Utvärdering av effekten av Protein Aggregation på cellulära oxidativ Stress i jäst

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Protein aggregering framkallar cellulära oxidativ stress. Det här protokollet beskriver en metod för övervakning av intracellulära påstår av amyloidogenic proteiner och oxidativ stress i samband med dem, med hjälp av flödescytometri. Metoden används för att studera beteendet hos lösliga och aggregation-benägen varianter av amyloid-beta peptiden.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Carija, A., Ventura, S., Navarro, S. Evaluation of the Impact of Protein Aggregation on Cellular Oxidative Stress in Yeast. J. Vis. Exp. (136), e57470, doi:10.3791/57470 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protein Skellefteåsjukan och aggregering till amyloid konformationer har relaterats till uppkomsten och utvecklingen av flera neurodegenerativa sjukdomar. Det finns dock fortfarande lite information om hur olösligt protein aggregat utöva deras toxiska effekter in vivo. Enkel modell av prokaryota och eukaryota organismer, som bakterier och jäst, har bidragit till vår nuvarande förståelse av mekanismerna bakom den intracellulära amyloid bildas, aggregat förökning och toxicitet. I detta protokoll beskrivs användning av jäst som en modell att dissekera förhållandet mellan bildandet av protein aggregat och deras inverkan på cellulära oxidativ stress. Metoden kombinerar detektion av intracellulära lösliga/aggregerade staten av ett amyloidogenic protein med kvantifiering av de cellulära oxidativ skada till följd av sitt uttryck med hjälp av flödescytometri (FC). Denna metod är enkel, snabb och kvantitativa. Studien visar tekniken genom att sammanföra de cellulära oxidativ stress orsakad av en stor uppsättning av amyloid-beta peptid varianter med deras respektive inneboende aggregering böjelser.

Introduction

Proteostasis är en grundläggande faktor för fitness och åldrande processer i cellen. I celler upprätthålls protein homeostas av sofistikerade protein kvalitetskontroll nätverk syftar till att säkerställa den rätta vika av felveckning protein konformationer av chaperones eller deras riktade proteolys med flera väl bevarade mekanismer1 ,2,3,4,5. Ett stort antal studier stödja kopplingen mellan uppkomsten och utvecklingen av en rad mänskliga sjukdomar och misslyckandet av proteostasis, vilket leder till protein Skellefteåsjukan och aggregering. Till exempel anses förekomsten av protein insättningar ett patologiskt kännetecken för många neurodegenerativa sjukdomar, som Alzheimers, Parkinsons och Huntingtons sjukdomar6,7,8, prionogenic sjukdomar, och icke-degenerativa amyloidoses9. Det har föreslagits att tidiga Oligomera och protofibrillar församlingar i aggregering reaktion är de viktigaste elicitors av cytotoxicitet, om avvikande interaktioner med andra proteiner i de trånga cellulära miljö10. Dessutom kan protein inneslutningar (PI) överföras mellan celler, förökningsmaterial deras toxisk effekt11,12. Det kan därför vara att bildandet av PI verkligen kan utgöra en avgiftande mekanism som begränsar förekomsten av farliga aggregerade arter till specifika platser i cellen, där de kan bearbetas eller ackumulerade utan större biverkningar 13 , 14.

Standard i vitro biokemiska metoder har gett viktiga insikter i olika arter som befolkar aggregering reaktioner och deras boenden15,16. De villkor som används i dessa analyser är dock tydligt skiljer sig från de som förekommer inom cellen och, därför, ifrågasätta deras fysiologiska betydelse. På grund av anmärkningsvärda bevarande av cellulära vägar som protein kvalitetskontroll, autofagi eller regleringen av den cellulära redox stat17,18 bland Eukaryoter19,20,21 ,22,23, spirande jästen Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) har vuxit fram som en privilegierad enkel cellulära modell att studera de molekylära bestämningsfaktorerna av protein aggregation och dess associerade cytotoxiska effekter i biologiskt relevanta miljöer24,25,26.

Protein aggregering benägenhet är en funktion som till sin natur kodade i sekvensen primära. Således, bildningen av amyloid-liknande strukturer kan förutsägas baserat på identifiering och utvärdering av styrkan av aggregation-främja regioner i polypeptider27. Men trots framgången av bioinformatiska algoritmer för att förutsäga in vitro- aggregering egenskaper proteinsekvenser, är de fortfarande långt ifrån prognoser hur dessa böjelser översätta till i vivo cytotoxisk effekt. Studier som behandlar sambandet mellan aggregerade staten av ett visst protein och dess associerade cellulära skador på ett systematiskt sätt kan bidra till att kringgå denna computational begränsning. Detta sammanhang behandlas i föreliggande studie, att dra nytta av ett stort antal varianter av amyloid-beta peptiden Aβ42 skiljer sig endast i en enda rester, men visar en kontinuerlig rad aggregering böjelser i vivo28. Särskilt beskrivs en strategi baserad på FC att identifiera konfirmerande arten redovisning för oxidativ skada som framkallas av aggregation-benägen proteiner i jästceller. Metoden ger många fördelar såsom enkelhet, hög-genomströmningskapacitet och exakt kvantitativ mätning. Denna strategi gjorde det möjligt att bekräfta att PI spela en skyddande roll mot oxidativ stress.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. S. cerevisiae kulturer och proteinuttryck

Obs: Aβ varianter uppvisar olika relativa aggregering böjelser på grund av en mutation i en enda restprodukt vid position 19 (Phe19) av Aβ42 peptiden (figur 1A). Dessa peptid varianter är märkta med grönt fluorescerande protein (GFP), som fungerar som en aggregering reporter (figur 1)29.

  1. Omvandla plasmider kodning för 20 Aβ42-GFP varianter i jästceller med en BY4741 föräldrarnas bakgrund (MATa hans3Δ1 leu2Δ0 mötte15Δ0 ura3Δ0)30. Varje plasmid kodar för en Aβ42 mutant smält till GFP av en GSSGSSG länkare. Plasmidsna är pESC(-URA) och har valbara markören URA329.
    1. Förbereda det syntetiska komplett mediet utan uracil (SC-URA) med följande komponenter: 1,9 g/L jäst kväve bas utan uracil, 5 g/L ammoniumsulfat och 900 mL ddH2O kombinerat med 100 mL 20% (w/v) glukos.
    2. Sätta en koloni av de transformerade jästcellerna i 20 mL SC-URA medium innehållande 2% glukos och växa kulturer över natten vid 30 ° C under agitation vid 210 rpm.
  2. Nästa dag, växer nya jäst celler kulturer genom ympning 100 µL av övernattning kultur in 5 mL färsk SC-URA medium.
  3. På en OD590 0,5, Centrifugera kulturer vid 3 000 x g i 4 min, avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna i samma volym av färska SC-URA medium innehållande 2% raffinos.
  4. Inkubera vid 30 ° C under omrörning vid 210 rpm i 30 min. Sedan Centrifugera cellerna vid 3 000 x g i 4 min och kasta bort supernatanten. Att resuspendera cellerna i färska SC-URA medium innehållande 2% galaktos inducera ett rekombinant proteinuttryck.
  5. Efter 16 h inducera proteinuttryck i SC-URA medium innehållande 2% galaktos, skörda 1 mL av inducerad cellerna i sterila mikrocentrifugrör genom centrifugering vid 3 000 x g i 4 min.
    Obs: De mest relevanta skillnaderna uppstå efter en introduktionsperiod 16 h. inducerad jäst celler uttrycker Aβ42-GFP varianter kan visualiseras genom fluorescensmikroskopi att bestämma rekombinant protein fördelningen inne i cellerna (figur 2B).

2. cellen färgning

Anmärkning: Färska icke-inducerad celler behövs som en negativ kontroll att fastställa ett fluorescerande tröskelvärde under en FC analys.

  1. Ta 16 h-inducerad jästceller och avgöra deras optiska densitet vid 590 nm (OD590). Späda ut dem i en steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) till en OD590 av 0,1.
    1. Förbereda 1 x fosfatbuffrad saltlösning enligt följande: Lägg till 8 g NaCl, 0,2 g kaliumklorid, 1,44 g av Na2HPO4, och 0.24 g KH2PO4 800 ml ddH2O. fylla lösningen upp till 1 L ddH2O efter justera pH till 7,4 med HCl. filtrera bufferten genom ett 0,2 µm filter.
  2. Överför de uttrycker cellsuspensioner lämpligt märkta rör (12 × 75 mm runda-botten polystyren) och skyddas från ljus. Kontrollera att de är redo att lastas på en flödescytometer för analys, tillsammans med icke-inducerad och icke-färgade celler.
  3. Lägga till oxidativ stress sonden (t.ex. CellROX djupröd) i varje prov med en slutlig koncentration på 5 µM och inkubera cellerna vid 30 ° C i 30 min i mörker.
  4. Efter inkubation, tvätta cellerna 3 gånger med 1 x PBS och återsuspendera dem i samma volym av buffert före deras analys av FC.

3. Flödesanalys flödescytometri

Obs: Använd en FC setup med lämpliga lasrar och filter för att upptäcka GFP och oxidativ stress sonden fluorescens signal. En flödescytometer utrustad med en 488 nm blå laser för detektion av god Jordbrukarsed och en 635 nm röd laser för detektion av oxidativ stress sonden fluorescens kan användas. Förvärv av utsläpp fluorescens av god Jordbrukarsed och oxidativ stress sond utförs med en 530/30 nm BP och en 660/20 BP filtret, respektive (tabell 1).

  1. Klicka på Öppna nya kalkylblad panelen och skapa följande förvärv dot tomterna.
    1. Välj Scatter Plot verktyg från verktygsfältet och skapa en tomt med variabler Side Scatter-området (SSC-A) på den y-axeln vs. fram Scatter-området (FSC-A) i en linjär skala på x-axeln.
    2. Klicka på Scatter Plot verktyg från verktygsfältet och skapa en handling med variabler FL1-området (FITC) på x-axeln vs. FL3-området (APC) i en logaritmisk skala på y-axeln.
  2. Klicka på ikonen Instrument inställningar . Klicka på fliken kompensation och ange alla kompensationsnivåer. Klicka på fliken förvärv och välj totalt antal 20.000 evenemang ska registreras.
  3. Klicka på ikonen Flöde för att växla flödet till låg.
  4. Klicka på fliken förvärva att börja köra de icke-inducerad, ofärgade cellerna och justera spänningen i Instrumentets inställningar av framåt och side scatter tills befolkningen fördelas i mitten-vänster kvadranten.
    1. Klicka på ikonen Polygon ställa en region R1 runt cellen befolkningen exklusive cellfragment och Använd denna gated population P1 = R1 för alla fluorescerande dot tomter och histogram representationer (figur 3).
  5. För att justera PMT spänningen av fluorescens signalen, kör de ofärgade cellerna i FL1-FL3 dot tomten, tuning vinsten i fliken Instrument inställning tills cellerna distribueras i den nedre vänstra kvadranten.
  6. Ändra urvalet till inducerad cellerna att mäta GFP fluorescens. I fliken Instrument inställning ange förstärkning i de FSC-A vs. FL1 (FITC) när befolkningen fördelas i den nedre högra kvadranten. Definiera positiva cell befolkningen med en grind (Gate P2).
  7. Förändring provet till den icke-inducerad färgade celler Visa oxidativ stress genom att fluorescensen på en dot FSC-A vs. FL3 (APC) tomt. Tune känsligheten tills cell befolkningen fördelas i vänster övre kvadranten. Gate positiv cell befolkningen i P3.
  8. Gör två histogram tomter med på histogramikonen att representera cellen fluorescensen. För att representera fluorescensintensiteten, kontrollera FL1 (FITC) som representerar god Jordbrukarsed fluorescensen är i x-axeln och FL3 (APC) som representerar fluorescensen är i y-axeln, tillämpa P2 och P3 populationer på en logaritmisk skala, respektive.
    Obs: Histogram överlagringar är ett bra sätt att illustrera skillnader mellan fluorescens profiler av celler som uttrycker olika Aβ varianter.

4. rekombinant Protein Immunodetection

  1. För att bestämma protein uttryck nivåer, skördar de jäst kulturer inducerad för 16 h genom centrifugering vid 4000 x g i 6 min och lagra cell pellets vid-80 ° C.
    1. Återsuspendera de insamlade celler som uttrycker rekombinant protein för 16 h i PBS. Preparering av 200 µL av varje Aβ42-GFP-muterat till en OD590 20.
  2. För totalt protein fraktionen analys, skörda 100 µL av varje mutant genom centrifugering vid 14 000 x g i 20 min och återsuspendera cell pellets i samma volym av jäst lyseringsbuffert Y-PER (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 1% DMSO, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA innehållande 10 mg/mL SB3-14 (myr istyl sulfobetaine) kompletteras med 1 mM phenylmethylsulfonyl fluor (PMSF)).
    1. Inkubera proverna för 20 min i rumstemperatur under mild omskakning.
  3. Bestämma protein extract koncentration med hjälp av Bradford analysen. Ladda upp till 5 µg av protein extrakt av varje prov på en 15% akrylamid SDS-PAGE elektrofores gel och blot på ett polyvinylidene kryptondifluorid (PVDF) membran vid 100 V för 60 min.
    1. Förbereda en Bradford reagens med 100 mg Coomassie Brilliant Blue G-250 löses i 50 mL 95% etanol och tillsätt 100 mL av 85% (w/v) fosforsyra. Sedan när färgen är helt upplöst, späd blandningen med ddH2O 1 l och filtrera den genom cellulosa filterpapper strax före användning.
      Obs: Bradford reagens bör vara ljust brun.
    2. Förbereda en standard av bovint serumalbumin (BSA) allt från 5-100 µg av protein i 1000 µL av Bradford reagens.
    3. Lägg till 1-10 µL av protein extrahera till 1 mL av Bradford reagens och inkubera blandningen i rumstemperatur i 5 min.
    4. Mät absorbansen hos standarderna och proteinet extrahera prover på OD595.
    5. För analysen, göra en tomt med absorbansvärdena som erhållits för standarder vs. µg av protein. Baserat på standardkurvan, bestämma koncentrationerna av de ursprungliga proverna från mängden protein, med tanke på volymen och utspädning, om någon.
  4. Skölj membranet med 1 x Tris-buffrad koksaltlösning (TBS), 0,1% Tween 20 (TTBS), och blockera det med 5% (w/v) nonfat torr mjölk i 1 x TTBS.
    1. För att förbereda 1 L 10 x TBS, lös upp 24 g Tris base och 88 g NaCl i 900 mL H2Odd och justera pH till 7,6. Lägg till ddH2O till en slutlig volym av 1 L. För en 1 x lösning, blanda 1 del av 10 x lager med 9 delar av ddH2O.
  5. Inkubera membranet för 1 h med en primär β-amyloid antikropp 6E10 utspädd 1:1,000 och för 1 h i rumstemperatur med en sekundär antikropp get antimus IgG-HRP-konjugat utspätt 1:10 000.
  6. Utveckla membran med 1 mL Luminata fluorescerande reagens och kvantifiera band av Densitometrisk analys som beskrivs i steg 5.2.

5. dataanalys

  1. För att analysera de data som erhållits genom FC, skapa en tabell som visar den genomsnittliga fluorescerande intensiteten (MFI) och median fluorescens med dess motsvarande standardfel och/eller koefficienten för variansen (CV) för god Jordbrukarsed fluorescens och oxidativ stress.
    1. Klicka på fliken inspektör och ikonen statistik att anpassa de statistiska uppgifter som krävs för varje kanal.
      Obs: När man jämför protein varianter, konvertera fluorescens värden data till en dubbelvikt bakgrund eller upplösning metriska (RD):
      Equation 1
      I detta mått, genomsnittlig provet är den genomsnittliga fluorescensen av problem prover, kontrollen medelvärdet är den genomsnittliga fluorescensen av celler som används som en kontroll och SD är standardavvikelsen för medelvärdet fluorescensen. RD faktor är ett mer exakt index än MFI värdet eftersom det inte bara beräknar skillnaden mellan prover men även konton för fördelningen av data. Denna beräkning är särskilt relevant när jämföra data som kommer från olika experiment utförs över tid. När RDs har beräknats, är användning av ett statistiskt test tillrådligt att bekräfta betydelsen av de observerade skillnaderna mellan protein varianter.
  2. För protein immunodetection, kvantifiera rekombinant proteinnivåer genom Western blot med ImageJ programvara.
    1. Innan densitometry analysen, konvertera de ursprungliga raw-bilderna av utvecklade membranet i JPEG format och gråskala filläge.
    2. Justera avsnittet Ange mätningar i menyn analysera menar gråvärde.
    3. Klicka på verktyget rektangel från ImageJ och definiera en region av intresse (ROI) med en konsekvent storlek för bandet densitometry analys. Centrerar varje band på membran bilden inuti skapade rektangulär ram och spela in mätningen en använder Ctrl + M (kommandot mätning).
    4. Mäta lokala bakgrunden intill varje band, tillämpa samma ROI område. Efter mätning, subtrahera motsvarande lokala bakgrunden från varje enskilt band.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Det här protokollet beskriver hur man använder en samling av 20 varianter av Aβ42 peptiden där Phe19 har varit muterat till alla naturliga proteinogena aminosyror28. De teoretiska aggregering böjelser av dessa proteiner kan analyseras med hjälp av två olika bioinformatiska algoritmer (AGGRESCAN och TANGO31,32). I båda fallen gör denna analys en progressiv gradering av aggregation tendenser, att tillskriva, som regel, de högsta värdena för hydrofoba rester och det lägsta laddade och polära ettor (figur 1B, 1 C).

Om du vill spåra experimentellt tillståndet intracellulära aggregering av Aβ42 varianterna, kräver beskrivna experimentet en omvandling av en plasmid, kodning för Aβ42 och smält till GFP (figur 1A) under kontroll av den galaktos-inducerbara GAL1, i S. cerevisiae. Jästceller som uttrycker Aβ42 varianter efter en introduktionsperiod på 16 h kan visualiseras i fluorescens Mikroskop. Denna visualisering gör det möjligt att bekräfta bildandet av PI i 10 av de 20 varianterna från samlingen analyserade. Antal och storlek av fluorescerande aggregaten skiljer sig från variant till variant (figur 2). Figur 2A visar PI kvantifiering av totalt 500 celler i var och en av de två oberoende kulturerna. Här, vi kan observera en utmärkt överenskommelse mellan förutspådde och i vivo aggregering egenskaper.

Adressera om bildandet av protein aggregat kan utlösa oxidativ stress i denna modell cellsystem genom använder detta protokoll FC för att övervaka den cellulära GFP fluorescensen tillsammans med fluorescensen fluorogenic sondens som indikator av reaktivt syre arter (ROS) produktion. Figur 3 illustrerar förfarandet och uppnått resultat för Gln och Ile mutanter, som motsvarar De homogeneously distribuerade och PI-bilda Aβ42 varianterna, respektive.

Först analyseras cell befolkningen är gated (P1) i FSC-A vs. SSC-A prick komplott för att ta bort cell detritus från analysen (figur 3A). Fluorescens signalen av GFP vs. oxidativ stress sond av P1 befolkningen representeras i dot tomt grafer där grön fluorescerande celler är gated i P3 (figur 3B). Figur 3 c och 3D visar histogrammen skapade för att få statistiska uppgifter för varje uttryckt variant, inklusive CV (tabell 2), för att kvantifiera medelvärdet och medianen fluorescensen av varje fluorescerande markör.

Alla mutanter förväntas uttryckas på samma nivåer eftersom de skiljer sig i en enda aminosyra (0,02% av den Aβ42-GFP-sekvensen). Dock kan proteostasis maskinen reagera en differentiell till deras särskilda aggregering böjelser. Därför kvantifieras protein uttrycksnivåerna i cellulär extrakt med en Aβ-specifika antikroppen (figur 4). Vi ser att, som en allmän trend, PI-bilda Aβ42 varianter är närvarande på lägre nivåer än de återstående homogeneously distribuerade i cytosolen.

Viktiga skillnader bland Aβ42 varianter kan observeras när deras oxidativ stress sonden fluorescens, proteinnivåer och god Jordbrukarsed fluorescens egenskaper är representerade i förhållande till deras förmåga att bilda PI och deras inneboende aggregering böjelser ( Figur 5). Den mer aggregation-benägna PI-bilda varianter framkalla mycket lägre oxidativ stress än sina mer lösliga motsvarigheter (figur 5A, 5B). Med dessa resultat finns det inget uppenbart samband mellan storlek och antalet aggregat per enskild cell (figur 2) och oxidativ stress. PI-bilda varianter, särskilt mutanter med Trp och Phe på plats 19, är närvarande i cellen på lägre nivåer än de likartad distribueras i cytosolen (figur 5 c, 5 D). Undantaget från detta är Thr mutant, som utgör mindre än 10% av cellerna PI (figur 1B, 1 C). Detta motsvarar med det faktum att de mest aggregation-benägen varianterna rensas selektivt av jäst kvalitetskontroll nedbrytning maskiner28. GFP fluorescens och proteinnivåer korrelerar väl för formulären mer lösliga Aβ42, men inte för de som utgör PI (figur 5E, 5F). Detta är förmodligen eftersom i dessa cellulära populationer, fluorescensen kommer från två olika fack, cytosolen och inneslutningar, och deras relativa bidrag till den totala fluorescensen variera mellan mutanter34.

Figure 1
Figur 1 . Aggregation benägenhet analys för insamling av Aβ42-GFP fusion konstruktioner härstammar från mutationen av rester vid position 19 i Aβ42 peptiden genom alla naturliga aminosyror. A. denna bild visar en 3D-modell av wt Aβ42 smält till GFP av en länkare (Aβ42, grå; GFP, grön), baserat på den preliminära 1EMA för grönt fluorescerande protein från Aequorea victoria och 2OTK för Alzheimers Aβ peptiden där Phe19 sidokedjan av wt Aβ42 visas i rött. Modellen är skapad med Pymol programvara. Rester 19 i sekvensen Aβ42 intar en central ställning i centrala hydrofoba klustret. Stolpdiagram skapas med två olika bioinformatiska prediktorer: B. AGGRESCAN, C. TANGO. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 . Aβ42-GFP PI-bilda varianter i S. cerevisiae kulturer inducerad för 16 h uttryck. A. stapeldiagrammet anger procentandelen av celler som innehåller olika antal PI beräknas från sammanlagt 500 fluorescerande celler för varje variant i två biologiska replikat. B. dessa bilder är representativa fluorescerande mikroskopi bilder av valda Aβ42-GFP varianter (Phe, Ile, Thr, Trp). De förvärvades under UV-ljus med en excitationsfilter för god Jordbrukarsed (450-500 nm) och ett utsläpp utbud (515-560 nm). Skalstapeln representerar 10 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 . Systemet för flödet flödescytometri (FC) analys of S. cerevisiae celler som uttrycker valda Aβ42-GFP varianter. A. diagrammet visar gated jästceller (P1) i dot tomter (FSC-A vs. SSC-A) där cellen detritus avlägsnas från cell befolkningen. Mikroskopiska bilder av Gln (homogeneously distribueras) och Ile (PI-bilda) varianter visas bredvid FC dot tomter. Skalstapeln representerar 10 µm. B. Dessa scatter dot tomt bilder representerar GFP-A vs. oxidativ stress sond där gated befolkningen (P3) innehåller endast fluorescerande celler, exklusive bakgrund signalen. Cell frekvens histogram är c. GFP signalen (FITC amplitud) gated från P1 och D. CellROX (APC amplitud) gated från P3. Cell förvärvet utfördes med en flödescytometer. Varje tomt representerar 20.000 evenemang. Q och jag motsvarar Gln och Ile Aβ42 mutanter, respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 . Kvantifiering av cellulära proteinnivåer. Denna figur visar Western blotting av totalprotein fraktioner av Aβ42-GFP mutanter efter 16 h yttrandefriheten i S. cerevisiae. Varianter av PI-bilda är färgade i grönt och de distribueras diffust i cytosolen är färgade i ljusrött. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5 . Cellulära oxidativ stress, intracellulära GFP fluorescens och cellulära proteinnivåer för Aβ42-GFP mutanter bestäms efter 16 h yttrandefriheten i S. cerevisiae. Varianter av representerade på x-axeln har beställts enligt deras förväntade aggregering böjelser av antingen AGGRESCAN (till vänster) eller TANGO (höger panel). Varianter av PI-bilda är färgade i grönt och varianter av icke-PI-bilda är färgade i ljusrött. A. B. diagrammen bar visar oxidativ stress sonden fluorescens-värden som erhålls av en FC analys av Aβ42-GFP mutanter. C. D. dessa stolpdiagram representerar proteinnivåer som kvantifieras genom Western blot densitometry analys med ImageJ programvara. E. F. dessa stapeldiagram visar god Jordbrukarsed fluorescens värdena efter en FC analys. Felstaplarna för oxidativ stress sond och god Jordbrukarsed fluorescens värden representerar koefficienten för varians (CV) av FC-gated cellerna. Felstaplarna för protein uttryck nivåer representera ± SE (n = 3). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Kanal Fluorophore Magnetiseringen våglängd (nm) Band Pass Filter
FITC GOD JORDBRUKARSED 488 530/30
APC CellRox 635 660/20
PerCP IP 488 585/42

Tabell 1. Laserkälla, band-passera filter och fluorophores används i flödescytometer.

GFP fluorescens CV CellROX fluorescens CV
A 9316 96,4 1964 127,5
C 9709 91,9 1275 172,2
D 11213 101,7 3443 155,8
E 12256 101,1 3220 152,2
F 3010 96,1 1245 146,4
G 11541 97,2 2947 158
H 7895 98,2 3582 120,8
Jag 7365 97,2 1416 141,3
KARLSSON 10839 100,4 3102 122,1
L 7605 96,9 1401 161,8
M 8149 96 1308 170,4
N 12741 97,5 3403 134,9
P 9768 102,8 2629 143,6
Q 13066 91,3 3354 169,9
R 8537 101,3 2839 127,5
S 12053 99,1 3313 174,3
T 10615 97,7 2213 107,7
V 9169 96,1 1878 121,7
W 1715 94,7 1531 100
Y 7574 94,5 1234 138

Tabell 2. Lista med värden för god Jordbrukarsed fluorescens och oxidativ stress sonden fluorescens erhålls genom FC analys av jästceller som uttrycker Aβ42-GFP mutanter för 16 h. Den här tabellen visar genomsnittliga fluorescensintensiteten (MFI) och CV för varje mutant.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ett brett spektrum av sjukdomar är kopplade till ansamling av felveckning proteiner i cellulära insättningar6,7,8,33. Många ansträngningar har gjorts att riva upp de molekylära mekanismer som utlöser uppkomsten av dessa sjukdomar med hjälp av beräkningsvetenskapliga metoder, som inte tar in i konto protein koncentrationer, eller in vitro- metoder, där protein koncentrationen konstant under reaktionen. Dock i cellen, proteiner ständigt syntetiseras och förstörd i ett trångt och heterogen miljö. Detta förklarar de frekventa avvikelserna mellan i silico, in vitro, och i vivo aggregering amyloidogenic proteiners egenskaper.

I området i närheten finns det flera skäl till varför enkla cellular-modeller, såsom jäst, är ett rimligt val att studera aggregering och associerade toxicitet av proteiner relaterade till neurodegenerativa sjukdomar i ett mer biologiska sammanhang. Till exempel, ger de oss möjlighet att analysera effekten av protein felveckning aggregeras på en intakt cellulära befolkning med snabba analyser som genomförts här. Dock bör vi överväga att oxidativ nivåer kan variera bland jäststammar. Således för att jämföra mellan stammar, eller ens mellan olika proteiner, bör oxidanter och reduktionsmedel, såsom DTT och diamine, användas för att upprätta en oxidation/reduktion skala.

I exemplet som illustreras i denna artikel, bioinformatiska analyser, cellulära protein kvantifiering, har protein lokalisering imaging och samtidig FC analys av GFP aktivitet och oxidativ stress integrerats för att identifiera molekylära arter som är ansvarig för oxidativ skada som framkallas av protein aggregering reaktioner. Resultaten visar att varianter av mer lösliga Aβ42, snarare än den mer aggregation-benägen, främja den högsta oxidativ stressen. Detta pekar till diffusible arter att vara farligare Aβ42 arter i vivo. Lägre toxicitet aggregerar varianter verkar svara både på det faktum att dessa konformationer är binds till PI och deras förmånliga nedbrytning av protein kvalitet maskinen, vilket resulterar i lägre proteinnivåer än deras lösliga motsvarigheter.

Den beskrivna metoden är inte begränsad till analysen av oxidativ stress produceras av Aβ42 aggregerade/lösliga arter och kan också användas för att studera en mängd protein aggregering störningar. Tekniken kan dessutom vara lämpligt att övervaka effekten av aggregation-hämmare på cellulära oxidativ stress, gör det möjligt för att kassera för ytterligare kliniska applikationer de molekyler som främjar ansamling av oxidativ aktivt protein arter. Slutligen, så länge det finns en fluorogenic sond, metoden erbjuder enastående möjligheter att identifiera de molekylära arterna som är ansvarig för andra toxiska effekter kopplade till protein aggregation i ett snabbt ett enkelt sätt, tillhandahålla kvantitativa data.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

   

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Yeast cells BY4741  ATCC 201388 Genotype: MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0
pESC(-Ura) plasmid  Agilent Genomics 217454 Yeast expression plasmid with a Gal promotor. Selectable marker URA3
Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements Sigma Y1501 Powder
Yeast Nitrogen Base Without Amino Acids Sigma Y0626 Powder
Raffinose Sigma R7630 Powder
Glucose Sigma G7021 Powder
Galactose Sigma G0750 Powder
Phosphate Buffered Saline (PBS) Fisher Scientific BP3991  Solution 10X
CellROX Deep Red Reagent  Life Technologies C10422 Free radical cell-permeant fluorescent sensor, non-fluorescent while in a reduced state, and exhibits bright fluorescence upon oxidation by reactive oxygen species (ROS), with absorption/emission maxima at 644/665 nm. 
Y-PER protein extraction reagent  Thermo Scientific 78990 Liquid cell lysis buffer
Acrylamide/Bis-acrylamide Sigma A6050 Solution
Bradford dye reagent Bio-Rad  5000205 Dye reagent for one-step determination of protein concentration
β-amyloid antibody 6E10  BioLegend 803001 Mouse IgG1. The epitope lies within amino acids 3-8 of beta amyloid (EFRHDS).
Goat anti-mouse IgG-HRP conjugate  Bio-Rad 1721011
Membrane Immobilon-P, PVDF Millipore IPVH00010
Luminata forte Merk WBLUF0100 Premixed, ready to use chemiluminescent HRP detection reagent
Phenylmethanesulfonyl fluoride solution (PMSF) Sigma 93482 Protease inhibitor. Dissolved at 0.1 M in ethanol
FACSCanto flow cytometer  BD Biosciences 657338 Equipped with a 488 nm blue laser for the detection of GFP, and 635 nm red laser / 530/30 nm BP filter and 660/20 BP filter
Mini Trans-Blot Electrophoresis Transfer cell Bio-Rad 1703930 Protein transference system
Mini-PROTEAN Tetra Handcast Systems Bio-Rad 1658000FC Electrophoresis system

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frydman, J. Folding of newly translated proteins in vivo: the role of molecular chaperones. Annual Review of Biochemistry. 70, 603-647 (2001).
  2. Hartl, F. U., Bracher, A., Hayer-Hartl, M. Molecular chaperones in protein folding and proteostasis. Nature. 475, 324-332 (2011).
  3. Wong, E., et al. Molecular determinants of selective clearance of protein inclusions by autophagy. Nature Communications. 3, (2012).
  4. Winkler, J., Tyedmers, J., Bukau, B., Mogk, A. Chaperone networks in protein disaggregation and prion propagation. Journal of Structural Biology. 179, 152-160 (2012).
  5. Glickman, M. H., Ciechanover, A. The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway: destruction for the sake of construction. Physiological Reviews. 82, 373-428 (2002).
  6. Dobson, C. M. Getting out of shape. Nature. 418, 729-730 (2002).
  7. Chiti, F., Dobson, C. M. Protein misfolding, functional amyloid, and human disease. Annual Review of Biochemistry. 75, 333-366 (2006).
  8. Aguzzi, A., O'Connor, T. Protein aggregation diseases: pathogenicity and therapeutic perspectives. Nature Reviews Drug Discovery. 9, 237-248 (2010).
  9. Rapezzi, C., et al. Transthyretin-related amyloidoses and the heart: a clinical overview. Nature Reviews Cardiology. 7, 398-408 (2010).
  10. Deas, E., et al. Alpha-synuclein oligomers interact with metal ions to induce oxidative stress and neuronal death in Parkinson's disease. Antioxidants & Redox Signaling. 24, 376-391 (2016).
  11. Brundin, P., Melki, R., Kopito, R. Prion-like transmission of protein aggregates in neurodegenerative diseases. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 301-307 (2010).
  12. Frost, B., Diamond, M. I. Prion-like mechanisms in neurodegenerative diseases. Nature Reviews Neuroscience. 11, 155-159 (2009).
  13. Arrasate, M., Mitra, S., Schweitzer, E. S., Segal, M. R., Finkbeiner, S. Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and the risk of neuronal death. Nature. 431, 805-810 (2004).
  14. Ross, C. A., Poirier, M. A. Opinion: what is the role of protein aggregation in neurodegeneration? Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 891-898 (2005).
  15. Mishra, R., Sjölander, D., Hammarström, P. Spectroscopic characterization of diverse amyloid fibrils in vitro by the fluorescent dye Nile red. Molecular BioSystems. 7, 1232-1240 (2011).
  16. Klunk, W. E., Jacob, R. F., Mason, R. P. Quantifying amyloid by congo red spectral shift assay. Methods in Enzymology. 309, 285-305 (1999).
  17. Khurana, V., Lindquist, S. Modelling neurodegeneration in Saccharomyces cerevisiae: why cook with baker's yeast? Nature Reviews Neuroscience. 11, 436-449 (2010).
  18. Tenreiro, S., Outeiro, T. F. Simple is good: yeast models of neurodegeneration. FEMS Yeast Research. 10, 970-979 (2010).
  19. Moosavi, B., Mousavi, B., Macreadie, I. G. Yeast model of amyloid-β and Tau aggregation in Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease. 47, 9-16 (2015).
  20. Tenreiro, S., Munder, M. C., Alberti, S., Outeiro, T. F. Harnessing the power of yeast to unravel the molecular basis of neurodegeneration. Journal of Neurochemistry. 127, 438-452 (2013).
  21. Yang, J., Hao, X., Cao, X., Liu, B., Nyström, T. Spatial sequestration and detoxification of huntingtin by the ribosome quality control complex. eLife. 5, (2016).
  22. Braun, R. J., Büttner, S., Ring, J., Kroemer, G., Madeo, F. Nervous yeast: modeling neurotoxic cell death. Trends in Biochemical Sciences. 35, 135-144 (2010).
  23. Figley, M. D., Gitler, A. D. Yeast genetic screen reveals novel therapeutic strategy for ALS. Rare Diseases. 1, e24420 (2013).
  24. Cooper, A. A., et al. Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models. Science. 313, 324-328 (2006).
  25. Johnson, B. S., McCaffery, J. M., Lindquist, S., Gitler, A. D. A yeast TDP-43 proteinopathy model: exploring the molecular determinants of TDP-43 aggregation and cellular toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 6439-6444 (2008).
  26. Bharathi, V., et al. Use of ade1 and ade2 mutations for development of a versatile red/white color assay of amyloid-induced oxidative stress in saccharomyces cerevisiae. Yeast. 33, 607-620 (2016).
  27. Pallarès, I., Ventura, S. Advances in the prediction of protein aggregation propensity. Current Medicinal Chemistry. (2017).
  28. Villar-Piqué, A., Ventura, S. Protein aggregation propensity is a crucial determinant of intracellular inclusion formation and quality control degradation. Biochimica et Biophysica Acta. 1833, 2714-2724 (2013).
  29. Navarro, S., Villar-Piqué, A., Ventura, S. Selection against toxic aggregation-prone protein sequences in bacteria. Biochimica et Biophysica Acta. 1843, 866-874 (2014).
  30. Morell, M., de Groot, N. S., Vendrell, J., Avilés, F. X., Ventura, S. Linking amyloid protein aggregation and yeast survival. Molecular BioSystems. 7, 1121-1128 (2011).
  31. Conchillo-Solé, O., et al. AGGRESCAN: a server for the prediction and evaluation of "hot spots" of aggregation in polypeptides. BMC Bioinformatics. 8, 65 (2007).
  32. Fernandez-Escamilla, A. M., Rousseau, F., Schymkowitz, J., Serrano, L. Prediction of sequence-dependent and mutational effects on the aggregation of peptides and proteins. Nature Biotechnology. 22, 1302-1306 (2004).
  33. Renner, M., Melki, R. Protein aggregation and prionopathies. Pathologie Biologie.(Paris). 62, 162-168 (2014).
  34. Carija, A., Navarro, S., de Groot, N. S., Ventura, S. Protein aggregation into insoluble deposits protects from oxidative stress. Redox Biology. 12, 699-711 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics