Summary
이 문서에서는 빠르고, 최소 침 습으로 주사를 형광 미의 작은 물고기의 circulatory system 및 물고기의 혈액에 미의 비보에 시각화의 원칙을 보여 줍니다.
Abstract
맥 관 구조 시각화, 약물 및 백신 납품, 작은 광학 센서 및 유전자 변형 세포의 이식에 대 한 살아있는 유기 체에 마이크로 크기 입자의 체계적 관리를 적용할 수 있습니다. 그러나, 생물 및 동물 실험실에서 주로 사용 되는 작은 동물에 정 맥 microinjections 매우 어려운 고 숙련 된 직원을 필요. 여기, 물고기 신장에 주입 하 여 성인 zebrafish (Danio rerio)의 순환 시스템에 미의 도입에 대 한 강력 하 고 효율적인 방법을 설명합니다. 시각화는 맥 관 구조에 소개 된 미, 하 우리는 물고기 아가미에 간단한 intravital 이미징 기술을 제안 합니다. 주입 된 microencapsulated 형광을 사용 하 여 달성 되었다 vivo에서 zebrafish 혈액 pH의 모니터링 조사, SNARF-1, 설명 기술의 가능한 응용 프로그램 중 하나를 보여 줍니다. 이 문서는 pH에 민감한 염료의 캡슐화에 대 한 자세한 설명을 제공 하 고 빠른 주사의 원리와 형광 신호의 비보에 기록에 대 한 취득된 microcapsules의 시각화를 보여 줍니다. 주입의 제안된 방법 낮은 사망률에 의해 특징입니다 (0-20%)와 높은 효율 (70-90% 성공), 그리고 그것을 일반적으로 사용 가능한 장비를 사용 하 여 쉽습니다. 관 상용 열대어와 메 다카 같은 다른 작은 물고기 종에 모든 설명 된 절차를 수행할 수 있습니다.
Introduction
동물 유기 체에 마이크로 크기 입자의 관리 약물 및 백신 납품1, 맥 관 구조 시각화2, 유전자 변형 세포 이식3및 작은 광학 센서 이식 등의 분야에서 중요 한 작업입니다. 4 , 그러나 5., 작은 실험실 동물의 혈관 시스템으로 미 입자에 대 한 주입 절차는 어려운, 특히 섬세 한 수생 생물에 대 한. Zebrafish 같은 인기 있는 연구 표본에 대 한 조언 비디오 프로토콜을 사용 하 여 명백 하 게이 프로시저를.
Intracardiac 및 모 세관 microinjections zebrafish 혈액으로 microobjects의 납품을 위한 훈련 된 인력과 독특한 미세 시설 필요. 이전, 역 궤도 수동 주입3 전체 셀의 관리에 대 한 간단 하 고 효과적인 방법으로 제안 했다. 그러나, 우리의 경험에 눈 모 세관 네트워크의 작은 지역 때문에 걸리는이 기술에서 원하는 결과 달성 하기 위해 많은 연습.
여기, 우리 기술 순환 시스템으로 강력 하 고 효율적인 microparticle 이식 하는 방법 성인 zebrafish의 신장 조직에 직접 수동 주입는 모세 혈관과 신장 혈관이 풍부 하다. 이 기술은 세포 이식 zebrafish 신장6에 대 한 비디오 프로토콜에 기반 하지만 외상 및 시간이 걸리는 microsurgical 단계 탈락 했다. 제안된 된 방법 낮은 사망률에 의해 특징입니다 (0-20%)와 높은 효율 (70-90% 성공), 그리고 그것을 일반적으로 사용 가능한 장비를 사용 하 여 쉽습니다.
제안 된 프로토콜의 중요 한 부분이 이다는 이식된 미 (해당 되는 경우에 그들은 형광 또는 colorized) 아가미 모세 혈관에 주입 품질, 수의 거친 상대 평가의 확인에 대 한 수의 시각화 주입 된 입자, 그리고 순환 혈액에서 직접 생리 측정 스펙트럼 신호 감지. Vivo에서 zebrafish 혈액 pH microencapsulated 형광 프로브, SNARF-1, 원래에 제안 된 Borvinskaya를 사용 하 여의 측정을 위한 프로토콜 설명 설명된 기술의 가능한 응용 프로그램의 예를 들어, 외. 20175.
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Protocol
모든 실험 절차는 동물 실험에 대 한 EU 지침 2010/63/EU에 따라 실시 했다 하 고는 동물 주제 연구 위원회 연구소의 생물학의 이르쿠츠크 주립 대학에 의해 승인 되었습니다.
1입니다. Microcapsules의 제조
참고: Microcapsules 형광 염료를 들고 반대로 충전된 polyelectrolytes7,8의 레이어, 레이어 어셈블리를 사용 하 여 준비가 되어 있습니다. 모든 절차는 실 온에서 수행 했다.
- 형광 염료를 포함 하는 다공성 CaCO3 microcores 합성, 혼합 SNARF-1-dextran 솔루션 (FITC BSA 등 대부분 폴리머 바인딩된 형광 염료를 사용할 수 있습니다.)의 2 개 mL ~ 2 mg/mL의 농도에서 0.6 mL CaCl2의 1 mol/L 솔루션 와 나2CO3 빠른 교 아래.
참고: photobleaching;에 형광 염료의 다른 감도에 관심을 지불 (SNARF-1) 같은 빛에 민감한 형광 프로브를 사용 하는 경우는 미의 저장 하 고 조작 해야 합니다 수행할 수 가능한 작은 빛으로. - 동요의 5-10 s, 후 전송 현 탁 액 2 mL microcentrifuge 튜브와 15에 대 한 원심 분리기 CaCO3 microcores 펠 렛에 10000-12000 g에서 s.
- 삭제는 상쾌한, 이온된 수, ~ 2 mL와 코어를 세척 하 고 떨고 하 여 펠 릿을 resuspend.
- 세 번 총에에서 원심 분리 세척 절차를 반복 합니다. 마지막 원심 분리 후에 상쾌한을 삭제 합니다.
- 그들의 집계를 줄이기 위해 초음파 목욕에서 1 분 microcores를 품 어.
주의: 헤드폰으로 귀를 보호 하기 위해 잊지 마세요. - 서식 파일에서 첫 번째 폴리머 레이어를 입금, 1 mol/L NaCl에에서 poly(allylamine hydrochloride) (PAH)의 4 mg/mL 해결책의 ~ 2 mL에 코어를 resuspend.
- 일정 한 동요와 ~ 5 분에 대 한 솔루션에는 microcores를 유지.
- 15 후 원심 분리의 s 삭제 언바운드 PAH와 상쾌한. 3 번 이상 여러 원심 분리 및 세척 단계를 통해 이온을 제거 된 물으로 덮여 microcores 세척. 마지막 원심 분리 후에 상쾌한을 삭제 합니다.
- 그들의 집계를 줄이기 위해 초음파 목욕에서 1 분 microcores를 품 어.
참고: 폴 리 (나트륨 4-styrenesulfonate)에서 시작 하는 경우 적용 된 형광 성 염료는 양이온, (PSS) 1 mol/L NaCl에에서 (단계 1.7 참조).
- 서식 파일에 두 번째 폴리머 레이어를 입금 PSS (또한 1 mol/L NaCl을 포함 하는)의 4 mg/mL 해결책의 ~ 2 mL와 1.6 단계를 반복 합니다.
- 1.6 및 1.7 6 번 입금 12 폴리머 레이어를 단계를 반복 합니다.
참고: 권장 되지 않습니다 (~ 12 h 이상) 긴 휴식 ~ 3-5까지 절차에 레이어 입금 되었습니다 때문에 보험 없이 CaCO3 microcores recrystallize 하는 경향이 있습니다. Note PSS 범위는 microcores의 더 높은 집계 원인과 긴 일시 중지는 (PLL-g-PEG) outmost 레이어는 PAH 또는 폴 리-L-리 신 폴 리 에틸렌 글리콜으로 투입 하는 경우에 좋습니다. - 2 mg/ml PLL-g-말뚝 (microtube 당 ~ 1 mL) 적어도 2 시간에 대 한 커버 microcores를 품 어.
- Microcores 연속 원심 분리 및 물의 resuspension 단계를 통해 물으로 씻는 다. 마지막 원심 분리 후에 상쾌한을 삭제 합니다.
- 빈 microcapsules를 하려면 대상된 microcores를 사용 0.1 mol/L ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 솔루션 (NaOH로 pH 7.1 조정)의 2 개 mL를 추가 하 여 CaCO3 서식 파일을 분해.
- 외피의 ~ 5 분, 후 원심 45 s 및 삭제에 대 한 microcapsules EDTA와 상쾌한.
- 1.10 1.10.1 단계를 두 번 반복 합니다.
- 0.9 %NaCl 여러 원심 분리를 통해 세 번 45 내 단계 microcapsules 세척 세척 단계 뒤에 s. 원심 분리의 마지막 단계, 후에 상쾌한을 삭제 합니다.
참고: 주입에 대 한 최종 microcapsule 솔루션 유지 되어야 한다 살 균 (예를 들어 추가 하 여 암 피 실린, 0.1 mg/mL), 그리고 미디어 생체 조사 (isotonic 미디어 중립 ph) 대상이 되어야 합니다. - 형광 현미경 hemocytometer에 준비 된 microcapsules의 농도 견적 한다. microcapsules의 그림의 일련, 한 백 microcapsules ImageJ9 또는 해당 소프트웨어를 사용 하 여에 대 한의 직경을 측정 하 고 히스토그램을 사용 하 여 크기 분포를 조사.
- 저장소는 획득된 캡슐화 프로브 어둠 속에서.
참고: 살 균 0.9%에서 여러 빨 래 후 NaCl, microcapsules는 4 ° c.에 몇 달 동안 저장 될 수 있다 저장 동안에 microcapsules의 완전 한 건조 하는 것은 권장 하지 않습니다.
2. 준비의 광학 설치 및 Microencapsulated SNARF-1의 교정
참고: microencapsulated SNARF-1 거친 pH 측정 형광 현미경7의 두 채널의 이미지를 사용 하 여 만들 수 있습니다 하지만 섬유 분석기에 연결 된 한 개 채널 형광 현미경이이 프로토콜에 적용 했다.
- 필요한 일련의 형광 필터 적용 된 형광 염료의 특성에 따라 형광 현미경에 놓고 형광 램프를 켭니다.
- 접 안경에 레버를 당겨.
주의: 초과 빛 분석기 매트릭스를 손상 수 있습니다. 따라서, 레버는 "아이피" 모드는 분석기를 사용 하지 않을 있는지 확인 합니다. - 분석기와는 다른 쪽 끝을는 겨냥 틀을 광섬유의 한쪽 끝을 연결 합니다. 어댑터를 사용 하 여 카메라 튜브의 초점 또는 형광 현미경의 다른 사용 가능한 포트에는 겨냥 틀을 배치 합니다.
- 분석기를 켭니다. 분 광 계 제어 프로그램을 실행 하 고는 분석기 측정을 위한 준비.
- 접 안경에 레버를 당겨.
- Microcapsule 배치의 교정에 대 한 microcapsule 정지 (이온된 수 µ L 당 10 ~ 000 microcapsules)의 ~ 5 µ L 현미경 슬라이드에 놓고 건조 (35 ° C에서 온도)에서 예를 들어 어두운 장소에 드롭.
- Microencapsulated SNARF-1의 스펙트럼 특성을 보정 하려면 다른 pH 값 범위 ~ 6-9에에서 버퍼의 시리즈를 사용 합니다. ~ 10 µ L SNARF-1-dextran와 말린된 microcapsules에 버퍼를 삭제 하 고는 coverslip로 그것을 커버.
- 현미경 단계에 유리 슬라이드를 놓습니다. Microcapsules를 × 40 목표를 사용 하 여 찾습니다.
- 카메라 포트를 현미경 레버를 설정. 그들의 형광 분석기를 등록 합니다. 레버는 접 안 렌즈를 다시 설정 합니다.
참고: 배경 수준 보다 훨씬 스펙트럼 신호는 다는 것을 확인 하 고 보기의 필드에 microcapsules는 거품에서 (로 전환 하 여 낮은 확대 필요한 경우) 확인 합니다. 동일한 microcapsules의 장시간된 조명을 하지 마십시오. SNARF-1은 photobleaching에 민감합니다. - 10-15 회 다른 microcapsules에 대 한 단계 2.2.3을 반복 합니다.
- 모든 등록 된 스펙트럼에 대 한 형광 피크 비율 (예: R 또는 Scilab 사용)을 계산 하 고 회귀선 (각 버퍼)에 대 한 평균 비율 및 다음 수식을 사용 하 여 중간 pH 사이 결정:
참고: SNARF-1 스펙트럼 protonated 및 deprotonated 염료의 방출에 해당 하는 두 개의 봉우리 있으며 봉우리 사이의 비율 매체의 pH에 반응입니다. 이 연구에서 605, 660 nm의 형광 강도 사이 비율 사용 됩니다. 이 파장은 사용 하는 필터 설정에 따라 선택 됩니다. a 와 b 는 계수 비 선형 회귀 (예: R를 사용 하 여)에 의해 결정 됩니다. 0.15 및 1.1 값은, 각각,의 최소 및 최대 값 나605/I660 는 교정 중 관찰. - 약 5 성인 동물에서 물고기 혈액의 약 10 µ L를 수집 합니다. 장소 1 µ L/mL와 페 트리 접시에 마 취에 대 한 정 향 오일의 서 스 펜 션 물 생선과 동물의 측면에는 지 느 러 미의 pinches을 응답 하지 않습니다 때까지 기다렸다가 (보통 2 ~ 3 분). 유리 슬라이드에 물고기를 전송 합니다. 물고기 꼬리는 바소와에서 잘라내어 꼬리 정 맥에서 물고기 혈액의 약 2 µ L를 수집.
참고: 혈액 응고 방지 하기 위해, 헤 파 린 (5000 U/mL)와 절 개를 치료 하 고 heparinized 유리 모 세관 및 microcentrifuge 튜브를 사용 하 여 혈액을 수집.- microelectrode의 끝에 피 펫과 혈액의 약 10 µ L 똑 하 고 pH 미터를 사용 하 여 pH를 결정 합니다.
- 말린된 microcapsules와 함께 슬라이드에 혈액을 삭제 하 고 등록 교정 버퍼 (2.2-2.3 단계)에 대 한 설명으로 형광 강도의 비율.
- 곡선 (대 한 자세한 내용은 참조 Borvinskaya 외. 20175) 물고기 혈액 측정 일치 하도록 교정 곡선의 선형 계수를 조정 합니다.
3입니다. 주입에 대 한 준비
- 날카로운 바소와 플라스틱을 제거 하 여 인슐린 펜 (또는 주사기)의 끝에서 강철 바늘을 놓습니다.
참고: 모든 얇은 바늘 (Ø0.33 m m 또는 더 적은) 또는 유리 모 세관 (일반적으로 Ø1 m m) microinjection10,11준비 될 수 있다. - 유리 microcapillary; 중간 바늘 삽입 신속 하 고 부드럽게 솔더 가스 토치를 사용 하 여.
- 유리 microcapillary는 microinjector에 연결 하 고 세 번 살 균 물으로 플러시. 액체는 바늘에 흐르는 확인 하십시오.
- 증류수로 시스템을 채우십시오.
참고: 시스템에 있는 아무 거품 다는 것을 확인 하십시오.
4입니다. 주입
- Microcapsules의 준비 된 현 탁 액 resuspend (살 균 0.9 %NaCl에서, 또는 어떤 다른 매체 든 지에 사용 microliter 당 0.5 6 백만 microcapsules의 농도 주사) 1 분 동안 초음파 목욕을 사용 하 여.
참고: 다음 주입 동안 침전 하는 microcapsules 경향이 있기 때문에 동요는 microcapsules와 유리병 기계적으로 (로 터를 사용 하 여) 또는 수동으로 수 분 마다 그들을 resuspend 하 고 그들의 집계를 방지. - 장소 마 (정 향 오일 물에 0.1 mL/L)와 페 트리 접시에 물고기 2 ~ 3 분 대기 물고기의 측면에는 지 느 러 미의 빛 핀치에 응답 하지 않습니다 때까지.
- 숟가락을 사용 하 여, 마 취에서 생선을 전송 하 고 부드럽게 머리 (사람을 위해 오른 손잡이) 왼쪽으로 또는 오른쪽 (왼손잡이 사람)에 대 한 가로 위치에 젖은 스폰지에 두십시오.
- 주사의 바로 전에 1-2 m m 유리 모 세관으로 공기의 microinjector와 연결 된 빨 아. 그런 다음, 분산 된 microcapsules의 약 2 µ L와 함께 로드 됩니다.
참고: 주입, 전에 microcapsule 솔루션 물고기 지켜진다 온도를 조정할 수 합니다. - 부드럽게 비 지배적인 손 가진 스폰지에 물고기의 시체를 안정화 합니다.
- 물고기의 측면 라인을 찾아. 정신적으로 복 부 구멍의 끝에는 operculum에서 확장 하는 세그먼트를 선택 합니다. 이 세그먼트의 중간을 찾아. 더 낮은 복 부 방향으로 1 m m 바늘을 넣어.
- 된다고 운동, 생선 비늘, 고 펑크 부드럽게 이동 합니다. 테이블 표면에 45 °의 각도에서 본문에 바늘을 삽입 합니다.
- 그것은 신중 하 게 그것에 대하여 휴식 때까지 척추 쪽으로 바늘을 밀어.
- 신장에 microcapsules의 현 탁 액의 약 1 µ L를 놓고 천천히 바늘을 철회.
참고: 적절 한 바늘 사이트를 찾을 수 쉽게, 유용 그림 2A 와 2B와같이 아래 빛을 사용 하 여 물고기를 transilluminating 하 여 트렁크 신장을 찾는 연습을 합니다.
- 씻어 주사 사이트에서 유출된 된 microcapsules를 제거 하는 물 스트림 꼬리에 머리에서 물고기.
5. Vivo에서 시각화
- 해 부가 위를 사용 하 여 물고기 머리에서 아가미 덮개를 제거 하 고 물고기 아가미를 발가 벗기다. 린스 물으로 아가미.
- 숟가락을 사용 하 여, 현미경 슬라이드에 물고기를 전송 하 고 형광 현미경의 스테이지에 배치.
참고: 연속 절차 동안 물고기의 아가미를 건조 하지 않는 다는 것을 확인 하십시오. 이 방지 하려면 정기적으로 축 축 하 게 그들 파스퇴르 피 펫 (1-2 분 마다 약)를 사용 하 여 물으로. - 방을 어둡게 하 고 형광 microcapsules 데 아가미 검사 낮은 배율 (x 10의 목표)를 사용 하 여.
참고: 물고기 순환 시스템에 몇 가지 형광 입자의 도입에 대 한 절차를 사용 하는 경우이 좋습니다 주사 하기 전에 예기치 않은 형광 입자에 대 한 몇 가지 개인의 아가미를 검사. 야생-타입 zebrafish의 아가미 autofluorescence, 필요가 없습니다 하지만 경우에 따라 (같은 음식 조각 또는 단 세포 symbionts) 산발적 형광 입자 아가미에 수 있습니다. 경우 필요한, 이러한 입자 인식 될 수 있다 그들의 특정 모양에 따라 (예를 들어 음식 조각을 구형 microcapsules 달리 불규칙 한 모양) 또는 형광 스펙트럼 (즉, 색상).- 더 높은 크기 (× 40 목표), 렌즈를 전환 하 고 한 microcapsule 또는 microcapsules의 그룹 보기의 필드의 중앙에 위치 합니다.
- 연결된 분석기와 포트에 레버를 설정. 스펙트럼 신호를 기록 합니다.
- 레버는 접 안 렌즈를 다시 설정 합니다.
- 여러 번 다른 microcapsules에 대 한 측정을 반복 합니다.
- 복구에 대 한 적절 한 환기와 수족관에 물고기를 전송 합니다.
참고: 최소의 연습으로, 그것은 주입 및 물고기 마다 2-3 분의 대략적인 속도로 기록 하는 신호를 수행할 수 있습니다. 측정 반복된 낮은, 무해 한 복용량 마 취의 또는 고정의 또 다른 방법은 사용 하 여 하나의 개별 여러 번 반복할 수 있습니다. 장기 관찰에 대 한 지속적인 마 취12시스템을 사용 합니다.
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Representative Results
얻은 결과 제시 프로토콜의 세 가지 주요 범주 중 하나에서 온: 형광 염료 (그림 1)에 추가 시각화와 microcapsules의 신장 주입의 캡슐화에 의해 형광 미의 형성 모세 혈관 (그림 2 및 3) 아가미와, 마지막으로, vivo에서 스펙트럼의 녹음 SNARF 1 형광 모니터링 하 혈액 pH 수준 (그림 4).
반대로의 계층으로 염료를 포함 하는 템플릿 CaCO3 코어의 코팅을 사용 하 여 레이어, 레이어 접근 청구 (PAH와 PSS) 고분자 및 생체 고분자 (PLL-g-PEG)의 가장 바깥쪽 레이어는 간단 하 고 비용 효율적인 방법 SNARF-1-dextran, FITC BSA 등 다른 (그림 1A) 다른 형광 프로브를 캡슐화 하는 것을 허용. 그 결과, 안정적인 반 투과성 탄성 포탄 크기 및 형광 염료와 로드의 미세 빈 microcapsules (그림 1B) 얻을 수 있습니다. 이 기술에 의해 조작 하는 microcapsules는 일반적으로 비-유니폼, 입자 크기와 각 일괄 처리 (그림 1С) 독특한 중간 크기의 정규 분포.
그림 1 : 레이어, 레이어 합성 및 빈 전해질 microcapsules의 형광 염료와 로드. (A) (Gurkov 외. 20164출판 비슷한 스키마에서 얻을) microcapsules 어셈블리의 계획. (B) 빈 microcapsules의 그림은 형광 염료 FITC BSA와 로드. (C) 그림 1B에서 microcapsules의 배치의 크기. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
작은 물고기의 순환 시스템에 강력 하 고 효율적인 microparticle 이식 물고기 신장에 직접 수동 주입 하 여 수행할 수 있습니다. 물고기 몸 (트렁크 신장)의 적절 한 사이트에 빵 꾸 미 수동 주입의 신속한 배달을 위해 결정적 이다. 생선 신장은 조 혈 기관 이다 안료 melanophores를 포함 하 고 따라서, 그것은 잘 착 색. 그것은 수영 방광의 투명 한 챔버 사이 자리 잡고, 때문에 약한 염색 또는 그림 2A 와 2B와 같이 하단 광원을 사용 하 여 작은 물고기의 transillumination에 의해 그대로 동물에서 기관 식별 하기 쉽습니다.
그림 2 : 신장 주입에 대 한 적절 한 사이트의 지역화. (A) 는 제 브라의 트랜스 조명 트렁크 신장 (화살표)의 지역화를 보여 줍니다. (B) 제도 적절 한 펑크 사이트를 식별 하는 방법을 보여 줍니다. 흰색 점선 물고기의 복 부 세그먼트의 측면 라인을 나타냅니다. 화살표는 펑크와 척추 쪽으로 주입의 적절 한 방향에 대 한 사이트를 나타냅니다. 수영 방광은 녹색 선으로 지정 됩니다. Zebrafish 신장 기관 및 몸 벽의 제거 다음의 (C) 시각화. 화살표의 트렁크 신장 중앙 부푼 것을 가리킵니다. (D) D. rerio 의 화살 조직학 섹션에서는 성인 물고기의 내부 장기의 일반 해부학 (H & E 얼룩). (E) 후부 추기경 정 맥의 루멘을 가리키는 화살표 (D)에서 축소는 물고기 신장 (점선)의 현미경 사진. 별표는 수영 방광을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
확인 하려면 주사 절차의 성공, 낮은 배율 (x10-20 목표)에 아가미의 급속 한 시각 검사 물고기 아가미 덮개 (그림 3A) 절단 후 여야 한다. 주입 위치에 남아 또는 신체 구멍 (그림 3B)으로 흘리 고 microcapsules의 대부분에도 불구 하 고 주사를 올바르게 수행 하는 경우 그것은의 아가미 모세 혈관에 자유롭게 떠 형광 microcapsules를 관찰 하는 (그림 3C) 주사 후 즉시 denuded 물고기 아가미. 경우 없는 형광 입자는 아가미, 동일한 찔린에 주입을 반복 가능 하다. 혈 류 배달 총 주입 된 물고기의 약 70-90%에서 얻을 수 한다.
그림 3 : 길 모 세관에서 추가 시각화와 microcapsules의 신장 주입. (A) zebrafish 류에 microcapsule 배달의 전체 체계. (B) 녹색 FITC BSA 염료 (펑크 사이트는 화살표로 표시 됩니다)와 microcapsules의 주입 후 zebrafish의 형광 이미지. (C) (B)에서 축소 하는 물고기의 아가미의이 그림 신장 주입에 의해 microcapsules의 성공적인 납품을 보여줍니다 (야생-타입 zebrafish의 아가미가 없는 autofluorescence). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
물고기 트렁크 신장에 직접 주입 하는 동안 광범위 한 일반적으로 멍이 형성 펑크 사이트 아래 나타내는 실질 모세 혈관에 신장 혈관 손상. 신속 하 게 계약 하는 빵 꾸 때문에 몸에서 혈액 누설이 있다. 내부 출혈에 불구 하 고 개인 약 80-90% (표 1) 절차를 통해 살아남은 여전히 복구할 수 있습니다. 그것은 또한 어 종 부상13,14후 nephrons 드 노 보 를 재생할 수 있습니다 알려져. 경우 물고기의 20% 이상이 죽어가 고 있다, 하나는 anesthetization 제대로 수행 되도록 확인 해야 합니다.
| 캡슐화 된 형광 염료 | n | 농도, µ L 당 microcapsules | 사출 볼륨, µ L | Microcapsules µ m의 평균 직경 | 생선 류에 배달 % | 주입 후 사망률 % | |
| 1 h | 1 일 | ||||||
| 트렁크 신장에 주입 | |||||||
| FITC BSA | 36 | 4 x 106 | 1.6 | 2.7 | 94 | 8 | 3 |
| SNARF-1-dextran | 29 | 3-6 10 x5 | 1-2 | 5.1 | 72 | 7 | 12 |
| RITC dextran | 20 | 6 x 106 | 2 | 2.0 | 70 | 0 | 0 |
| 0.9 %NaCl | 41 | - | 1-2 | - | - | 5 | 0 |
| 레트로 궤도 주입 | |||||||
| FITC BSA | 9 | 1 x 105 | 2 | 4.2 | 11 | 22 | 0 |
| RITC dextran | 11 | 6 x 106 | 1 | 2.0 | 9 | 18 | 0 |
표 1입니다. Zebrafish 혈 류로 microcapsules의 납품의 안전 그리고 효율성. 절차의 성공 물고기 아가미 모세 혈관에 형광 물질의 존재에 의해 결정 됩니다.
주입 된 미의 농도가 부족 한 경우, 몇 가지 입자 물고기 아가미에 급속 하 게 구상 될 수 있을 수 있습니다. 같은 시간에 너무 높은 농도 가진 서 스 펜 션 바늘을 막힐 수 있습니다. 평균 직경 2 ~ 5 µ m와 레이어, 레이어 조립된 microcapsules, 경우 µ L 당 약 4 * 105-6 * 106 microcapsules의 농도 물고기 신장 (테이블에 삽입 후 어려움 없이 검출 물고기 아가미에 최적 2).
| 농도, µ L 당 microcapsules | 다른 개인의 아가미에 현미경 분야의 보기 (× 20 목표)에서 microcapsules의 수 (n = 7 농도 당) | ||||||
| 4 x 106 | > 100 | > 100 | 0 | > 100 | ≈ 70 | ≈ 50 | > 100 |
| 4 x 105 | ≈ 10 | ≈ 20 | 0 | 0 | ≈ 20 | ≈ 40 | ≈ 15 |
| 4 x 104 | 0 | 3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 4 |
| 4 x 103 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
표 2입니다. FITC BSA 포함 된 microcapsules에서의 시각적 계산의 기록 D. rerio 후 아가미 주입 (1.6 µ L) 트렁크 신장으로.
물고기 순환 시스템으로 미 이식의 제안된 된 방법 microencapsulated 형광 프로브, SNARF-1 (그림 4)에 의해 vivo에서 zebrafish 혈액 pH의 모니터링에 대 한 적용할 수 있습니다. SNARF-1 (그림 4A) protonated 및 deprotonated 염료의 방출에 해당 하는 두 개의 봉우리는 스펙트럼, 따라서 미디어의 다른 pH에서 봉우리 사이의 비율의 곡선 수 교정 플롯 (그림 4B). 혈액의 구성 요소에 캡슐화 된 SNARF-1의 (그림 4B), microcapsules 및 유리 microelectrode와 pH-미터 혈액 pH의 동시 측정에 의해 실험적으로 평가 될 수 있는 판독 영향. Zebrafish 혈액에서 microcapsules에 대 한 상 상속 보정 곡선 계수 같은 실험적으로 측정 하는 pH 차이 의해 버퍼의 곡선을 이동 하 여 표시 한다 (Borvinskaya 외. 20175 에 대 한 자세한 내용은 참조).
Zebrafish 아가미 모세 혈관에서 혈액 pH microcapsules (그림 4C)의 주입 후 적어도 몇 시간 동안 안정적인 남아 있습니다. 같은 시간에 짧은 hypercapnic 노출 연구 vivo에서 작은 물고기에 대 한 방법의 적용을 보여 혈액 pH의 통계적으로 유의 한 감소에 지도 한다.
그림 4 : Zebrafish 혈액의 모니터링의 대표적인 예 Microencapsulated 염료 SNARF-1의 형광 스펙트럼의 등록에 의해 рН. (A) 준비 된 microcapsules의 스펙트럼 SNARF-1 다른 pH에서 나트륨 인산 염 버퍼에 로드합니다. 나트륨 인산 염 버퍼 및 추출 된 zebrafish 혈액 준비 pH에 민감한 microcapsules의 (B) 보정 곡선. 모든 측정, 평균 ± 표준 편차 그려져 있습니다. (C)는 vivo에서 모니터링 zebrafish 혈액 рН의 캡슐화 된 형광 SNARF 1 염료 zebrafish 아가미 모세 혈관에 의해의 대표적인 예입니다. 제어 조건에서 혈액 산도 5 분 노출 심한 hypercapnia (녹은 CO2의 900-1000 mg/L)에서 발생 물고기 혈액의 산성화 동안 microcapsules, 주사 후 4 시간 동안 안정 남아 있습니다. 별표 p < 0.01 (맨-휘트니 U 테스트)와 병렬 제어 그룹에서 통계적으로 유의 한 차이 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
Zebrafish 신장으로 미의 주입을 보여 우리 반 투과성 microcapsules 지시자 염료와 로드를 사용 합니다. 따라서, 프로토콜 반대로 충전된 polyelectrolytes7,8,,1516,17의 레이어, 레이어 어셈블리를 사용 하 여 microcapsules의 제조에 대 한 지침을 포함 ,18 (그림 1A). 이 기술의 장점은 사용 가능한 실험실 장비로 수행 하기 쉽습니다. 조건 및 화합물 사용에 따라 조작된 microcapsules 0.5에서 나노미터 두께 전해질 셸15100 µ m 까지입니다. 합성 매개 변수 크기 (그림 1B 및 1 C)에 약 2-6 µ m이 원고 중합체의 (뿐만 아니라 최종 생체 레이어) 12 층으로 구성 된 탄력 있는 microcapsules에에서 설명 합니다. microcapsules의 크기를 결정 하는 가장 중요 한 단계 서식 파일 microcores의 형성 이다. 이 프로세스 포함 한다 탄산 칼슘 결정의 자발적인 형성 되며 따라서, 얻은 입자 균일 하지 않은. 따라서, 모든 일괄 처리에 대 한 microcapsule 크기 분포의 특성화를 수행 되어야 한다.
이 프로토콜의 중요 한 단계는 micromanipulation 기술의 사용 없이 zebrafish 순환 시스템으로 미의 납품의 최적화 이다. 레트로 궤도 주입 하 여 전체 셀의 세부 사항3에 이전 설명 하고있다. 그러나, 우리의 경험에, 그것 쉽지 않다 복고 궤도 구멍은 매우 작고 인 두와 아가미 아치, 실수로 바늘으로 손상 하기 쉬운 위치 때문에 작가 의해 설명 된 주입 효율을 얻기 위해 초보 사용자를 위한. 밀리미터 미만부터 정확도 필요 주사, 제대로 주입 다소 어려운 작업입니다. 동등 하 게 신속 하 고 효율적 대안 (표 1) 물고기 신장 실질에 직접 주입 하는 것입니다. 주입, 동안 바늘 기계적 손해 신장 모세 혈관과 혈관 (예를 들어, 최대 후부 추기경 정 맥), 순환 시스템 (그림 2E)으로 미의 입구를 수 있습니다. 마지막으로, 성인 zebrafish에 트렁크 신장의 중앙 급등이 큰 만큼 (최대 2 m m) microsurgical 장비 없이 수동 분사에 대 한.
주사 바늘의 적절 한 위치 하는 것이 성공적인 수동 관리에 대 한 중요 합니다. Transilluminating 물고기 그림 2A 와 2B와 같이 아래 빛을 사용 하 여 트렁크 신장 그대로 동물에 찾는 연습할 수 있습니다. 그림 2B 에서 구성표에서는 주사를 제대로 수행 하는 방법을 보여 줍니다. 혈 류로 미를 관리 하는 절차 못하면 다시 주입 개인의 생존 율에 거의 아무런 영향 짧은 시간 내 같은 펑크에서 만들 수 있습니다.
(테스트도 성공적으로 성인 붕어 Poecilia reticulata에) 성인 zebrafish의 트렁크 신장에 주입 허용 동물 사망률;과 생선 류에 microparticle 배달의 효과적인 방법입니다. 그러나, 주입 된 볼륨에 있는 변이 때문에 약국에 대 한 완벽 하 게 적당 하다. 이 방법의 약점은 빠른 관리 때문에 복 부에 신장에서 솔루션의 중요 한 누설. 그럼에도 불구 하 고, 혈 류 량으로 주입 하는 물질의 상대적 양은 수 될 대략 추정 아가미 모세 혈관 (표 2)의 시각화를 사용 하 여. 사출 볼륨의 엄격한 제한은 없습니다 하지만 정지 이상 1 µ L의 효과적인 것 같습니다. 최고의 유리 모 세관 microinjection;에 대 한 적용 될 수 있습니다. 그러나, microcapsules의 많은 집계 선동 경향이 있기 때문에 31-29 G의 사용 권장 (Ø 0.33-0.25 m m) 강철 바늘을 바늘 루멘에 나 막 신을 피하기 위해.
신장 혈 류 량으로 주사를 통해 microcapsule 배달의 성공 아가미에 형광 입자의 존재에 대 한 빠른 검사를 사용 하 여 모니터링 해야 합니다. 아가미는 vivo에서 관측을 위해 쉽게 접근할 수 있는 기관 이다. 길 필은 혈액 모 세관 혈액의 흐름 intravital 이미징 아가미에 특히 편리 하 게 호흡기 상피의 얇은 층에 의해 보호 (자연 광학 창의 일종)의 네트워크. 관측을 수행 하려면 연골 아가미 덮개는 필 라 멘 트 폭로 잘릴 수 있다. 이 절차는 수명 감소 없이 잘 화난된 물 denuded 아가미 살 수 있는 물고기에 대 한 안전. 또한, 큰 물고기의 아가미 방법19에서 operculum 추진 하면 현미경으로 시험 될 수 있다. 성공적인 주입의 경우 형광 미 즉시 아가미 (그림 3)에 나타납니다. Note는 이식된 미는 순환 혈액 볼륨에 상당히 녹아 있는 그리고 입자는 아가미 모세 혈관에 도달, 따라서 미의 충분 한 농도 검출 후 물고기 아가미에 선택 해야 합니다 물고기 신장 (표 2)으로 하는 주입
이식에 대 한 제안된 절차는 작은 물고기의 다른 종의 관련 연구의 넓은 범위에 적용할 수 있습니다. 기술을 개발 하 고 순환 시스템으로 형광 미의 주입을 위해 최적화 된 데에 불구 하 고 그것은 비 색 마이크로/나노 입자의 주입에 대 한 적용할 수 있습니다 또는 해산 물질; 그러나,이 경우 주입의 효과 다른 방법으로 확인 되어야 한다. 현재 기술된 단계는 이러한 목적에 대 한 최적의 사용 하 여 다른 광학 마이크로-또는 nanosensors, 맥 관 구조의 시각화, 백신 이나 약물의 배달 일부 광학 표시 사업자의 주입으로 생리 적 모니터링 유전자 변형된 세포입니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자는 크게 비디오 프로토콜의 준비에 Bogdan Osadchiy 및 Evgenii Protasov (이르쿠츠크 주립 대학, 러시아)의 도움을 인정합니다. 이 연구는 기초 연구 (#15-29-01003)에 대 한 러시아 과학 재단 (#15-14-10008) 및 러시아 재단에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SNARF-1-dextran, 70000 MW | Thermo Fisher Scientific | D3304 | Fluorescent probe. Any other appropriate polymer-bound fluorescent dye can be used as a microcapsule filler |
| Albumin-fluorescein isothiocyanate conjugate (FITC-BSA) | SIGMA | A9771 | Fluorescent probe |
| Rhodamine B isothiocyanate-Dextran (RITC-dextran) | SIGMA | R9379 | Fluorescent probe |
| Calcium chloride | SIGMA | C1016 | CaCO3 templates formation |
| Sodium carbonate | SIGMA | S7795 | CaCO3 templates formation |
| Poly(allylamine hydrochloride), MW 50000 (PAH) | SIGMA | 283215 | Cationic polymer |
| Poly(sodium 4-styrenesulfonate), MW 70000 (PSS) | SIGMA | 243051 | Anionic polymer |
| Poly-L-lysine [20 kDa] grafted with polyethylene glycol [5 kDa], g = 3.0 to 4.5 (PLL-g-PEG) | SuSoS | PLL(20)-g[3.5]-PEG(5) | Final polymer to increase the biocompatibility of microcapsules |
| Sodium chloride | SIGMA | S8776 | To dissolve applied polymers |
| Water Purification System | Millipore | SIMSV0000 | To prepare deionized water |
| Magnetic stirrer | Stegler | For CaCO3 templates formation | |
| Eppendorf Research plus pipette, 1000 µL | Eppendorf | Dosing solutions | |
| Eppendorf Research plus pipette, 10 µL | Eppendorf | Dosing solutions | |
| Pipette tips, volume range 200 to 1000 µL | F.L. Medical | 28093 | Dosing solutions |
| Pipette tips, volume range 0.1-10 μL | Eppendorf | Z640069 | Dosing solutions |
| Mini-centrifuge Microspin 12, High-speed | BioSan | For microcapsule centrifugation-washing procedure | |
| Microcentrifuge tubes, 2 mL | Eppendorf | Z666513 | Microcapsule synthesis and storage |
| Shaker Intelli-mixer RM-1L | ELMY Ltd. | To reduce microcapsule aggregation | |
| Ultrasonic cleaner | To reduce microcapsule aggregation | ||
| Head phones | To protect ears from ultrasound | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid | SIGMA | EDS | To dissolve the CaCO3 templates |
| Monosodium phosphate | SIGMA | S9638 | Preparation of pH buffers |
| Disodium phosphate | SIGMA | S9390 | Preparation of pH buffers |
| Sodium hydroxide | SIGMA | S8045 | To adjust the pH of the EDTA solution and buffers |
| Thermostat chamber | To dry microcapsules on glass slide | ||
| Hemocytometer blood cell count chamber | To investigate the size distribution and concentration of the prepared microcapsules | ||
| Fluorescent microscope Mikmed 2 | LOMO | In vivo visualization of microcapsules in fish blood | |
| Set of fluorescent filters for SNARF-1 (should be chosen depending on the microscope model; example is provided) | Chroma | 79010 | Visualization of microcapsules with fluorescent probes |
| Fiber spectrometer QE Pro | Ocean Optics | Calibration of microcapsules under microscope | |
| Optical fiber QP400-2-VIS NIR, 400 μm, 2 m | Ocean Optics | To connect spectrometer with microscope port | |
| Collimator F280SMA-A | Thorlabs | To connect spectrometer with microscope port | |
| Glass microscope slide | Fisherbrand | 12-550-A3 | Calibration of microcapsules under microscope |
| Coverslips, 22 x 22 mm | Pearl | MS-SLIDCV | Calibration of microcapsules under microscope |
| Glass microcapillaries Intra MARK, 10 µL | Blaubrand | BR708709 | To collect fish blood |
| Clove oil | SIGMA | C8392 | Fish anesthesia |
| Lancet No 11 | Apexmed international B.V. | P00588 | To cut the fish tail and release the steel needle from the tip of insulin autoinjector |
| Heparin, 5000 U/mL | Calbiochem | L6510-BC | For treating all surfaces that come in contact with fish blood during fish blood collection |
| Seven 2 Go Pro pH-meter with a microelectrode | Mettler Toledo | To determine fish blood pH | |
| Insulin pen needles Micro-Fine Plus, 0.25 x 5 mm | Becton, Dickinson and Company | For injection procedure. Any thin needle (Ø 0.33 mm or less) is appropriate | |
| Glass capillaries, 1 x 75 mm | Hirschmann Laborgeräte GmbH & Co | 9201075 | For injection procedure |
| Gas torch | To solder steel needle to glass capillary | ||
| Microinjector IM-9B | NARISHIGE | For precise dosing of microcapsules suspension | |
| Petri dishes, 60 mm x 15 mm, polystyrene | SIGMA | P5481 | For manipulations with fish under anesthesia |
| Plastic spoon | For manipulations with fish under anesthesia | ||
| Damp sponge | For manipulations with fish under anesthesia | ||
| Dissection scissors | Thermo Scientific | 31212 | To remove the gill cover from the fish head |
| Pasteur pipette, 3.5 mL | BRAND | Z331767 | To moisten fish gills |
References
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