke plaat orgel door te vermenigvuldigen met het aantal kruisjes raken het gebied profiel door de oppervlakte die overeenkomt met een kruis.
        Opmerking: Voor het ontvangen van voldoende nauwkeurige volume schat, kies een kruis raster met een voldoende kleine afstand tussen aangrenzende kruisen, zodat een gemiddelde van ten minste 100 kruist treft de sectie oppervlakken van de platen van een orgel in elk onderzocht geval van de studie . Empirisch aanrader cross raster maten voor meest varkens organen en weefsels zijn aangegeven in het aanvullend materiaal van "Weefsel bemonstering gidsen voor varkens biomedische modellen"7.
      2. Meten van de gebieden van de platen van het weefsel in de digitale beelden van de foto's / scans met behulp van passende verkrijgbare of freeware morphometry soft- en hardware toepassingen (Figuur 3 H), zoals een commerciële afbeelding analyse systeem21, of ImageJ22.
        Let op: Opmerking dat een weefsel plaat (de eerste of de laatste) wordt geplaatst op de scanner op zijn natuurlijke oppervlak, respectievelijk rusten, geconfronteerd met de camera met zijn natuurlijke oppervlak. Daarom het gescande beeld, het beeld van de foto van deze plaat, verschijnt niet het oppervlak van een sectie. Daarom wordt geen sectie gebied profiel gemeten in de afbeelding van de gescande afbeelding/foto van dit weefsel plaat (figuur 3I). Ook Opmerking overmatige projectie presenteren in gescande afbeeldingen en foto's van orgaan/weefsel platen, dat wil zeggen, alleen het meten van de gebieden van de profielen van de werkelijke sectie, maar niet van het weefsel in de afbeelding ligt achter de plaat sectie oppervlak (Figuur 12 G-H).
    7. Berekenen van de geschatte orgel volume als het product van de som van alle desbetreffende sectie profiel oppervlakten van alle weefsel platen per geval (dat wil zeggen, consequent van rechts of links, respectievelijk de boven- of ondergrens sectie oppervlak van elk orgaan slab en de gemiddelde dikte van de platen (dat wil zeggen, het quotiënt van de gemeten lengte van het orgel van de verticale as (l) en het aantal platen)15.
  3. Bepaling van de omvang van driedimensionale insluiten-gerelateerde weefsel krimp tijdens verwerking van weefselmonsters voor histologie
    1. Bereiden van de materialen: Microtome messen, pincet, agar, metaal gieten mallen, digitale scanner en grootte liniaal (b.v., grafiek papier).
    2. Snijd een vers, vlak sectie oppervlak uit een vaste weefsel monster.
      Opmerking: Als monsters van gemakkelijk vervormbaar (zachte) weefsels (vetweefsel, gelatine-achtige weefsels), insluiten het vaste weefsel monster in agar voorafgaand aan vectorafbeeldingsbestanden (figuur 4A).
    3. Monster in agar insluiten:
      1. Meng standaard agar poeder zoals gebruikt voor microbiologie kweekmedium met een juiste hoeveelheid water (ongeveer 0,5 – 1 g agar/10 mL water) in een bekerglas van glas. Roer het mengsel en verwarmen in de magnetron op 700 W tot koken voor 3 – 5 s. Roer het mengsel en breng aan de kook weer voor 3 – 5 s.
      2. Optioneel, het vergroten van het contrast van de agar aan het weefsel monster, kleurstof vloeibaar agar, bijvoorbeeldmet zwarte inkt (1 mL inkt toevoegen aan 10 mL hete vloeibare agar en roer krachtig).
      3. Giet de hete agar in een mal gieten (bijvoorbeeld, een metalen mal gebruikt voor paraffine insluiten, figuur 10A-D) en het onderdompelen van de steekproef vast weefsel in de warme agar. Laat de agar afkoelen tot stolling, verwijderen van de mal, en snijd het agar-blok met de ingesloten weefsel met een microtoom of scheermesje.
        Let op: Draag tijdens het verwerken van hete vloeibare agar, veiligheidsbril en handschoenen. Proces weefselsteekproeven vast in formaldehyde oplossing onder een uitlaat zonnekap en laboratorium handschoenen en veiligheidsbril dragen.
    4. Leg het monster met zijn oppervlakte van de sectie naar beneden op een flatbed-scanner, samen met een liniaal grootte en scannen van het oppervlak van de sectie (figuur 4AB).
    5. Bepaal de oppervlakte van de oppervlakte van de sectie van het monster (eenf) van de vaste weefsel in de digitale scan, met behulp van een van de technieken beschreven in stap 1.2.6 (figuur 4B).
    6. Insluiten van het monster in kunststof insluiten medium, zoals epoxy (bijvoorbeeldEpon) of glycolmethacrylate/methylmethacrylate (GMA/MMA)23, volgende standaardprotocollen23,24,25 ) Figuur 4C). Zorgen dat het oppervlak van de sectie van het vaste monster gescand in de vorige stap (1.3.4) in het monster kunststof-ingesloten.
      Opmerking: Om de richting van het oppervlak van de sectie van het monster tijdens de verwerking van het monster, consequent leg het monster met zijn oppervlakte van de beoogde sectie beneden gericht in de insluiten cassette of de mal gieten, of de beoogde sectie markeren oppervlak (of de andere kant van het monster) met inkt.
    7. Knippen histologische toont een sectie uit het plastic blok overeenkomt met de oorspronkelijke sectie oppervlak van de vaste weefsel monster (stap 1.3.2) gebruikend microtome (Figuur 4 d), monteren van de sectie op een glasplaatje (Figuur 4 d) en vlek het routinematig ( bijvoorbeeld, de haematoxyline en eosine stain, H & E)24,25.
      Let op: Om te ontvangen een histologische sectie ongeveer in hetzelfde vlak als de oorspronkelijke sectie oppervlak van de vaste weefsel monster, zorgvuldig pas de positie van de kunststof blok op de berg van de microtoom voordat segmenteren.
    8. Plaats de dia met het bevlekte gedeelte beneden zijn gericht op een flatbed-scanner samen met een liniaal grootte en scannen van de sectie (figuur 4E).
    9. Bepaal de oppervlakte van de sectie van het monster van de kunststof-embedded weefsel (A-e) in de digitale scan, met behulp van een van de technieken beschreven in stap 1.2.6 (figuur 4F).
    10. Bereken de gemiddelde insluiten-gerelateerde weefsel krimp (voor de respectieve weefsel en insluiten medium) van het gemeten gebied van overeenkomstige sectie profielen van weefselmonsters vóór en na het inbedden in kunststof medium te embedding. De lineaire krimp factor fs wordt berekend als de vierkantswortel van het quotiënt van de gebieden van de profielen van de sectie van n weefselsteekproeven na insluiten in kunststof insluiten medium (A-e) en het gebied van de overeenkomstige sectie profielen van de dezelfde weefselmonsters voor insluiten in kunststof medium (eenf) (Figuur 4 g) te embedding14.

2. volume-gewogen systematische aselecte steekproef door punt tellen en verwerken van weefsel deelmonsters voor verschillende Downstream-soorten analyse7

  1. Bereiden van de materialen: heerser, remklauw, mes, schaar, pincet, waterdichte pen, punt/Kruis rasters gedrukt op kunststof transparanten en willekeurige aantal tabellen.
    Opmerking: Kopie sjablonen voor grensoverschrijdende rasters (5-60 mm) vindt u in het aanvullend materiaal van "Weefsel bemonstering gidsen voor varkens biomedische modellen"7.
  2. Plaats het orgel/het weefsel op een platte ondergrond (snijden base) en meet de lengte (l) van het orgel langs de longitudinale as (figuur 5A, figuur 6A).
  3. Snijd het volledige orgaan/weefsel in equidistante parallelle segmenten orthogonale om de lengteas (figuur 5B). Kies een afstand d tussen twee secties (dat wil zeggen, de vectorafbeeldingsbestanden interval/sectie dikte, meestal ongeveer 1 cm) klein genoeg om een voldoende aantal weefsel/orgel segmenten te verkrijgen. Willekeurig het standpunt van de eerste sectie in een afstand tussen 0 en het vectorafbeeldingsbestanden-interval van de marge van het orgel. Tijdens het snijden, visueel beoordelen de positie en oriëntatie van elke Sectievlak te verkrijgen van ongeveer parallel orgaan/weefsel platen van ongeveer uniforme dikte.
    Opmerking: Het benodigde aantal weefsel/orgel platen is afhankelijk van de grootte van de onderzochte organen/weefsels en het aantal locaties van de bemonsterde weefsel. Als kleine organen of monsters worden gesegmenteerd in dunne platen van ≤5 mm moeten, insluiten de monsters in agar voorafgaand aan segmenteren (zie stap 1.3.3.) en het gebruik van technische hulpmiddelen voor het snijden van het monster agar-ingesloten. Empirisch aan te bevelen vectorafbeeldingsbestanden intervallen voor meest varkens organen en weefsels, alsmede voorbeelden voor het snijden van de apparaten zijn aangegeven in het aanvullend materiaal van "Weefsel bemonstering gidsen voor varkens biomedische modellen"7.
  4. Plaats alle orgaan/weefsel platen op hetzelfde oppervlak naar beneden op de basis snijden (figuur 6B).
  5. Overlay de weefsel platen met een gepaste afmetingen Kruis raster op een kunststof transparantie gedrukt door het plaatsen van de buitenste overgebleven bovenste cross van het raster een willekeurig punt buiten het weefsel (figuur 5C-D, figuur 6B).
    Opmerking: Kies een kruis raster met een voldoende kleine afstand tussen aangrenzende kruisen, zodat in elk onderzocht geval van de studie, ten minste tweemaal zoveel kruisen zal treffer naar de sectie remvlak(ken) van het weefsel compartiment te bemonsteren, als het aantal monsters dat moet dat weefsel compartiment te worden onttrokken. Empirisch aanrader cross raster maten voor meest varkens organen en weefsels zijn aangegeven in het aanvullend materiaal van "Weefsel bemonstering gidsen voor varkens biomedische modellen"7.
  6. Mark en graaf alle kruist het raken van het weefsel (respectievelijk de weefsel sub compartiment te bemonsteren). Consequent toepassen van een uniforme manier van tellen en nummering van de kruisen het raken van het weefsel compartiment te bemonsteren in alle weefsel platen, bijvoorbeelddoor opeenvolgende nummering van de respectieve kruisen in elke lijn per lijn, van links naar rechts en van boven naar onder, of, bijvoorbeelddoor de nummering van de kruisen in een weefsel plaat na de andere in de richting van de klok, beginnend met het Kruis zich het dichtst bij de twaalf uur positie, zoals exemplarisch blijkt in het 5E cijfer.
  7. Het getal van kruisen het raken van het weefsel/weefsel compartiment te steekproef (n) delen door het aantal monsters moet worden gegenereerd om te verkrijgen van de systematische voorbeeldinterval (i).
  8. De eerste bemonstering positie bepalen door te kiezen voor een random getal x in het interval tussen de 1 en ik. Hiervoor door een random-nummer tabel te gebruiken. Mark de eerste bemonstering positie (x) en elke volgende x + i, x + 2ik, x + 3i, enz., Kruis het raken van het weefsel/weefsel compartiment te bemonsteren op de plastic transparantie met behulp van een waterdichte pen (figuur 5F).
    Opmerking: Random nummer tabellen kunnen gemakkelijk en snel gegenereerd worden met behulp van een online random number generator.
  9. Label van het weefsel dat overeenkomt met de gemarkeerde locaties doorkruist door iets verhogen de kunststof transparantie en het plaatsen van een klein stukje van schone, lege confetti papier op het oppervlak van het weefsel plaat met behulp van een pincet (Figuur 5 g, Figuur 6 sexies ).
  10. Accijnzen specimen van weefsel van de bemonsterde locaties (Figuur 5 H, figuur 6F, figuur 7A) en verder onderverdelen hen voor verschillende types van latere analyses (figuur 6G, figuur 7A-B), als omschreven in Tabel 1.
  11. Na de monsterneming, de kunststof transparanten met warm water en zeep, droog, schoon en hergebruiken.

3. productie van isotroop uniforme willekeurige (IUR) secties en verticale uniforme willekeurige (VUR) secties voor kwantitatieve Stereological Analyses

  1. "Isector" techniek
    1. Bereiden van de materialen: Razor of microtoom messen, agar, sferische gieten mallen (bijvoorbeeldgieten mallen voor pralines, die kunnen worden verkregen van banketbakker leveranciers), foldback klemmen en pincet.
    2. Plaats een weefsel van voldoende grootte stuk (1 x 1 x 1 cm3) vaste, systematisch willekeurig bemonsterd in een bolvormige gieten schimmel, bijeenhouden door foldback klemmen, en vul de mal met warme vloeibare agar (figuur 8A-E).
    3. Verwijder de agar bol (figuur 8F) uit de mal gieten na stollen van de agar.
    4. Rollen van de agar-gebied met het monster van de ingesloten weefsel over de tafel, stoppen, en deel het op een willekeurige positie.
      Opmerking: De resulterende sectievlak is een IUR sectie (figuur 8F-G).
    5. Gaat u verder met het insluiten van het weefsel monster in kunststof hars zoals GMA/MMA, behoud van de richting van de sectie IUR vliegtuig (zie 1.3.5).
  2. "Oriënteringsapparaten" techniek
    1. Bereiden van de materialen: Razor of microtoom messen met agar, pincet, willekeurige nummer tabel(len), afdrukken van is, en cosinus-gewogen kringen.
      Opmerking: Kopie sjablonen van cirkels zijn verstrekt in eerdere publicaties8,26.
    2. Leg het monster met vaste weefsel (of agar-embedded vaste weefsel) op een afdruk van een cirkel is met een rand evenwijdig aan de 0-180 ° richting (figuur 9A, figuur 10E).
    3. Een willekeurige hoek bepalen met behulp van de random nummer tabel. Vind de overeenkomstige merken op de schaal van de is cirkel, die het monster op rust. Gebruik van deze merken, gesneden een sectie door middel van het monster (of via de agar rondom het ingesloten weefsel monster), met het sectievlak wordt gericht, parallel aan de richting van de willekeurige hoek op de schaal van de cirkel is aangegeven, en verticale naar de oppervlakte van het monster (figuur 9B-C, figuur 10F) rusten.
    4. Plaats het weefsel blok met het oppervlak van de sectie gegenereerd in de vorige stap tegenover nadeel op een cirkel cosinus-gewogen met de rand van de rust vlak evenwijdig aan de 1-1 richting (figuur 9D, Figuur 10 H) geplaatst.
    5. Herhaal stap 3.2.3 en knippen van een nieuwe sectie door middel van het monster in een willekeurige hoek bepaald met behulp van de random nummer tabel (Figuur 9 sexies-F, figuur 10I-J).
      Opmerking: De resulterende sectievlak is een IUR sectie.
    6. In voorkomend geval, bepalen van het gebied van het IUR sectie profiel van de steekproef vast weefsel voor bepaling van de insluiten-gerelateerde weefsel krimp (figuur 9G-J) zoals beschreven in stap 1.3, en gaat u verder met het insluiten van het weefsel monster in kunststof hars zoals GMA/MMA.
  3. Generatie van verticale uniforme willekeurige (VUR) secties
    1. Bereiden van de materialen: Razor of microtoom messen, agar, pincet, willekeurige nummer tabel(len) en prenten is cirkels.
      Opmerking: Kopie sjablonen van cirkels zijn verstrekt in eerdere publicaties8,26.
    2. Definieer een verticale as binnen het vaste weefsel monster dat altijd herkenbaar is in het monster/secties tijdens de daaropvolgende stappen.
      Opmerking: Doorgaans de as verticaal op het natuurlijke oppervlak van het weefsel monster wordt gekozen als de verticale as.
    3. Eventueel insluiten het monster in agar (Figuur 11).
      Opmerking: Agar-insluiting voorafgaand aan VUR - of IUR-afdelen van het vaste monster is over het algemeen aan te bevelen voor kleine, dunne, breekbare of zachte monsters. Ook gebruiken agar-insluiting van monsters om de positionering van de VUR verdeelde steekproef tijdens de daaropvolgende inbedding van het monster in kunststof hars medium.
    4. Leg het monster op een afdruk van een cirkel is, met de verticale as wordt orthogonaal gericht op het vlak van de tabel/papier tabel (figuur 11C).
    5. Knip het monster in een willekeurige hoek (bepaald met behulp van een willekeurige numerieke tabel) met het sectievlak orthogonale aan de tabel en evenwijdig aan de verticale as te ontvangen een VUR sectievlak (figuur 11D).
    6. In voorkomend geval, bepalen van het gebied van het IUR sectie profiel van de steekproef vast weefsel voor bepaling van de krimp van de insluiten-gerelateerde weefsel zoals beschreven in stap 1.3 (in vergelijking met figuur 9G-J) en ga verder met het insluiten van het weefsel monster in kunststof hars zoals GMA/MMA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Onderdompeling techniek voor de bepaling van de dichtheid van het weefsel/orgel

Figuur 12A -B toont de representatieve bepaling van de dichtheid en het volume van een varkens nier met behulp van de onderdompeling techniek beschreven in stap 1.1 (Figuur 1, Figuur 2). Meer representatieve resultaten van metingen van de dichtheid van extra varkens organen en weefsels worden gepresenteerd in tabel 2. Een uitgebreidere lijst van referentie dichtheden van uiteenlopende varkens weefsels en organen wordt weergegeven in de "Weefsel bemonstering gidsen voor varkens biomedische modellen"7. De geldigheid van weefsel dichtheid meetwaarden, verkregen met behulp van de methode onderdompeling kan worden geraamd door herhaalde metingen van hetzelfde monster en van onafhankelijke specimens. Meest varkens weefsels weergavewaarden dichtheid iets hoger dan water (ρwater ≈ 1,0), overwegende dat weefsels zwemmen in een zoutoplossing (vetweefsel, longweefsel) dichtheden vertonen < 1.0.

Cavalieri methode voor de bepaling van orgel volumes

Figuur 12C -F toont de representatieve bepaling van de omvang van de varkens nier (het hetzelfde orgaan als aangegeven in Figuur 12 bis-B). De gebieden van het oppervlak van de sectie van de orgel-platen werden bepaald door punt-tellen, met behulp van een bovenliggende cross raster gedrukt op een kunststof transparantie, maar ook door planimetrische meting van de sectie gebieden van orgel platen in een gescande afbeelding van de platen (betalende aandacht voor overmatige projectie van weefsel gelegen achter de platen sectie oppervlakken, Figuur 12 G-H). De nauwkeurigheid van orgaan/weefsel volume gegevens die zijn verkregen door uitoefening van de Cavalieri aanpak (stap 1.2, Figuur 3) kan worden geraamd in vergelijking met het respectieve volume berekend op basis van het gewicht en de dichtheid van het orgel/het weefsel. De volumes van de nier onderzocht in Figuur 12 bepaald door de onderdompeling-methode en de methode(n) Cavalieri door minder dan 1% van elkaar verschilden. Als een maatregel van de nauwkeurigheid van de schattingen van de volume Cavalieri, kan de coëfficiënt van fout (CE) worden berekend, als beschreven eerdere15.

Bepaling van de driedimensionale insluiten-gerelateerde weefsel krimp tijdens de verwerking van weefselmonsters voor histologie

Representatieve resultaten van de omvang van weefsel krimp aan inbedding van varkens weefselmonsters (corticale renale weefsel) gerelateerde in kunststof harsen (GMA/MMA of epoxy) voor kwantitatief histomorphological onderzoek zijn weergegeven in tabel 2 (voorheen niet-gepubliceerde gegevens). De lineaire krimp factoren aangegeven in tabel 2 werden vastgesteld zoals beschreven in stap 1.3 (Figuur 4). Ze verwijzen naar een driedimensionaal volume vermindering van 29% voor het insluiten van GMA/MMA, en 22% voor epoxy inbedding van varkens corticale renale weefsel. Afbeelding 13 toont representatieve voorbeelden van voldoende en onvoldoende bereid monsters van agar-embedded, formaline-vaste adipeus weefsel voor meting van de steekproef sectie oppervlakte voorafgaand aan kunststof-insluiting.

Volume-gewogen systematische aselecte steekproef door punt Counting en verwerking van weefsel deelmonsters voor verschillende Downstream analyse

De "vectorafbeeldingsbestanden en punt-tellen" techniek voor het volume-gewogen systematische aselecte steekproef van parenchymal organen (stap 2, Figuur 5, Figuur 6, Figuur 7) vertegenwoordigt een gevestigde, robuuste methode voor generatie van vertegenwoordiger monsters voor meerdere opeenvolgende soorten analyses2,7. Representatieve resultaten van generatie systematisch willekeurig bemonsterde, zeer overbodig biobank exemplaar van verschillende varkens organen en weefsels, met een daaropvolgende differentiële verwerking van het verwijderde weefselmonsters voor meerdere verschillende stroomafwaarts analysemethoden gebruik van de techniek van de bemonstering beschreven in stap 2 (Figuur 5, Figuur 7en exemplarisch aangetoond in Figuur 6) geweest eerder gepubliceerde2. Voor de opwekking van biobank monsters van leverweefsel in een eerdere studie, varkens biobank2, bijvoorbeeld varkens levers waren volledig gesegmenteerd in ongeveer 20 platen van 2-3 cm dikte, met bovenop een met een 3 cm cross raster, zoals beschreven in stap 2 en 16 locaties van het weefsel van ongeveer 2 x 2 x 2 cm3 werden systematisch willekeurig bemonsterd en weggesneden in elk geval. Uit elk van de verwijderde monsters, vijf deelmonsters werden vervolgens gegenereerd voor moleculair analyses (bevroren bij-80 ° C) van de bemonsterde locaties, één deelmonster voor cryohistology, een deelmonster was vast in Methacarn oplossing, en één in formaldehyde oplossing voor latere paraffine insluiten en histologische- en immunohistochemische onderzoek. De generatie van de 74 verschillende monsters per geval (tot bevriezing of overdracht van de monsters in fixatie oplossing) werd bereikt in ongeveer 20 min., op gemiddeld2. De uitvoerbaarheid/succes de beschreven bemonsterings-en subsampling aanpak kan worden geraamd door de beoordeling van de kwaliteit van de gegenereerde monsters (dat wil zeggen, de kwaliteit of RNA - eiwit isoleert, behoud van de histomorphological en Ultrastructurele eigenschappen van weefselmonsters, hun geschiktheid voor immunohistological analyses, etc.)2

Generatie isotrope uniforme willekeurige (IUR) secties en verticale uniforme willekeurige (VUR) secties voor kwantitatieve Stereological Analyses

De technieken gedemonstreerd voor een toekomstgerichte generatie isotrope uniforme willekeurige (IUR) secties en VUR secties van varkens (biobank) weefselmonsters (protocol van stap 3, Figuur 8, Figuur 9, Figuur 10, figuur 11), waardoor de meeste kwantitatieve stereological parameters te onderzoeken, snel kan worden bereikt met wat oefening en zonder redelijke moeilijkheden of bronnen van fout. Daarom is de generatie voor IUR-samples weergegeven in Figuur 9 (isector techniek) en Figuur 10 (oriënteringsapparaten techniek) volledig vertegenwoordiger voor deze methode (n).

Figure 1
Figuur 1: Schematische afbeelding van de "onderdompeling techniek" voor bepaling van de dichtheid van het weefsel/orgel. (A) meting van het monster gewicht (dat wil zeggen, massa, mS). (B) schaal getarreerde aan het gewicht van een bekerglas gevuld met 0,9% zoutoplossing van 20 ° C en een monsterhouder ondergedompeld in de zoutoplossing naar een positie gedefinieerd, gemarkeerd. (C) volledige onderdompeling van het monster met het duidelijke standpunt van de monsterhouder zonder enig contact naar de binnenmuren of de onderkant van het bekerglas. Het gewicht wordt weergegeven op de balans is het gewicht van de hoeveelheid zoutoplossing verdrongen worden door het monster). De dichtheid van het monster wordt berekend zoals aangegeven (hier: ρmonster = mS/VS = mS/ (mL/1.0048) = 5.153/(4.538/1.0048) = 1.141 g/cm³). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: "Onderdompeling techniek" voor bepaling van de dichtheid van het weefsel/orgel. (A) verschillende monster houders opgebouwd uit dunne draad. Van links naar rechts: een lus van dunne draad wol door middel van een dunne injectie canule, een spiraalvormige mand van draad te houden van kleine en kwetsbare exemplaren, en een eenvoudige sling van dunne draad. Pijlen in A-C geven aan de standpunten waarnaar de monster-houders zijn ondergedompeld in zout. (B, C) Positionering van de monsterhouder tijdens de onderdompeling van het monster in een zoutoplossing (in vergelijking met Figuur 1 C). (B) Complete varkens slijmachtige klier geplaatst in een mand-vormig monsterhouder. (C) monster van varkens myocard. Opmerking de volledige onderdompeling van de monsters in een zoutoplossing zonder contact opnemen met de muren of de bodem van het bekerglas. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: Schematische afbeelding van de toepassing van de Cavalieri-methode voor de bepaling van varkens orgel volumes. (A) munt stapelen voorbeeld voor het begrijpen van het principe van Cavalieri. Zie Inleiding voor meer informatie. (B-H) Schematische aantoning van volume schatting van een nier perfusie-fixed. (B) meting van de lengte (l) van de nier langs de longitudinale as. (C) snijden van het compleet orgel in n even dik (d) parallelle segmenten loodrecht op de longitudinale orgel-as. (D) orgel platen op hetzelfde oppervlak naar beneden geplaatst. Merk op dat de eerste plaat (rechts) weefsel wordt geplaatst op zijn natuurlijke oppervlak, dat wil zeggen, beschikt niet over een oppervlak van de sectie. (E-H) Verschillende benaderingen om te bepalen van de oppervlakten van de sectie van de platen van het weefsel. (E) traceren van de omtrek van elk orgel slab met een waterdichte pen op een kunststof transparantie-overlay van de geschetste orgel plaat profielen met een gepaste afmetingen, gekalibreerd Kruis raster gedrukt op een kunststof transparantie, tellen van kruist raken de gebied van het profiel. Het orgel slab sectie profiel gebied is berekend op basis van het aantal kruisjes raken de sectie profiel ruimte en de oppervlakte die overeenkomt met een kruis. (F,G) Bepaling van de gebieden van de sectie van het orgel platen in foto's genomen in verticale richting op de sectie oppervlakken (F), of in gescande beelden van het weefsel platen (G), met linialen voor kalibratie. (H) bepaling van de gebieden van de sectie van de platen van het weefsel in de digitale beelden van de foto's / scans met behulp van passende morphometry softwaretoepassingen. (ik) berekening van de geschatte omvang van het orgel als het product van de cumulatieve oppervlakte van de overeenkomstige sectie oppervlakken van alle orgel platen vermenigvuldigd met de gemiddelde dikte van het orgel tegels15. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: Schematische afbeelding van bepaling van de driedimensionale insluiten-gerelateerde weefsel krimp tijdens de verwerking van weefselmonsters voor histologie. (A) snijden van een sectie van het vers, vlakke oppervlak uit een vaste weefsel monster (stabilisatie van de vorm van gemakkelijk vervormbaar (zachte) weefsels zoals adipeus of Long weefsel door te sluiten in agar voorafgaand aan afdelen). Scannen van het oppervlak van de sectie van het monster samen met een liniaal grootte. (B) planimetrische bepaling van het oppervlak van het oppervlak van de sectie van het vaste weefsel monster (eenf). (C) Routine inbedding van het monster in kunststof medium te embedding. (D) voorbereiding van een histologische gedeelte van het plastic blok met behoud van het sectievlak van het monster. Montage van de sectie op een glasplaatje en routine kleuring van de dia. (E) scannen van de dia samen met een liniaal grootte. (F) planimetrische bepaling van het oppervlak van het gedeelte van het monster van kunststof-embedded (A-e). (G) berekening van de omvang van insluiten-gerelateerde weefsel krimp als het quotiënt van het gemeten gebied van overeenkomstige sectie profielen van weefselmonsters vóór en na het inbedden in kunststof middellange14te embedding. Afbeeldingen aan de rechterkant tonen het oppervlak van de sectie van een formaldehyde-vaste steekproef van vetweefsel ingesloten in inkt-zwart agar voordat insluiten in kunststof hars (boven) en het overeenkomstige sectie profiel (HE-kleuring) van het monster van GMA/MMA-embedded (onder). Schaal bars = 2 mm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5: Schematische afbeelding van systematische steekproeven volume-gewogen. Het gepresenteerde voorbeeld toont systematische aselecte steekproef van zes locaties van de weefsel binnen de renale cortex van een nier perfusie-fixed. (A) meting van de lengte (l) van de nier langs de longitudinale as. (B) Complete afdelen van het gehele orgaan in even dikke (d) parallelle plakjes loodrecht op de longitudinale orgel-as. (C) orgaan/weefsel platen geplaatst op hetzelfde (dat wil zeggen, het recht of links) oppervlak naar beneden. (D) Overlay van de weefsel platen met een gepaste afmetingen Kruis raster gedrukt op een kunststof transparantie. De buitenste links bovenste cross van het raster wordt geplaatst over een willekeurig punt buiten het weefsel (aangegeven met een blauwe stip, ). (E) Counting en nummering van alle kruisen de renale cortex te raken. In het huidige voorbeeld, de kruisen het raken van de renale cortex opeenvolgend genummerd in één nier plaat na de andere (van links naar rechts), in elke procedure van de plaat in de richting van de klok, beginnend met het dichtst bij de twaalf uur positie Kruis. Hier is 36 kruisjes sloeg de renale cortex. Zes posities van de bemonstering moeten worden bemonsterd. Dus, elke zesde positie waar een kruis het weefsel raakt wordt bemonsterd (36/6 = 6). (F) In het huidige voorbeeld, de positie van de vierde cross (N ° 4) raken de renale cortex is willekeurig gekozen als de eerste positie van de bemonstering. Elke volgende zesde Kruis slaan de renale cortex is gemarkeerd op het plastic transparantie met een waterdichte pen. In het huidige voorbeeld zijn dat de standpunten 4, 10, 16, 22, 28 en 34. (G) Tags toevoegen van de bijbehorende locaties van het weefsel van kleine stukjes schoon, lege confetti papier geplaatst op het oppervlak van het weefsel. (H) excisie van weefsel monsters van de willekeurig systematisch bemonsterde locaties en de verdere verwerking voor verdere analyses. Dit cijfer is gewijzigd van Albl et al. (2016), cijfers S236 en S237, pagina 186 (supplementen)7. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 6
Figuur 6: Volume-gewogen systematische aselecte steekproef van de renale cortex van een varkens nier (zie figuur 5) en regels voor het tellen van punt. (A) verse varken nier. (B) nier gesegmenteerd in even dikke parallelle plakjes loodrecht op de longitudinale orgel as, bedekt met kruis raster gedrukt op een kunststof transparantie. De rode cirkel geeft de positie van het willekeurige punt de positie van het Kruis raster Randomize gebruikt. (C) illustratie van punt-tellen regels: een cross/point wordt geteld als het raken van het weefsel compartiment te worden bemonsterd (referentie compartiment), als de rechter boven binnenste hoek van de verticale en horizontale bar van het Kruis (pijl) heeft betrekking op het weefsel. (D) markering van kruisen het raken van de renale cortex en systematische steekproefsgewijze bemonstering van weefsel locaties (hier, 119 kruisen hit de renale cortex en 17 locaties worden systematisch willekeurig bemonsterd met een bemonstering interval i = 7). (E) bemonsterd willekeurig systematisch locaties van renale cortex gelabeld door confetti papier. (F) weggesneden monsters. (G) verdere onderverdeling van verwijderde monsters voor verdere verwerking van deelmonsters voor soorten verschillende downstream-analyse. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 7
Figuur 7: onderverdeling van weefselmonsters weggesneden uit systematisch willekeurig bemonsterde weefsel locaties en verwerking van deelmonsters voor soorten verschillende downstream analyse. (A) Schematische illustratie van generatie weefsel deelmonsters van de ene systematisch willekeurig bemonsterde locatie van renale cortex (native weefsel) voor verschillende analyses (bijvoorbeeldFF-PE: formaline-vaste, paraffine-ingebedde monster en MTC-PE: Methacarn-vaste, paraffine-ingebedde monster voor licht-microscopische histologie; CRYO: Monster voor bevroren sectie histologie; -80 ° C:-Droogijs bevroren weefselmonsters voor moleculaire analyse). (B) excisie van systematisch willekeurig bemonsterde locaties van de renale cortex van een nier perfusie-vaste, verdere onderverdeling van het verwijderde weefselmonsters, en verwerking van de deelmonsters voor kwalitatieve en kwantitatieve morfologische analyses. Platen van perfusie-vaste varkens nier (1), cross-raster (2), willekeurig nummer tabel (3), is en cosinus-gewogen cirkels (4) voor generatie IUR secties (Zie Figuur 9, Figuur 10), verschillende fixatie oplossingen (5, 6, 7), en monster container voor elektronen microscopische monsters (8). Dit cijfer is gewijzigd van Albl et al. (2016), figuur S239, pagina 186 (supplementen)7. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 8
Figuur 8: "Isector" sectie bereiding op basis van formaline-vaste varkens weefsel. (A) monster van varkens renale cortex perfusie-fixed. (B) sferische gieten mallen. (C) vloeibare agar. (D-E) Agar-insluiting voor samples in sferische gieten mallen. (F) Agar bol met ingesloten weefsel monster. (G) Agar bol met ingesloten weefsel gesegmenteerd op een willekeurige positie (IUR sectievlak). Dit cijfer is gewijzigd van Albl et al. (2016), figuur S6, pagina 14 (supplementen)7. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 9
Figuur 9: Schematische afbeelding van de "Oriënteringsapparaten" techniek voor bereiding van IUR secties. (A) elk exemplaar van vaste weefsel geplaatst op een is cirkel (ci1) met een rand evenwijdig aan de 0-180 ° richting (aangegeven met een rode lijn). (B) Sectioning van het monster in een willekeurige hoek (groene lijn). (B, C) Nieuw gegenereerde sectie oppervlak van het weefsel monster (aangegeven in groene kleur). (D) monster geplaatst op een cosinus-gewogen cirkel (ci2) met het sectionele oppervlak gegenereerd in de vorige stap tegenover nadeel en één rand van het rust vlak evenwijdig aan de richting van de 1-1 (aangegeven met een rode lijn). (E) snijden van de tweede sectie door middel van het monster in een willekeurige hoek. (F) Resulting willekeurig isotrope afdeling vliegtuig van het monster (aangegeven in blauw). (G) bepaling van het oppervlak van de IUR sectie van het monster van de vaste weefsel voor schatting van insluiten-gerelateerde weefsel krimp zoals beschreven in stap 1.3. (H) insluiten van het weefsel monster in kunststof hars. (ik) Sectioning van het plastic blok is verdeelde (parallel met het deurvlak IUR) op een microtoom. (J) montage van de IUR kunststof-secties op glas glijdt. Dit cijfer is gewijzigd van Albl et al. (2016), figuur S8, pagina 15 (supplementen)7. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 10
Figuur 10: "Oriënteringsapparaten" techniek voor bereiding van IUR secties van agar-ingebedde weefselsteekproeven. (A-D) Optioneel, een eventueel agar-insluiten een systematisch willekeurig bemonsterde specimen van vaste weefsel (agar-insluiten is handig voor kleine weefselsteekproeven, zodat de eerste of willekeurige gedeelten kunnen worden geplaatst binnen de agar zonder snijden het weefsel). (E) plaatsing van de agar blok op een is cirkel (ci1) met een rand evenwijdig aan de richting van de 1-1 (aangegeven met een rode lijn). (F, G) Afdelen van het blok in een willekeurige hoek (hier: 15-15, groene lijn) bepaald met behulp van een willekeurige numerieke tabel (rnt, groene pijl). (H) opeenvolgende positionering van de agar blok op het oppervlak van de sectie gesneden in F op een cosinus-gewogen cirkel (ci2) met de rand van het rust oppervlak geplaatst parallel aan de richting van de 1-1 (aangegeven met een rode lijn). (ik) tweede sectie snijden door het monster in een willekeurige hoek (hier: 20-20, aangegeven door een blauwe lijn), bepaald met behulp van een willekeurige numerieke tabel (rnt, blauwe pijl). (J) resulterende IUR afdeling vliegtuig van het weefsel monster. Dit cijfer is gewijzigd van Albl et al. (2016), figuur S9, pagina 16 (supplementen)7. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 11
Figuur 11: Schematische afbeelding van VUR sectie preparaat. (A) vaste weefsel monster met een gedefinieerde (herkenbare) verticale as (bijvoorbeeldverticale naar zijn natuurlijke oppervlak). (B) vaste weefsel monster ingebed in agar. (C) plaatsing van the(agar-embedded) weefsel monster op een afdruk van een is cirkel (ci1). A: verticale as. (D) Sectioning van het monster in een willekeurige hoek (willekeurige nummer tabel; hier: 30-30 richting, die wordt aangegeven door een blauwe lijn) met het sectievlak orthogonaal op de tabel en evenwijdig aan de verticale as van het monster wordt gericht. Resulterende VUR sectievlak van het weefsel monster (aangegeven in blauw). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 12
Figuur 12: vertegenwoordiger volumetrie van een varkens nier. (A-B) Onderdompeling techniek. (A) bepaling van het gewicht van de nier (mkid). (B) bepaling van het gewicht van de hoeveelheid zoutoplossing dakloos geraakt door de nier (m-displ.saline). De nier is opgehangen aan een koord en volledig ondergedompeld in een zoutoplossing zonder het aanraken van de bodem of de wanden van het bekerglas. De berekende volume worden gecontroleerd van de nier is 92,6 cm³. (C-D) Cavalieri techniek, platte grond door het tellen van de punt. (C) meting van de lengte (l) van de nier langs de longitudinale as. (D) bepaling van de gebieden profiel sectie van de nier platen door punt tellen nadat overlay van een raster van gelijkelijk verdeelde kruisen op een kunststof transparantie afgedrukt. Hier is de geschatte omvang van de nier 93.3 cm³. (E-F) Cavalieri techniek, platte grond van gescande afbeeldingen van sectie profiel gebieden van de nier platen (F). Hier is de geschatte omvang van de nier 92.8 cm³. In C-E, de natuurlijke ronde oppervlak van de eerste of de laatste plaat van de nier op de scanner geplaatst of bedekt door het Kruis raster transparantie is niet een sectie oppervlak en daarom geen gedeelte oppervlakte wordt gemeten in dit weefsel plaat. (G-H) Aantoning van overprojection in gescande beelden van orgaan/weefsel platen (G) en in orgaan/weefsel platen bedekt met een kruis raster transparantie (H). Overprojecting delen van het weefsel van de orgel-platen worden aangegeven door de gestippelde witte en zwarte lijnen. Alleen de gebieden van de profielen van het werkelijke gedeelte (dat wil zeggen, het weefsel daaromheen de gedeeltelijk aangegeven witte gestippelde lijn) worden bepaald. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 13
Figuur 13: vertegenwoordiger illustratie van adequate (A) en suboptimaal (B) voorbereiding van agar-ingebedde weefselsteekproeven voor bepaling van weefsel krimp aan inbedding van stalen in histologische kunststof media te embedding gerelateerde. (A) Scanned afbeelding van het oppervlak van de sectie van een vaste monster van varkens onderhuids vetweefsel voorafgaand aan insluiten in kunststof hars. Het monster wordt ingesloten in inkt-zwart agar voor stabilisatie van de vorm van het monster en een duidelijke identificatie van de sectie oppervlakte contouren. (B) Indistinct overzicht van de sectie oppervlak en prikroller luchtbel (pijl) binnen de agar. Schaal bars = 5 mm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Analyse Monster Verwerking
Type Methode (n)
Moleculaire analyse RNA transcriptie, eiwit, metaboliet en lipide-profielen,
metabolomica analyse, DNA analyse
Kleine stukken * van verse (native) weefsel Bevriezen op droog ijs of in vloeibare stikstof. Winkel bij-80 ° C.
Kwalitatieve morfologische analyses Histologie
[de lichte microscopie, incl. immunohistochemistry (IHC) & kruising in situ]
Vers (native) — of in situ - vaste * weefselsteekproeven Gebruik van verschillende fixatives (bijv., 4% formaldehyde oplossing) en media te embedding (paraffine, GMA/MMA, epoxy), in voorkomend geval.
Cryohistology
(bevroren secties, incl. IHC)
Verse (native) weefselsteekproeven Monster in blokkerende medium insluiten en bevriezen in vloeibare stikstof-gekoelde tolueen.
Ultrastructurele analyse
[elektronenmicroscopie, incl. transmissie-(TEM) en scanning elektronen microscopie]
Kleine stukjes van verse (native) — of in situ- vaste * weefselsteekproeven Monster in 2.5 – 6,25% Glutaaraldehyde oplossing corrigeren en insluiten in kunststof epoxyhars.
Kwantitatieve morfologische analyses De lichte microscopie Vers (native)- of in situ - vaste * weefselsteekproeven IUR-secties (oriënteringsapparaten-, isector-delen) en/of VUR-secties van kunststof ingebedde weefselsteekproeven te bereiden.
TEM Kleine stukjes van verse (native) — of in situ - vaste * weefsel IUR (oriënteringsapparaten-, isector-secties) secties van epoxy-ingebedde weefselsteekproeven te bereiden.

Tabel 1: verwerking van weefsel deelmonsters weggesneden vanuit systematisch willekeurig bemonsterde locaties voor verschillende downstream analyses typen. Afhankelijk van de proefopzet voor een studie en het orgel/het weefsel onderzochte, moet verschillend aantal deelmonsters worden vanaf elke locatie systematisch willekeurig bemonsterde weefsel weggesneden en verwerkt voor verschillende soorten downstream analyses. Gedetailleerde protocollen voor meest varkens organen/weefsels en studie typen vindt u in de "Weefsel bemonstering gidsen voor varkens biomedische modellen"7. GMA/MMA: Glycolmethacrylate/methylmethacrylate. IUR: Isotrope uniform willekeurige. VUR: Verticale uniform willekeurige. * max. 2 x 2 x 2 mm,3. bijvoorbeeld, perfusie vaste weefsel of pulmonaire weefsel van longen ingeprent met fixatie oplossing.

Methode Representatieve resultaten
Onderdompeling techniek voor de bepaling van de dichtheid van het weefsel/orgel (stap 1.1, Figuur 1, Figuur 2) Varkens orgaan/weefsel Ρ (g/cm³)
Lever 1.071 ± 0,007
Alvleesklier 1.062 ± 0.016
Ventrikel myocard 1.036 ± 0.014
Nier 1.044 ± 0.006
Abdominale viscerale adipeus weefsel * 0.921 ± 0.032
Schildklier 1.061 ± 0,007
Hersenen 1.051 ± 0,007
Bijnier 1.063 ± 0,025
Skeletal muscle ** 1,074 ± 0.003
Gegevens zijn middelen ± SD. specifieke orgaan/weefsel gewichten in n vastbesloten waren = 18 varkens (14 vrouwelijke en 4 mannelijke varkens; leeftijd 60 dagen tot 2 jaar; lichaam gewicht 30 tot 250 kg). * Adipeus weefsel van het mesenterium jejunal. ** De gemiddelde waarden voor de M. longissimus dorsi, M. tibialis cranialis, M. triceps brachii en M. gluteobiceps.
Bepaling van de driedimensionale insluiten-gerelateerde weefsel krimp tijdens de verwerking van weefselmonsters voor histologie (stap 1.3, Figuur 4) Orgaan/weefsel Medium te Embedding       fS
Renale cortex (varken) GMA/MMA 0,89 ± 0,02
Epoxy 0,92 ± 0,02
Gegevens zijn middelen ± SD van metingen van 24 monsters van 12 varkens. fS: Lineaire krimp correctiefactor.

Tabel 2: Representatieve resultaten van dichtheid van geselecteerde varkens organen en weefsels7, en lineaire krimp correctiefactoren voor insluiten-gerelateerde weefsel krimp van varkens corticale nierweefsel in verschillende kunststof media te embedding.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Generatie van biobank monstercollecties van varkens diermodellen vereist robuuste technieken en protocollen voor de bepaling van orgaan/weefsel volumes, de reproduceerbare generatie van vertegenwoordiger, redundante weefselsteekproeven geschikt voor een breed scala aan verschillende analysemethoden, en voor randomisatie van de oriëntatie van monster secties voor kwantitatieve stereological analyses. De in dit artikel beschreven methoden zijn aangepast aan de grootte van varkens organen en weefsels, en hebben ontwikkeld om effectief aan deze eisen2,7te. Ze zijn gebaseerd op goed herkend methodologische beginselen, en eerder hun uitvoerbaarheid in verschillende gepubliceerde studies2,,7,,12,21hebben bewezen. De aanbevolen methoden zijn belangrijk voor de verschillende soorten studies onderzoeken weefsel/orgaanmonsters, want zij een basis vormen voor de generatie van representatieve monsters, en voor de verwerving van een aantal parameters die anders niet kon worden vastgesteld. Deze methoden kunnen snel worden uitgevoerd met weinig inspanning, en zijn compatibel met vrijwel alle soorten downstream analyses. Daarom kunnen zij worden beschouwd als niet alleen geschikt voor varkens diermodel biobank projecten, maar ook zijn nuttig bij studies waarbij kwantitatieve histomorphological analyses van weefselmonsters van andere grote diermodel soorten (bijvoorbeeld, schapen), als evenals in veterinaire studies. Inachtneming van de technische aspecten van de verschillende methoden, moeten een paar kritische stappen en beperkingen worden beschouwd tijdens de uitvoering van de protocollen van de respectievelijke technieken.

Onderdompeling techniek voor de bepaling van de dichtheid van het weefsel/orgel

Tijdens de bepaling van weefsel dichtheden methode onderdompeling (stap 1.1, Figuur 1, Figuur 2) zorg moeten worden genomen niet aan te raken de binnenmuren of de bodem van het bekerglas af met het monster van het weefsel of de monsterhouder terwijl het weefsel is monster ondergedompeld in een zoutoplossing. Anders wordt de schaal weergegeven het gewicht van het monster in plaats van het gewicht van de hoeveelheid zoutoplossing verdrongen worden door het monster. Voor zeer kleine/licht weefselmonsters (een paar mg) is de onderdompeling methode voor de bepaling van de dichtheid van het weefsel beperkt, als gevolg van de surface tension van het zout en de negatieve hoge quotiënt van monstervolume aan het volume van onderdompeling vloeistof in het bekerglas, die is belemmeren de nauwkeurigheid van de meting. Hier, kan het gewicht van het monster worden gebruikt voor verdere berekeningen in plaats van de dichtheid-berekende volume. Bepaling van de dichtheid van het weefsel door onderdompeling is ook niet effectief voor verse (losse) longweefsel, vanwege de inconsistente gehalte van de lucht in het weefsel, en in sommige gevallen, waar de organen zijn experimenteel geperfundeerd/ingeprent met fixatives.

Cavalieri methode voor de bepaling van orgel volumes

De methode van Cavalieri volumetrie van varkens organen en weefsels is meer omslachtig in vergelijking met de bepaling van het orgel volume van het orgel gewicht en dichtheid. Het is echter geschikt voor organen die kunnen niet op de juiste wijze worden gewogen als gevolg van de experimentele verwerking ervan (bijvoorbeeld, perfusie-vaste organen of longen ingeprent met fixatie oplossing). De Cavalieri volumetrie methode kan hier, idealiter worden gecombineerd met de techniek van de systematische steekproeven volume-gewogen beschreven in stap 2 (Figuur 5, Figuur 6, Figuur 12). Tijdens de schatting van orgaan/weefsel volumes van de gebieden van sectie profielen van parallelle, equidistante segmenten van het orgaan/weefsel (Cavalieri aanpak, stap 1.2, Figuur 3) tegels onderhoud van de oriëntatie van het weefsel (bovenste en onderste sectievlak ), evenals de nauwkeurige bepaling van het oppervlak van alle sectie-profielen zijn van groot belang. In het bijzonder als digitale beelden of scans van orgel platen planimetrically worden geanalyseerd, moeten overprojections weefsel (buiten het vliegtuig verdeelde weefsel) van het weefsel plaat (Figuur 12G-H) zorgvuldig worden geacht op te leveren betrouwbare volume schattingen.

Bepaling van de driedimensionale insluiten-gerelateerde weefsel krimp tijdens de verwerking van weefselmonsters voor histologie

De omvang van insluiten-gerelateerde weefsel krimp hangt af van het insluiten medium en het soort weefsels, en kan ook variëren tussen differentieel verwerkte monsters van de dezelfde weefsel.

Overwegende dat de bevroren secties worden geacht vrijwel geen krimp in het X-Y vlak en kunststof insluiten in het algemeen veroorzaakt weinig krimp van het weefsel, is weefsel insluiten-gerelateerde krimp bijzonder uitgebreid in paraffine-ingebedde weefselsteekproeven , en zal meestal aanzienlijk afbreuk doen aan kwantitatieve morfologische analyses van dimensionale parameters in histologische secties van deze monsters. Naast de grote omvang van de totale driedimensionale krimp zorgt paraffine-insluiting ook voor een niet-uniforme, differentiële anisotrope en variabele krimp van het monster en van verschillende anatomische structuren, weefseltypes (HLA) en celtypes binnen het weefsel monster8,13. Bovendien, met name in dikker histologische secties van paraffine-ingebedde weefselsteekproeven, de omvang van weefsel krimp ook aanzienlijk afwijken in de X-Y en de Z-richting van de sectie. Dit kan te wijten zijn aan een differentiële krimp van de ruimte van de sectie (in X-Y-richting) en de hoogte van de sectie (dat wil zeggen, de dikte van de verticale doorsnede) tijdens het oprekken van de sectie in het waterbad van warme weefsel flotatie na de sectie is gesneden uit het weefsel blokkeren, en tijdens de daaropvolgende procedures voor de verwerking, kleuring en coverslipping van de sectie gemonteerd op een glas dia (dat wil zeggen, een homogene ineenstorting van de secties z-as)8. Bovendien, in dikke secties, is er mogelijk een relatief sterkere compressie van de sectie-vliegtuig-in de buurt van weefsel regio's binnen de sectie terwijl de sectie is gesneden uit het weefsel blok (leidend tot een differentiële vervorming van de secties z-as)19 . Deze effecten kunnen vervolgens ook vervormen de schattingen van het aantal weefsel structuren binnen de sectie afzonderlijke kwantitatieve van stereological analysemethoden, zoals de optische disector. Voorspelling, controle en correctie van insluiten-gerelateerde weefsel krimp dus niet haalbaar voor paraffine-ingebedde weefsel monsters8.

De mate van krimp van het volume van weefselmonsters ingebed in kunststof harsen, zoals GMA/MMA of epoxy, is daarentegen aanzienlijk lager en, belangrijker, meer uniform. Daarom insluiten in kunststof hars met een veronderstelde homogene, isotrope en mondiaal krimp van het weefsel is gunstig voor de verschillende analysemethoden van verschillende kwantitatieve morfologische parameters17,18. Tijdens de schatting van weefsel krimp gerelateerde te embedding in kunststof hars, mag de vorm van het vaste weefsel niet bovendien worden verstoord tijdens de insluiten procedure, met het oog op vergelijking van de desbetreffende sectie profiel oppervlakten van de vaste en ingesloten monsters. Dit kan moeilijk in zachte of gemakkelijk samendrukbaar weefselsteekproeven zoals adipeus of Long weefsel of in weefselmonsters met een hoog vocht gehalte. Hier, het insluiten van het vaste monster in agar voorafgaand aan afdelen van het weefsel is nuttig om te stabiliseren de vorm van het weefsel monster tijdens de daaropvolgende plastic procedure te embedding (protocol stap 1.3., Figuur 4). Om te bereiken van betrouwbare gegevens, moeten herhaalde metingen van de krimp insluiten-gerelateerde weefsel worden uitgevoerd met verschillende monsters van de dezelfde weefsel. De omvang van insluiten-gerelateerde weefsel krimp wordt uitgedrukt als de lineaire weefsel krimp factor fs (protocol stap 1.3.9., Figuur 4 g). Voorbeelden van vergelijkingen met behulp van fs voor krimp correctie van verschillende lengte, oppervlakte en volume parameters van verschillende weefsel structuren worden geleverd in verschillende kwantitatief stereological onderzoek14, 21,27.

Volume-gewogen systematische aselecte steekproef door punt tellen en verwerken van weefsel deelmonsters voor soorten verschillende downstream analyse

De techniek van de voorgestelde volume-gewogen bemonstering voor varkens organen steekproeven locaties binnen het weefsel eenmaal bepaalt, en vervolgens genereert alle nodige monsters voor verder uiteenlopende analyses door de steekproef van de weefselmonsters weggesneden uit deze locaties7. In de systematische steekproeven volume-gewogen regimes, elke locatie mogelijk bemonstering binnen het totale volume van het orgel/het weefsel onderzochte heeft precies dezelfde willekeurige kans te bemonsteren, en dan wordt gewaarborgd door de collectie van een voldoende aantal specimens. Met behulp van de systematische steekproeven volume-gewogen ontwerpen voor generatie van monsters van parenchymal organen, daarom effectief voorkomt u dat de resultaten van de analyse mogelijk beïnvloed door (mogelijk onverwachte en onbekende) ongelijke verdelingen van verschillende eigenschappen van de functionele of morfologische weefsel binnen verschillende locaties van een orgaan, die hebben aangetoond, bijvoorbeeldvoor het gemiddelde volume en de dichtheid van de numerieke omvang van varkens hepatocyten in verschillende regio's van de lever parenchym28 . De aanbevolen "weefsel-slabbing en subsampling" strategie voor varkens organen kan is gemakkelijk te begrijpen, voldoet aan de technische voorschriften van de downstream-analyse methoden, en worden snel uitgevoerd en aangepast aan de eisen van een specifieke studie, waardoor het vermijden van systematische bemonstering vooroordelen, reductie van experimentele variabiliteit, en verbetering van de precisie van de algehele experiment, terwijl ze efficiënter dan bemonstering van strategieën waarin elke locatie enkele bemonstering wordt willekeurig bepaald9 ,15. Het aantal exemplaren dat worden gegenereerd moet, is uiteraard afhankelijk van de onderzochte parameter en haar variabiliteit binnen monsters vanaf verschillende locaties van het bemonsterde orgaan/weefsel. Voor de opwekking van biobank monstercollecties ontworpen om door een verscheidenheid van verschillende analytische methoden voor onderzoek van een maximum van verschillende parameters (niet nader gespecificeerd op het tijdstip van bemonstering), een dergelijke toekomstgerichte bemonsteringsstrategie meestal gepland generatie van relatief hoge aantal redundante monsters per orgaan/weefsel.

Generatie van isotroop uniforme Random (IUR) secties en verticale uniforme Random (VUR) secties voor kwantitatieve stereological analyses

Enkele van de technieken die worden gebruikt voor de generatie van IUR en VUR secties voor kwantitatieve stereological analyses hebben enigszins gecompliceerd theoretische grondslagen en toelichtingen zijn daarom vaak (onnodig) door vele wetenschappers vermeden, hoewel hun praktische uitvoering is redelijk eenvoudig. VUR de secties zijn met name gemakkelijk te genereren, en zijn optimaal voor dichtheid/oppervlakte schattingen in combinatie met de cycloid test systemen8,9,20. Ze hebben vaak de voorkeur als gevolg van de bekende oriëntatie van het sectievlak. In tegenstelling tot IUR secties zijn VUR secties echter niet geschikt voor de schatting van de lengte-parameters8,9.

Tijdens de voorbereiding van IUR en VUR secties, de kritieke stap is, in principe, te behouden de IUR of VUR sectie oppervlak van de vaste monster tijdens insluiten in kunststof hars en om ervoor te zorgen dat de verticale as van de VUR secties altijd kan worden geïdentificeerd (stap 3, Figuur 9, Figuur 10, Figuur 11).

In de toekomst de bredere toepassing van de hierboven beschreven methoden kan aanzienlijk bijdragen tot een consequent hoge kwaliteit normen vast te stellen voor de generatie van vergelijkbare, multi purpose biobank monsters van varkens en andere grote diermodellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

De auteurs bedanken Lisa Pichl voor uitstekende technische bijstand.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar Carl Roth GmbH, Germany Agar (powder), Cat.: 5210.3 Dissolve approximately 1 g of agar in 10 ml cold water in a glass or plastic beaker, heat in microwave-oven at 700 W, boil the solution twice with rigorous stirring. Cast into mold while still warm and let solidify. Caution: While handling with hot liquid agar, wear protective goggles and gloves.
Caliper Hornbach Baumarkt GmbH, Bornheim, Germany Schieblehre Chrom/Vernickelt 120 mm Cat.: 3664902 Any kind of caliper (mechanical or electronic) will do as well.
Casting molds (metal) Engelbrecht Medizin & Labortechnik, Edermünde, Germany Einbettschälchen aus Edelstahl, 14 x 24 x 5 mm, Cat.: 14302b Any other kind of metal casting mold used for paraffin-embedding will do as well.
Copy templates of cross grids (5mm - 6 cm) n.a. n.a. Copy templates of cross grids (5mm - 6 cm) are provided in the supplemental data file of Albl et al.  Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016)
Copy templates of equiangular and cosine-weighted circles n.a. n.a. Copy templates of equiangular and cosine-weighted circles are provided in Nyengaard & Gundersen. Eur Respir Rev. 15, 107-114, doi: 10.1183/09059180.00010101 (2006) and in Gundersen et al. Stereological Principles and Sampling Procedures for Toxicologic Pathologists. In: Haschek and Rousseaux´s Handbook of Toxicologic Pathology. 3rd ed, 215-286, ISBN: 9780124157590 (2013).
Foldback clamps (YIHAI binder clips, 15 mm and 19 mm) Ningbo Tianhong Stationery Co ltd., China Y10006 and Y10005 Any other type of standard office foldback clamps will do as well.
Forceps (anatomical) NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany neoLab Standard -Pinzette 130 mm, anatomisch, rund, Cat.: 1-1811 Any type of anatomical forceps will do.
Formaldehyde-solution 4% SAV-Liquid Produktion GmbH, Flintsbach, Germany Formaldehyd 37/40 %, Cat.: 1000411525005 Dilute to 4% from concentrated solution. Buffer to neutral pH. Wear appropriate eye-, hand- and respiratory protection. Process tissue samples fixed in formaldehyde solution under an exhaust hood and wear protective goggles and laboratory gloves.
Graph paper (for calibration) Büromarkt Böttcher AG, Jena, Germany. www.bueromarkt-ag.de Penig Millimeterpapier A4, Cat.: 2514 Any type of graph paper (scaled in millimeter) will do.
Laboratory beakers (5ml, 10 ml, 50 ml, 100 ml) NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany Becherglas SIMAX® , niedrige Form, Borosilikatglas 3.3 Cat.: E-1031, E-1032, E-1035, E-1036 Any kind of glass- or plastic beakers of 5 – 100 ml volume will do.
Laboratory scale(s) Mettler Toledo GmbH, Gießen, Germany PM6000 Any standard laboratory scales with measuring ranges between 0.1 mg to approximately 20 g, respectively between 100 mg to approximately 500 g will do
Sartorius AG, Göttingen, Germany BP61S
Microtome blades Engelbrecht Medizin & Labortechnik, Edermünde, Germany FEATHER Microtome blasdes S35, Cat.:14700 Any kind of single-use microtome blades will do.
Morphometry/planimetry software/system National Institute of Health (NIH) ImageJ Download from https://www. imagej.nih.gov/ij/ (1997).
Zeiss-Kontron, Eching, Germany VideoplanTM image analysis system Out of stock
Photo camera Nikon D40 Any kind of digital photocamera that can be mounted to a tripod  will do.
Plastic transparencies Avery Zweckform GmbH, Oberlaindern, Germany Laser Overhead-Folie DINA4 Cat.:  3562 Any (laser)-printable plastic transparency will do.
Random number tables n.a. n.a. Random number tables can conveniently be generated (with defined numbers of random numbers and within defined intervals), using random number generators, such as: https://www.random.org/
Razor blades Plano GmbH, Wetzlar, Germany T5016 Any kind of razor blades will do.
Ruler Büromarkt Böttcher AG, Jena, Germany. www.bueromarkt-ag.de Office-Point Lineal 30 cm, Kunststoff, transparent, Cat.: ln30 Any kind of cm-mm-scaled ruler will do as well.
Saline (0.9%) Carl Roth GmbH, Germany Natriumchlorid, >99% Cat.: 0601.1 To prepare 0.9% saline, dissolve 9 g NaCl in 1000 ml of distilled water at 20°C.
Scalpel blades Aesculap AG & Co KG, Tuttlingen, Germany BRAUN Surgical blades N°22 Any kind of scalpel blades will do.
Scanner Hewlett-Packard hp scanjet 7400c Any type of standard office scanner capable of scanning with resolutions from 150-600 dpi will do.
Slicing devices n.a. n.a. Examples forself constructed slicing devices can be found in Knust, et al. Anatomical record. 292, 113-122, doi: 10.1002/ar.20747 (2009) and in the supplemental data file of Albl et al.  Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016).
Spherical casting molds (e.g., in 25.5 mm diameter) Pralinen-Zutaten.de, Windach, Germany Pralinen-Hohlkugeln Vollmilch, 25.5 mm Spherical casting molds can as well be be self-constructed, or obtained from other confectioner suppliers (for for pralines). The casting molds indicated here are actually the package/wrapping of hollow pralines bodies (first eat the pralines and then use the package for generation of i-sector sections)
Thin wire Basteln & Hobby Schobes, Straßfurth, Germany. www,bastel-welt.de Messingdraht (0.3 mm) Cat.: 216464742 Any other kind of thin wire will also do.
Tissue paper NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany Declcate Task Wipes-White, Cat.: 1-5305 Any other kind of laboratory tissue paper will do as well.
Waterproof pen Staedler Mars GmbH & Co KG, Nürnberg, Grmany Lumocolor permanent 313, 0.4 mm, S, black, Cat.: 313-2 Any other kind of waterproof pen will do as well.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aigner, B., et al. Transgenic pigs as models for translational biomedical research. J Mol. Med. 88, 653-664 (2010).
  2. Blutke, A., et al. The Munich MIDY Pig Biobank: A unique resource for studying organ crosstalk in diabetes. Mol Metab. 6, 931-940 (2017).
  3. Klymiuk, N., et al. Dystrophin-deficient pigs provide new insights into the hierarchy of physiological derangements of dystrophic muscle. Hum Mol Genet. 22, 4368-4382 (2013).
  4. Klymiuk, N., Seeliger, F., Bohlooly, Y. M., Blutke, A., Rudmann, D. G., Wolf, E. Tailored pig models for preclinical efficacy and safety testing of targeted therapies. Toxicol Pathol. 44, 346-357 (2016).
  5. Renner, S., et al. Permanent neonatal diabetes in INSC94Y transgenic pigs. Diabetes. 62, 1505-1511 (2013).
  6. Abbott, A. Inside the first pig biobank. Nature. 519, 397-398 (2015).
  7. Albl, B., et al. Tissue sampling guides for porcine biomedical models. Toxicol Pathol. 44, 414-420 (2016).
  8. Gundersen, H. J. G., Mirabile, R., Brown, D., Boyce, R. W. Stereological principles and sampling procedures for toxicologic pathologists. Haschek and Rousseaux's Handbook of Toxicologic Pathology. Haschek, W. 3rd ed, Academic Press. London. 215-286 (2013).
  9. Howard, C. V., Reed, M. G. Unbiased Stereology: Three-Dimensional Measurement in Microscopy. 2nd ed, Garland science/Bios Scientific Publishers. Oxford. 1-277 (2005).
  10. Mattfeldt, T., Mall, G., Gharehbaghi, H., Moller, P. Estimation of surface area and length with the orientator. J Microsc. 159, 301-317 (1990).
  11. Nyengaard, J. R., Gundersen, H. J. G. The isector: A simple and direct method for generating isotropic, uniform random sections from small specimens. J Microsc. 165, 427-431 (1992).
  12. Tschanz, S., Schneider, J. P., Knudsen, L. Design-based stereology: Planning, volumetry and sampling are crucial steps for a successful study. Ann Anat. 196, 3-11 (2014).
  13. Dorph-Petersen, K. A., Nyengaard, J. R., Gundersen, H. J. Tissue shrinkage and unbiased stereological estimation of particle number and size. J Microsc. 204, 232-246 (2001).
  14. Mattfeldt, T. Stereologische Methoden in der Pathologie [Stereologic methods in pathology]. Normale und pathologische Anatomie. Doerr, W., Leonhardt, H. Georg Thieme Verlag. Stuttgart-New York. (1990).
  15. Gundersen, H. J., Jensen, E. B. The efficiency of systematic sampling in stereology and its prediction. J Microsc. 147, 229-263 (1987).
  16. Scherle, W. A simple method for volumetry of organs in quantitative stereology. Mikroskopie. 26, 57-60 (1970).
  17. Nielsen, K. K., Andersen, C. B., Kromann-Andersen, B. A comparison between the effects of paraffin and plastic embedding of the normal and obstructed minipig detrusor muscle using the optical disector. J Urol. 154, 2170-2173 (1995).
  18. Schneider, J. P., Ochs, M. Alterations of mouse lung tissue dimensions during processing for morphometry: a comparison of methods. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 306, L341-L350 (2014).
  19. von Bartheld, C. S. Distribution of particles in the z-axis of tissue sections: Relevance for counting methods. NeuroQuantology. 10, 66-75 (2012).
  20. Baddeley, A. J., Gundersen, H. J., Cruz-Orive, L. M. Estimation of surface area from vertical sections. J microsc. 142, 259-276 (1986).
  21. Blutke, A., Schneider, M. R., Wolf, E., Wanke, R. Growth hormone (GH)-transgenic insulin-like growth factor 1 (IGF1)-deficient mice allow dissociation of excess GH and IGF1 effects on glomerular and tubular growth. Physiol Rep. 4, e12709 (2016).
  22. Rasband, W. S. ImageJ. U.S. National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. Available from: http://rsb.info.nih.gov/ij (1997).
  23. Hermanns, W., Liebig, K., Schulz, L. C. Postembedding immunohistochemical demonstration of antigen in experimental polyarthritis using plastic embedded whole joints. Histochemistry. 73, 439-446 (1981).
  24. Böck, P. Romeis Mikroskopische Technik. Urban und Schwarzenberg. München, Wien, Baltimore. 17. Auflage 1-697 (1989).
  25. Suvarna, K. S., Layton, C., Bancroft, J. D. Bancroft's theory and practice of histological techniques. Suvarna, K. S., Layton, C., Bancroft, J. D. Churchill Livingstone. 1-654 (2013).
  26. Knust, J., Ochs, M., Gundersen, H. J., Nyengaard, J. R. Stereological estimates of alveolar number and size and capillary length and surface area in mice lungs. Anat Rec (Hoboken). 292, 113-122 (2009).
  27. Nyengaard, J. R., Gundersen, H. J. G. Sampling for stereology in lungs. Eur Respir Rev. 15, 107-114 (2006).
  28. Junatas, K. L., et al. Stereological analysis of size and density of hepatocytes in the porcine liver. J Anat. 230, 575-588 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics