간단 하 고 효과적인 관리 및 신장 주입을 사용 하 여 작은 물고기의 순환 시스템에 미의 시각화
Summary
이 문서에서는 빠르고, 최소 침 습으로 주사를 형광 미의 작은 물고기의 circulatory system 및 물고기의 혈액에 미의 비보에 시각화의 원칙을 보여 줍니다.
Abstract
맥 관 구조 시각화, 약물 및 백신 납품, 작은 광학 센서 및 유전자 변형 세포의 이식에 대 한 살아있는 유기 체에 마이크로 크기 입자의 체계적 관리를 적용할 수 있습니다. 그러나, 생물 및 동물 실험실에서 주로 사용 되는 작은 동물에 정 맥 microinjections 매우 어려운 고 숙련 된 직원을 필요. 여기, 물고기 신장에 주입 하 여 성인 zebrafish (Danio rerio)의 순환 시스템에 미의 도입에 대 한 강력 하 고 효율적인 방법을 설명합니다. 시각화는 맥 관 구조에 소개 된 미, 하 우리는 물고기 아가미에 간단한 intravital 이미징 기술을 제안 합니다. 주입 된 microencapsulated 형광을 사용 하 여 달성 되었다 vivo에서 zebrafish 혈액 pH의 모니터링 조사, SNARF-1, 설명 기술의 가능한 응용 프로그램 중 하나를 보여 줍니다. 이 문서는 pH에 민감한 염료의 캡슐화에 대 한 자세한 설명을 제공 하 고 빠른 주사의 원리와 형광 신호의 비보에 기록에 대 한 취득된 microcapsules의 시각화를 보여 줍니다. 주입의 제안된 방법 낮은 사망률에 의해 특징입니다 (0-20%)와 높은 효율 (70-90% 성공), 그리고 그것을 일반적으로 사용 가능한 장비를 사용 하 여 쉽습니다. 관 상용 열대어와 메 다카 같은 다른 작은 물고기 종에 모든 설명 된 절차를 수행할 수 있습니다.
Introduction
동물 유기 체에 마이크로 크기 입자의 관리 약물 및 백신 납품1, 맥 관 구조 시각화2, 유전자 변형 세포 이식3및 작은 광학 센서 이식 등의 분야에서 중요 한 작업입니다. 4 , 그러나 5., 작은 실험실 동물의 혈관 시스템으로 미 입자에 대 한 주입 절차는 어려운, 특히 섬세 한 수생 생물에 대 한. Zebrafish 같은 인기 있는 연구 표본에 대 한 조언 비디오 프로토콜을 사용 하 여 명백 하 게이 프로시저를.
Intracardiac 및 모 세관 microinjections zebrafish 혈액으로 microobjects의 납품을 위한 훈련 된 인력과 독특한 미세 시설 필요. 이전, 역 궤도 수동 주입3 전체 셀의 관리에 대 한 간단 하 고 효과적인 방법으로 제안 했다. 그러나, 우리의 경험에 눈 모 세관 네트워크의 작은 지역 때문에 걸리는이 기술에서 원하는 결과 달성 하기 위해 많은 연습.
여기, 우리 기술 순환 시스템으로 강력 하 고 효율적인 microparticle 이식 하는 방법 성인 zebrafish의 신장 조직에 직접 수동 주입는 모세 혈관과 신장 혈관이 풍부 하다. 이 기술은 세포 이식 zebrafish 신장6에 대 한 비디오 프로토콜에 기반 하지만 외상 및 시간이 걸리는 microsurgical 단계 탈락 했다. 제안된 된 방법 낮은 사망률에 의해 특징입니다 (0-20%)와 높은 효율 (70-90% 성공), 그리고 그것을 일반적으로 사용 가능한 장비를 사용 하 여 쉽습니다.
제안 된 프로토콜의 중요 한 부분이 이다는 이식된 미 (해당 되는 경우에 그들은 형광 또는 colorized) 아가미 모세 혈관에 주입 품질, 수의 거친 상대 평가의 확인에 대 한 수의 시각화 주입 된 입자, 그리고 순환 혈액에서 직접 생리 측정 스펙트럼 신호 감지. Vivo에서 zebrafish 혈액 pH microencapsulated 형광 프로브, SNARF-1, 원래에 제안 된 Borvinskaya를 사용 하 여의 측정을 위한 프로토콜 설명 설명된 기술의 가능한 응용 프로그램의 예를 들어, 외. 20175.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zebrafish 신장으로 미의 주입을 보여 우리 반 투과성 microcapsules 지시자 염료와 로드를 사용 합니다. 따라서, 프로토콜 반대로 충전된 polyelectrolytes7,8,,1516,17의 레이어, 레이어 어셈블리를 사용 하 여 microcapsules의 제조에 대 한 지침을 포함 ,18 (<strong cla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 크게 비디오 프로토콜의 준비에 Bogdan Osadchiy 및 Evgenii Protasov (이르쿠츠크 주립 대학, 러시아)의 도움을 인정합니다. 이 연구는 기초 연구 (#15-29-01003)에 대 한 러시아 과학 재단 (#15-14-10008) 및 러시아 재단에 의해 지원 되었다.
Materials
| SNARF-1-dextran, 70000 MW | Thermo Fisher Scientific | D3304 | Fluorescent probe. Any other appropriate polymer-bound fluorescent dye can be used as a microcapsule filler |
| Albumin-fluorescein isothiocyanate conjugate (FITC-BSA) | SIGMA | A9771 | Fluorescent probe |
| Rhodamine B isothiocyanate-Dextran (RITC-dextran) | SIGMA | R9379 | Fluorescent probe |
| Calcium chloride | SIGMA | C1016 | CaCO3 templates formation |
| Sodium carbonate | SIGMA | S7795 | CaCO3 templates formation |
| Poly(allylamine hydrochloride), MW 50000 (PAH) | SIGMA | 283215 | Cationic polymer |
| Poly(sodium 4-styrenesulfonate), MW 70000 (PSS) | SIGMA | 243051 | Anionic polymer |
| Poly-L-lysine [20 kDa] grafted with polyethylene glycol [5 kDa], g = 3.0 to 4.5 (PLL-g-PEG) | SuSoS | PLL(20)-g[3.5]-PEG(5) | Final polymer to increase the biocompatibility of microcapsules |
| Sodium chloride | SIGMA | S8776 | To dissolve applied polymers |
| Water Purification System | Millipore | SIMSV0000 | To prepare deionized water |
| Magnetic stirrer | Stegler | For CaCO3 templates formation | |
| Eppendorf Research plus pipette, 1000 µL | Eppendorf | Dosing solutions | |
| Eppendorf Research plus pipette, 10 µL | Eppendorf | Dosing solutions | |
| Pipette tips, volume range 200 to 1000 µL | F.L. Medical | 28093 | Dosing solutions |
| Pipette tips, volume range 0.1-10 μL | Eppendorf | Z640069 | Dosing solutions |
| Mini-centrifuge Microspin 12, High-speed | BioSan | For microcapsule centrifugation-washing procedure | |
| Microcentrifuge tubes, 2 mL | Eppendorf | Z666513 | Microcapsule synthesis and storage |
| Shaker Intelli-mixer RM-1L | ELMY Ltd. | To reduce microcapsule aggregation | |
| Ultrasonic cleaner | To reduce microcapsule aggregation | ||
| Head phones | To protect ears from ultrasound | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid | SIGMA | EDS | To dissolve the CaCO3 templates |
| Monosodium phosphate | SIGMA | S9638 | Preparation of pH buffers |
| Disodium phosphate | SIGMA | S9390 | Preparation of pH buffers |
| Sodium hydroxide | SIGMA | S8045 | To adjust the pH of the EDTA solution and buffers |
| Thermostat chamber | To dry microcapsules on glass slide | ||
| Hemocytometer blood cell count chamber | To investigate the size distribution and concentration of the prepared microcapsules | ||
| Fluorescent microscope Mikmed 2 | LOMO | In vivo visualization of microcapsules in fish blood | |
| Set of fluorescent filters for SNARF-1 (should be chosen depending on the microscope model; example is provided) | Chroma | 79010 | Visualization of microcapsules with fluorescent probes |
| Fiber spectrometer QE Pro | Ocean Optics | Calibration of microcapsules under microscope | |
| Optical fiber QP400-2-VIS NIR, 400 μm, 2 m | Ocean Optics | To connect spectrometer with microscope port | |
| Collimator F280SMA-A | Thorlabs | To connect spectrometer with microscope port | |
| Glass microscope slide | Fisherbrand | 12-550-A3 | Calibration of microcapsules under microscope |
| Coverslips, 22 x 22 mm | Pearl | MS-SLIDCV | Calibration of microcapsules under microscope |
| Glass microcapillaries Intra MARK, 10 µL | Blaubrand | BR708709 | To collect fish blood |
| Clove oil | SIGMA | C8392 | Fish anesthesia |
| Lancet No 11 | Apexmed international B.V. | P00588 | To cut the fish tail and release the steel needle from the tip of insulin autoinjector |
| Heparin, 5000 U/mL | Calbiochem | L6510-BC | For treating all surfaces that come in contact with fish blood during fish blood collection |
| Seven 2 Go Pro pH-meter with a microelectrode | Mettler Toledo | To determine fish blood pH | |
| Insulin pen needles Micro-Fine Plus, 0.25 x 5 mm | Becton, Dickinson and Company | For injection procedure. Any thin needle (Ø 0.33 mm or less) is appropriate | |
| Glass capillaries, 1 x 75 mm | Hirschmann Laborgeräte GmbH & Co | 9201075 | For injection procedure |
| Gas torch | To solder steel needle to glass capillary | ||
| Microinjector IM-9B | NARISHIGE | For precise dosing of microcapsules suspension | |
| Petri dishes, 60 mm x 15 mm, polystyrene | SIGMA | P5481 | For manipulations with fish under anesthesia |
| Plastic spoon | For manipulations with fish under anesthesia | ||
| Damp sponge | For manipulations with fish under anesthesia | ||
| Dissection scissors | Thermo Scientific | 31212 | To remove the gill cover from the fish head |
| Pasteur pipette, 3.5 mL | BRAND | Z331767 | To moisten fish gills |
References
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