דגם Syngeneic Orthotopic זוהרים, פלורסנט מאתר של סירוס עמידים ו אנדרוגן תלויי סרטן הערמונית

* These authors contributed equally
Cancer Research
 

Summary

המטרה של פרוטוקול זה היא להפגין אינטרה-הערמונית הזרקה של תאי סרטן הערמונית, עם סירוס עוקבות. Orthotopic מודלים קליניים של סירוס עמידים ו אנדרוגן תלויי סרטן הערמונית הם קריטיים כדי לחקור את המחלה בהקשר של microenvironment של הגידול הרלוונטית קלינית, מארח immunocompetent.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Anker, J. F., Mok, H., Naseem, A. F., Thumbikat, P., Abdulkadir, S. A. A Bioluminescent and Fluorescent Orthotopic Syngeneic Murine Model of Androgen-dependent and Castration-resistant Prostate Cancer. J. Vis. Exp. (133), e57301, doi:10.3791/57301 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Orthotopic הגידול דוגמנות הוא כלי רב ערך למחקר סרטן הערמונית ניסויים פרה-קליניים, כפי יש מספר יתרונות על פני שניהם תת עורית של הטרנסגניים מהונדסים גנטית עכבר מודלים. בניגוד תת עורית גידולים, גידולים orthotopic מכילים להערכת מדויקת יותר מבחינה רפואית, גידול microenvironment ואת התגובות טיפולים מרובים. לעומת מודלים מהונדס גנטית עכבר, orthotopic מודלים יכול להתבצע עם עלות נמוכה יותר, בעוד פחות זמן, לערב את השימוש בעכבר הטרוגנית ומורכבת מאוד או שורות תאים סרטניים אנושיים, אלא זה יחיד שינויים גנטיים, ותא האלה קווים יכול להיות מהונדסים גנטית, כגון אקספרס סוכני דימות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול בניתוח הזרקת קו תא סרטן הערמונית מאתר לוציפראז - ו mCherry-ביטוי לתוך האונה הערמונית הקדמי של עכברים. עכברים אלה פיתחו גידולים orthotopic היו לא-פולשנית בפיקוח ויוו וניתח בהמשך הגידול נפח, משקל, העכבר הישרדות של הסתננות המערכת החיסונית. יתרה מזו, orthotopic נושאות עכברים היו בניתוח עיקור, המוביל רגרסיה הגידול מיידית הישנות עוקבות, המייצגים סירוס עמידים סרטן הערמונית. למרות מיומנות טכנית נדרש כדי לבצע הליך זה, מודל זה syngeneic orthotopic של אנדרוגן תלויי והן סירוס עמידים סרטן הערמונית הוא לעזר כל החוקרים בתחום.

Introduction

סרטן הערמונית מעריכים כי יש את השכיחות הגבוהה ביותר (גברים 161,360) ולגרום למותם סרטן הגברי השלישית (גברים 84,590) ב- 20171. לאחר אבחון, גידולי הערמונית הן אנדרוגן תלויי, מטופלים על ידי prostatectomy כירורגי, טיפול בקרינה, ו/או טיפול מניעת אנדרוגן (ADT), ובכל זאת כל טיפול מזוהה עם מספר מרכזי morbidities וסיבוכים2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. למרות רגרסיה הגידול לאחר ADT, כמעט כל הגידולים יישנו כמו סירוס עמידים סרטן הערמונית (CRPC). בשלב זה, אושרה טיפולים הכוללים דוסטקסול, Sipuleucel-T חיסוני, ואת enzalutamide מולקולות קטנות אנטי אנדרוגן abiraterone, עדיין אין טיפול פרטני מקנה יתרון הישרדות של יותר מ- 5.2 חודשים11, 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17. לכן, גברים בכל שלבי סרטן הערמונית צריכים הן אפשרויות טיפול משופר וניהול של morbidities, עבור המחלה קליניים אופטימלית דוגמנות הוא קריטי.

עם ההליך הנכון, שורות תאים סרטן הערמונית יכול להיות בניתוח שהוחדרו לתוך הערמונית מאתר, המובילים להתפתחות של שני גידולים orthotopic syngeneic או xenogeneic. Orthotopic הגידול דוגמנות הוא אידיאלי עבור כל גידול ביולוגיה סמים פיתוח ומחקר, ומאפשר התפתחות גידולים עם microenvironment הגידול נציג קלינית (טיים). מחקרים קודמים הראו שיש תת עורית (ש) גידולים להערכת הגידול מסולף, שמוביל דיפרנציאלית ופחות מדויק קלינית תגובות אנטי-אנגיוגנזה טיפולים18,19. בנוסף, מחקרים רבים הבחינו היעילות עלייה או ירידה של chemotherapeutics מרובים בטיפול באותו קו תא, תלוי אם זה היה מנוהל ספורטינג או orthotopically, שהכי האחרון אשר ייצג מה שנראה בן אנוש סרטן20,21,22. עוד, רק במודל orthotopic של סרטן המעי הגס, אבל לא במודל ספורטינג, גידולים ייצרה הנכון degradative אנזימים הדרושים לגרום גרורות23. לבסוף, כמו immunotherapies להמשיך להגיח בחוד החנית של טיפול בסרטן, במיוחד כאשר יש להם עדיין לספק יתרון משמעותי עבור24,סרטן הערמונית25, מודלים קליניים syngeneic עם טיים מדויק, ניקוז הלימפה immunocompetent המארחים הם קריטיים.

ישנם גורמים רבים אחראי על ממצאים אלה לא עקבי המבוססת על גידול האתר. עם טיים שונות, תאים סרטניים נחשפים אנדותל רקמות ספציפיות שונות ואין לשנותן אנגיוגנזה, ובכך להשפיע על גידול פיתוח26,27. Orthotopic גידולים עם טיים הנכונות לאפשר משלוח סמים הרלוונטית קלינית, תנאים שתקבעו, והערכה של טיפולים אנטי-אנגיוגנזה28. בעוד מודלים מהונדס גנטית (אבני חן) להכיל של טיים מדויק, הם דורשים זמן זמני עבור רבייה, עלות גבוהה, והם לעתים קרובות בהתבסס על מניפולציות של יחיד או מספר גנים בנוקאאוט או overexpressed מעבר רמות הרלוונטית קלינית. לעומת זאת, הקווים התא סרטן הערמונית אנושית או מאתר בשימוש orthotopic גידולים, כמו גידולים אנושיים, מורכבים הרבה יותר גנטית בתוך תאים בודדים והן בהצגת הטרוגניות בין תאים29,30. גם בניגוד אבני חן, שורות תאים סרטן orthotopic שניתן הנדסה לאחור כדי להביע שיטות הדמיה או עלה או ירד רמות של מולקולות אחרות של עניין, ולא במבחנה ויוו ניסיוני תוצאות ניתן להשוות ישירות. גידולים Orthotopic יכול להיווצר גם מתאי העיקרי נגזר החולה. כאן, אנו מדווחים על המתודולוגיה לביצוע אינטרה-הערמונית זריקות של תאי סרטן הערמונית טופס גידולים אנדרוגן תלויי orthotopic, ו, לאחר סירוס, להישנות כמו orthotopic CRPC.

Protocol

כל ההליכים בבעלי חיים המתוארות ב פרוטוקול זה הם שיש לבצע בדרישות תקנות אתיות ואת אישור של האוניברסיטה המתאים אכפת לי חיה מוסדיים שימוש הוועדה (IACUC).

1. הכנת חומרים כירורגי, תאים סרטניים

  1. לפני יום הניתוח, החיטוי המספריים לנתח מיקרו, Graefe מלקחיים, מלקחיים רקמת Graefe, מחזיק מחט עם חותכי תפרים ולאחר מספר מתאים של וילונות. לחטא מזרק 50 µL ומחטים 28-מד על ידי גז אתילן אוקסיד (איור 1C).
  2. לפני יום הניתוח, התרבות תאים Myc-קאפ במנות 10 ס מ ב- RPMI בתוספת 10% סרום שור עוברית (FBS) ו- 1% פניצילין/סטרפטומיצין (P/S) בחממה2 CO 37 ° C 5%. לניטור הגידול ביולומנאסן ו/או פלורסנט, transfect תאים 293T עם הווקטורים המתאים, לאחר מכן מגלי Myc-קאפ תאים עם מיקרומטר מסונן 0.45 lentivirus31. מיין תאים כדי ליצור קו תא יציב עם 100% התמרה חושית חיוביות.
    הערה: לבצע תרביות רקמה כל בתנאים סטריליים, וודא כי כל שורות תאים הם נטולי mycoplasma. הקו התא סרטן הערמונית מאתר מנוצל במחקר זה, כובע Myc32, transduced לבטא stably גחלילית לוציפראז והן mCherry. כובע Myc התא קו iss מבודד עם c-myc-overexpressing Hi-myc העכבר, ותאים אלה מכילים מוגבר של האנדרוגן (AR), אשר אנדרוגן תלויי32 ויוצרים גידולים CRPC לאחר סירוס מאתר33. עכברים כל במחקר זה הם עכברים FVB/NJ זכר שבוע 6-8. שורות תאים סרטן הערמונית מאתר חלופי יכול לשמש עם העכברים של הרקע הגנטי המתאים, כמו גם שורות תאים אנושיים של סרטן הערמונית או ראשי נגזר לחולה סרטן הערמונית תאים עם עכברים immunodeficient. המספר האופטימלי של תאים לכל זריקה צריך להיקבע מדעית עבור שורות תאים חלופי. בנוסף, חלופה הדמיה שיטות יכול להיות מנוצל כדי להמחיש גידולים, כולל דימות תהודה מגנטית (MRI), טומוגרפיית פליטת פוזיטרונים (PET) או טומוגרפיה (CT), כמו גם ה-GFP, כחלופה mCherry.
  3. בלילה שלפני הניתוח, במקום matrigel קרום המרתף מטריקס וקרח נטולת פנול אדום על בגיל 4 ° C כדי להפשיר.
  4. ביום של הניתוח, לאסוף את התאים על ידי רחצתם בתמיסת פוספט buffered (PBS) וניתוק עם 0.25% טריפסין-EDTA. לנטרל טריפסין עם RPMI עם 10% FBS ו 1% P/S.
  5. Centrifuge התאים ב 400 g x במשך 5 דקות.
  6. לשטוף את התאים עם 10 מ"ל של RPMI ללא FBS או P/S.
  7. לספור את התאים, resuspend את התאים ב- PBS ב ריכוז של 6.67x107 תאים/מ ל (1 × 106 תאים/15 µL).
  8. הוסף אמצעי שווה של matrigel ליצירת השעיה תא PBS/matrigel 1:1 ב ריכוז סופי של 1 × 106 תאים/30 µL, לשמור את התאים על הקרח עד זריקה למניעת התמצקות.
    הערה: לבצע זריקות של הערמונית-"אינטרה" בתוך 3 שעות של הכנת matrigel תא המתלים. אם מבצע זריקות של הערמונית-"אינטרה" על עכברים יותר מ-5, חזור על השלבים שלעיל כדי להכין השעיה תא matrigel טריים.

2. שטרם-נותחו העכבר הכנה

הערה: עכברים בבית אוניברסיטת בעלי חיים במתקן למשך לפחות שבוע לפני הניתוח כדי לאפשר הסתגלות נאותה וכדי לצמצם מתח בעלי חיים. צעדים 2.1-2.6 מבוצעים על ידי המנתח המסייע. כל ניתוח והשלבים מבוצעים על ידי המנתח באמצעות כפפות סטריליות וכלי ניתוח סטרילי טכניקה.

  1. עזים ומתנגד העכברים עם איזופלוריין (2-5% עבור אינדוקציה ויה קאמרית, 1-3% עבור תחזוקה דרך האף חרוט). ודא אינדוקציה מלא על ידי האובדן של הבוהן קמצוץ רפלקס.
  2. שוקל העכברים ולפקח לפחות 0.05 מ"ג/ק"ג של הבופרנורפין מאלחש ספורטינג
    הערה: העכבר משקל ≥ 20 g הינו אידיאלי עבור מוצלחת זריקות של הערמונית-"אינטרה".
  3. משחה אופטלמולוגיות שימון חלות על שתי העיניים כדי למנוע ייבוש הקרנית.
  4. לגלח כל פרווה מהבטן.
  5. לעקר את הבטן על ידי שלושה סבבי יישום מעגלית של שיחים כירורגי באמצעות רפידות סטרילי ללא הקפדה, ואחריו מגבונים אלכוהוליים סטרילי. לאפשר את הבטן לייבש.
    הערה: עבור שאר הליך כירורגי, רק כפפות סטריליות, מכשירי ניתוח באפשרותך לפנות בבטן העכבר מעוקר.
  6. העבר את העכבר פרקדן על משטח נקי על כרית החימום ישירות תחת המטרה של מיקרוסקופ כירורגי נקי.
  7. מכסים את העכבר עם תלוי סטרילי עם חור קטן מעל הבטן.

3. אינטרה-הערמונית הזרקה

הערה: בצע את כל השלבים כירורגי בתנאים סטריליים. התאמת המיקרוסקופ, מיקום העכבר או כל אובייקטים אחרים שאינו סטרילי חייב להיעשות על ידי המנתח המסייע.

  1. ביצוע כ 1 ס מ החתך של העור החיצוני לאורך הקו האמצעי של הבטן על הפין, בלוטות preputial (איור 1D).
  2. להפריד את רקמת החיבור בין בעור בטן החיצוני את מערכת השרירים הפנימיים של הבטן על-ידי פתיחת את המספריים בין השכבות.
  3. לבצע חתך דומה של מערכת השרירים הפנימיים של הבטן תוך שימוש מלקחיים להרים את מערכת השרירים כדי להימנע ניקב את המעיים או שלפוחית השתן (איור 1D).
  4. אתר אחד של שלפוחית הזרע הדו-צדדיים (איור 1A, לבן) / אונות הערמונית הקדמי (איור 1A, שחור), לעתים קרובות האחורי, לרוחב, מעט סופריור שלפוחית השתן (איור 1A, צהוב), אבל זה עשוי להשתנות בין עכברים . האונות הקדמיות הערמונית הם שקופים המחוברים למבנה המעוגל פחותה של שלפוחית הזרע לבן.
  5. הרימו בעדינות את קצה שלפוחית הזרע עם המלקחיים Graefe רקמות כדי ליצור מתח על הרקמה ללא ניקב את שלפוחית הזרע (איור 1E).
  6. לערבב את הפתרון matrigel Myc-קאפ על ידי אומות העולם pipetting (שבוצעה על-ידי המסייע המנתח), כמו תאים עשויים להיות מגורען, ואת לאט תשאף 30 µL (1 x 106 תאים) לתוך המחט כדי למנוע בועות אוויר.
  7. להוסיף בזהירות שיפוע של המחט במקביל לציר הארוך של האונה הערמונית הקדמי. לאט לאט להחדיר 30 µL לתוך האונה ומשכו לאט את המחט כדי למנוע דליפה (איור 1F). לאמת הזרקת נאותה על ידי engorgement של האונה הערמונית הקדמי (איור 1 ג'י).
  8. בזהירות להחזיק את שלפוחית הזרע מוזרק האונה הערמונית מחוץ העכבר עבור 30 s כדי לאפשר matrigel לגבש חלקית בתוך האונה. במהלך תקופה זו, לאסוף את כל דליפה פתרון תא בבטן באמצעות של פוליאסטר סטרילי משופעת המוליך למניעת התפתחות גידולים שאינם orthotopic, ללא לחיצה על האונה הערמונית מוזרק.
  9. בזהירות להחזיר את שלפוחית הזרע ואת האונה הערמונית מוזרק לתוך. חלל הבטן מבלי לוחצת על האונה. החלף את כל הרקמות המוחצנת.
  10. ביצוע תפרים רציפים כדי לסגור את מערכת השרירים בבטן הפנימי בתפרים מחט תפר נספג שנספג גזירה לאחור 5-0.
  11. ביצוע תפרים קטעה לסגור בעור בטן החיצוני עם 4-0 ניילון monofilament גזירה לאחור נספגים המחט התפרים.
    הערה: סיכות סטיריליים 9 מ מ יכול לשמש גם כדי לסגור את העור בבטן החיצוני. עם זאת, בניגוד התפרים, הם להפריע גידול זוהרים, פלורסנט עוקבות הדמיה אות.
  12. לנקות את כל הכלים עם מגבונים סטריליים אתנול (נפתח על-ידי המסייע המנתח) ומניחים מעקר חרוז זכוכית עבור אפשר ס' 30 הכלים לייבוש לפני השימוש על העכבר הבאה.
  13. לרוקן את המזרק ואת המחט בתוך תמיסת מלח סטרילית (נפתח על-ידי המסייע המנתח) כדי למנוע סתימת מאת שריד matrigel.
    הערה: עוזרת המנתח צריך להיות נוכח עבור כל פעולות, ביצוע כל שאינו סטרילי העכבר שטרם-נותחו הכנה וגם העכבר לאחר הניתוח טיפול, כמו גם לערבב את הפתרון matrigel Myc-קאפ לפני זריקות. כדי לצמצם את זמן, כמו כל הליך אינטרה-הערמונית עכבר ידרוש 20-30 דקות, המסייע המנתח יכול להתחיל בהכנת העכבר הבאה כפי המנתח הוא תפירת העכבר הנוכחי.

4. לאחר הניתוח העכבר טיפול

  1. לנהל 1 מ"ג/ק"ג של meloxicam מאלחש ספורטינג באופן מיידי, 24 שעות ביממה ו- 48 שעות לאחר הניתוח.
  2. לאפשר עכברים לשחזר בכלוב ללא מצע באמצע הדרך מונחת כרית החימום. לפקח על עכברים במשך לפחות 30 דקות לאחר הניתוח עד שהם ישובו נורמלי ניידות ופעילות, אחרי אשר מקם אותם בתוך כלוב נקי עם אוכל על הרצפה של הכלוב.
  3. עוד לפקח על עכברים מדי יום עבור ריפוי הפצע תקין משקל גוף, טיפוח, ambulation לאחר הניתוח. עכברים נפרד לתוך כלובים נפרדים על ראיות של לחימה.
  4. הסר כל התפרים שנותרו בתוך 14 ימים לאחר הניתוח.

5. ביולומנאסן הגידול הדמיה

  1. להכין סטרילי-מסוננים Na+ או K+ D-luciferin, כפי שתואר על ידי היצרן ומוגן בפני אור.
  2. מזריקים עכברים intra-peritoneally 10 µL גרם של משקל הגוף של luciferin.
  3. לפחות 10 דקות מאוחר יותר, התמונה עכברים עם IVIS ספקטרום הדמיה מערכת, תיאר כאמור34,35.
  4. ניתוח תמונות בעזרת תוכנה תמונה חיה, כפי שתואר לעיל34,35.
    הערה: IVIS הדמיה ניתוח שימושי לקביעת זריקות אינטרה-הערמונית מוצלחת והתפתחות הגידול הראשוני לנרמל את נטל הגידול בקרב קבוצות הניסוי. עם זאת, תלוי בעוצמת האות זוהרים או פלורסנט, רוויה עלולה לגרום מישור כימות התמונה למרות גידול בגודל הגידול בפועל. לכן, בשלבים המאוחרים יותר של הגידול, הדמיה IVIS עשויים להיות שימושיים לקבוע ירידה בגודל הגידול על טיפול מוצלח ולא העלאות גודל לאחר התמונה רוויה.

6. הגידול איסוף, ניתוח גידול, הישרדות קצה

  1. אם אוסף הגידול בניתוח, המתת חסד עכברים CO2 והחשיפה משני נקע בצוואר הרחם, או על ידי שיטות אלטרנטיביות IACUC אושרה, ומכבד לנתח גידולים מהבטן. גידולים צריך להיות ממוקם orthotopically ערמונית.
    הערה: גידולים לדופן הבטן הקדמי או נזרע לאורך כל הבטן מצביעים על הזרקת אינטרה-הערמונית עניים או דולפים, אין להתייחס גידולים orthotopic.
  2. שוקלים הגידולים.
  3. חישוב נפח הגידול כמו π/6 × L × W × H (L = אורך הציר הארוך של הגידול, W = רוחב בניצב, H = גובה אנכי).
  4. גידולים יכולים להיות מנותח על ידי היסטולוגיה (תיקון בפורמלין במאגר נייטרלי 10%), flow cytometry (ליצור תא בודד השעיות), חלבונים (הכנת הרקמה lysate במאגר ריפה), או RNA (מיד רקמות במקום ב- RNAlater).
  5. לניתוח חיסוניות, גם לאסוף את הערמונית מרוקנות-גידול פארא-ותיני בלוטות הלימפה (איור 1B, תפוזים) והן בטחול.
    הערה: אם בעקבות עכברים להישרדות, נקודת הקצה של מודל זה מוגדר כהופעת מיימת בבטן hemorrhagic36 ו/או ירידה ambulation, טיפוח, ו/או piloerection37. עכברים לצורך ניתוח הישרדות מקבלים שיכוך כאבים לפני ואחרי הניתוח (פרוטוקול שלבים 2.2, 4.1), חייב להיות במעקב קבוע. עכברים להפרידם לתוך כלובים נפרדים אם שאלחם מתהווה, והיא צריכה להרדימם בצורה אנושית על המראה של כל הקריאות הקצה לעיל.

7. ניתוח סירוס לדגם CRPC

  1. המודל CRPC, ביצוע האמור לעיל בפרוטוקול הזרקה של הערמונית-"אינטרה" (פרוטוקול שלבים 1-5).
  2. לפחות שבוע מאוחר יותר, לאחר התפתחות גידולים, לבצע סירוס כירורגי באמצעות החריצה, כפי שתואר לעיל38.
  3. רגרסיה הגידול צג, הישנות על ידי הדמיה זוהרים. לאחר סירוס, רגרסיה הגידול יתרחש בתוך 3 ימים, הישנות הגידול יתרחש בתוך 30 יום לערך, המייצג את CRPC.

Representative Results

כתב יד זה, בניתוח הזרקנו הקו תא מאתר סרטן הערמונית, Myc-קאפ, לתוך האונה הערמונית הקדמי (איור 1 א'), מובילה להתפתחות של גידולים בערמונית orthotopic עם טיים הרלוונטית קלינית ונכון בלוטת הערמונית-ניקוז הלימפה (איור 1B). זה היה מתבצע באמצעות מספריים לנתח מיקרו, Graefe מלקחיים, Graefe רקמות מלקחיים, בעל מחט עם חותכי תפרים מזרק 50 µL עם מחט 28-מד (איור 1C). לאחר ביצוע הבטן-החתך כ 1 של ס מ קו האמצע, מעל בלוטות preputial (איור 1D), אחד שלפוחית הזרע, המצורפת האונה הערמונית הקדמי אותרו, מוחצן (איור 1E) ו 30 µL (1 x 106 תאים) של 1:1 PBS/matrigel תא הבולם היה מוזרק לתוך בלוטת הערמונית (איור 1F), אומתו גם בתחילה את engorgement של האונה וחוסר דליפה (איור 1 ג'י).

כדי לנטר את צמיחת הגידול orthotopic, אנחנו stably transfected Myc-קאפ התאים לבטא גחלילית לוציפראז והן mCherry, המאפשר גידולים ולאחריו לא פולשנית ויוו ביולומינסנציה (איור 2 א), קרינה פלואורסצנטית (איור 2B), בהתאמה. מגבלה אחת של הדמיה זו היא כי, בהתאם הכוח של האות, הדמיה כימות עשוי עיתוני בעוד הגידול ממשיכה להגדיל את גודל. לכן, עם עוצמות האות גבוה, זה הדמיה ויוו הוא יותר שימושי עבור תחילה נרמול גידול הנטל על פני קבוצות ניסוי לקביעת מאוחר יותר ירידה בגודל הגידול לאחר טיפולים ניסיוניים. שיטות הדמיה נוספים יכול גם להיות מנוצל, כגון חיים קטן MRI, PET או סי-טי

גידולים Orthotopic היו גזור מן הבטן ביום 30 לאחר ההזרקה אינטרה-הערמונית (איור 3 א). גידולים Orthotopic צריך להיות ממוקם באתר של האונה הערמונית הקדמי. גידול להמונים לאורך כל הבטן או לדופן הבטן הקדמי לציין הזרקת אינטרה-הערמונית לא תקין ודליפה. עם הטכניקה הנכונה, הגידול (איור 3B) משקל ונפח (איור 3C) ניתן לרשום שגיאת התקן קטן יחסית. עם זאת, כפי שנצפו, יהיו כמה השתנות עם ההמונים גידול קטנים וגדולים. לכן, השימוש הראשוני של טרום טיפול כימות דימות על מנת להשוות גידול הנטל בין הזרועות ניסיוני הוא קריטי עבור כל הניסויים. עוד יותר, כמו אלו תאים סרטניים מאתר היו מוזרק עכברים FVB/NJ immunocompetent, טיים ניתן לנתח באמצעות אימונוהיסטוכימיה (IHC) (או cytometry זרימה או בטכניקות אחרות) תאי CD3 T (דמות תלת-ממד) (או סוגי תאים חיסוניים אחרים). לבסוף, מודל זה מספק נקודת קצה הישרדות אובייקטיבי, כמו הגידול העיקרי גדול גורם המוני מיימת בבטן hemorrhagic36 (איור 3E) ו/או ירידה ambulation, טיפוח, ו/או piloerection37. לעיתים, מוות עלולה להיגרם גם על ידי הגידול חוסם תפוקת השתן.

לבסוף, מודל זה יכול להיות מנוצל כדי ללמוד CRPC, האחרון אשר מקנה פרוגנוזה גרועה והיא זקוקה לסיוע אפשרויות טיפול הרומן והן אנדרוגן תלויי סרטן הערמונית. לאחר התפתחות גידולים orthotopic, עכברים היו בניתוח עיקור, כפי שתואר לעיל38. כמו, זה הניתוח השני הישרדות הגדולות יש להעניק טיפול נוסף כדי לפקח על שחזור וכל תופעות לוואי או סיבוכים. בתוך 3 ימים לאחר סירוס, רגרסיה הגידול חזקה נצפתה, ואחריו הישנות הגידול עוקבות אחרי 30 יום לערך, המייצג CRPC (איור 4A). גידולים CRPC יכול להיות ניתוח, ניתח בהיסטולוגיה, אינם מציגים הבדל נוירואנדוקריניים, כפי שהם לשמור על רמות גבוהות של AR שליליים עבור דה מרקר נוירואנדוקריניים, synaptophysin (איור 4B).

Figure 1
איור 1: אונה קדמית הערמונית ניקוז הלימפה, טכניקה נציג לזריקות אינטרה-הערמונית תא. תמונות של האונה הערמונית נכון הקדמי (א) (שחור, *), מצורף שלפוחית הזרע נכון (לבן), נכון האשך (ירוק) fat pad, ואת שלפוחית השתן (צהוב), (B) הדו-צדדי מרוקנות-הערמונית פארא-ותיני הלימפה (כתום), (ג) מספריים לנתח מיקרו Graefe מלקחיים, Graefe רקמות מלקחיים, מחזיק מחט עם חותכי תפרים, 50 µL מזרק עם מחט בקוטר 28 (משמאל לימין), (ד) קו האמצע חתכים, שלפוחית הזרע (E) , באונה הקדמי הערמונית הוצאתו, (F), הזרקת אינטרה-הערמונית ו engorgement (G) של האונה הערמונית הקדמי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: In vivo הגידול זוהרים, פלורסנט הדמיה- (א) לוציפראז - ו (ב) mCherry-לבטא orthotopic Myc-כיפה-גידולים היו עם תמונה באמצעות מערכת הדמיה IVIS הספקטרום. ביולומינסנציה הייתה לכמת על ידי סך השטף (פוטונים/s). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: Orthotopic ניתוחים הגידול על ידי גידול נפח, משקל, היסטולוגיה הסתננות המערכת החיסונית, הישרדות. גידולים Orthotopic היו גזור ביום 30 לאחר ההזרקה אינטרה-הערמונית וניתח לפי ברוטו (א) ממוחשב הדמיה, (B) גידול נפח (π/6 × L × W × H; L = אורך הציר הארוך של הגידול, W = רוחב בניצב, H = גובה אנכי), משקל הגידול (ג) , (ד) CD3 IHC (סולם בר = 100 מיקרומטר), הישרדות (E) , עם נקודת הקצה אובייקטיבית כמו הופעת דימום בבטן מיימת. (A-B) נתונים המיוצגים כמו זאת אומרת ± שגיאת התקן של הממוצע. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: זריקות אינטרה-הערמונית עם סירוס כירורגי עוקבות לדגם אנדרוגן תלויי סרטן הערמונית והן CRPC. (א) עכברים הנושאת גידולים המבטאים לוציפראז orthotopic היו עם תמונה מאת ביולומינסנציה מראש, שלאחר סירוס (Cx), ו- (B) חזר CRPC גידולים היו גזור (שחור = orthotopic גידול הערמונית; צהוב = שלפוחית השתן) וניתח מאת H & E, AR IHC, ו- synaptophysin IHC (עם בקרת מאתר חיובי) (סולם בר = 50 מיקרומטר). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

כתב יד זה אנחנו חלוקה לרמות את פרוטוקול כדי לבצע ניתוח סרטן הערמונית-"אינטרה" תא זריקות. אנחנו מנוצל את אנדרוגן תלויי ואת MYC -overexpressing (ביטויMYC נתפסת על 80-90% של סרטן הערמונית האנושי39) מאתר סרטן הערמונית תאים בטור, Myc-קאפ, במקור מבודד מן העכבר Hi-Myc32 ,33. שורת התאים. זה היה transduced stably לבטא לוציפראז והן mCherry, עבור לא פולשנית ויוו הדמיה הגידול זוהרים, פלורסנט, בהתאמה. עוד, ניתוחי סירוס בוצעה גם לאחר פיתוח אנדרוגן תלויי סרטן, המוביל רגרסיה הגידול הישנות עוקבות. לכן, אנו מספקים פרטים לדגם orthotopic אנדרוגן תלויי סרטן הערמונית וגם CRPC ב מארח immunocompetent.

כובע myc התאים היו מוזרק לתוך האונה הערמונית הקדמי של עכברים. הערמונית עכבר מורכב האונות הקדמיות, הגחון ו דורסולטרלי ערמונית, בלוטת הערמונית האנושי מורכב אזור הפריפריה, אזור המעבר וכן אזור המרכז בתוך האונה יחיד40. בעוד מחקרים קודמים יש לי מבחינה אנטומית, בהיסטולוגיה לעומת האונה דורסולטרלי העכבר כדי ההיקפית האנושי אזור, האתר של הרוב המכריע של סרטן הערמונית41, ואת האונה הקדמי העכבר על אזור המרכז האנושי42, 43, ניתוח האחרונות ומקיף יותר הוכיח כי באונה הקדמי של האונה דורסולטרלי להציג דפוסי ביטוי גנים הקשורים קשר הדוק, לעומת האונה הגחון. 44 נוסף, התפתחות סרטן הערמונית נצפתה באונה הקדמי של אבני חן40, ומאפשר, שהפרוצדורה אינטרה-הערמונית, האונה הקדמי עבור ההזרקה של הנפח של סרטן תאים פתרון בשכנוע מינימלי ולשינויים.

באמצעות ספורטינג ופנינה הטרנסגניים סרטן הדגמים יש מספר חסרונות ומגבלות. ספורטינג גידולים גדלו ב טיים מלאכותי יש תגובות דיפרנציאלית chemotherapies, בניגוד בשני גידולים orthotopic שורות תאים זהה, מחלות אנושיות20,21,22. זה יכול להיות בגלל להערכת מסולף של גידולים ספורטינג, למשל, את תגובתם דיפרנציאלית אנטי-אנגיוגנזה טיפול18,19. להיפך, orthotopic גידולים לפתח עם טיים המתאים של ניקוז הלימפה, להערכת, ניתן לבצע באמצעות שורות תאים מאתר, ובכך גם לאפשר לניתוח של הגידול אימונולוגיה, בתגובה immunotherapies.

אבני חן הטרנסגניים לפתח גידולים עם טיים המתאים במארח immunocompetent, עדיין מודלים אלה בדרך כלל לפשט סרטן אנושי על ידי פיתוח גידולים עם שינויים גנטיים בודד או מספר29. ניתוח של Myc-קאפ וקווים אחרים של התא סרטן הערמונית חשף כי הן הכילו הרבה שינויים מספר גדול של עותק סומאטית והשינויים כרומוזומלית מאשר גידולים של העכברים Hi-Myc ואבני אחרים שמהם שהיו הנגזרות29. יתר על כן, אבני חן מוגבלים על ידי עלות מוגברת ואת הזמן הדרוש עבור עכברים רבייה לבצע ניסויים של מתח מספיק. Orthotopic הגידול דוגמנות ניתן להתגבר על מגבלות אלה. שורות תאים אנושיים וסרטן הערמונית מאתר להכיל שינויים גנטיים רבים הנוגעים מחלות אנושיות29, וגם, כמו סרטן אנושי, להציג הטרוגניות נהדר בין תאים בודדים30. גידולים syngeneic מאתר Orthotopic מאפשרים ניתוח חיסוניות, בזמן orthotopic גידולים xenogeneic האנושי מאפשרים ניתוח של הרפוי על תאי האדם. בסופו של דבר, בניגוד עם אבני חן, התא יכול להיות שונה קווים לפני זריקה, המאפשר ביטוי של ביולומנאסן או פלורסנט הדמיה מולקולות לעקוב אחר הגידול, לנרמל את נטל הגידול בקרב קבוצות הניסוי, לפקח על התגובה לטיפול, וכדי בצע רגרסיה הגידול CRPC הישנות לאחר סירוס כירורגי.

השלבים הקריטיים של פרוטוקול זה כוללים איתור להחצין את שלפוחית הזרע ואת המצורפת האונה הערמונית הקדמי ללא גרימת נזק לרקמות אחרות או ניקב את שלפוחית הזרע, ביצוע זריקת אינטרה-הערמונית מוצלח של µL 30 של תא ההשעיה ללא דליפה, ואיסוף כראוי דליפה כלשהי למניעת התפתחות גידולים שאינם-orthotopic לאורך כל הבטן. המגבלה העיקרית של זריקות אינטרה-הערמונית היא השגת את מיומנות טכנית הדרושה כדי למזער את הגידול השתנות בין עכברים. זה חשוב במיוחד עבור מידול CRPC, שבו יש במשתנה נוסף של סירוס כירורגי. עכברים אינטרה-prostatically מוזרק ולא מסורס חייב גם להיות במעקב מקרוב עבור שחזור של אירועים קשים, כפי שעברו שני ניתוחים הישרדות הגדולות. מגבלה נוספת היא הזמן של כל זריקה של הערמונית-"אינטרה". זה יכול להיות מופחת כדי נמוך כמו 20 דקות, וכן המנתח עוזר ניתן להכין את העכבר הבאה כמו העכבר הנוכחי מאוחה. לבסוף, orthotopic Myc-כיפה-גידולים אגרסיביים, במהירות גוברת גידולים להגיע אל נקודת הקצה של הישרדות כ 46 ימים (ולא מוקדם ככל 35 ימים) עקב הגידול העיקרי. מחקרים הדורשים פיתוח הגידול איטי או טיפולים לטווח ארוך צריכה להיות ממוטב מדעית הזרקת הראשונית תא ספירת וטיפול משטר. בניגוד המגבלות של ספורטינג גידולים, אבני חן, כל המגבלות הנ של הדגם גידול orthotopic ניתן להתגבר, שינויים נוספים של הפרוטוקול שניתן יהיה מבוסס על הצרכים האישיים ניסיוני.

כמו orthotopic הגידול דגם כרוכה בשימוש במבחנה-מטופל תאים, התאים האלה יכול להיות שונה בהתאם לצרכים של המחקר. כאן, אנחנו ששינה תאים אלה לבטא stably לוציפראז ואת mCherry לניטור ויוו הגידול. ערכנו גם פצצה CRISPR-Cas9 של מדכאי PTEN, כדי ליצור קו אגרסיבי יותר, הרלוונטית קלינית תא גדל מהר כמו orthotopic גידולים (כתב היד בסקירה). עם היתרונות של הדגם גידול orthotopic, היכולת ללמוד אנדרוגן תלויי סרטן הערמונית ו- CRPC וגם את היכולת לבטא שיטות הדמיה או נוקאאוט או overexpress בחר גנים, פרוטוקול זה משמש משאב יקר-ערך עבור כל למחקר סרטן הערמונית.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענקים Thumbikat חיים גרינברג (NIDDK R01 DK094898), Sarki חיה פרנקל (NCI R01 CA167966, NCI R01 CA123484, NCI P50 CA180995) של יונתן אנקר (NCI F30 CA203472).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Myc-CaP cell line ATCC CRL-3255 Verify as mycoplasma-free before use
Micro-dissecting scissors Roboz RS-5910
Graege forceps Roboz RS-5135
Graefe tissue forceps Roboz RS-5150
Olsen-Hegar needle holder with suture cutters FST 12002-12
50 µL Syringe 705 RN SYR Hamilton 7637-01 Sterilize by ethylene oxide gas
28-gauge Needles Small Hub RN Hamilton 7803-02 Point style 4, Angle 45°, Length 0.75 in. Sterilized by ethylene oxide gas
RPMI Gibco 18875-093
FBS Gibco 10437-028
Pencillin/Streptomycin Gibco 15140-122
PBS Gibco 14190-144
0.25% trypsin-EDTA Gibco 25200-056
Matrigel basement membrane matrix, phenol red-free, LDEV-free Corning 356237 Thaw on ice in 4°C overnight before use
Isoflurane Henry Schein 11695-0500-2 Acquired from Northwestern University Center for Comparative Medicine (CCM)
26 5/8-gauge syringe BD 309597 For meloxicam and buprenorphine injections
Buprenorphine hyrochloride 0.3 mg/mL 12496-0757-5 Controlled substance, acquired from Northwestern University CCM
Ophthalmic ointment lubrication Akron 17478-162-35
Betadine surgical scrub (povidone-iodine, 7.5%) Purdue Products 67618-151-16
Sterile non-adhering pads Moore Medical 10775
Sterile alcohol wipes Fisher Scientific 22-363-750
Surgical microscope Stemi DV4 Zeiss
Sterile polyester tipped applicators Puritan 25-806 1PD
5-0 vicryl absorbable reverse cutting needle sutures eSutures J493G
4-0 nylon monfilament non-absorbable reverse cutting needle sutures eSutures 699H
Glass bead sterilizer Fine Science Tools 18000-45
Sterile saline 0.9% sodium chloride Hospira 0409-4888-02
Meloxicam (Eloxiject) 5 mg/mL Henry Schein 11695-6925-1 Acquired from Northwestern University CCM
D-luciferin Firefly, sodium salt monohydrate Goldbio LUCNA
IVIS Spectrum Imaging System PerkinElmer
Cauery surgical pen Bovie Medical Corporation AA01
CD3ε antibody (clone 2GV6) Ventana 790-4341
Caliper Fisher Scientific 14-648-17
Androgen receptor antibody Thermo Scientific RB-9030-P1 1:500 staining dilution
Synaptophysin antibody (clone Z66) Life Technologies 18-0130 1:200 staining dilution

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer Statistics, 2017. CA-Cancer J Clin. 67, (1), 7-30 (2017).
  2. Alemozaffar, M., et al. Prediction of erectile function following treatment for prostate cancer. JAMA. 306, (11), 1205-1214 (2011).
  3. Alibhai, S. M., et al. 30-day mortality and major complications after radical prostatectomy: influence of age and comorbidity. J Natl Cancer I. 97, (20), 1525-1532 (2005).
  4. Chen, R. C., Clark, J. A., Talcott, J. A. Individualizing quality-of-life outcomes reporting: how localized prostate cancer treatments affect patients with different levels of baseline urinary, bowel, and sexual function. J Clin Oncol. 27, (24), 3916-3922 (2009).
  5. Kohutek, Z. A., et al. Long-Term Impact of Androgen-Deprivation Therapy on Cardiovascular Morbidity after Radiotherapy for Clinically Localized Prostate Cancer. Urology. (2015).
  6. Murray, L., et al. Second primary cancers after radiation for prostate cancer: a systematic review of the clinical data and impact of treatment technique. Radiother Oncol. 110, (2), 213-228 (2014).
  7. Resnick, M. J., et al. Long-term functional outcomes after treatment for localized prostate cancer. N Engl J Med. 368, (5), 436-445 (2013).
  8. Shahinian, V. B., Kuo, Y. F., Freeman, J., Goodwin, J. S. Risk of fracture after androgen deprivation for prostate cancer. New Engl J Med. 352, (2), 154-164 (2005).
  9. Wilke, D. R., et al. Testosterone and erectile function recovery after radiotherapy and long-term androgen deprivation with luteinizing hormone-releasing hormone agonists. BJU Int. 97, (5), 963-968 (2006).
  10. Zhao, J., et al. Androgen deprivation therapy for prostate cancer is associated with cardiovascular morbidity and mortality: a meta-analysis of population-based observational studies. PLoS One. 9, (9), e107516 (2014).
  11. Berthold, D. R., et al. Docetaxel plus prednisone or mitoxantrone plus prednisone for advanced prostate cancer: updated survival in the TAX 327 study. J Clin Oncol. 26, (2), 242-245 (2008).
  12. Bono, J. S., et al. Prednisone plus cabazitaxel or mitoxantrone for metastatic castration-resistant prostate cancer progressing after docetaxel treatment: a randomised open-label trial. Lancet. 376, (9747), 1147-1154 (2010).
  13. Fizazi, K., et al. Abiraterone acetate for treatment of metastatic castration-resistant prostate cancer: final overall survival analysis of the COU-AA-301 randomised, double-blind, placebo-controlled phase 3 study. Lancet Oncol. 13, (10), 983-992 (2012).
  14. Kantoff, P. W., et al. Sipuleucel-T immunotherapy for castration-resistant prostate cancer. New Engl J Med. 363, (5), 411-422 (2010).
  15. Parker, C., et al. Alpha emitter radium-223 and survival in metastatic prostate cancer. New Engl J Med. 369, (3), 213-223 (2013).
  16. Rathkopf, D. E., et al. Updated Interim Efficacy Analysis and Long-term Safety of Abiraterone Acetate in Metastatic Castration-resistant Prostate Cancer Patients Without Prior Chemotherapy (COU-AA-302). Eur Urol. 66, (5), 815-825 (2014).
  17. Scher, H. I., et al. Increased survival with enzalutamide in prostate cancer after chemotherapy. New Engl J Med. 367, (13), 1187-1197 (2012).
  18. Field, S. B., et al. Differences in vascular response between primary and transplanted tumours. Brit J Cancer. 63, (5), 723-726 (1991).
  19. Cowen, S. E., Bibby, M. C., Double, J. A. Characterisation of the vasculature within a murine adenocarcinoma growing in different sites to evaluate the potential of vascular therapies. Acta Oncol. 34, (3), 357-360 (1995).
  20. Kuo, T. H., et al. Site-specific chemosensitivity of human small-cell lung carcinoma growing orthotopically compared to subcutaneously in SCID mice: the importance of orthotopic models to obtain relevant drug evaluation data. Anticancer Res. 13, (3), 627-630 (1993).
  21. Fidler, I. J., et al. Modulation of tumor cell response to chemotherapy by the organ environment. Cancer Meta Rev. 13, (2), 209-222 (1994).
  22. Wilmanns, C., et al. Modulation of Doxorubicin sensitivity and level of p-glycoprotein expression in human colon-carcinoma cells by ectopic and orthotopic environments in nude-mice. Int J Oncol. 3, (3), 413-422 (1993).
  23. Fidler, I. J. Orthotopic implantation of human colon carcinomas into nude mice provides a valuable model for the biology and therapy of metastasis. Cancer Meta Rev. 10, (3), 229-243 (1991).
  24. Kwon, E. D., et al. Ipilimumab versus placebo after radiotherapy in patients with metastatic castration-resistant prostate cancer that had progressed after docetaxel chemotherapy (CA184-043): a multicentre, randomised, double-blind, phase 3 trial. Lancet Oncol. 15, (7), 700-712 (2014).
  25. Topalian, S. L., et al. Safety, activity, and immune correlates of anti-PD-1 antibody in cancer. New Engl J Med. 366, (26), 2443-2454 (2012).
  26. Pasqualini, R., Ruoslahti, E. Organ targeting in vivo using phage display peptide libraries. Nature. 380, (6572), 364-366 (1996).
  27. Conway, E. M., Carmeliet, P. The diversity of endothelial cells: a challenge for therapeutic angiogenesis. Genome Biol. 5, (2), 207 (2004).
  28. Loi, M., et al. The use of the orthotopic model to validate antivascular therapies for cancer. Int J Dev Biol. 55, (4-5), 547-555 (2011).
  29. Bianchi-Frias, D., Hernandez, S. A., Coleman, R., Wu, H., Nelson, P. S. The landscape of somatic chromosomal copy number aberrations in GEM models of prostate carcinoma. Mol Cancer Res. 13, (2), 339-347 (2015).
  30. Pan, Y., et al. Characterization of chromosomal abnormalities in prostate cancer cell lines by spectral karyotyping. Cytogenet Cell Genet. 87, (3-4), 225-232 (1999).
  31. Wang, J., et al. Pim1 kinase synergizes with c-MYC to induce advanced prostate carcinoma. Oncogene. 29, (17), 2477-2487 (2010).
  32. Watson, P. A., et al. Context-dependent hormone-refractory progression revealed through characterization of a novel murine prostate cancer cell line. Cancer Res. 65, (24), 11565-11571 (2005).
  33. Ellis, L., Lehet, K., Ramakrishnan, S., Adelaiye, R., Pili, R. Development of a castrate resistant transplant tumor model of prostate cancer. Prostate. 72, (6), 587-591 (2012).
  34. Nunez-Cruz, S., Connolly, D. C., Scholler, N. An orthotopic model of serous ovarian cancer in immunocompetent mice for in vivo tumor imaging and monitoring of tumor immune responses. J Vis Exp. (45), (2010).
  35. Lim, E., Modi, K. D., Kim, J. In vivo bioluminescent imaging of mammary tumors using IVIS spectrum. J Vis Exp. (26), (2009).
  36. Ellis, L., Lehet, K., Ku, S., Azabdaftari, G., Pili, R. Generation of a syngeneic orthotopic transplant model of prostate cancer metastasis. Oncoscience. 1, (10), 609-613 (2014).
  37. Wallace, J. Humane endpoints and cancer research. ILAR J. 41, (2), 87-93 (2000).
  38. Valkenburg, K. C., Amend, S. R., Pienta, K. J. Murine Prostate Micro-dissection and Surgical Castration. J Vis Exp. (111), (2016).
  39. Koh, C. M., et al. MYC and Prostate Cancer. Genes Cancer. 1, (6), 617-628 (2010).
  40. Shappell, S. B., et al. Prostate pathology of genetically engineered mice: definitions and classification. The consensus report from the Bar Harbor meeting of the Mouse Models of Human Cancer Consortium Prostate Pathology Committee. Cancer Res. 64, (6), 2270-2305 (2004).
  41. McNeal, J. E., Redwine, E. A., Freiha, F. S., Stamey, T. A. Zonal distribution of prostatic adenocarcinoma. Correlation with histologic pattern and direction of spread. Am J Surg Pathol. 12, (12), 897-906 (1988).
  42. Price, D. Comparative Aspects of Development and Structure in the Prostate. Natl Cancer I Monogr. 12, 1-27 (1963).
  43. Roy-Burman, P., Wu, H., Powell, W. C., Hagenkord, J., Cohen, M. B. Genetically defined mouse models that mimic natural aspects of human prostate cancer development. Endocr-Relat Cancer. 11, (2), 225-254 (2004).
  44. Berquin, I. M., Min, Y., Wu, R., Wu, H., Chen, Y. Q. Expression signature of the mouse prostate. J Biol Chem. 280, (43), 36442-36451 (2005).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics