מודל דוקסורוביצין-induced קרדיומיופתיה בדג זברה למבוגרים

*1,2,3, *2,3, 2,3,4, 1,2,3
* These authors contributed equally
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

שיטה לייצר מודל קרדיומיופתיה דוקסורוביצין-induced למבוגרים דג זברה (רזבורה rerio) מתואר כאן. שתי דרכים חלופיות של הזרקת בקרום הבטן מוצגים ואת התנאים כדי להפחית וריאציות בין קבוצות שונות ניסיוני הנדונים.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Ma, X., Ding, Y., Wang, Y., Xu, X. A Doxorubicin-induced Cardiomyopathy Model in Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (136), e57567, doi:10.3791/57567 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

דג זברה בוגרת גנטית נגיש (רזבורה rerio) יותר ויותר שימש כמודל חוליות להבנת מחלות אנושיות כגון שריר הלב. בשל הנוחות amenability כדי מניפולציות גנטיות תפוקה גבוהה, הדור של קרדיומיופתיה רכשה מודלים, כגון המודל דוקסורוביצין-induced קרדיומיופתיה (DIC) בדג זברה למבוגרים, פותח את דלתות השדרות מחקר חדש, לרבות גילוי סימני פיסוק שריר הלב באמצעות בדיקה גנטית קדימה. שונה מהמודל DIC דג זברה עובריים, חריפה הראשונית והן לאחר מכן כרונית השלבים של שריר הלב יכול להיקבע במודל DIC דג זברה למבוגרים, המאפשרת לימוד מנגנוני איתות תלויי-הבמה אסטרטגיות טיפוליות. עם זאת, ניתן להשיג תוצאות משתנה עם המודל הנוכחי, אפילו בידי חוקרים מנוסים. כדי להקל על יישום העתידי של המודל DIC, אנו מציגים פרוטוקול מפורט כיצד ליצור מודל זה DIC בדג זברה בוגרת. ומתארות שתי דרכים חלופיות בקרום הבטן הזרקה (IP). בהמשך נדון אפשרויות כיצד להפחית וריאציות כדי להשיג תוצאות אמינות ואת לספק הצעות כיצד לפרש את התוצאות בהתאם.

Introduction

דוקסורוביצין (DOX), גם בשם Adriamycin, פותחה כמו תרופה אנטי-אמצעים מאז שנות ה-601,2. עכשיו זה עדיין בשימוש פעיל בשם כימותרפית חשוב עבור קשת רחבה של גידולים. עם זאת, יישום קליני של DOX היה הקשו על ידי שלה רעילות למינון, במיוחד cardiotoxicity מאופיין על ידי הסימפטומים משתנים החל שינויים electrocardiographic ללא תסמינים דלקת כרום הלב ולא מפוצה קרדיומיופתיה 1 , 2. עד כה, הועלו השערות הגדולות לפחות שלושה להסביר DIC, כולל חמצן תגובתי מופעל מינים (ROS)1,3,4,5, עיכוב של טופואיזומראז II-β ( 6,TOP2β)7, ו אפנון של סידן תאיים שחרור1,8,9. לצבירת ראיות גם מרמזת על נטייה גנטית מהווה גורם סיכון מרכזי DIC10,11,12,13. זהויות גנים הקשורים נטיות אלה DIC, לעומת זאת, נותרים אינו מודע לקיומם. Dexrazoxane הוא היחיד אדג'וונט סוכן שאושרו על ידי מינהל המזון והתרופות האמריקני (FDA) לטיפול DIC, אבל עם יישום מוגבל14,15,16, דבר המלמד את הצורך לזהות נוספים אסטרטגיות טיפוליות. מודלים חייתיים של DIC נידונות ולכן למטרות אלו. בשל הנגישות שלהם ואת הפשטות, מחקרים מכניסטית בדגמים DIC יכול באופן פוטנציאלי יש רחבה יותר השפעות על סוגים אחרים של cardiomyopathies: פתוגנזה נפוצה עשוי להיות משותף בין cardiomyopathies של חבלות מסיבות שונות, במיוחד בזמן מאוחר יותר שלבים פתולוגיים17,18,19,20.

בנוסף מודלים מכרסם של DIC, פותחו מודלים DIC דג זברה עם תפוקה גבוהה יותר כדי להקל על הגילוי של גורמים גנטיים חדשים והן הרפוי. מודל DIC עובריים הוקם העוברים דג זברה שקוף לסינון תרכובות טיפולית21. בהתחשב בכך cardiomyopathies הן מחלות תחילת למבוגרים עם הפתוגנזה פרוגרסיב, קרדיומיופתיה דג זברה בוגרת מודלים כבר פיתח22,23,24,25,26. אנחנו שנוצר המודל רכשה הראשון הנובע אנמיה כרונית24, ואחריו DIC כמודל קרדיומיופתיה רכשה השני דג זברה בוגרת23של שריר הלב. מצאנו כי הזרקה של סיילין יחיד DOX לתוך דג זברה בוגרת המניע cardiotoxicity המורכב שלב אקוטי בערך בתוך 1 בשבוע שלאחר ההזרקה (wpi), בעקבות שלב כרונית של שריר הלב עד 6 חודשים לאחר ההזרקה. בעוד haploinsufficiency של מטרת rapamycin מכניסטית(mtor) המשפרת את שריר הלב בשלב כרוני, היא מגזימה תמותת דגים בשלב אקוטי, דבר המלמד את הערך של המודל DIC למבוגרים להבחין תלויי-שלב מנגנונים23. אנחנו עוד יותר הוכיח כי המודל DIC למבוגרים יכול לשמש כדי להדגיש אוסף של דג זברה insertional לב (ZIC) המוטנטים שנוצרו באמצעות גישה המבוסס על transposon מוטגנזה מכוונת insertional27. מסך פיילוט זיהה 3 גנים ידועים של שריר הלב, כמו גם DnaJ (Hsp40) homolog, תת משפחה B וחבר 6b (dnajb6b) כמו חדש DIC הרגישות גנים28. לכן, הדור של המודל DIC למבוגרים בדג זברה הוביל מתודולוגיה חדשה המאפשרת זיהוי ממגבילי גנטיים עבור DIC, אשר משלים את הגנום כולו האגודה קיים מחקר (GWAS) ואת לוקוס תכונה כמותית (QTL באופן שיטתי ) ניתוח.

בתקופת הדור, יישומו של המודל DIC דג זברה למבוגרים, הבחנו וריאציות משמעותית בקרב חוקרים שונים ו/או אפילו בין זריקות שונות שביצע החוקר אותו. הטבע האורך של המודל מטיל אתגרים רישום תוצאות של חוקרים שונים, את תהליך פתרון הבעיות רציפים. כדי להקל על השימוש פשוט בתדר קרדיומיופתיה מתח שיטה זו על ידי קהילת המחקר, אנו מתארים את הפרוטוקול שלנו בפירוט, נוכח שני סוגים של הזרקת ה-IP, ולדון שיקולים להפחית וריאציות בקרב חוקרים שונים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים המתוארים כאן בוצעו על פי המדריך על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה (הלאומי באקדמיות העיתונות-2011), הן אושרו על ידי מאיו קליניק טיפול חיה מוסדיים ועל שימוש הוועדה.

1. הכנת דג זברה בגיר

  1. להגדיר זוגות רבייה מספיק למעבר טנקים לרכוש לפחות כפול כמו הדגים הכולל לצורך הזרקת DOX. אם משווים דגים עם רקע גנטי שונה, מתרבים כל הדגים בתוך באותו שבוע כדי להבטיח בקרת תואמות גיל.
  2. לאסוף את העוברים דגים בבוקר שלמחרת, להעביר אותם ל 100 מ מ פטרי, ולשמור אותם בתוך חממה 28.5 ° C. לשמור על העוברים על צפיפות נמוכה (< 100 עוברי/צלחת פטרי).
  3. רענון המים העובר מדי יום כדי למנוע חוסר איזון סקס, להסיר באופן ידני את הביצים מת במועד באמצעות פיפטה של העברה.
  4. הזן את אותו המספר של העוברים בכל טנק (לדוגמה, בתחילה כל טנק בינוני עוברי/3 L 60) כדי להבטיח בקרת צפיפות התאים.
  5. להתחיל paramecia האכלה ב 4 ימים לאחר ההפריה (dpf).
  6. בדוק את הדגים מדי יום במהלך השלב לנוער. להתאים את מספר הדגים לפי הצורך כדי להבטיח דגים דומה בצפיפות.
  7. כאשר הדגים מגיעים בגיל 4 שבועות, להעביר עד 20 דגים לתוך טנק בינוני חדש אחד 3 L לצמיחה נוספת. להתחיל להאכיל את הדג עם שרימפסים המקווקו בשידור חי.

2. הכנה ואיחסון של פתרון מניות DOX

הערה: DOX ניתן לרכוש מחברות ביו שונות. המתחם נרכשת בדרך כלל כאבקה במיכלים חום כהה.

  1. ביסודיות להמיס את האבקה DOX במים מיוננים כדי להבטיח שגושים לא גלויים, עם ריכוז הסופי של 5 מ"ג/מ"ל כפתרון מניות. Aliquot 1 מ"ל של מניות DOX לתוך כל שפופרת מנעול כספת 1.5 mL. לעטוף את הצינורות 1.5 mL בנייר רדיד אלומיניום כדי להגן על DOX מפני חשיפה קלה.
    הערה: לבצע שלב זה ברדס כימי.
  2. שמור את הפתרון מניות DOX ב 4 ° C עבור אחסון. לאחסון לטווח ארוך (> 4 שבועות) של פתרון מניות DOX, לבצע את 3 המקטע אופציונלי המתוארים להלן.

3. בקרת איכות של DOX באמצעות דג זברה עוברי (אופציונלי)

הערה: DOX הוא שני לחות אור-והרגיש, כך הוא יכול לאבד את יעילותה סמים עבור מידול DIC לאחר אחסון מורחבים. עבור DOX לרכוש מחברות שונות, או קבוצות שונות אפילו מאותה חברה, זה שימושי לכייל את יעילותה סמים באמצעות פראי-סוג (WT) דג זברה העוברים לפני ביצוע הניסויים על דגים למבוגרים. שיטה זו נגזרת של דג זברה שדווחה עובריים DIC דגם21.

  1. לאסוף WT דג זברה עוברי לפחות 2 זוגות של דגים. Dechorionate עוברי-24 שעות לאחר ההפריה (hpf) באופן ידני באמצעות מזרק עם מחט מיקרו. לחלופין, התייחס העובר עם proteinase K-הריכוז הסופי של µg/mL 10 למשך 10-15 דקות בחממה 30 מעלות צלזיוס. רענן את המים העובר לאחר dechorionation. להסיר את עוברי המת ולשמור על עוברי לפחות 36 של כל אצווה.
  2. לדלל את הפתרון מניות DOX במים טריים העובר כדי ריכוז סופי של 100 מיקרומטר. אמצעי האחסון של פתרון נמצא µL 100 עבור כל העוברים 3. מערבבים את הפתרון DOX מדולל על ידי מערבולת. הפתרון מדולל הסופי צריך להיות אור, צבע אדום.
  3. להוסיף 100 µL טוב של פתרון DOX מדוללת של צלחת נקי 96-ובכן שקוף.
  4. לקחת 3 עוברי dechorionated עם פיפטה העברת פלסטיק, ולשמור את העוברים קרובה לסוף של קצה פיפטה. מכניסים את הטיפ פיפטה מכל קידוח בעזרת DOX פתרון. תן סוף הטיפ לגעת הפתרון ולאפשר את העוברים לשחות לתוך הבאר.
    הערה: להימנע באופן ידני דוחף את העוברים, אשר להוסיף עוד מים לתוך הבאר, לדלל את הפתרון DOX.
  5. לרענן את הפתרון DOX ב 48 hpf. בזמן הזה, להתבונן הבארות תחת מיקרוסקופ עם 10 X הגדלה לזיהוי עוברי המת (הפסקת פעימות הלב) או עוברי עם בצקת. לספור ולהסיר כל העוברים מת במועד, אחרת העוברים הנותרים חשופים הפתרון עם עוברי המת יכול למות מהר גם כן.
  6. בדוק את העוברים-72 hpf ולספור אותם. הטיפול DOX נחשב "יעילות התרופה טובה" אם > 25% מוות (הפסקת דופק) יכול להיות שנצפו בשתי קבוצות של העוברים.

4. הזרקת טרום הכנה

הערה: דגים של 8 שבועות כדי בגיל 6 חודשים משמשים להזרקה DOX. משקל הגוף (BWs) דג התבגר קריוטיפ אינדיאני פראי (WIK) כדי להיות מוזרק יכול לנוע בין 0.2-0.5 g.

  1. מהר את הדג במשך 24 שעות לפני ההזרקה.
  2. עזים ומתנגד הדג עם העובר מים המכילים tricaine 0.16 מ"ג/מ"ל. להשתמש בנייר סינון נקיה לייבוש המים משני צידי הגוף. למדוד את BW של כל דג בקנה מידה. קבוצת דגים בתוך 10% הבדל ב BW יחד להזרקה מאוחר יותר.
    הערה: כדי למזער את עומס העבודה בשלב זה, דג בתוך 10% הבדל ב BW נחשבים באותה המידה; לכן, להכין אחד DOX הפתרון עובד לפי הממוצע שלהן BW.
  3. תכנית להחדיר כל דג בוגר 5 µL של פתרון. חשב את הריכוז בעבודה DOX לפי BWs ובמספרים דגים.
    הערה: ללמוד cardiotoxicity כרונית למעלה לחצי שנה, השתמש DOX במינון של 20 מ"ג/ק"ג. ללמוד cardiotoxicity חריפה של DOX, ניתן להגדיל את המינון DOX עד 50 מ"ג/ק"ג של BW.
  4. לדלל את המניה DOX 1 x של האנק מאוזנת תמיסת מלח (HBSS) עבור ריכוזים עבודה המתאימה. מערבולת לערבב את הפתרון. בקצרה ספין למטה כדי לאסוף את הפתרון.

5. DOX הזרקת בדגים הבוגרים

  1. המקום נקי 100 מ"מ צלחת פטרי עם ספוג בפנים, מתחת למיקרוסקופ לנתיחה, ואז להתאים את המוקד. חותכים את הספוג לעשות חור של כ 4 ס מ אורך להחזיק דג. לעשות חור יותר עבור דג גדול יותר.
  2. מכינים מחט 34 G עם 10 µL מיקרו-מזרק. יש לשטוף את המחט עם מאגר x HBSS 1 כדי להסיר את כל הבועות של רחובות מן המזרק אבובים.
  3. עזים ומתנגד של הדגים הבוגרים העובר מים המכילים 0.16 מ"ג/מ"ל tricaine למשך 2 דקות.
    הערה: ההרדמה ממושכת מעל 5 דקות ולאחריו DOX הזרקת יכולה בקלות לגרום דג המוות.
  4. משרים את הספוג במים העובר עם tricaine, ולהעביר את הדג על גבי הספוג להזרקה.
  5. לבצע הזרקת IP DOX באמצעות אחת משתי השיטות המתוארות להלן.
    1. IP קלאסי הזרקת29
      1. מקם את הדג עם הבטן למעלה בחלל של הספוג. במהירות הוספה המחט, עם 45° זווית לגוף דגים לתוך האמצע בין הסנפירים האגן, ולחדור כ 1-2 מ מ. לשחרר לאט לאט כל פתרון DOX. חכי 5 s לפני הוצאת המחט. בדוק את המשלוח DOX באמצעות צבע אדום גלוי בבטן הדג.
    2. הזרקת IP חלופית
      1. מניחים את הדג רוחבית על גבי הספוג עם הקדמי בצד ימין. בעדינות לייצב את הדג בעזרת מלקחיים הקהה של יד שמאל, והחזק את המזרק-המיקרו עם יד ימין.
      2. מקם את המחט מתחת לקו לרוחב מעל האגן סנפיר, עם שפוע פונה כלפי מעלה. מצביע על המיקום בשעה שבע בזווית של 45°, את המחט 3-4 מ"מ עד חלל דגים הממוקם בין של אגן הירכיים את הסנפירים אנאלי, ואז לאט לאט את הבוכנה. בדוק את המשלוח DOX באמצעות צבע אדום גלוי בבטן הדג.
  6. במהירות העברת הדגים מוזרק מעבר נקי למיכל מלא במים טריים מערכת כדי לאפשר את הדגים לשחזר. יש לשטוף את המחט פעם אחת עם מאגר x HBSS 1 בין זריקות.

6. שלאחר הזרקת דגים ניהול

  1. לאחר ההזרקה, להחזיר את הדגים למערכת עם הפעלת זרימת הדם. במידת האפשר, לשמור על דגים שטופלו DOX בנפרד מהמערכת המרכזית כדי למנוע זיהום צולב בין טנקים שונים המשתפים את זרימת הדם.
  2. מהר את הדג מוזרק עוד 24 שעות להתאוששות. לבחון את הדגים מדי יום במהלך השבוע הראשון. הסר את הדג מת במועד כדי למנוע זיהום דגים אחרים.
    הערה: דגים מותם בתוך 24 השעות הראשונות צפויות בשל נגעים פיזיים שנגרמו על ידי ההזרקה.
  3. עוד יותר לשמור על הדגים הדגיש DOX עבור תצפיות האורך. הסר דגים מתים בזמן כדי למנוע זיהומים אחרים דגים במיכל.
    הערה: מספרי דגים מתועדים ליצירת עקומת הישרדות.
  4. השתמש מבחני ניסיוני שונים כדי פנוטיפ הדג הדגיש DOX, כגון אקוקרדיוגרפיה30, תפקוד הלב כתב מהונדס קו23, שחייה אתגר26, כימות של שיפוץ פתולוגיים אחרים סמני23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כאן, שתי שיטות לביצוע הזרקה IP למודל DIC בדג זברה בוגרת מוצגים. תוך שימוש קלאסי, מבוססת IP הזרקת שיטת29, צוין כי הפתרון DOX מוזרק (צבע אדום) יכול לפעמים מתריסה החוצה מהמיקום שבו חדרו המחט. הזריקה IP חלופית משתמש במיקום שונה לתקוע מחט זה 3-4 מ מ בלבד הצפק איפה DOX הוא שוחרר (איור 1 א'), ביעילות המונעת את בריחת (איור 1B, 1 ג). מסירה מוצלחת של DOX לתוך הצפק עבור שתי שיטות שמעידים הפצה מהירה של צבע אדום ברחבי בבטן הדג, הגלויה לעין בצד הנגדי של מיקומה הזרקה.

הזרקה של DOX עצומות-50 מ"ג/ק"ג בשיטת ה-IP חלופית מוביל רעילות חמורות, שבו מרבית הדגים ימותו תוך שבוע (איור 2). לעומת זאת, הזרקה של DOX עצומות-20 מ ג/ק ג באמצעות הגורמים שיטת ה-IP חלופית כמעט אין המוות דג במהלך 2 השבועות הראשונים ומוות דגים ~ 10% ב 4 wpi (איור 3 א). הזרקה של DOX עצומות-20 מ"ג/ק"ג בשיטת ה-IP קלאסי תערוכות ~ 30% מוות דגים ב 4 wpi (איור 3C). דגים הזריק אחת מהשיטות התערוכה מוות ~ 20% דגים דומים 4 wpi עד 10 wpi (איור 3B, יח).

לנו יש ממונף את קספר ; Tg(cmlc2:nusDsRed) דגים כדי להעריך את ההתקדמות של תפקוד הלב ב- DIC מודל (איור 4A)23. גוף שקוף מאפשר תיעוד של לב אדום-סיסטולי (איור 4B) והן הדיאסטולי שלבים (איור 4C) תחת מיקרוסקופ נמכרות. לאחר הזרקה של 20 מ"ג/ק"ג DOX בשיטת ה-IP חלופית, התדרדרות תפקוד ניתן להבחין החל מ- 4 wpi (איור 4D).

Figure 1
איור 1: הזרקת מסלולים. זריקה (1A) השרטוטים של הזריקה IP קלאסי (b) ו- IP חלופית () שיטות. העיגול האדום מציין את DOX נפוצות שחרור האתר עבור הזרקה שתי השיטות. עיגולים ירוקים מציינים את האתרים חדירה של המחט. המרחקים מוערכים בהתבסס על דגים WIK למבוגרים במשקל של 0.3 ג' (1 ב, 1 ג) נציג תוצאות המציין משלוח DOX מוצלח באמצעות שתי שיטות הזרקה בקרום הבטן. אדמומיות בפנים בבטן הדג למבוגרים ניתן לציין מיד לאחר ההזרקה. דגים מוזרק נבדקו שוב לאחר 5 דקות השחזור של מים טריים המערכת. HBSS: של האנק x 1 מאוזן תמיסת מלח. דג זברה WT WIK הועסקו. סרגל קנה מידה: 5 מ מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: הישרדות נציג עקומות של דג זברה בוגרת בעקבות הלחץ DOX עם הזרקת DOX 50 מ"ג/ק"ג. מוצגות 3 קבוצות של זריקות DOX בקבוצות שונות של דגים למבוגרים WT בגיל 3-6 חודשים. ב- n, סה כ = 24 דגים הועסקו קבוצת הביקורת x HBSS 1, ו- n = 8 דגים היו מועסקים בכל אצווה הזריק DOX. אין הבדל דגים שרידים למשהו שקיים עד נרשמו בין הזרקת שתי השיטות. דג זברה WT WIK הועסקו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: הישרדות נציג עקומות של דג זברה בוגרת בעקבות הלחץ DOX עם הזרקת DOX 20 מ"ג/ק"ג, ההשוואה בין שתי שיטות הזרקה בקרום הבטן. ההישרדות (3A) דגים בתוך 0-4 שבועות לאחר DOX משלוח על ידי הזרקת בקרום הבטן קלאסי. אחוז דגים מספר בשבוע 0 נחשב 100%. (3B) דג הישרדות לאחר 4 שבועות פוסט משלוח DOX בזריקה בקרום הבטן קלאסי. אחוז דגים מספר בשבוע 4 נחשב 100%. (3 ג) דג הישרדות בתוך 0-4 שבועות בעקבות משלוח DOX בזריקה בקרום הבטן חלופי. אחוז דגים מספר בשבוע 0 נחשב 100%. (3D) דג הישרדות לאחר 4 שבועות בעקבות משלוח DOX בזריקה בקרום הבטן חלופי. אחוז דגים מספר בשבוע 4 נחשב 100%. הנתונים המוצגים (3A) (3B) הם 9 שונים בקבוצות DOX הזרקה של דג רקק מוזרק 223-גיל 3-6 חודשים. הנתונים המוצגים (3 ג) ו- (3D) נמצאים 14 שונים בקבוצות DOX הזרקה של דג רקק מוזרק 335 בגיל 2-6 חודשים. המספרים של דגים חיים נרשמים מדי שבוע. קווי שגיאה לייצג סטיית תקן באחוזים של הישרדות בין קבוצות שונות-כל שבוע. דג זברה WT WIK הועסקו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: הערכת תפקוד הלב נציג בעקבות הלחץ DOX באמצעות קספר ; Tg(cmlc2:nusDsRed) דגים. קספר (4A) תמונה של מבוגר ; Tg(cmlc2:nusDsRed) דגים. סרגל קנה מידה = 1 ס מ. (4B) נציג תמונה של החדר האדום בשלב סוף סיסטולי של קספר התבגר ; Tg(cmlc2:nusDsRed) דגים. מקף קו מייצג סוף סיסטולי קוטר (ESD). (4 C) נציג דימוי החדר האדום בשלב הדיאסטולי סוף של קספר התבגר ; Tg(cmlc2:nusDsRed) דגים. תמונות (4B) ו- (4 C) היו שחולצו מן הסרטים של לב פועם שנתפסו עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי לנתיחה באמצעות הגדלה x 6.3. מקף קו מייצג סוף דיאסטולי קוטר (EDD). סרגל קנה מידה = 1 מ מ. (4 יח) נציג לב פונקציה נמדד באמצעות קספר ; Tg(cmlc2:nuDsRed) דג זברה בוגרת לאחר ההזרקה DOX 20 מ"ג/ק"ג. EDD, ESD נמדדו כפי שמוצג (4B) ו- (4 C) דגים בודדים, ועל חדרית שבר לינוק מחושבת באמצעות הנוסחה (EDD − ESD) / אריה קנטור. משמעותית ירידה שבר חדרית קיצור זוהתה ב 4 שבועות ולאחר מכן. השתמשו בשיטת בקרום הבטן חלופי. הערכים מוצגים השגיאה הסטנדרטית זאת אומרת ±. n ≥ 3 בכל קבוצה. במבחן t התלמיד שימש השוואה של שתי הקבוצות. p < 0.05. הדמויות שונו מ דינג. et al. 23 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

המודל של DIC מתקדמת, המינון של 20 מ"ג/ק"ג DOX נקבע ניסיוניים בתור המינון הגבוה גורם המוות דגים משמעותית במהלך 1 wpi אבל עדיין תוצאות במוות דגים וצמצום של תפקוד הלב לאחר wpi 4 (איור 3 ו איור 4C). מנה זו משולה אלה המשמשות לעתים קרובות במודלים DIC מכרסמים (15-25 מ"ג/ק"ג), המינון המצטבר מגבלת בבני אדם (550 mg/m2, אשר שווה ל 15 מ"ג/ק"ג)4,7,31,32 , 33. במינונים גבוהים של DOX, כגון 50 מ"ג/ק"ג, להראות מוות דגים משמעותית במהלך 1 wpi, ולכן הם יכולים לשמש כדי ללמוד רק אקוטי לב רעילים התגובות DOX23,28.

במהלך היישום של מודל זה DIC, שמנו לב כי היה קשה חוקרים חדשים כדי לשכפל את אותן תוצאות בתחילה. אפילו עבור חוקרים מנוסים, בקשר 20 אחוז וריאציה של התמותה בשלב כרוני עדיין ניתן למצוא בין זריקות שונות (איור 3), המציין uncharacterized הגורמים הביולוגיים מבלבלים במודל הנוכחי. למרות פחות מודל מושלם, אנו עדיין מאמינים כי מודל זה-DIC הנוכחית מספיקה להפוך גילוי הקול בגלל הראיות הבאות. ראשית, לאחר מספר שיטות, תוצאות מהמודל DIC יכול להיות מאוחר יותר רשום בקרב רוב, אם לא כולם, החוקרים. שנית, בהתבסס על מודל זה DIC, זיהינו 4 מכפילי גנטי משמעותי. הראיות הקיימות מדוחות ספרות נתמך 3 מהם כמו שריר הלב הגנים34,35,36,37. 4th אחד הוא DnaJ homolog תת B חבר 6 (DNAJB6), אשר הוכח להיות גן קרדיומיופתיה חדש הנתמך על-ידי המחקר הגנטי האנושי28. לפיכך, אנו מסיקים כי התוצאות על סמך אינטרה-ניסיוני קבוצות באמצעות פקדי והטכני תואם גיל הם עדיין מאוד לחזור עליהם, אף על פי המודל DIC במתכונתה הנוכחית אינה אמינה להשוואה בין ניסיוני.

הגורמים מבלבלים שתורמים חוסר העקביות שנצפתה המודל הנוכחי שלנו DIC עשוי לכלול את הדברים הבאים: הזדקנות (1), ההבדל בין המינים היו נחשבים בתור מכריע גורמי סיכון למחלות לב וכלי דם כולל DIC38, 39,40. בעוד cofounders ממוצע הן נשארות להיבדק במודל שלנו במיוחד, לב כי בגילאי דגים נוטים להיות יותר רגישים DOX רעילות (נתונים לא מוצג). הווריאציות אצווה אינטר שנמדדו באמצעות שתי השיטות IP (איור 3) הם גם סביר תרמו cofounders שני אלה. (2) שונה של דגמים בעלי חיים גדולים, גודל דג זברה למבוגרים הוא קטן. לפיכך, מקומי שנגרם על ידי הזרקת DOX יכול להיות חמור יותר ומשתנה. (3) מותו של דגים מוזרק עשוי לנבוע DOX רעילות באיברים אחרים (למשל, רעילות כליות), בנוסף הלב. בעוד ניסויים תוכנן בקפידה יותר נדרשים לפנות את כל הגורמים מבלבלים, עבודה קודמות עולה כי ואזהרות הבאים תסייע להפחית וריאציות פנוטיפי: ראשית, זה קריטי כדי להבטיח את היעילות של DOX. אבקת DOX להחזיקה תמיד באזור יבש וכהה, ויש פתרונות לטפל בזהירות כדי לצמצם חשיפה לאור. מומלץ כי פתרונות עבודה DOX להיות מוכן טרי כל פעם לפני הזרקת דגים. אנחנו בדרך כלל לא משתמשים פתרונות DOX מניות לאחר 4 שבועות באחסון. . כשיש ספק, לבצע את 3 המקטע אופציונלי לפרוטוקול זה באמצעות מודל DIC עובריים מהירה כדי לכייל את התרופות היעילות של כל אצווה DOX. שנית, דגים למבוגרים סינכרון היא גורלית. המתח דגים אותו צריך להיות העלו ב צפיפות זהה, כדי להבטיח גודל גוף דומה. אנחנו לאחר מכן מראש לבחור דג עם BWs דומה לחישוב מינון. מומלץ לשמור על דגים לפחות פי שניים סה עבור הליך מיון מוקדם. כל הדגים הם צמתי במשך 24 שעות לפני תהליך מיון מוקדם. שלישית, מומלץ תמיד להשתמש דגים בעלי גיל דומה, וכדי סקס את הדג לפני הזרקת DOX בשל שיעורי צמיחה שונים שלהם פוטנציאל שונים התגובות לב DOX.

שמנו לב כי הרוב המכריע של מסקנות לא עקבית יכולה ולשייך קבוצת ביקורת מפוקפק. לכן, אנו ממליצים חוקרים חדשים למודל DIC כדי זריקות DOX תרגול לפני ביצוע ניסויים אמיתיים. כאשר 20 מ"ג/ק"ג DOX מוזרק באמצעות שיטת הזרקת IP חלופית, טכניקה בזריקה טובה יכול תסומן באמצעות מוות דגים קרוב לאפס במהלך wpi 1 של DOX ושיעור התמותה יחסית עקבית ב 2-3 חודשים פוסט-DOX הזרקה. הראיות האולטימטיבי להכנת דגמים מוצלחים כל ההפחתה של מדד הלב-פונקציונלי, אשר יכול להיות לכמת באמצעות אקוקרדיוגרפיה25,30, באמצעות תיעלם ; Tg(cmlc2:nusDsRed) קו מהונדס, או על ידי שימוש פיתח ex-vivo-המבוסס על תפקוד הלב assay (מידע לא מוצג).

בנוסף הזריקה IP, נתיבים משלוח סמים אחרים כגון הזרקת רטרו-מסלולית41, אורלי האכלה42, דגירה מים משמשים לעתים קרובות גם דג זברה למבוגרים. לא אימצנו את הגישה הזרקת רטרו-מסלולית, למרות שלו שחרור הסמים ישיר למערכת מחזור הדם, עקב חוסר שיטה לאימות משלוח סמים מוצלח, כמו האדמומיות של DOX יכול להיות בקלות על ידי רעולי פנים דימום פוטנציאליים. ניסינו פרוטוקול משלוח אוראלי דרך הטמעת DOX עם גלוטן שנספג42, אשר היה מעורב עם ארוחות להאכיל דגים למבוגרים. למרבה הצער, עם עד המינון המצטבר של 150 מ"ג/ק"ג בשימוש בתוך תקופת האכלה של 4 שבועות, לא נתבונן בכל cardiotoxicity חמורה, רומז לחוסר היעילות של משלוח אוראלי DOX. לחלופין, טכניקת gavage אוראלי יכול להיות עוד יותר בחנו43. יתר על כן, הפרוטוקול דגירה של השריית הדג בתמיסה המכילה DOX הוא גם התוואי משלוח פוטנציאלי יכול להיבדק גם בעתיד.

אנו להכיר שאחת המגבלות הגדולות של המודל DIC הנוכחי היא שיטת הזרקת בולוס יחיד, אשר יכול לגרום רעילות גבוהה ונזק מקומית לאיברים הפנימיים. גישה זו תוכננה כדי להפחית את עומסי העבודה וכדי להגדיל את התפוקה, כך הקרנה גנטי יכול להתבצע על תפוקה גבוהה דגים בוגרים28. בעתיד, מודלים עם זריקות מרובות של DOX במינון נמוך צריך להיות נרדף, אשר מסכם את הדברים טוב יותר של DIC שנצפתה חולי סרטן שטופלו עם כימותרפיה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים אין קונפליקטים של אינטרסים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי מענק פיתוח מדען של איגוד הלב האמריקני (14SDG18160021 כדי הסתייגות), R01 NIH ארה ב מעניקה HL 81753 HL 107304 ל XX ואת לקרן מאיו XX.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Crossing tank Aquaneering ZHCT100 Fish breeding
Incubator ThermoFisher Maintaining embryo
3 L medium tank Aquaneering ZT280 Maintaining fish
Paramecia Carolina 131560 Food for juvenile fish
Live hatched brine shrimp in house Food for adult fish
Doxorubicin hydrochloride Sigma D1515-10MG
1.5 ml safe-lock tube Eppendorf No. 022363204 For drug storage
Aluminum foil paper Fisher 1213104 For preventing light exposure
Proteinase K Roche No. 03115887001 For dechorionating embryo
Hank's balanced salt solution (HBBS) ThermoFisher 14025076 Vehicle for DOX
100 mm petri dish Falcon 431741
10 μL NanoFil micro-syringe WPI NANOFIL For injection
34 gauge needle WPI NF34BV-2 For injection
Tricaine Argent MS-222 Anesthetizing fish
96 well plate Costar 3539 For embryo drug treatment
Transfer pipette Bel-art product F37898 For transfering embryo

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Octavia, Y., et al. Doxorubicin-induced cardiomyopathy: from molecular mechanisms to therapeutic strategies. J Mol Cell Cardiol. 52, (6), 1213-1225 (2012).
  2. Singal, P. K., Iliskovic, N. Doxorubicin-induced cardiomyopathy. N Engl J Med. 339, (13), 900-905 (1998).
  3. Angsutararux, P., Luanpitpong, S., Issaragrisil, S. Chemotherapy-Induced Cardiotoxicity: Overview of the Roles of Oxidative Stress. Oxid Med Cell Longev. 795602 (2015).
  4. Ichikawa, Y., et al. Cardiotoxicity of doxorubicin is mediated through mitochondrial iron accumulation. J Clin Invest. 124, (2), 617-630 (2014).
  5. Zhang, Y. W., Shi, J., Li, Y. J., Wei, L. Cardiomyocyte death in doxorubicin-induced cardiotoxicity. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 57, (6), 435-445 (2009).
  6. Sawyer, D. B. Anthracyclines and heart failure. N Engl J Med. 368, (12), 1154-1156 (2013).
  7. Zhang, S., et al. Identification of the molecular basis of doxorubicin-induced cardiotoxicity. Nat Med. 18, (11), 1639-1642 (2012).
  8. Dodd, D. A., et al. Doxorubicin cardiomyopathy is associated with a decrease in calcium release channel of the sarcoplasmic reticulum in a chronic rabbit model. J Clin Invest. 91, (4), 1697-1705 (1993).
  9. Mitry, M. A., Edwards, J. G. Doxorubicin induced heart failure: Phenotype and molecular mechanisms. Int J Cardiol Heart Vasc. 10, 17-24 (2016).
  10. Aminkeng, F., et al. A coding variant in RARG confers susceptibility to anthracycline-induced cardiotoxicity in childhood cancer. Nat Genet. 47, (9), 1079-1084 (2015).
  11. Deng, S., et al. Dystrophin-deficiency increases the susceptibility to doxorubicin-induced cardiotoxicity. Eur J Heart Fail. 9, (10), 986-994 (2007).
  12. Leong, S. L., Chaiyakunapruk, N., Lee, S. W. Candidate Gene Association Studies of Anthracycline-induced Cardiotoxicity: A Systematic Review and Meta-analysis. Sci Rep. 7, (1), 39 (2017).
  13. Wasielewski, M., et al. Potential genetic predisposition for anthracycline-associated cardiomyopathy in families with dilated cardiomyopathy. Open Heart. 1, (1), e000116 (2014).
  14. Lebrecht, D., et al. Dexrazoxane prevents doxorubicin-induced long-term cardiotoxicity and protects myocardial mitochondria from genetic and functional lesions in rats. Br J Pharmacol. 151, (6), 771-778 (2007).
  15. QuanJun, Y., et al. Protective Effects of Dexrazoxane against Doxorubicin-Induced Cardiotoxicity: A Metabolomic Study. PLoS One. 12, (1), e0169567 (2017).
  16. Seifert, C. F., Nesser, M. E., Thompson, D. F. Dexrazoxane in the prevention of doxorubicin-induced cardiotoxicity. Ann Pharmacother. 28, (9), 1063-1072 (1994).
  17. Adams, J. W., et al. Enhanced Galphaq signaling: a common pathway mediates cardiac hypertrophy and apoptotic heart failure. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, (17), 10140-10145 (1998).
  18. Bowles, N. E., Bowles, K. R., Towbin, J. A. The "final common pathway" hypothesis and inherited cardiovascular disease. The role of cytoskeletal proteins in dilated cardiomyopathy. Herz. 25, (3), 168-175 (2000).
  19. Kroumpouzou, E., et al. Common pathways for primary hypertrophic and dilated cardiomyopathy. Hybrid Hybridomics. 22, (1), 41-45 (2003).
  20. Towbin, J. A., Bowles, K. R., Bowles, N. E. Etiologies of cardiomyopathy and heart failure. Nat Med. 5, (3), 266-267 (1999).
  21. Liu, Y., et al. Visnagin protects against doxorubicin-induced cardiomyopathy through modulation of mitochondrial malate dehydrogenase. Sci Transl Med. 6, (266), 266ra170 (2014).
  22. Asimaki, A., et al. Identification of a new modulator of the intercalated disc in a zebrafish model of arrhythmogenic cardiomyopathy. Sci Transl Med. 6, (240), 240ra274 (2014).
  23. Ding, Y., et al. Haploinsufficiency of target of rapamycin attenuates cardiomyopathies in adult zebrafish. Circ Res. 109, (6), 658-669 (2011).
  24. Sun, X., et al. Cardiac hypertrophy involves both myocyte hypertrophy and hyperplasia in anemic zebrafish. PLoS One. 4, (8), e6596 (2009).
  25. Sun, Y., et al. Activation of the Nkx2.5-Calr-p53 signaling pathway by hyperglycemia induces cardiac remodeling and dysfunction in adult zebrafish. Dis Model Mech. 10, (10), 1217-1227 (2017).
  26. Yang, J., Shah, S., Olson, T. M., Xu, X. Modeling GATAD1-Associated Dilated Cardiomyopathy in Adult Zebrafish. J Cardiovasc Dev Dis. 3, (1), (2016).
  27. Ding, Y., et al. Trapping cardiac recessive mutants via expression-based insertional mutagenesis screening. Circ Res. 112, (4), 606-617 (2013).
  28. Ding, Y., et al. A modifier screen identifies DNAJB6 as a cardiomyopathy susceptibility gene. JCI Insight. 2, (8), (2017).
  29. Kinkel, M. D., Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E. Intraperitoneal injection into adult zebrafish. J Vis Exp. (42), (2010).
  30. Wang, L. W., et al. Standardized echocardiographic assessment of cardiac function in normal adult zebrafish and heart disease models. Dis Model Mech. 10, (1), 63-76 (2017).
  31. Desai, V. G., et al. Development of doxorubicin-induced chronic cardiotoxicity in the B6C3F1 mouse model. Toxicol Appl Pharmacol. 266, (1), 109-121 (2013).
  32. Zhu, W., Shou, W., Payne, R. M., Caldwell, R., Field, L. J. A mouse model for juvenile doxorubicin-induced cardiac dysfunction. Pediatr Res. 64, (5), 488-494 (2008).
  33. Chatterjee, K., Zhang, J., Honbo, N., Karliner, J. S. Doxorubicin cardiomyopathy. Cardiology. 115, (2), 155-162 (2010).
  34. Bang, C., et al. Cardiac fibroblast-derived microRNA passenger strand-enriched exosomes mediate cardiomyocyte hypertrophy. J Clin Invest. 124, (5), 2136-2146 (2014).
  35. Rassaf, T., Kelm, M. Protection from diabetic cardiomyopathy - putative role of the retinoid receptor-mediated signaling. J Mol Cell Cardiol. 59, 179-180 (2013).
  36. Wahbi, K., et al. Dilated cardiomyopathy in patients with mutations in anoctamin 5. Int J Cardiol. 168, (1), 76-79 (2013).
  37. Zhou, M. D., Sucov, H. M., Evans, R. M., Chien, K. R. Retinoid-dependent pathways suppress myocardial cell hypertrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, (16), 7391-7395 (1995).
  38. Hershman, D. L., et al. Doxorubicin, cardiac risk factors, and cardiac toxicity in elderly patients with diffuse B-cell non-Hodgkin's lymphoma. J Clin Oncol. 26, (19), 3159-3165 (2008).
  39. Silber, J. H., Barber, G. Doxorubicin-induced cardiotoxicity. N Engl J Med. 333, (20), 1359-1360 (1995).
  40. Von Hoff, D. D., et al. Risk factors for doxorubicin-induced congestive heart failure. Ann Intern Med. 91, (5), 710-717 (1979).
  41. Pugach, E. K., Li, P., White, R., Zon, L. Retro-orbital injection in adult zebrafish. J Vis Exp. (34), (2009).
  42. Zang, L., Morikane, D., Shimada, Y., Tanaka, T., Nishimura, N. A novel protocol for the oral administration of test chemicals to adult zebrafish. Zebrafish. 8, (4), 203-210 (2011).
  43. Collymore, C., Rasmussen, S., Tolwani, R. J. Gavaging adult zebrafish. J Vis Exp. (78), (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics