نموذج حلقة معوية الواصلة في الدجاج الحرة تخديره الممرض محددة لدراسة كلوستريديوم بيرفرنجنز الفوعة

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

نقدم هنا بروتوكولا لإنشاء 'الحلقات الواصلة المعوية' جراحيا في الأمعاء الصغيرة الدجاج. يسمح هذا الإجراء للمقارنة بين سلالات كلوستريديوم بيرفرنجنز متعددة بضراوة في الموقع في مضيف واحد. ملحوظة هذا الأسلوب يقلل من عدد الدجاج اللازمة عادة لتجارب مماثلة في فيفو .

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Parent, E., Burns, P., Desrochers, A., Boulianne, M. A Ligated Intestinal Loop Model in Anesthetized Specific Pathogen Free Chickens to Study Clostridium Perfringens Virulence. J. Vis. Exp. (140), e57523, doi:10.3791/57523 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

ودرس الأمعاء نخرية في الدجاج باستخدام مختلف نماذج العدوى في الجسم الحي . ومعظم هذه استخدام مزيج من العوامل المهيئة مثل الكوكسيديا والنظام الغذائي، مع تزقيمية مدتها أو الإدارة عن طريق تغذية استخدام كلوستريديوم بيرفرنجنز. في هذه النماذج، يتطلب مقارنة عدة سلالات بيرفرنجنز جيم- فوعة الدراسات عدد كبير من المضيفين للحصول على نتائج ملموسة. يمكن أن يكون معدل الوفيات أثناء فترة الدراسة عالية اعتماداً على نموذج تجريبي، ومن ثم زيادة الشواغل الأخلاقية فيما يتعلق بالرفق بالحيوان في البحث. من المهم تطوير نماذج جديدة من العدوى التي تحتاج إلى عدد أقل من الحيوانات لدراسة نشوء المرض، بعد تقديم نتائج هامة وصحيحة إحصائيا، في الحد من استخدام الحيوانات في البحوث. قد استخدمت نماذج المعوية الحلقة الواصلة لدراسة التهابات كلوستريديال في العديد من الأنواع مثل الفئران والأرانب والعجول. وبعد العمليات الجراحية لإنشاء شرائح الحلقة الواصلة، يتم حقن سلالات بيرفرنجنز جيم- مباشرة في الحلقات إقامة اتصال وثيق بين البكتيريا ومخاطيه الأمعاء. وتؤخذ عينات من الأمعاء ومحتويات لومينال في إنهاء الإجراءات بعد بضع ساعات. يمكن تلقيح سلالات بكتيرية متعددة في كل الحيوانات، ومن ثم الحد من عدد المواضيع المطلوبة في هذه التجارب. أيضا، يتم تنفيذ إجراءات تحت التخدير العام لتقليل ألم الحيوان. سيكون هذا النموذج في الدجاج، وأكثر ملاءمة من الإدارة عن طريق الفم لمقارنة بيرفرنجنز جيم- إجهاد القدرة الإمراضية لأن هناك حاجة إلى عدد أقل من الحيوانات، وتلزم لا العوامل المهيئة للحث على هذا المرض، ويتم التحكم في الألم بالمسكنات . نموذج الحلقة الواصلة المعوية وصف ضعيف في الدجاج وتوحيد ضروري للاستخدام الأمثل لها. هذه المخطوطة يوفر جميع الخطوات اللازمة لإنشاء العديد من الحلقات الواصلة المعوية في الدجاج ويجمع معلومات عن النقاط الحرجة للحصول على نتائج صحيحة.

Introduction

استخدام نماذج حيوانية لدراسة الأمراض المعدية التي تصيب الإنسان والحيوان أداة أساسية في تقييم عوامل الفوعة تنظم الآلية المرضية لشرط معين، وكذلك فيما يتعلق بوضع استراتيجيات لمنع أو علاج الأمراض1. وعلى الرغم من المزايا العديدة لاستخدام نماذج حيوانية لدراسة الأمراض المختلفة، تنشأ الشواغل الأخلاقية فيما يتعلق بهذه الممارسة. يحتاج الباحثون للحد من استخدام الحيوانات في حين الحصول على نتائج ملموسة وصالحة. مفهوم المبادئ 3 روبية (استبدال وتقليل وصقل) وضعت لضمان معالجة قضايا الرعاية الاجتماعية في مثل هذه المحاكمات. في دراسات التهاب الأمعاء نخرية الدجاج، تستخدم في فيفو نماذج الدجاج للتحقيق المسببات والوقاية والعلاج من هذا الشرط2،3،،من45. وتدار سلالات ممرضة من بيرفرنجنز جيم- تحمل عوامل الفوعة محددة، مثل السمية نتب6، يسبب التهاب الأمعاء نخرية في الدجاج7. مبدأ الاستبدال، ولذلك يصعب، تحقيق في مثل هذه الحالة عوامل الفوعة هذه قد لا تكون ذات أهمية حاسمة في الأنواع الحيوانية الأخرى. ومعظم النماذج للامعاء نخرية في الدجاج استخدام تركيبة من عوامل الخطر، مثل الكوكسيديا وتغيير النظام الغذائي لحمل نخرية الأمعاء تليها تزقيمية مرق الثقافة التي تحتوي على عدد كبير من. بيرفرنجنز جيم-2 هذه النماذج سوف يحفز هذا المرض في عدد كبير من الدجاج، والوفيات يمكن أن تكون هامة في مثل هذه المحاكمات8، مما يثير المخاوف حول مبادئ الحد والصقل في الأبحاث الحيوانية.

نماذج الحلقات الواصلة المعوية بديل المرغوب فيه لدراسة الأمراض الناجمة عن العوامل الممرضة المعوية فيما يتعلق بمبدأ تخفيض، وصقل. قطاعات الأمعاء تسمى 'الحلقات' في هذه النماذج، يتم إنشاؤها بواسطة وضع الحروف المركبة على طول الأمعاء شكل حجرات مستقلة والمحكم حيث يمكن حقن مسببات الأمراض وحدها9 أو مع الجزيئات الأخرى، مثل لقاح المرشحين 10 , 11-توضع مسببات الأمراض ذات الأهمية في اتصال وثيق مع الخلايا المعوية، وبعد بضع ساعات من وقت الإصابة، يمكن استرداد العينات المعوية لمزيد من التحليل. وهذا يسمح باستخدام العلاج ومراقبة مجموعات متعددة في نفس الحيوان. يمكن إجراء التحليل الإحصائي مع نماذج التدابير المتكررة، مما يزيد من قوة التمييز بين المجموعات ويقلل من عدد الدجاج اللازمة مقارنة بمحاكمات تزقيمية الشفوي. أيضا، يتم تنفيذ العمليات الجراحية ومرات الإصابة اللاحقة تحت التخدير العام المستمر والتسكين، ومن ثم تقليل الألم الحيوان. ليجيشنز حلقة مغلقة، نموذجا مثاليا لخفض إعداد المضيف وإنشاء نظام أكثر إنسانية في الأبحاث الحيوانية.

نماذج الحلقات الواصلة المعوية الموصوفة كذلك في الأنواع المختلفة، مثل العجول والأرانب والفئران2،9، ولكن وصف ضعيف في الدجاج7. لاستخدام أمثل لهذا النموذج الجراحية، الأسلوب السليم والتنفيذ ضرورية لخلق الحلقات المعوية الواصلة لتجنب الأضرار بسلامة الأمعاء. والهدف من هذه المخطوطة وصف أسلوب خطوة بخطوة في إنشاء الحلقات المعوية متعددة في نموذج دجاج. ويحد هذا الأسلوب الجراح مهارة وخبرة، كإجراءات دقيقة ضرورية لنجاح المشروع.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

إذن جميع الإجراءات باستخدام الحيوانات الحية "اللجنة الأخلاقية" لكلية الطب البيطري، جامعة دي مونتريال (CÉUA، 'لجنة د' الأخلاق دي استخدام des Animaux ').

1-الاعتبارات قبل الجراحة

  1. حدد 10 أسابيع من العمر الممرض محددة مجاناً (منتدى جنوب المحيط الهادئ) القبعة الدجاج لعملية جراحية.
    ملاحظة: يجب أن يكون وزنها بين 1.0 و 1.2 كجم.
  2. سحب تغذية ح 12 قبل إجراءات لإفراغ الأمعاء.
  3. قبل الجراحة، ضع الدجاج تحت التخدير العام بعد بروتوكول التحقق من قبل طبيب تخدير. بريميديكاتي كل الدجاج 15 دقيقة قبل الجراحة مع حقن العضلي (IM) من الميدازولام 1 مغ/كغ وبوتورفانول 4 مغ/كغ. أكرر، كل ح 4، حقن بوتورفانول 4 مغ/كغ الدردشة أو عند تغيير نمط التنفس والتردد يزيد أثناء التخدير. للتخدير العام، خلال جميع الإجراءات، إدارة إيسوفلوراني بتركيز تتراوح بين 1.5 و 2.5% مع أنبوب تحسن.
    ملاحظة: ينصح باستخدام تخدير للتخدير والتسكين كما أنهم سوف إلى حد كبير تحسين عمق التخدير، تقليل كمية المسكنات اللازمة خلال جميع الإجراءات، فضلا عن تمكين الباحثين للتحكم في مستويات الألم.
  4. رصد التخدير عن طريق تسجيل درجة حرارة الجسم ومعدل ضربات القلب ورسم القلب (ECG)، والجهاز التنفسي معدل وإيقاع، تشبع الأكسجين، منتهية الصلاحية غاز ثاني أكسيد الكربون (CO2) وردود الفعل العصبية.
    ملاحظة: يجب تعيين شخص لرصد هذه المعلمات في جميع أنحاء جميع الإجراءات.
  5. اتبع المبادئ العقم طوال الإجراءات الجراحية. ضمان أن الجراح والجراح مساعد اللباس مع العباءات العقيمة وقفازات وقناع ونظارات واقية وفقا للبروتوكولات قبل الجراحة المؤسسية. ضمان أن الجراح تقشير اليدين بفرشاة عقيمة مشربة غلوكونات الكلورهيكسيدين تصل إلى الكوع مع التركيز على الأظافر وكل سطح الإصبع.
  6. تعقيم الأدوات الجراحية مع معقم.

2-إعداد الموقع الجراحي

  1. أولاً، إزالة الريش يدوياً من البطن مع جر لطيف.
  2. فرك موقع الجراحية مع الكلورهيكسيدين غلوكونات منظفات مشربة معقم فرشاة. بلطف فرك الجلد من المركز إلى الخارج لوقت اتصال إجمالي من 5 دقائق دون العودة إلى المركز.
  3. تنفيذ ممرات بديلة 3 على الموقع الجراحي مع محلول غلوكونات الكلورهيكسيدين وكحول الأيزوبروبيل استخدام جاوزيس العقيمة.
    ملاحظة: يجب أن تبدأ بمرور من منتصف موقع الجراحية إلى الحدود لتفادي التلوث من المناطق غير تطهيرها لموقع الجراحية.
  4. مكان ثني الجراحية المعقمة على الدجاج.

3-استخراج الأمعاء الصغيرة من تجويف البطن

  1. جداً ثني الجراحية مع مقص لفضح فقط جلد موقع الجراحية.
  2. جداً الجلد عن طريق إجراء شق خط الوسط منخفض شكل '' ل '' مع شفرة المبضع #3.
    1. يبدأ الشق الأول 1 سم والذيلية للقص ووضع حد لها في الجمجمة مجرور 1 سم.
    2. تنفيذ الشق الثاني عمودي على الشق الأول. تبدأ من نهاية الشق الأول والذيلية وتستمر 5 سم في الجانب الأيمن من البطن باتباع خط الحوض.
      ملاحظة: سيتم إنشاء هذا الانفتاح رفرف التي تسمح استخراج أسهل من الأمعاء.
  3. مع مقص جراحة، قطع الصفاق وعضلات البطن مع نفس نمط الشكل '' ل '' لفتح تجويف البطن.
    ملاحظة: هذا سوف يعرض الحويصلات. الأمعاء تقع تحت هذه الهياكل. يجب أن تكون هوميديفيد الأكياس الهوائية مع جاوزيس المشبعة بالعقيمة % 0.85 المالحة لتجنب جفاف وتمزق ممكن طوال فترة الإجراءات.
  4. هوك في تجويف البطن باتباع جدار البطن الأيسر إدراج سنوك التعقيم والعمل بطريقة حول الحويصلات البطن.
  5. بلطف اكستريورز الأمعاء وانتشرت هذه في مجال الجراحة.
    ملاحظة: تبقى الأمعاء هوميديفيد بشكل متكرر الرش عقيمة المالحة 0.9% طوال فترة الإجراءات. أيضا، يمكن وضع جاوزيس هوميديفيد مع المالحة العقيمة في الأمعاء لتجنب جفاف.
  6. الاستيلاء على الأمعاء شاش معقم جافة باستخدام وسحب بلطف الأمعاء الصغيرة بالجر اليدوي لفضح الصائم.
    ملاحظة: سفن المساريقي العلوي هشة وقد تمزق التوتر الزائد منها والتي قد تؤدي إلى الآفات الدماغية المعوية وتضر إلى حد كبير نتيجة الإجراء.

4-تصنيع الحلقات المعوية

  1. إنشاء حلقة رقم 1.
    1. ضع حرف مزدوج بسيطة مع مادة بوليجلاكتين مولتيفيلامينت اصطناعية قابلة لامتصاص في صائم الدانية بتجنب حرف مزدوج للسفن المساريقي العلوي الرئيسية.
    2. مكان حرف مزدوج القاصي 2 سم بعيداً عن حرف مزدوج الدانية.
      ملاحظة: يتم وضع الحروف البسيطة المصنوعة من مواد خياطة مولتيفيلامينت على طول القناة المعوية لإنشاء شرائح المحكم. مخطط (الشكل 1) يصف موقع كل الحروف المركبة. الحلقات تتكون من حرف مزدوج الدانية والبعيدة، مفصولة بواسطة سم 2.
  2. إنشاء إينتيرلوب رقم 1.
    1. مكان بسيط إبطاله 0.5 سم أبورالي إلى حرف مزدوج القاصي من حلقة رقم 1.
      ملاحظة: بين الحلقات المتعاقبة، وهناك إينتيرلوبس من 1 سم، أي قطاعات صنع فصل المادي بين الحلقات. لانخفاض المخاطر المحتملة للتلوث عبر من حلقة واحدة إلى أخرى، ويرجح أن يوضع حرف مزدوج بسيطة في وسط إينتيرلوب (0.5 سم من حرف مزدوج البعيدة والقريبة من الحلقات المجاورة 2). وهذا يقلل من خطر الملوثات تسربت ممكن من حلقة للوصول إلى حرف مزدوج من حلقة المتاخمة. هذه القطع ليست إلزامية ولكن سيتم تقليل مخاطر التلوث عبر.
  3. إنشاء الحلقات اللاحقة وإينتيرلوبس.
    1. كرر الخطوات من 4.1 و 4.2 للحصول على عدد الحلقات المطلوبة.
      ملاحظة: في هذه التجربة، الحلقات 9 و 8 إينتيرلوبس تم إنشاؤها. وبلغ إجمالي طول 26 سم. يمكن ضبط عدد الحلقات تبعاً للدراسة.

5-حقن كلوستريديوم بيرفرنجنز "سلالات في الحلقات"

  1. حقن بحقنه معقمة وابرة ز 26 الممرض في حلقة رقم 1. إدراج الإبرة على الجانب أنتيميسينتيريك من الأمعاء بلطف بزاوية 45 درجة.
    ملاحظة: في هذه التجربة، تم حقن 0.2 مل من الدماغ القلب ضخ (بهي) التي تحتوي على زيمبابوي (مستعمرة تشكيل وحدات) من بيرفرنجنز جيم- 1 × 106 في مرحلة النمو سجل منتصف في كل حلقة. تم حقن سلالات مختلفة 5 في 5 حلقات مختلفة وتم حقن 4 الحلقات المتبقية مع عنصر تحكم سلبية التي تحتوي على لا البكتيريا (العقيمة بهي)، مسببات الأمراض والعقيمة بهي الحلقات بالتناوب.
  2. كرر الخطوة 5.1 لحقن جميع الحلقات.
  3. استبدال الأمعاء في المنطقة الظهرية من تجويف البطن، أسفل الحويصلات بلطف.

6-إقفال التجويف البطني

  1. خياطة للغشاء البريتوني وعضلات البطن.
    1. خياطة الغشاء البريتوني وعضلات البطن على طول الحوض (صنع في الخطوة 3، 3) مع نمط خياطة مستمرة بسيطة باستخدام مادة بوليجلاكتين مولتيفيلامينت اصطناعية قابلة لامتصاص.
    2. خياطة الصفاق وعضلات البطن من القص مجرور (في الخطوة 3، 3. مع نمط خياطة مستمرة بسيطة باستخدام مادة بوليجلاكتين مولتيفيلامينت اصطناعية قابلة لامتصاص.
  2. خياطة الجلد.
    1. استخدام مواد اصطناعية مولتيفيلامينت بوليجلاكتين ونمط خياطة مستمرة بسيطة، أغلق شق الجلد على طول الحوض في الخطوة 3، 2.
    2. باستخدام نفس المواد مولتيفيلامينت حرف مزدوج ونمط خياطة مستمرة بسيطة، أغلق شق الجلد من القص إلى مجرور في الخطوة 3، 2.

7-الخاتمة

  1. بعد الإجراءات الجراحية، إبقاء الدجاج تحت التخدير العام مع الاستخدام السليم للمسكنات لتقليل ألم الحيوان أثناء وقت الإصابة. مواصلة رصد مخدر لضمان مستوى تخدير الكافي.
  2. بعد وقت الإصابة المرجوة، معاملة إنسانية euthanize الدجاج بخلع عنق الرحم تحت التخدير العام.
    ملاحظة: لهذه الإجراءات، كان الوقت اللازم للحث على آفات مجهرية مع سلالات ممرضة بيرفرنجنز جيم- ح 7.
  3. مع شفرة المبضع #3، قطع من 0.5 سم إلى قسم حلقة طويلة 1 سم ووضعه في الفورمالين 10% للتثبيت بين عشية وضحاها وكذلك نسيجية تحليل.
  4. مع نفس شفرة المبضع، قص المقطع حلقة المتبقية ووضعه في أنبوب ميكروسينتريفوجي عقيمة لعزل سلالات بيرفرنجنز جيم- في كل حلقة تحليل باكتيريولوجيك كذلك لتكييفها الوراثية.
  5. كرر الخطوات من 7.2 و 7.3 لجميع الحلقات بتغيير شفرة المبضع بين كل حلقة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويرد في الشكل 1تخطيطي للحلقات المعوية 9 و 8 إينتيرلوبس. في هذا النموذج، يتم إنشاء مجموعة الحلقات 9 و 8 إينتيرلوبس مع الحروف البسيطة. حلقة تتألف من الحروف الدانية والبعيدة متباعدة من 2 سم يقاس من حرف مزدوج الدانية. اثنين من الحلقات المتجاورة مفصولة إينتيرلوب من 1 سم. لتقليل المخاطر المحتملة للتلوث المتبادل بين الحلقات بالتسرب من حرف مزدوج، يوضع حرف مزدوج إينتيرلوب منتصف الطريق من حرف مزدوج القاصي وحرف مزدوج الدانية 2 الحلقات المتاخمة. يمكن ضبط عدد الحلقات تبعاً لمتطلبات الدراسة.

Figure 1
رقم 1: التمثيل التخطيطي للحلقات المعوية الواصلة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 2 ألف (HPS وصمة عار) يظهر مظهر مجهرية من حلقة معوية حقن بوسيلة تحكم عقيمة. الحدود فرشاة المخاطية سليمة وهناك لا نخر موجودة في المقطع. احتقان خفيف قد تكون موجودة في طبقات الأمعاء (الغشاء المخاطي، سوبموكوسا، موسكولاريس، و serosa) شرائح. الشكل 2 ويبين (HPS وصمة عار) نخر الأغشية المخاطية 7 ساعات بعد الحقن من سلالة المسببة للأمراض من كلوستريديوم بيرفرنجنز استردادها من حالة سريرية من الأمعاء نخرية في مزرعة لدجاج. هي تآكل نصائح الزوائد مع نخرية انتيروسيتيس المحيطة بنصائح الزوائد. في مواد نخرية المحيطة بالزوائد، لوحظت مجموعات كبيرة من البكتيريا على شكل قضيب (الأسهم). كذلك اعتبرت هذه البكتيريا بكتيريا إيجابية مع وصمة عار توورت (غير معروضة). هذا الاستنتاج، جنبا إلى جنب مع العزلة من الجراثيم لإعداد كبيرة من كلوستريديوم بيرفرنجنز، يشير إلى الآفات كان سببها هذه البكتيريا. الشكل 2 (HPS وصمة عار) يبين الآفات النسيجي لحلقة الدماغية، حيث لا يتصل نخر بحقن الممرضة بيرفرنجنز جيم- السلالات ولكن نتيجة لسوء تنفيذ الإجراءات. ويبين هذا التكبير نخر التخثر الشديدة التي يمكن أن يساء تفسيرها كالآفات الناجمة عن كلوستريديوم بيرفرنجنز. ومع ذلك، لوحظت لا البكتيريا في هذا القسم. أيضا، هي شدة المتوسعة في الأوعية الدموية في طبقة العضلات بتراكم عدد كبير من الكريات الحمراء تردي (الأسهم). وهذا يدل على احتقان الأوعية الدموية، وفي هذه الحالة، سببه احتقان في الأوعية الدموية المساريقي العلوي الواصلة. حلقات الدماغية يمكن بسهولة التعرف على الميكروسكوب أثناء الإجراءات الجراحية؛ عقب شديدة الازدحام والأوعية الدموية، ستكون سيروسا الأزرق الداكن بدلاً من التلون الوردي المحمر العادي لها.

Figure 2
رقم 2: نتائج الأنسجة 7 ح ما بعد الإصابة. وهناك (أ) لا آفات نخرية في الغشاء المخاطي في الأنسجة بعد الحقن من الدماغ القلب ضخ (بهي)، وسيلة الثقافة عقيمة. (ب) في الحلقات حقن بسلالة كلوستريديوم بيرفرنجنزالمسببة للأمراض، وهناك يتم وضع علامة نخر في الغشاء المخاطي عديدة كبيرة إيجابية على شكل قضيب البكتيريا تغطي الغشاء المخاطي. (ج) يمكن أن تشبه الآفات الدماغية آفات نخرية الناجمة عن بيرفرنجنز جيم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

في هذه الدراسة، تم حقن الحلقات متوسطة ثقافة السيطرة عقيمة (بهي) أو واحد خمس سلالات مختلفة من كلوستريديوم بيرفرنجنز المستخرجة من مختلف قطعان الدجاج الحرة المضادات الحيوية المتأثرة أو لا مع الأمعاء نخرية12 . الدجاج عشر استخدمت في هذه الدراسة. ويمكن تحديد السلالات الإمراضية استناداً إلى قدرتها على أحداث آفات متوافقة مع التهاب الأمعاء نخرية للغشاء المخاطي مرارا وتكرارا. بينما شُفي سلالات المستردة من الحالات السريرية لالتهاب الأمعاء نخرية أظهرت قدرة على تسبب نخر الأغشية المخاطية سلالات ما بعد الإصابة، ح 7 مزارع الدجاج صحية سريرياً الحث على عدم نخر الأغشية المخاطية والغشاء المخاطي كان مماثلاً للعادي النتائج المستخلصة من حلقات التحكم حقن بهي12. باستخدام حلقات عديدة في الحيوان نفسه، يمكن استخدام خمسة بيرفرنجنز جيم- سلالات وأربع حلقات التحكم في الطيور نفسها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وقد وصف نماذج الحلقات المعوية في العديد من الأنواع لدراسة التفاعل المضيف الممرض والمرضية للأمراض الناتجة عن مسببات الأمراض المعوية المختلفة، مثل كلوستريديوم بيرفرنجنز، المطثيّة العسيرة و السالمونيلا انتيريكا7،9،13،،من1415. فقد استخدمت أيضا لتحليل الاستجابة المناعية المخاطية16، فعالية الأجسام المضادة لتحييد السموم البكتيرية التي تفرز بمسببات الأمراض المعوية11 وتقييم المرشحين اللقاحات للوقاية من الأمراض المعوية10 . ومع ذلك، هذا النموذج باستخدام العديد من الحلقات الواصلة الحيوان فردية واحدة وصف ضعيف في الدجاج والتوحيد القياسي لهذا الأسلوب إلزامية للحصول على نتائج صحيحة كما التلاعب غير كافية قد يؤدي إلى نتائج خاطئة وتفسيرات خاطئة . وتبين هذه المخطوطة إنشاء 9 حلقات الواصلة متتالية تقع في صائم والدقاق المسالك المعدية المعوية الدجاج. استخدمت هذه الدراسة الممرض محددة مجاناً (SPF) القبعة الذكور دجاجة تزن بين 1.0 و 1.2 كجم. وكان الحد الأقصى لعدد الحلقات التي يسمح بها هذا تولد في هذا الوزن 9، منذ 26 سم أمعاء الصغيرة يمكن أن تكون اكستيريوريزيد بسهولة من تجويف كولوميك. أنه لا يستبعد أن قد يكون إجمالي عدد الحلقات التي تم إنشاؤها باستخدام آخر سلالة و/أو دجاج القبعة ذكور أثقل، مختلفة، وحتى أعلى من 9. ويمكن أيضا تعديل طول الحلقات المعوية، ولكن طول 2 سم يعتبر الأمثل للسماح لجمع العينات للأنسجة وعلم الجراثيم أثناء استخدام السعة القصوى لطول الأمعاء المتاحة.

الحلقة الواصلة المعوية تقنية الموضحة في هذه المقالة يمكن أن تكون بديلاً قيماً للنماذج الحالية المتاحة لدراسة الأمعاء نخرية في الدجاج تسببها كلوستريديوم بيرفرنجنز. وفقا للنتائج المذكورة في المادة سابقة12، تقييم سلالات بيرفرنجنز جيم- 5 مع الدجاج 10 كان كافياً للتفرقة بين سلالات عالية خبثاً وكومينسال بيرفرنجنز جيم. وبالمقارنة، سيتطلب نماذج العدوى الأخرى استخدام التطعيم كل نظام التشغيل لإنتاج الأمعاء نخرية مع بيرفرنجنز جيم- عدد كبير من الأفراد للحصول على نفس النتائج. في الأدب، عدد الطيور اللازمة لتقييم ضراوة بيرفرنجنز جيم- سلالات يتراوح من 10 إلى 30 من الدجاج كل مجموعة17،،من1819 المضيفين مائة كل مجموعة20. وفيما يتعلق بمبدأ التحسين لاستخدام الحيوانات في البحوث، تنصح باستخدام هذه التقنية التي تتطلب أقل عدد من المضيفين للحصول على نتائج ملموسة. نموذج الحلقة الواصلة المعوية الموضحة في هذه المقالة على الأرجح النموذجية التي تتطلب أقل عدد من الدجاج لمقارنة ضراوة سلالات بيرفرنجنز جيم .

حيث يمكن تقييم التلوث عبر التسرب من حرف مزدوج إلا بعد بيرفرنجنز جيم- الثقافة وتوصيف بنابض الحقل هلام استشراد (بفجي) عدة أيام بعد الإجراءات، كان من أهمية قصوى للتقليل من هذا المخاطر بما في ذلك 1 سم إينتيرلوبس الذي يحتوي على حرف مزدوج إينتيرلوب منتصف طريق بين 2 الحلقات المتاخمة. باتخاذ هذه الاحتياطات، كان من الممكن تجنب الصليب-تلوث المحتمل. وفي الواقع، بينما السلالات المسببة للأمراض بسبب آفات نخرية المجهري متطابقة مع التهاب الأمعاء نخرية، هناك كانت لا آفات مجهرية كبيرة في الحلقات المتاخمة حقن غير ممرضة سلالات بيرفرنجنز جيم- أو بهي الثقافة المتوسطة المراقبة السلبية. وكان هذا يدل أن سلالات مختلفة يمكن أن يكون حقن بأمان في الحلقات المعوية المتاخمة للدجاج نفسه.

وكان من القضايا الأكثر صعوبة مع هذا النموذج اكستيريوريزيشن الأمعاء الصغيرة دون المساس بالتهوية والأوعية المعوية. وقد الطيور الجهاز التنفسي مختلفة من الثدييات. الحجاب الحاجز غائبا، والتهوية تسيطر أيرساكس، الهياكل رقيقة الجدران في تجويف البطن. وهناك 7 من هؤلاء في الدجاج وهي تنقسم في عنق الرحم (1)، والصدر الأمامي (2)، والصدر الخلفي (2) والبطن الأكياس الهوائية (2). هذه الهياكل الشبيهة ببالون ترتبط مباشرة إلى الرئتين، وتسمح بحركة الهواء في الجهاز التنفسي. عند فتح تجويف البطن بين القص ومجرور، أيرساكس البطن بارزة، وتميل إلى أن تكون تمزق بسهولة، خاصة إذا كانت جافة. ولهذا السبب، المهم الترطيب المستمر مع جاوزيس ثبط مع المحلول الملحي المعقم لتخفيف التهوية المناسبة والتخدير أثناء الإجراءات. أيضا، يمكن أن يكون من الصعب تجنب ثقوب صغيرة في أيرساكس البطن أثناء اكستيريوريزينج الأمعاء خارج تجويف البطن. من المهم رصد البارامترات مخدر، مثل معدل التنفس ونمط وردود الفعل بالبيبرال، ومعدل ضربات القلب والحركات للدجاج، للتأكد من أن الدجاج يبقى تحت طائرة كافية للتخدير. تسرب الهواء الصغيرة أقل من المحتمل أن تؤثر على نوعية التخدير، ولكن يجب التقليل من هذا التسرب. من المهم أن مغلقة بأحكام إغلاق الصفاق بعد الإجراءات. هذا وسوف إعادة ضغط الهواء الداخلي والتهوية وسوف تعود إلى طبيعتها بعد هذه الخطوة. بعد إغلاق هذا الهيكل، ينبغي أن يكون هناك لا تسرب الهواء من البطن. هذا يمكن التحقق منها برش كمية صغيرة من المحلول الملحي المعقم في خياطة الجروح وابحث عن تشكيل فقاعة الهواء التي تشير إلى القادمة من تجويف البطن. إذا حدث هذا، يمكن وضع خيوط إضافية الجلد بسيطة في موقع تسرب الهواء.

جانب تحديا تقنيا آخر يتصل بمخاطر الآفات الدماغية النامية في الأمعاء بسبب الإجراءات الجراحية تنفذ بشكل سيئ. الاسكيمية يحدث عندما يكون هناك تقييد إمدادات الدم إلى الأنسجة، مما تسبب في نقص الأكسجين والجزيئات الأخرى اللازمة الأيض الخلوية. وفي هذه الحالة، سوف تصبح الأمعاء بسرعة زرقاء داكنة الميكروسكوب بدلاً من اللون الوردي المحمر وخلايا الأغشية المخاطية المعوية وسوف تتدهور بسرعة. هذا سوف يسبب الآفات الدماغية لا علاقة لها بحقن مسببات المرض وأنها سوف تتداخل مع تفسير نسيجية. يمكن أن تؤدي حالات إشكالية اثنين إلى الاسكيمية. أولاً، سوف يسبب حرف مزدوج للسفن المساريقي العلوي بسهو هذا الشرط. لهذا السبب، فمن الأهمية بمكان أن ننظر بعناية في وضع الحروف على طول الأمعاء لتجنب بما في ذلك سفن المساريقي العلوي. وثانيا، يمكن أن يحدث الاسكيمية في حالة حدوث نزيف الأوعية المساريقي العلوي أثناء الإجراءات. وهذه الهياكل مسورة رقيقة وهشة. التوتر المفرط يمكن أن يؤدي إلى تمزق بهم وحين يدوياً اكستيريوريزينج الأمعاء، ينبغي إيلاء الاهتمام للتوتر على سفن المساريقي العلوي لضمان سلامتهم أثناء هذه الخطوة. أيضا، يمكن أن يحدث النزيف سفن المساريقي العلوي إذا كانت هذه هي ثقب بإبرة خياطة العمليات جراحية. الجراح يجب أن ننظر بعناية في الموقع الذي يخترق عن طريق مساريق مع الإبرة. يمكن إيقاف النزيف في كلتا الحالتين، ولكن عملية التخثر سوف توقف أو تقلل إلى حد كبير تدفق الدم إلى هذه الأجزاء المعوية، ومن ثم تسبب آفات لا رجعة فيها والمساس بصحة النتائج.

هذا النموذج مفيد لدراسة التفاعلات بين المضيف الممرض والمرضية للأمراض المعوية التي تسببها العوامل المعدية. النموذج المقترح يمكن تكييفها تبعاً للدراسة عن طريق تغيير عدد الحلقات التي تم إنشاؤها أو عن طريق تعديل طول كل حلقة. قبل تنفيذ هذه التغييرات، من المستحسن لتوحيد طريقة لضمان تحقيق نتائج هامة. القيود المفروضة على هذا الأسلوب توجها إلى المهارة وموظفين مدربين تدريبا سليما فقط يجب إجراء هذه الجراحة على الحيوانات الحية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل الرئيس في "بحوث الدواجن" (م. بولين) من "كلية الطب البيطري" جامعة مونتريال. بولين بيليغوز والأصل وضع النموذج. بولين بيليغوز والأصل إجراء العمليات الجراحية. الدكتور بيرنز ساعد في وضع بروتوكول التخدير. الأصل الدكتور تحرير الفيديو وكتبت المخطوطة. بيرنز Drs، ديسروتشيرس وبولين تحرير المخطوطة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
EZ-Scrub 747 Becton Dickinson and Company 4% chlorhexidine gluconate detergent impregnated sterile brush. No catalog number available. Web address: https://www.bd.com/en-us/offerings/capabilities/infection-prevention/surgical-hand-scrubs/ez-scrub-preoperative-surgical-scrub-brushes 
Isopropyl alcohol 70% USP 4 L Commercial isopropyl alcohol P016IP70 Web address: http://www.comalc.com/products/
Chlorexidine Sigma-Aldrich 282227-1G Chlorhexidine gluconate solution, must be diluted to 4%. Web address: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/282227?lang=fr&region=CA&gclid=EAIaIQ
obChMI8vHr4_OY1wIV3rrACh2Z
WQKuEAAYAiAAEgLKx_D_BwE
Surgical Drape Small (27 inch x 24 inch) with 3 x 6 inch Fenestration Veterinary Specialty Products 32724 Web address: http://www.vetspecialtyproducts.com/index.cfm?fuseaction=ecommercecatalog.
detail&productgroup_id=15
Scalpel blades #3 Swann-Morton 301 Web address: https://www.swann-morton.com/product/16.php
Sterile saline NaCl 0.9% Sigma-Aldrich S8776-100ML Web address: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s8776?lang=fr&region=CA
Vicryl 3-0 Ethicon D9003 Polyglactin multifilament absorbable suture material. Web address: http://www.ethicon.com/healthcare-professionals/products/wound-closure/absorbable-sutures/coated-vicryl-polyglactin-910-suture
Syringe 1 ml with 26G needle Becton Dickinson and Company 329652 Web address: https://www.bd.com/en-us/offerings/capabilities/diabetes-care/insulin-syringes/bd-1-ml-conventional-insulin-syringes
Brain Heart Infusion Sigma-Aldrich 1104930500 Web address: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/mm/110493?lang=fr&region=CA&cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xorders-_-prodRecCold2-1
Eppendorf tube Sigma-Aldrich T9661-500EA Microcentrifuge tube. Web address: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t9661?lang=fr&region=CA&gclid=EAIaIQ
obChMI-YizzfiY1wIVRkCGCh
30SQjuEAAYAiAAEgLK5fD_BwE
Formalin solution, buffered neutral, 10% Sigma-Aldrich HT501128-4L Ratio tissue : formalin of 1: 10 for adequate fixation. Web address: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/ht501128?lang=fr&region=CA
Clostridium perfringens strains Université de Montréal, Chaire en recherche avicole N/A Specific to each laboratory, available upon request to correspondant author

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vitale, A., Chiarotti, F., Alleva, E. The use of animal models in disease research. Rare diseases and orphan drugs. 2, (1), 1-4 (2015).
  2. Uzal, F. A., et al. Animal models to study the pathogenesis of human and animal Clostridium perfringens infections. Veterinary Microbiology. (2015).
  3. Bernier, G., Phaneuf, J. B., Filion, R. Necrotic enteritis in broiler chickens. III. Study of the factors favoring the multiplication of Clostridium perfringens and the experimental transmission of the disease. Canadian Journal of Comparative Medicine. 41, (1), 112-116 (1977).
  4. Al-Sheikhly, F., Truscott, R. B. The pathology of necrotic enteritis of chickens following infusion of broth cultures of Clostridium perfringens into the duodenum. Avian Diseases. 21, (2), 230-240 (1977).
  5. Wicker, D. L., Iscrigg, W. N., Trammell, J. H. The control and prevention of necrotic enteritis in broilers with zinc bacitracin. Poultry Science. 56, (4), 1229-1231 (1977).
  6. Keyburn, A. L., et al. NetB, a new toxin that is associated with avian necrotic enteritis caused by Clostridium perfringens. PLoS Pathog. 4, (2), e26 (2008).
  7. Timbermont, L., et al. Origin of Clostridium perfringens isolates determines the ability to induce necrotic enteritis in broilers. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 32, (6), 503-512 (2009).
  8. Paradis, M. A., et al. Efficacy of avilamycin for the prevention of necrotic enteritis caused by a pathogenic strain of Clostridium perfringens in broiler chickens. Avian Pathol. 45, (3), 365-369 (2016).
  9. Valgaeren, B., et al. Lesion development in a new intestinal loop model indicates the involvement of a shared Clostridium perfringens virulence factor in haemorrhagic enteritis in calves. Journal of Comparative Pathology. 149, (1), 103-112 (2013).
  10. Goossens, E., et al. The C-terminal domain of Clostridium perfringens alpha toxin as a vaccine candidate against bovine necrohemorrhagic enteritis. Vet Res. 47, (1), 52 (2016).
  11. Goossens, E., et al. Toxin-neutralizing antibodies protect against Clostridium perfringens-induced necrosis in an intestinal loop model for bovine necrohemorrhagic enteritis. BMC Vet Res. 12, (1), 101 (2016).
  12. Parent, E., Archambault, M., Charlebois, A., Bernier-Lachance, J., Boulianne, M. A chicken intestinal ligated loop model to study the virulence of Clostridium perfringens isolates recovered from antibiotic-free chicken flocks. Avian Pathol. 46, (2), 138-149 (2017).
  13. Janvilisri, T., et al. Temporal differential proteomes of Clostridium difficile in the pig ileal-ligated loop model. PLoS One. 7, (9), e45608 (2012).
  14. Aabo, S., et al. Development of an in vivo model for study of intestinal invasion by Salmonella enterica in chickens. Infection and Immunity. 68, (12), 7122-7125 (2000).
  15. Meurens, F., et al. Early immune response following Salmonella enterica subspecies enterica serovar Typhimurium infection in porcine jejunal gut loops. Vet Res. 40, (1), 5 (2009).
  16. Gerdts, V., et al. Multiple intestinal 'loops' provide an in vivo model to analyse multiple mucosal immune responses. J Immunol Methods. 256, (1-2), 19-33 (2001).
  17. Wade, B., et al. The adherent abilities of Clostridium perfringens strains are critical for the pathogenesis of avian necrotic enteritis. Vet Microbiol. 197, 53-61 (2016).
  18. Cooper, K. K., et al. Virulence for chickens of Clostridium perfringens isolated from poultry and other sources. Anaerobe. 16, (3), 289-292 (2010).
  19. Cooper, K. K., Songer, J. G. Virulence of Clostridium perfringens in an experimental model of poultry necrotic enteritis. Veterinary Microbiology. 142, (3-4), 323-328 (2010).
  20. Chalmers, G., Bruce, H. L., Toole, D. L., Barnum, D. A., Boerlin, P. Necrotic enteritis potential in a model system using Clostridium perfringens isolated from field outbreaks. Avian Diseases. 51, (4), 834-839 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics