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간단 하 고 효과적인 관리 및 신장 주입을 사용 하 여 작은 물고기의 순환 시스템에 미의 시각화

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Summary

이 문서에서는 빠르고, 최소 침 습으로 주사를 형광 미의 작은 물고기의 circulatory system 및 물고기의 혈액에 미의 비보에 시각화의 원칙을 보여 줍니다.

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Borvinskaya, E., Gurkov, A., Shchapova, E., Karnaukhov, D., Sadovoy, A., Meglinski, I., Timofeyev, M. Simple and Effective Administration and Visualization of Microparticles in the Circulatory System of Small Fishes Using Kidney Injection. J. Vis. Exp. (136), e57491, doi:10.3791/57491 (2018).

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Abstract

맥 관 구조 시각화, 약물 및 백신 납품, 작은 광학 센서 및 유전자 변형 세포의 이식에 대 한 살아있는 유기 체에 마이크로 크기 입자의 체계적 관리를 적용할 수 있습니다. 그러나, 생물 및 동물 실험실에서 주로 사용 되는 작은 동물에 정 맥 microinjections 매우 어려운 고 숙련 된 직원을 필요. 여기, 물고기 신장에 주입 하 여 성인 zebrafish (Danio rerio)의 순환 시스템에 미의 도입에 대 한 강력 하 고 효율적인 방법을 설명합니다. 시각화는 맥 관 구조에 소개 된 미, 하 우리는 물고기 아가미에 간단한 intravital 이미징 기술을 제안 합니다. 주입 된 microencapsulated 형광을 사용 하 여 달성 되었다 vivo에서 zebrafish 혈액 pH의 모니터링 조사, SNARF-1, 설명 기술의 가능한 응용 프로그램 중 하나를 보여 줍니다. 이 문서는 pH에 민감한 염료의 캡슐화에 대 한 자세한 설명을 제공 하 고 빠른 주사의 원리와 형광 신호의 비보에 기록에 대 한 취득된 microcapsules의 시각화를 보여 줍니다. 주입의 제안된 방법 낮은 사망률에 의해 특징입니다 (0-20%)와 높은 효율 (70-90% 성공), 그리고 그것을 일반적으로 사용 가능한 장비를 사용 하 여 쉽습니다. 관 상용 열대어와 메 다카 같은 다른 작은 물고기 종에 모든 설명 된 절차를 수행할 수 있습니다.

Introduction

동물 유기 체에 마이크로 크기 입자의 관리 약물 및 백신 납품1, 맥 관 구조 시각화2, 유전자 변형 세포 이식3및 작은 광학 센서 이식 등의 분야에서 중요 한 작업입니다. 4 , 그러나 5., 작은 실험실 동물의 혈관 시스템으로 미 입자에 대 한 주입 절차는 어려운, 특히 섬세 한 수생 생물에 대 한. Zebrafish 같은 인기 있는 연구 표본에 대 한 조언 비디오 프로토콜을 사용 하 여 명백 하 게이 프로시저를.

Intracardiac 및 모 세관 microinjections zebrafish 혈액으로 microobjects의 납품을 위한 훈련 된 인력과 독특한 미세 시설 필요. 이전, 역 궤도 수동 주입3 전체 셀의 관리에 대 한 간단 하 고 효과적인 방법으로 제안 했다. 그러나, 우리의 경험에 눈 모 세관 네트워크의 작은 지역 때문에 걸리는이 기술에서 원하는 결과 달성 하기 위해 많은 연습.

여기, 우리 기술 순환 시스템으로 강력 하 고 효율적인 microparticle 이식 하는 방법 성인 zebrafish의 신장 조직에 직접 수동 주입는 모세 혈관과 신장 혈관이 풍부 하다. 이 기술은 세포 이식 zebrafish 신장6에 대 한 비디오 프로토콜에 기반 하지만 외상 및 시간이 걸리는 microsurgical 단계 탈락 했다. 제안된 된 방법 낮은 사망률에 의해 특징입니다 (0-20%)와 높은 효율 (70-90% 성공), 그리고 그것을 일반적으로 사용 가능한 장비를 사용 하 여 쉽습니다.

제안 된 프로토콜의 중요 한 부분이 이다는 이식된 미 (해당 되는 경우에 그들은 형광 또는 colorized) 아가미 모세 혈관에 주입 품질, 수의 거친 상대 평가의 확인에 대 한 수의 시각화 주입 된 입자, 그리고 순환 혈액에서 직접 생리 측정 스펙트럼 신호 감지. Vivo에서 zebrafish 혈액 pH microencapsulated 형광 프로브, SNARF-1, 원래에 제안 된 Borvinskaya를 사용 하 여의 측정을 위한 프로토콜 설명 설명된 기술의 가능한 응용 프로그램의 예를 들어, 외. 20175.

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Protocol

모든 실험 절차는 동물 실험에 대 한 EU 지침 2010/63/EU에 따라 실시 했다 하 고는 동물 주제 연구 위원회 연구소의 생물학의 이르쿠츠크 주립 대학에 의해 승인 되었습니다.

1입니다. Microcapsules의 제조

참고: Microcapsules 형광 염료를 들고 반대로 충전된 polyelectrolytes7,8의 레이어, 레이어 어셈블리를 사용 하 여 준비가 되어 있습니다. 모든 절차는 실 온에서 수행 했다.

  1. 형광 염료를 포함 하는 다공성 CaCO3 microcores 합성, 혼합 SNARF-1-dextran 솔루션 (FITC BSA 등 대부분 폴리머 바인딩된 형광 염료를 사용할 수 있습니다.)의 2 개 mL ~ 2 mg/mL의 농도에서 0.6 mL CaCl2의 1 mol/L 솔루션 와 나2CO3 빠른 교 아래.
    참고: photobleaching;에 형광 염료의 다른 감도에 관심을 지불 (SNARF-1) 같은 빛에 민감한 형광 프로브를 사용 하는 경우는 미의 저장 하 고 조작 해야 합니다 수행할 수 가능한 작은 빛으로.
  2. 동요의 5-10 s, 후 전송 현 탁 액 2 mL microcentrifuge 튜브와 15에 대 한 원심 분리기 CaCO3 microcores 펠 렛에 10000-12000 g에서 s.
  3. 삭제는 상쾌한, 이온된 수, ~ 2 mL와 코어를 세척 하 고 떨고 하 여 펠 릿을 resuspend.
  4. 세 번 총에에서 원심 분리 세척 절차를 반복 합니다. 마지막 원심 분리 후에 상쾌한을 삭제 합니다.
  5. 그들의 집계를 줄이기 위해 초음파 목욕에서 1 분 microcores를 품 어.
    주의: 헤드폰으로 귀를 보호 하기 위해 잊지 마세요.
  6. 서식 파일에서 첫 번째 폴리머 레이어를 입금, 1 mol/L NaCl에에서 poly(allylamine hydrochloride) (PAH)의 4 mg/mL 해결책의 ~ 2 mL에 코어를 resuspend.
    1. 일정 한 동요와 ~ 5 분에 대 한 솔루션에는 microcores를 유지.
    2. 15 후 원심 분리의 s 삭제 언바운드 PAH와 상쾌한. 3 번 이상 여러 원심 분리 및 세척 단계를 통해 이온을 제거 된 물으로 덮여 microcores 세척. 마지막 원심 분리 후에 상쾌한을 삭제 합니다.
    3. 그들의 집계를 줄이기 위해 초음파 목욕에서 1 분 microcores를 품 어.
      참고: 폴 리 (나트륨 4-styrenesulfonate)에서 시작 하는 경우 적용 된 형광 성 염료는 양이온, (PSS) 1 mol/L NaCl에에서 (단계 1.7 참조).
  7. 서식 파일에 두 번째 폴리머 레이어를 입금 PSS (또한 1 mol/L NaCl을 포함 하는)의 4 mg/mL 해결책의 ~ 2 mL와 1.6 단계를 반복 합니다.
  8. 1.6 및 1.7 6 번 입금 12 폴리머 레이어를 단계를 반복 합니다.
    참고: 권장 되지 않습니다 (~ 12 h 이상) 긴 휴식 ~ 3-5까지 절차에 레이어 입금 되었습니다 때문에 보험 없이 CaCO3 microcores recrystallize 하는 경향이 있습니다. Note PSS 범위는 microcores의 더 높은 집계 원인과 긴 일시 중지는 (PLL-g-PEG) outmost 레이어는 PAH 또는 폴 리-L-리 신 폴 리 에틸렌 글리콜으로 투입 하는 경우에 좋습니다.
  9. 2 mg/ml PLL-g-말뚝 (microtube 당 ~ 1 mL) 적어도 2 시간에 대 한 커버 microcores를 품 어.
    1. Microcores 연속 원심 분리 및 물의 resuspension 단계를 통해 물으로 씻는 다. 마지막 원심 분리 후에 상쾌한을 삭제 합니다.
  10. 빈 microcapsules를 하려면 대상된 microcores를 사용 0.1 mol/L ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 솔루션 (NaOH로 pH 7.1 조정)의 2 개 mL를 추가 하 여 CaCO3 서식 파일을 분해.
    1. 외피의 ~ 5 분, 후 원심 45 s 및 삭제에 대 한 microcapsules EDTA와 상쾌한.
    2. 1.10 1.10.1 단계를 두 번 반복 합니다.
  11. 0.9 %NaCl 여러 원심 분리를 통해 세 번 45 내 단계 microcapsules 세척 세척 단계 뒤에 s. 원심 분리의 마지막 단계, 후에 상쾌한을 삭제 합니다.
    참고: 주입에 대 한 최종 microcapsule 솔루션 유지 되어야 한다 살 균 (예를 들어 추가 하 여 암 피 실린, 0.1 mg/mL), 그리고 미디어 생체 조사 (isotonic 미디어 중립 ph) 대상이 되어야 합니다.
  12. 형광 현미경 hemocytometer에 준비 된 microcapsules의 농도 견적 한다. microcapsules의 그림의 일련, 한 백 microcapsules ImageJ9 또는 해당 소프트웨어를 사용 하 여에 대 한의 직경을 측정 하 고 히스토그램을 사용 하 여 크기 분포를 조사.
  13. 저장소는 획득된 캡슐화 프로브 어둠 속에서.
    참고: 살 균 0.9%에서 여러 빨 래 후 NaCl, microcapsules는 4 ° c.에 몇 달 동안 저장 될 수 있다 저장 동안에 microcapsules의 완전 한 건조 하는 것은 권장 하지 않습니다.

2. 준비의 광학 설치 및 Microencapsulated SNARF-1의 교정

참고: microencapsulated SNARF-1 거친 pH 측정 형광 현미경7의 두 채널의 이미지를 사용 하 여 만들 수 있습니다 하지만 섬유 분석기에 연결 된 한 개 채널 형광 현미경이이 프로토콜에 적용 했다.

  1. 필요한 일련의 형광 필터 적용 된 형광 염료의 특성에 따라 형광 현미경에 놓고 형광 램프를 켭니다.
    1. 접 안경에 레버를 당겨.
      주의: 초과 빛 분석기 매트릭스를 손상 수 있습니다. 따라서, 레버는 "아이피" 모드는 분석기를 사용 하지 않을 있는지 확인 합니다.
    2. 분석기와는 다른 쪽 끝을는 겨냥 틀을 광섬유의 한쪽 끝을 연결 합니다. 어댑터를 사용 하 여 카메라 튜브의 초점 또는 형광 현미경의 다른 사용 가능한 포트에는 겨냥 틀을 배치 합니다.
    3. 분석기를 켭니다. 분 광 계 제어 프로그램을 실행 하 고는 분석기 측정을 위한 준비.
  2. Microcapsule 배치의 교정에 대 한 microcapsule 정지 (이온된 수 µ L 당 10 ~ 000 microcapsules)의 ~ 5 µ L 현미경 슬라이드에 놓고 건조 (35 ° C에서 온도)에서 예를 들어 어두운 장소에 드롭.
    1. Microencapsulated SNARF-1의 스펙트럼 특성을 보정 하려면 다른 pH 값 범위 ~ 6-9에에서 버퍼의 시리즈를 사용 합니다. ~ 10 µ L SNARF-1-dextran와 말린된 microcapsules에 버퍼를 삭제 하 고는 coverslip로 그것을 커버.
    2. 현미경 단계에 유리 슬라이드를 놓습니다. Microcapsules를 × 40 목표를 사용 하 여 찾습니다.
    3. 카메라 포트를 현미경 레버를 설정. 그들의 형광 분석기를 등록 합니다. 레버는 접 안 렌즈를 다시 설정 합니다.
      참고: 배경 수준 보다 훨씬 스펙트럼 신호는 다는 것을 확인 하 고 보기의 필드에 microcapsules는 거품에서 (로 전환 하 여 낮은 확대 필요한 경우) 확인 합니다. 동일한 microcapsules의 장시간된 조명을 하지 마십시오. SNARF-1은 photobleaching에 민감합니다.
    4. 10-15 회 다른 microcapsules에 대 한 단계 2.2.3을 반복 합니다.
  3. 모든 등록 된 스펙트럼에 대 한 형광 피크 비율 (예: R 또는 Scilab 사용)을 계산 하 고 회귀선 (각 버퍼)에 대 한 평균 비율 및 다음 수식을 사용 하 여 중간 pH 사이 결정:
    Equation 1
    참고: SNARF-1 스펙트럼 protonated 및 deprotonated 염료의 방출에 해당 하는 두 개의 봉우리 있으며 봉우리 사이의 비율 매체의 pH에 반응입니다. 이 연구에서 605, 660 nm의 형광 강도 사이 비율 사용 됩니다. 이 파장은 사용 하는 필터 설정에 따라 선택 됩니다. ab 는 계수 비 선형 회귀 (예: R를 사용 하 여)에 의해 결정 됩니다. 0.15 및 1.1 값은, 각각,의 최소 및 최대 값 605/I660 는 교정 중 관찰.
  4. 약 5 성인 동물에서 물고기 혈액의 약 10 µ L를 수집 합니다. 장소 1 µ L/mL와 페 트리 접시에 마 취에 대 한 정 향 오일의 서 스 펜 션 물 생선과 동물의 측면에는 지 느 러 미의 pinches을 응답 하지 않습니다 때까지 기다렸다가 (보통 2 ~ 3 분). 유리 슬라이드에 물고기를 전송 합니다. 물고기 꼬리는 바소와에서 잘라내어 꼬리 정 맥에서 물고기 혈액의 약 2 µ L를 수집.
    참고: 혈액 응고 방지 하기 위해, 헤 파 린 (5000 U/mL)와 절 개를 치료 하 고 heparinized 유리 모 세관 및 microcentrifuge 튜브를 사용 하 여 혈액을 수집.
    1. microelectrode의 끝에 피 펫과 혈액의 약 10 µ L 똑 하 고 pH 미터를 사용 하 여 pH를 결정 합니다.
    2. 말린된 microcapsules와 함께 슬라이드에 혈액을 삭제 하 고 등록 교정 버퍼 (2.2-2.3 단계)에 대 한 설명으로 형광 강도의 비율.
  5. 곡선 (대 한 자세한 내용은 참조 Borvinskaya 외. 20175) 물고기 혈액 측정 일치 하도록 교정 곡선의 선형 계수를 조정 합니다.

3입니다. 주입에 대 한 준비

  1. 날카로운 바소와 플라스틱을 제거 하 여 인슐린 펜 (또는 주사기)의 끝에서 강철 바늘을 놓습니다.
    참고: 모든 얇은 바늘 (Ø0.33 m m 또는 더 적은) 또는 유리 모 세관 (일반적으로 Ø1 m m) microinjection10,11준비 될 수 있다.
  2. 유리 microcapillary; 중간 바늘 삽입 신속 하 고 부드럽게 솔더 가스 토치를 사용 하 여.
  3. 유리 microcapillary는 microinjector에 연결 하 고 세 번 살 균 물으로 플러시. 액체는 바늘에 흐르는 확인 하십시오.
  4. 증류수로 시스템을 채우십시오.
    참고: 시스템에 있는 아무 거품 다는 것을 확인 하십시오.

4입니다. 주입

  1. Microcapsules의 준비 된 현 탁 액 resuspend (살 균 0.9 %NaCl에서, 또는 어떤 다른 매체 든 지에 사용 microliter 당 0.5 6 백만 microcapsules의 농도 주사) 1 분 동안 초음파 목욕을 사용 하 여.
    참고: 다음 주입 동안 침전 하는 microcapsules 경향이 있기 때문에 동요는 microcapsules와 유리병 기계적으로 (로 터를 사용 하 여) 또는 수동으로 수 분 마다 그들을 resuspend 하 고 그들의 집계를 방지.
  2. 장소 마 (정 향 오일 물에 0.1 mL/L)와 페 트리 접시에 물고기 2 ~ 3 분 대기 물고기의 측면에는 지 느 러 미의 빛 핀치에 응답 하지 않습니다 때까지.
  3. 숟가락을 사용 하 여, 마 취에서 생선을 전송 하 고 부드럽게 머리 (사람을 위해 오른 손잡이) 왼쪽으로 또는 오른쪽 (왼손잡이 사람)에 대 한 가로 위치에 젖은 스폰지에 두십시오.
  4. 주사의 바로 전에 1-2 m m 유리 모 세관으로 공기의 microinjector와 연결 된 빨 아. 그런 다음, 분산 된 microcapsules의 약 2 µ L와 함께 로드 됩니다.
    참고: 주입, 전에 microcapsule 솔루션 물고기 지켜진다 온도를 조정할 수 합니다.
  5. 부드럽게 비 지배적인 손 가진 스폰지에 물고기의 시체를 안정화 합니다.
    1. 물고기의 측면 라인을 찾아. 정신적으로 복 부 구멍의 끝에는 operculum에서 확장 하는 세그먼트를 선택 합니다. 이 세그먼트의 중간을 찾아. 더 낮은 복 부 방향으로 1 m m 바늘을 넣어.
    2. 된다고 운동, 생선 비늘, 고 펑크 부드럽게 이동 합니다. 테이블 표면에 45 °의 각도에서 본문에 바늘을 삽입 합니다.
    3. 그것은 신중 하 게 그것에 대하여 휴식 때까지 척추 쪽으로 바늘을 밀어.
    4. 신장에 microcapsules의 현 탁 액의 약 1 µ L를 놓고 천천히 바늘을 철회.
      참고: 적절 한 바늘 사이트를 찾을 수 쉽게, 유용 그림 2A 와 2B와같이 아래 빛을 사용 하 여 물고기를 transilluminating 하 여 트렁크 신장을 찾는 연습을 합니다.
  6. 씻어 주사 사이트에서 유출된 된 microcapsules를 제거 하는 물 스트림 꼬리에 머리에서 물고기.

5. Vivo에서 시각화

  1. 해 부가 위를 사용 하 여 물고기 머리에서 아가미 덮개를 제거 하 고 물고기 아가미를 발가 벗기다. 린스 물으로 아가미.
  2. 숟가락을 사용 하 여, 현미경 슬라이드에 물고기를 전송 하 고 형광 현미경의 스테이지에 배치.
    참고: 연속 절차 동안 물고기의 아가미를 건조 하지 않는 다는 것을 확인 하십시오. 이 방지 하려면 정기적으로 축 축 하 게 그들 파스퇴르 피 펫 (1-2 분 마다 약)를 사용 하 여 물으로.
  3. 방을 어둡게 하 고 형광 microcapsules 데 아가미 검사 낮은 배율 (x 10의 목표)를 사용 하 여.
    참고: 물고기 순환 시스템에 몇 가지 형광 입자의 도입에 대 한 절차를 사용 하는 경우이 좋습니다 주사 하기 전에 예기치 않은 형광 입자에 대 한 몇 가지 개인의 아가미를 검사. 야생-타입 zebrafish의 아가미 autofluorescence, 필요가 없습니다 하지만 경우에 따라 (같은 음식 조각 또는 단 세포 symbionts) 산발적 형광 입자 아가미에 수 있습니다. 경우 필요한, 이러한 입자 인식 될 수 있다 그들의 특정 모양에 따라 (예를 들어 음식 조각을 구형 microcapsules 달리 불규칙 한 모양) 또는 형광 스펙트럼 (즉, 색상).
    1. 더 높은 크기 (× 40 목표), 렌즈를 전환 하 고 한 microcapsule 또는 microcapsules의 그룹 보기의 필드의 중앙에 위치 합니다.
    2. 연결된 분석기와 포트에 레버를 설정. 스펙트럼 신호를 기록 합니다.
    3. 레버는 접 안 렌즈를 다시 설정 합니다.
    4. 여러 번 다른 microcapsules에 대 한 측정을 반복 합니다.
  4. 복구에 대 한 적절 한 환기와 수족관에 물고기를 전송 합니다.
    참고: 최소의 연습으로, 그것은 주입 및 물고기 마다 2-3 분의 대략적인 속도로 기록 하는 신호를 수행할 수 있습니다. 측정 반복된 낮은, 무해 한 복용량 마 취의 또는 고정의 또 다른 방법은 사용 하 여 하나의 개별 여러 번 반복할 수 있습니다. 장기 관찰에 대 한 지속적인 마 취12시스템을 사용 합니다.

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Representative Results

얻은 결과 제시 프로토콜의 세 가지 주요 범주 중 하나에서 온: 형광 염료 (그림 1)에 추가 시각화와 microcapsules의 신장 주입의 캡슐화에 의해 형광 미의 형성 모세 혈관 (그림 2 및 3) 아가미와, 마지막으로, vivo에서 스펙트럼의 녹음 SNARF 1 형광 모니터링 하 혈액 pH 수준 (그림 4).

반대로의 계층으로 염료를 포함 하는 템플릿 CaCO3 코어의 코팅을 사용 하 여 레이어, 레이어 접근 청구 (PAH와 PSS) 고분자 및 생체 고분자 (PLL-g-PEG)의 가장 바깥쪽 레이어는 간단 하 고 비용 효율적인 방법 SNARF-1-dextran, FITC BSA 등 다른 (그림 1A) 다른 형광 프로브를 캡슐화 하는 것을 허용. 그 결과, 안정적인 반 투과성 탄성 포탄 크기 및 형광 염료와 로드의 미세 빈 microcapsules (그림 1B) 얻을 수 있습니다. 이 기술에 의해 조작 하는 microcapsules는 일반적으로 비-유니폼, 입자 크기와 각 일괄 처리 (그림 1С) 독특한 중간 크기의 정규 분포.

Figure 1
그림 1 : 레이어, 레이어 합성 및 빈 전해질 microcapsules의 형광 염료와 로드. (A) (Gurkov 외. 20164출판 비슷한 스키마에서 얻을) microcapsules 어셈블리의 계획. (B) 빈 microcapsules의 그림은 형광 염료 FITC BSA와 로드. (C) 그림 1B에서 microcapsules의 배치의 크기. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 

작은 물고기의 순환 시스템에 강력 하 고 효율적인 microparticle 이식 물고기 신장에 직접 수동 주입 하 여 수행할 수 있습니다. 물고기 몸 (트렁크 신장)의 적절 한 사이트에 빵 꾸 미 수동 주입의 신속한 배달을 위해 결정적 이다. 생선 신장은 조 혈 기관 이다 안료 melanophores를 포함 하 고 따라서, 그것은 잘 착 색. 그것은 수영 방광의 투명 한 챔버 사이 자리 잡고, 때문에 약한 염색 또는 그림 2A 와 2B와 같이 하단 광원을 사용 하 여 작은 물고기의 transillumination에 의해 그대로 동물에서 기관 식별 하기 쉽습니다.

Figure 2
그림 2 : 신장 주입에 대 한 적절 한 사이트의 지역화. (A) 는 제 브라의 트랜스 조명 트렁크 신장 (화살표)의 지역화를 보여 줍니다. (B) 제도 적절 한 펑크 사이트를 식별 하는 방법을 보여 줍니다. 흰색 점선 물고기의 복 부 세그먼트의 측면 라인을 나타냅니다. 화살표는 펑크와 척추 쪽으로 주입의 적절 한 방향에 대 한 사이트를 나타냅니다. 수영 방광은 녹색 선으로 지정 됩니다. Zebrafish 신장 기관 및 몸 벽의 제거 다음의 (C) 시각화. 화살표의 트렁크 신장 중앙 부푼 것을 가리킵니다. (D) D. rerio 의 화살 조직학 섹션에서는 성인 물고기의 내부 장기의 일반 해부학 (H & E 얼룩). (E) 후부 추기경 정 맥의 루멘을 가리키는 화살표 (D)에서 축소는 물고기 신장 (점선)의 현미경 사진. 별표는 수영 방광을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

확인 하려면 주사 절차의 성공, 낮은 배율 (x10-20 목표)에 아가미의 급속 한 시각 검사 물고기 아가미 덮개 (그림 3A) 절단 후 여야 한다. 주입 위치에 남아 또는 신체 구멍 (그림 3B)으로 흘리 고 microcapsules의 대부분에도 불구 하 고 주사를 올바르게 수행 하는 경우 그것은의 아가미 모세 혈관에 자유롭게 떠 형광 microcapsules를 관찰 하는 (그림 3C) 주사 후 즉시 denuded 물고기 아가미. 경우 없는 형광 입자는 아가미, 동일한 찔린에 주입을 반복 가능 하다. 혈 류 배달 총 주입 된 물고기의 약 70-90%에서 얻을 수 한다.

Figure 3
그림 3 : 길 모 세관에서 추가 시각화와 microcapsules의 신장 주입. (A) zebrafish 류에 microcapsule 배달의 전체 체계. (B) 녹색 FITC BSA 염료 (펑크 사이트는 화살표로 표시 됩니다)와 microcapsules의 주입 후 zebrafish의 형광 이미지. (C) (B)에서 축소 하는 물고기의 아가미의이 그림 신장 주입에 의해 microcapsules의 성공적인 납품을 보여줍니다 (야생-타입 zebrafish의 아가미가 없는 autofluorescence). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 

물고기 트렁크 신장에 직접 주입 하는 동안 광범위 한 일반적으로 멍이 형성 펑크 사이트 아래 나타내는 실질 모세 혈관에 신장 혈관 손상. 신속 하 게 계약 하는 빵 꾸 때문에 몸에서 혈액 누설이 있다. 내부 출혈에 불구 하 고 개인 약 80-90% (표 1) 절차를 통해 살아남은 여전히 복구할 수 있습니다. 그것은 또한 어 종 부상13,14후 nephrons 드 노 보 를 재생할 수 있습니다 알려져. 경우 물고기의 20% 이상이 죽어가 고 있다, 하나는 anesthetization 제대로 수행 되도록 확인 해야 합니다.

캡슐화 된 형광 염료 n 농도, µ L 당 microcapsules 사출 볼륨, µ L Microcapsules µ m의 평균 직경 생선 류에 배달 % 주입 후 사망률 %
1 h 1 일
트렁크 신장에 주입
FITC BSA 36 4 x 106 1.6 2.7 94 8 3
SNARF-1-dextran 29 3-6 10 x5 1-2 5.1 72 7 12
RITC dextran 20 6 x 106 2 2.0 70 0 0
0.9 %NaCl 41 - 1-2 - - 5 0
레트로 궤도 주입
FITC BSA 9 1 x 105 2 4.2 11 22 0
RITC dextran 11 6 x 106 1 2.0 9 18 0

표 1입니다. Zebrafish 혈 류로 microcapsules의 납품의 안전 그리고 효율성. 절차의 성공 물고기 아가미 모세 혈관에 형광 물질의 존재에 의해 결정 됩니다.

주입 된 미의 농도가 부족 한 경우, 몇 가지 입자 물고기 아가미에 급속 하 게 구상 될 수 있을 수 있습니다. 같은 시간에 너무 높은 농도 가진 서 스 펜 션 바늘을 막힐 수 있습니다. 평균 직경 2 ~ 5 µ m와 레이어, 레이어 조립된 microcapsules, 경우 µ L 당 약 4 * 105-6 * 106 microcapsules의 농도 물고기 신장 (테이블에 삽입 후 어려움 없이 검출 물고기 아가미에 최적 2).

농도, µ L 당 microcapsules 다른 개인의 아가미에 현미경 분야의 보기 (× 20 목표)에서 microcapsules의 수 (n = 7 농도 당)
4 x 106 > 100 > 100 0 > 100 ≈ 70 ≈ 50 > 100
4 x 105 ≈ 10 ≈ 20 0 0 ≈ 20 ≈ 40 ≈ 15
4 x 104 0 3 0 0 0 0 4
4 x 103 0 0 0 0 0 0 0

표 2입니다. FITC BSA 포함 된 microcapsules에서의 시각적 계산의 기록 D. rerio 후 아가미 주입 (1.6 µ L) 트렁크 신장으로.

물고기 순환 시스템으로 미 이식의 제안된 된 방법 microencapsulated 형광 프로브, SNARF-1 (그림 4)에 의해 vivo에서 zebrafish 혈액 pH의 모니터링에 대 한 적용할 수 있습니다. SNARF-1 (그림 4A) protonated 및 deprotonated 염료의 방출에 해당 하는 두 개의 봉우리는 스펙트럼, 따라서 미디어의 다른 pH에서 봉우리 사이의 비율의 곡선 수 교정 플롯 (그림 4B). 혈액의 구성 요소에 캡슐화 된 SNARF-1의 (그림 4B), microcapsules 및 유리 microelectrode와 pH-미터 혈액 pH의 동시 측정에 의해 실험적으로 평가 될 수 있는 판독 영향. Zebrafish 혈액에서 microcapsules에 대 한 상 상속 보정 곡선 계수 같은 실험적으로 측정 하는 pH 차이 의해 버퍼의 곡선을 이동 하 여 표시 한다 (Borvinskaya 외. 20175 에 대 한 자세한 내용은 참조).

Zebrafish 아가미 모세 혈관에서 혈액 pH microcapsules (그림 4C)의 주입 후 적어도 몇 시간 동안 안정적인 남아 있습니다. 같은 시간에 짧은 hypercapnic 노출 연구 vivo에서 작은 물고기에 대 한 방법의 적용을 보여 혈액 pH의 통계적으로 유의 한 감소에 지도 한다.

Figure 4
그림 4 : Zebrafish 혈액의 모니터링의 대표적인 예 Microencapsulated 염료 SNARF-1의 형광 스펙트럼의 등록에 의해 рН. (A) 준비 된 microcapsules의 스펙트럼 SNARF-1 다른 pH에서 나트륨 인산 염 버퍼에 로드합니다. 나트륨 인산 염 버퍼 및 추출 된 zebrafish 혈액 준비 pH에 민감한 microcapsules의 (B) 보정 곡선. 모든 측정, 평균 ± 표준 편차 그려져 있습니다. (C)는 vivo에서 모니터링 zebrafish 혈액 рН의 캡슐화 된 형광 SNARF 1 염료 zebrafish 아가미 모세 혈관에 의해의 대표적인 예입니다. 제어 조건에서 혈액 산도 5 분 노출 심한 hypercapnia (녹은 CO2의 900-1000 mg/L)에서 발생 물고기 혈액의 산성화 동안 microcapsules, 주사 후 4 시간 동안 안정 남아 있습니다. 별표 p < 0.01 (맨-휘트니 U 테스트)와 병렬 제어 그룹에서 통계적으로 유의 한 차이 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

Zebrafish 신장으로 미의 주입을 보여 우리 반 투과성 microcapsules 지시자 염료와 로드를 사용 합니다. 따라서, 프로토콜 반대로 충전된 polyelectrolytes7,8,,1516,17의 레이어, 레이어 어셈블리를 사용 하 여 microcapsules의 제조에 대 한 지침을 포함 ,18 (그림 1A). 이 기술의 장점은 사용 가능한 실험실 장비로 수행 하기 쉽습니다. 조건 및 화합물 사용에 따라 조작된 microcapsules 0.5에서 나노미터 두께 전해질 셸15100 µ m 까지입니다. 합성 매개 변수 크기 (그림 1B 및 1 C)에 약 2-6 µ m이 원고 중합체의 (뿐만 아니라 최종 생체 레이어) 12 층으로 구성 된 탄력 있는 microcapsules에에서 설명 합니다. microcapsules의 크기를 결정 하는 가장 중요 한 단계 서식 파일 microcores의 형성 이다. 이 프로세스 포함 한다 탄산 칼슘 결정의 자발적인 형성 되며 따라서, 얻은 입자 균일 하지 않은. 따라서, 모든 일괄 처리에 대 한 microcapsule 크기 분포의 특성화를 수행 되어야 한다.

이 프로토콜의 중요 한 단계는 micromanipulation 기술의 사용 없이 zebrafish 순환 시스템으로 미의 납품의 최적화 이다. 레트로 궤도 주입 하 여 전체 셀의 세부 사항3에 이전 설명 하고있다. 그러나, 우리의 경험에, 그것 쉽지 않다 복고 궤도 구멍은 매우 작고 인 두와 아가미 아치, 실수로 바늘으로 손상 하기 쉬운 위치 때문에 작가 의해 설명 된 주입 효율을 얻기 위해 초보 사용자를 위한. 밀리미터 미만부터 정확도 필요 주사, 제대로 주입 다소 어려운 작업입니다. 동등 하 게 신속 하 고 효율적 대안 (표 1) 물고기 신장 실질에 직접 주입 하는 것입니다. 주입, 동안 바늘 기계적 손해 신장 모세 혈관과 혈관 (예를 들어, 최대 후부 추기경 정 맥), 순환 시스템 (그림 2E)으로 미의 입구를 수 있습니다. 마지막으로, 성인 zebrafish에 트렁크 신장의 중앙 급등이 큰 만큼 (최대 2 m m) microsurgical 장비 없이 수동 분사에 대 한.

주사 바늘의 적절 한 위치 하는 것이 성공적인 수동 관리에 대 한 중요 합니다. Transilluminating 물고기 그림 2A 와 2B와 같이 아래 빛을 사용 하 여 트렁크 신장 그대로 동물에 찾는 연습할 수 있습니다. 그림 2B 에서 구성표에서는 주사를 제대로 수행 하는 방법을 보여 줍니다. 혈 류로 미를 관리 하는 절차 못하면 다시 주입 개인의 생존 율에 거의 아무런 영향 짧은 시간 내 같은 펑크에서 만들 수 있습니다.

(테스트도 성공적으로 성인 붕어 Poecilia reticulata에) 성인 zebrafish의 트렁크 신장에 주입 허용 동물 사망률;과 생선 류에 microparticle 배달의 효과적인 방법입니다. 그러나, 주입 된 볼륨에 있는 변이 때문에 약국에 대 한 완벽 하 게 적당 하다. 이 방법의 약점은 빠른 관리 때문에 복 부에 신장에서 솔루션의 중요 한 누설. 그럼에도 불구 하 고, 혈 류 량으로 주입 하는 물질의 상대적 양은 수 될 대략 추정 아가미 모세 혈관 (표 2)의 시각화를 사용 하 여. 사출 볼륨의 엄격한 제한은 없습니다 하지만 정지 이상 1 µ L의 효과적인 것 같습니다. 최고의 유리 모 세관 microinjection;에 대 한 적용 될 수 있습니다. 그러나, microcapsules의 많은 집계 선동 경향이 있기 때문에 31-29 G의 사용 권장 (Ø 0.33-0.25 m m) 강철 바늘을 바늘 루멘에 나 막 신을 피하기 위해.

신장 혈 류 량으로 주사를 통해 microcapsule 배달의 성공 아가미에 형광 입자의 존재에 대 한 빠른 검사를 사용 하 여 모니터링 해야 합니다. 아가미는 vivo에서 관측을 위해 쉽게 접근할 수 있는 기관 이다. 길 필은 혈액 모 세관 혈액의 흐름 intravital 이미징 아가미에 특히 편리 하 게 호흡기 상피의 얇은 층에 의해 보호 (자연 광학 창의 일종)의 네트워크. 관측을 수행 하려면 연골 아가미 덮개는 필 라 멘 트 폭로 잘릴 수 있다. 이 절차는 수명 감소 없이 잘 화난된 물 denuded 아가미 살 수 있는 물고기에 대 한 안전. 또한, 큰 물고기의 아가미 방법19에서 operculum 추진 하면 현미경으로 시험 될 수 있다. 성공적인 주입의 경우 형광 미 즉시 아가미 (그림 3)에 나타납니다. Note는 이식된 미는 순환 혈액 볼륨에 상당히 녹아 있는 그리고 입자는 아가미 모세 혈관에 도달, 따라서 미의 충분 한 농도 검출 후 물고기 아가미에 선택 해야 합니다 물고기 신장 (표 2)으로 하는 주입

이식에 대 한 제안된 절차는 작은 물고기의 다른 종의 관련 연구의 넓은 범위에 적용할 수 있습니다. 기술을 개발 하 고 순환 시스템으로 형광 미의 주입을 위해 최적화 된 데에 불구 하 고 그것은 비 색 마이크로/나노 입자의 주입에 대 한 적용할 수 있습니다 또는 해산 물질; 그러나,이 경우 주입의 효과 다른 방법으로 확인 되어야 한다. 현재 기술된 단계는 이러한 목적에 대 한 최적의 사용 하 여 다른 광학 마이크로-또는 nanosensors, 맥 관 구조의 시각화, 백신 이나 약물의 배달 일부 광학 표시 사업자의 주입으로 생리 적 모니터링 유전자 변형된 세포입니다.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgements

저자는 크게 비디오 프로토콜의 준비에 Bogdan Osadchiy 및 Evgenii Protasov (이르쿠츠크 주립 대학, 러시아)의 도움을 인정합니다. 이 연구는 기초 연구 (#15-29-01003)에 대 한 러시아 과학 재단 (#15-14-10008) 및 러시아 재단에 의해 지원 되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SNARF-1-dextran, 70000 MW Thermo Fisher Scientific D3304 Fluorescent probe. Any other appropriate polymer-bound fluorescent dye can be used as a microcapsule filler
Albumin-fluorescein isothiocyanate conjugate (FITC-BSA) SIGMA A9771 Fluorescent probe
Rhodamine B isothiocyanate-Dextran (RITC-dextran) SIGMA R9379 Fluorescent probe
Calcium chloride SIGMA C1016 CaCO3 templates formation
Sodium carbonate SIGMA S7795 CaCO3 templates formation
Poly(allylamine hydrochloride), MW 50000 (PAH) SIGMA 283215 Cationic polymer
Poly(sodium 4-styrenesulfonate), MW 70000 (PSS) SIGMA 243051 Anionic polymer
Poly-L-lysine [20 kDa] grafted with polyethylene glycol [5 kDa], g = 3.0 to 4.5 (PLL-g-PEG) SuSoS PLL(20)-g[3.5]-PEG(5) Final polymer to increase the biocompatibility of microcapsules
Sodium chloride SIGMA S8776 To dissolve applied polymers
Water Purification System Millipore SIMSV0000 To prepare deionized water
Magnetic stirrer Stegler For CaCO3 templates formation
Eppendorf Research plus pipette, 1000 µL Eppendorf Dosing solutions
Eppendorf Research plus pipette, 10 µL Eppendorf Dosing solutions
Pipette tips, volume range 200 to 1000 µL F.L. Medical 28093 Dosing solutions
Pipette tips, volume range 0.1-10 μL Eppendorf Z640069 Dosing solutions
Mini-centrifuge Microspin 12, High-speed BioSan For microcapsule centrifugation-washing procedure
Microcentrifuge tubes, 2 mL Eppendorf Z666513 Microcapsule synthesis and storage
Shaker Intelli-mixer RM-1L ELMY Ltd. To reduce microcapsule aggregation
Ultrasonic cleaner To reduce microcapsule aggregation
Head phones  To protect ears from ultrasound
Ethylenediaminetetraacetic acid SIGMA EDS To dissolve the CaCO3 templates
Monosodium phosphate SIGMA S9638 Preparation of pH buffers
Disodium phosphate SIGMA S9390 Preparation of pH buffers
Sodium hydroxide SIGMA S8045 To adjust the pH of the EDTA solution and buffers
Thermostat chamber To dry microcapsules on glass slide
Hemocytometer blood cell count chamber To investigate the size distribution and concentration of the prepared microcapsules
Fluorescent microscope Mikmed 2 LOMO In vivo visualization of microcapsules in fish blood
Set of fluorescent filters for SNARF-1 (should be chosen depending on the microscope model; example is provided) Chroma 79010 Visualization of microcapsules with fluorescent probes
Fiber spectrometer QE Pro Ocean Optics Calibration of microcapsules under microscope
Optical fiber QP400-2-VIS NIR, 400 μm, 2 m Ocean Optics To connect spectrometer with microscope port
Collimator F280SMA-A Thorlabs To connect spectrometer with microscope port
Glass microscope slide Fisherbrand 12-550-A3 Calibration of microcapsules under microscope
Coverslips, 22 x 22 mm Pearl MS-SLIDCV Calibration of microcapsules under microscope
Glass microcapillaries Intra MARK, 10 µL Blaubrand BR708709 To collect fish blood
Clove oil SIGMA C8392 Fish anesthesia
Lancet No 11 Apexmed international B.V. P00588 To cut the fish tail and release the steel needle from the tip of insulin autoinjector
Heparin, 5000 U/mL Calbiochem L6510-BC For treating all surfaces that come in contact with fish blood during fish blood collection
Seven 2 Go Pro pH-meter with a microelectrode Mettler Toledo To determine fish blood pH
Insulin pen needles Micro-Fine Plus, 0.25 x 5 mm Becton, Dickinson and Company For injection procedure. Any thin needle (Ø 0.33 mm or less) is appropriate
Glass capillaries, 1 x 75 mm Hirschmann Laborgeräte GmbH & Co 9201075 For injection procedure
Gas torch To solder steel needle to glass capillary
Microinjector IM-9B NARISHIGE For precise dosing of microcapsules suspension
Petri dishes, 60 mm x 15 mm, polystyrene SIGMA P5481 For manipulations with fish under anesthesia
Plastic spoon For manipulations with fish under anesthesia
Damp sponge For manipulations with fish under anesthesia
Dissection scissors Thermo Scientific 31212 To remove the gill cover from the fish head
Pasteur pipette, 3.5 mL BRAND Z331767 To moisten fish gills

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References

  1. Rivas-Aravena, A., Sandino, A. M., Spencer, E. Nanoparticles and microparticles of polymers and polysaccharides to administer fish vaccines. Biol. Res. 46, (4), 407-419 (2013).
  2. Yashchenok, A. M., Jose, J., Trochet, P., Sukhorukov, G. B., Gorin, D. A. Multifunctional polyelectrolyte microcapsules as a contrast agent for photoacoustic imaging in blood. J. Biophotonics. 9, (8), 792-799 (2016).
  3. Pugach, E. K., Li, P., White, R., Zon, L. Retro-orbital injection in adult zebrafish. J. Vis. Exp. (34), e1645 (2009).
  4. Gurkov, A., Shchapova, Е, Bedulina, D., Baduev, B., Borvinskaya, E., Timofeyev, M. Remote in vivo stress assessment of aquatic animals with microencapsulated biomarkers for environmental monitoring. Sci. Rep. 6, e36427 (2016).
  5. Borvinskaya, E., Gurkov, A., Shchapova, E., Baduev, B., Shatilina, Z., Sadovoy, A., et al. Parallel in vivo monitoring of pH in gill capillaries and muscles of fishes using microencapsulated biomarkers. Biol. Open. 6, (5), 673-677 (2017).
  6. Diep, C. Q., Davidson, A. J. Transplantation of cells directly into the kidney of adult zebrafish. J. Vis. Exp. (51), e2725 (2011).
  7. Kreft, O., Javier, A. M., Sukhorukov, G. B., Parak, W. J. Polymer microcapsules as mobile local pH-sensors. J. Mater. Chem. 17, (42), 4471-4476 (2007).
  8. Sadovoy, A., Teh, C., Korzh, V., Escobar, M., Meglinski, I. Microencapsulated bio-markers for assessment of stress conditions in aquatic organisms in vivo. Laser Phys. Lett. 9, (7), 542-546 (2012).
  9. Ferreira, T., Rasband, W. S. ImageJ User Guide - Version 1.44. imagej.nih.gov/ij/docs/guide/ (2012).
  10. Poland, R. S., Bull, C., Syed, W. A., Bowers, M. S. Rodent brain microinjection to study molecular substrates of motivated behavior. J. Vis. Exp. (103), e53018 (2015).
  11. Liu, L., Duff, K. A technique for serial collection of cerebrospinal fluid from the cisterna magna in mouse. J. Vis. Exp. (21), e960 (2008).
  12. Johnston, L., Ball, R. E., Acuff, S., Gaudet, J., Sornborger, A., Lauderdale, J. D. Electrophysiological recording in the brain of intact adult zebrafish. J. Vis. Exp. (81), e51065 (2013).
  13. Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A. Dissection of the adult zebrafish kidney. J. Vis. Exp. (54), e2839 (2011).
  14. McKee, R. A., Wingert, R. A. Zebrafish renal pathology: Emerging models of acute kidney injury. Curr Pathobiol Rep. 3, (2), 171-181 (2015).
  15. Donath, E., Sukhorukov, G. B., Caruso, F., Davi, S. A., Möhwald, H. Novel hollow polymer shells by colloid-templated assembly of polyelectrolytes. Angew. Chem. Int. Ed. 37, (17), 2201-2205 (1998).
  16. Antipov, A. A., Shchukin, D., Fedutik, Y., Petrov, A. I., Sukhorukov, G. B., Möhwald, H. Carbonate microparticles for hollow polyelectrolyte capsules fabrication. Colloids Surf. A. 224, 175-183 (2003).
  17. Gaponik, N., Radtchenko, I. L., Gerstenberger, M. R., Fedutik, Y. A., Sukhorukov, G. B., Rogach, A. L. Labeling of biocompatible polymer microcapsules with near-infrared emitting nanocrystals. Nano Lett. 3, (3), 369-372 (2003).
  18. Volodkin, D. V., Larionova, N. I., Sukhorukov, G. B. Protein encapsulation via porous CaCO3 microparticles templating. Biomacromolecules. 5, (5), 1962-1972 (2004).
  19. Tzaneva, V., Perry, S. F. A Time differential staining technique coupled with full bilateral gill denervation to study ionocytes in fish. J. Vis. Exp. (97), e52548 (2015).

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