Microdissection de la captura del laser de la malla Trabecular muy pura de ojos de ratón para análisis de expresión génica

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Biology

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Summary

Aquí, describimos un protocolo para un microdissection de la captura del laser reproducible (LCM) para aislar la red trabecular (TM) para posteriores análisis de ARN. La capacidad de analizar los cambios en la expresión génica en el TM ayudarán en la comprensión de los mecanismos moleculares subyacentes de enfermedades oculares relacionadas con la TM.

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Sutherland, C., Wang, Y., Brown, R. V., Foley, J., Mahler, B., Janardhan, K. S., Kovi, R. C., Jetten, A. M. Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis. J. Vis. Exp. (136), e57576, doi:10.3791/57576 (2018).

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Abstract

Microdissection de la captura del laser (LCM) ha permitido el análisis de expresión génica de las células y enriquecido las poblaciones de la célula en secciones del tejido. LCM es una gran herramienta para el estudio de los mecanismos moleculares subyacentes de la diferenciación celular y el desarrollo y progresión de varias enfermedades, incluyendo el glaucoma. El glaucoma, que comprende una familia de neuropatías ópticas progresivas, es la causa más común de ceguera irreversible en todo el mundo. Cambios estructurales y daños en la malla trabecular (TM) pueden resultar en aumento presión intraocular (PIO), que es un factor de riesgo para desarrollar glaucoma. Sin embargo, los mecanismos moleculares precisos involucrados son todavía poco conocidos. La capacidad para realizar análisis de expresión génica será crucial en la obtención de más conocimientos sobre la función de estas células y su papel en la regulación del desarrollo IOP y glaucoma. Para lograr esto, un método reproducible para aislar altamente enriquecido TM de secciones congeladas de ojos de ratón y un método para el análisis de la expresión del gen aguas abajo, tales como RT-qPCR y RNA-Seq es necesario. El método descrito en el presente documento es desarrollado para aislar TM muy puro de ojos de ratón para posterior PCR digital y análisis de microarrays. Además, esta técnica puede adaptarse fácilmente para el aislamiento de las células oculares muy enriquecidas y compartimentos celulares que han sido difíciles de aislar de ojos de ratón. La combinación de análisis LCM y el ARN puede contribuir a una comprensión más completa de los eventos celulares subyacentes glaucoma.

Introduction

El glaucoma es un grupo de enfermedades caracterizado por neuropatía óptica y retinopatía que en última instancia conduce a la ceguera irreversible1,2. Se estima que para 2020 más 70 millones de personas en todo el mundo estarán viviendo con algún tipo de enfermedad3,4,5,6,7. Glaucoma primario de ángulo abierto (GPAA), el tipo más frecuente de glaucoma, se caracteriza por una disminución en la salida de humor acuoso (AH) conduce a aumento de la presión intraocular (IOP)8,9,10, 11,12,13,143,15,16,17,18. Pio sin tratamiento, crónicamente elevada izquierda conduce a daño progresivo e irreversible de la retina y cabeza del nervio óptico causando ceguera radial1,2,19. Todos los métodos actuales para frenar la progresión del foco de glaucoma en la reducción de Pio, ya sea por disminución de la tasa de producción de AH por el cuerpo ciliar o mejorando su salida1,8,9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14. la malla trabecular (TM) juega un papel vital en la regulación activa de la principal vía de salida AH y su función inadecuada es un factor causativo para hipertensos glaucoma1,2,19. Sin embargo, los mecanismos moleculares asociados con la disfunción TM y cómo regula AH drenaje no se entienden todavía completamente y es actualmente un foco importante de glaucoma investigación1,2,19, 20. aunque varios estudios de Asociación de genoma completo (GWAS) han vinculado un número de genes para glaucoma y mayor resistencia a la instalación de la salida AH en el TM, los mecanismos moleculares exactos que conducen a la enfermedad no entienden todavía completamente21 , 22 , 23 , 24 , 25.

Modelos animales han mejorado considerablemente nuestros conocimientos actuales de progresión de la enfermedad de glaucoma (examinado exhaustivamente en3,15,16,26,27,28, 29,30,31,32,33). Se han desarrollado varios métodos pioneros para estudiar el TM34,35,36 y estos métodos se han utilizado ampliamente para avanzar en nuestra comprensión actual del tejido normal y enfermo. Un área que no ha sido explorado extensivamente es el uso de modelos de ratón modificados genéticamente para estudiar los mecanismos moleculares de la insuficiencia de TM. Transgénico knock-in y los estudios con ratones knock-out de genes TM asociado, tales como Myocilin (Myoc)37,38 y39de la Cyp1b1, han sido las herramientas principales para el estudio de los mecanismos moleculares de TM función. Lógicamente, el tamaño pequeño de la TM en ratones representa un serio obstáculo que debe superar para comenzar a estudiar este tejido. Modelos de ratón representan una poderosa herramienta para el estudio de la genética y mecanismos moleculares de la enfermedad, mientras que los avances en las tecnologías de LCM proporcionan las herramientas necesarias para potenciar el estudio de los tejidos más pequeños y más delicados, como el TM.

En este informe, se describe un método reproducible y robusto para el LCM de TM altamente enriquecido de ojos de ratón y posterior aislamiento de RNA, amplificación para análisis de aguas abajo de la expresión. Métodos similares han sido utilizados con éxito en ratones para aislar otros tipos de ojos tejidos40,41,42,43,44, la metodología que se divulga adjunto puede aplicarse a otros tejidos discretos del ojo para el estudio de RNA, microRNA, ADN y proteínas. Lo importante, esta técnica permite el uso de ratones modificados genéticamente para entender mejor la patogenia molecular de la deficiencia de la TM en glaucoma y enfermedad ocular3,15,16,17 ,18,26,31,45,46. La capacidad de aislar la TM de ojos de ratón por LCM será una técnica útil en la obtención de más conocimientos sobre los mecanismos moleculares de varias enfermedades oculares.

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Protocol

Toda metodología de este estudio en el NIEHS Animal estudio propuesta IIDL 05-46 aprobó el nacional Instituto de Ciencias de salud ambiental (NIEHS) Animal cuidado y uso de Comité (ACUC).

1. colección de tejido óptima para Microdisección láser

  1. Obtener 2 a 3 meses ratones, C57BL/6 macho o hembra. Eutanasia con CO2 para un mínimo de 1 minuto o hasta que la respiración ha cesado. Quitar el animal de la jaula y asegurar la muerte por dislocación cervical, decapitación o toracotomía.
  2. Antes de la disección, sean todas las herramientas de disección limpia y esterilizada.
    Nota: Para la eliminación de los ojos curvada tijeras y pinzas con punta dentada (preferido punta: 0.5 x 0.4 mm) será necesario.
  3. Coloque el ratón sobre una superficie plana en su lado, de manera que el ojo es fácilmente accesible. Aferramos al ángulo del ojo (rabillo del ojo) con la pinza estabilizar el ratón, y luego con las tijeras curvas, frente a la curva de los ojos, corte alrededor del ojo con el zócalo del ojo como guía hasta que el globo ocular se puede tomar fácilmente de la toma (utilizar la curva no la puntas de las tijeras).
  4. Jale con cuidado y, usando las tijeras curvas, corte del nervio óptico, que lanza el ojo de la cavidad orbitaria. Retire con cuidado el tejido no-ocular de los ojos y enjuáguelos en el 1 x de tampón fosfato salino (PBS). Repita 1.3-1.4 para el ojo contralateral.
  5. Seque el ojo con un trapo de tejido para quitar toda la humedad antes de incrustar. Colocar el ojo en molde (25 x 20 x 5 mm3) de la muestra para que la lente y del nervio óptico son paralelos a la mesa con el fin de obtener las secciones sagitales. Incrustar ojos de óptimo corte temperatura (O.C.T.) compuesto y coloque en el hielo seco para congelar. Una vez congelado, almacenar los bloques a-80 ° C.

2. congelado de la sección Preparación para Microdisección láser

  1. Antes de usar incubar terephthalate del polietileno (animal doméstico) membrana desliza en vinculante de UV a máxima potencia durante 45 minutos.
  2. Rocíe la solución de descontaminación de Rnasa en el cepillo, pinzas, frascos de acoplamiento y montaje de mandril. Limpie. Enjuague con agua libre de nucleasas y seque. Limpie el criostato con etanol al 100% para evitar la contaminación cruzada.
  3. Ajustar el criostato a-18 ° C. Eliminar un bloque congelado de congelador de-80 ° C en un tiempo y entregar al criostato con hielo seco. Permite el bloque congelado se equilibren con la temperatura del criostato para un mínimo de 10 minutos.
  4. Apriete una pequeña cantidad de O.C.T. en el pedazo de montaje (figura 1A) y desmoldar el bloque de tejido y coloque con cuidado el bloque en el mandril de montaje (figura 1B). Una vez que el bloque de tejido en el mandril de montaje está congelado sólido, inserte el soporte de espécimen de criostato (figura 2A).
  5. Ajustar el criostato para cortar 8 tramos de μm y cuidadosamente la sección a través del bloque O.C.T. para llegar a la muestra de tejido. Una vez que se observa el tejido, deje de seccionamiento, recortar los bloques congelados por todos lados con una navaja limpia y deje de O.C.T. el tejido circundante para permitir la manipulación con el pincel (figura 2B) 3-4 mm. Use un nuevo pincel limpio en lugar de la placa del rodillo entre cada cambio de muestra para evitar la contaminación cruzada de la muestra.
  6. Sección a través del ojo de trabajo rápidamente. Mancha mancha cada tercera sección inundando la diapositiva con un paso rápido hematoxylin y eosina (H & E) de 60 s, enjuague con agua corriente, aire seco, en agente de claro y montar en un portaobjetos de vidrio cargada con un cubreobjetos. Ver bajo el microscopio y continuar hasta que la TM es evidente en las secciones de corte de seccionamiento.
  7. Una vez que el TM comienza a aparecer, cortar 2 secciones y montar en un portaobjetos de vidrio cargados de rutina de H & E tinción para formar un mapa para el corte con LCM.
    Nota: Ver sección 3 para el mapa y detalles de coloración.
  8. Después de la primera H & E mapa de deslizamiento, corte y línea 6 serial 8 μm espesor secciones en criostato y montar simultáneamente en la diapositiva de la membrana de PET (Figura 3A, B). Adherir el tejido deslizando brevemente dedo enguantado a lo largo de la parte posterior de la membrana. Después del montaje, coloque el portaobjetos de la membrana de PET inmediatamente en una caja de deslizamiento en hielo seco.
    Nota: Las secciones menos se pueden montar, sin embargo, varias secciones en la diapositiva a la vez es recomendable utilizar para reducir la degradación de RNA limitando la cantidad de tiempo de que cada sección se expone a la temperatura ambiente.
  9. Continuar a la sección el ojo, después cada dos diapositivas de membrana de PET con 6 secciones, recoger dos secciones en un portaobjetos de vidrio cargada para crear otra diapositiva del mapa para la tinción de H & E. Continuar de seccionamiento, aproximadamente 100 μm 8 serial secciones gruesas, hasta que TM no es visible. Confirme rápidamente tiñendo una sección en un portaobjetos de vidrio cargada (ver 2.6).
  10. Almacenar las diapositivas de membrana de PET a-80 ° C para su uso posterior del LCM.

3. H y E mapa Deslice el protocolo de tinción y examen morfológico

  1. Para visualizar y revisar las diapositivas del mapa en las diapositivas de vidrio cargada, fijar el tejido mediante la transferencia de inmediato en un recipiente de tinción lleno de 100 mL de la solución de fijación rápida para enjuague s. 7 la diapositiva sumergiéndola en agua destilada 10 - 20 veces , entonces transfiera el porta a un frasco de acoplamiento con agua destilada.
  2. Quitar la corredera de agua y luego seco bordes con paño tejido. Pipeta de 200 μL modificado filtrado Harris Hematoxylin en cada sección e incube durante 30 s a temperatura ambiente. Enjuagar cuidadosamente el portaobjetos con agua corriente hasta que el agua salga claro. Borrar el final de la diapositiva con un trapo de tejido entre cada paso (blot entre cada paso de 3.2-3.5) para eliminar el exceso de líquido.
  3. Diapositiva de lugar de 1 x PBS a temperatura ambiente durante 30 s. Luego, enjuague con cuidado el portaobjetos con agua corriente durante 30 s.
  4. Inmersión de la diapositiva 3 - 4 veces en el baño de etanol de 95%. Aplique suficiente solución de colorante eosina Y para cubrir el tejido sobre el portaobjetos e incube durante 15 s a temperatura ambiente.
  5. Enjuagar el portaobjetos en un baño de etanol 95% dos veces con 10-20 inmersiones rápidas cada. Enjuagar el portaobjetos en un baño de etanol 100% dos veces con 10-20 inmersiones rápidas cada. Luego, enjuagar el portaobjetos dos veces en el baño de xileno (10-20 rápido sumerge cada).
  6. Montaje mediante la aplicación de medio de montaje resinosa al tejido, añadir el cubreobjetos con cuidado para evitar burbujas de aire y deje secar durante la noche en la capilla.
  7. Informe H & E se desliza visualmente o mediante un escáner de diapositivas digitales. Identificar mapa diapositivas con TM claramente visible y accesible para el corte. Utilizar la mascota diapositivas membrana entre estos mapa diapositivas de LCM.

4. polietileno tereftalato (PET) membrana diapositivas protocolo procesamiento y tinción

  1. Antes de quitar diapositivas de PET del congelador primero prepare solución violeta de cresilo disolviendo 0,3 g de acetato de cresilo violeta en 20 mL de etanol al 75% y colocar en coctelera para filtro de la solución con 0,22 μm filtro estéril y conservar a 4 ° C por no más de 2 h. de 6 el lunes MLS.
  2. Preparar eosina solución alcohólica con fresco 75% de etanol en una proporción de 1:4. Preparar soluciones de deshidratación (etanol 100%, 75% y 95%) y fijación (etanol del 75%) en los tubos polipropileno cónico de 50 mL limpio, libre de nucleasas, sobre hielo. Añadir el inhibidor de la Rnasa a cada solución.
  3. Retire la caja de diapositivas que contienen secciones de tejido congelado del congelador de-80 ° C y colocar en hielo seco. Proceso de una diapositiva al tiempo. Fijar diapositivas colocando la diapositiva inmediatamente en etanol frío del 75% durante 30 s.
  4. Cuidadosamente sumerja el portaobjetos en agua libre de nucleasa para 10-15 s disolver O.C.T. sin interferir con las secciones de tejido.
  5. Cuidadosamente pipetee 300 μL de solución de acetato violeta de cresilo 1.5% directamente a las secciones e incubar durante 45 s a temperatura ambiente. Luego, lavar una vez colocando en el baño de etanol 75% para 30 s. pipeta de 200 μL Y solución según en las secciones e incubar durante 3-5 s.
  6. Deshidratar el tejido colocando posteriormente el portaobjetos en etanol al 75%, etanol al 95% y, finalmente, baño de etanol 100% durante 30 s cada uno. Borrar el final de la diapositiva con un trapo de tejido entre cada paso para eliminar el exceso de líquido. Airee el tobogán seco completamente debajo de la campana por 5 min. Una vez seco, realizar LCM inmediatamente después.
    Nota: Se recomienda evitar el uso de xileno para este paso, puede hacer que las secciones de tejido para adherir a la diapositiva de la membrana y reduce la eficiencia de captura de tejido.

5. láser microdisección con láser UV

  1. Encienda el ordenador y deje que arranque. Abra el suministro de energía de luz blanca del microscopio. Encienda la llave de láser UV y un amarillo LED se iluminará. Inicie el software de la LCM, permite cargar completamente y un video en vivo mostrará. Presione el botón del láser en la caja del regulador y un LED verde se iluminará.
  2. Cargar una nueva diapositiva de cristal sobre la platina del microscopio, luego coloque el portaobjetos de la membrana de PET con el lateral de tejido teñido hacia abajo directamente en la parte superior del portaobjetos de vidrio. Asegúrese de que la membrana y el portaobjetos de cristal están emparejados firmemente sobre la platina del microscopio.
  3. Inicio LCM estableciendo primero los límites de la diapositiva. Elija la menor 4 X aumentos en el panel de objetivos (figura 4). Luego definir el área de trabajo de la diapositiva de membrana moviendo la microscopios xy-etapa hasta la esquina superior izquierda, donde se unen el metal y la membrana es visible en el video en vivo, presione el botón "Limit 1" y un rectángulo rojo aparecerá en la hoja de ruta. A continuación, pasar a la etapa de xy a la esquina opuesta y presione el botón "límite 2". Presione el botón de "scan" para crear una imagen de mapa de ruta de la membrana y los tejidos dentro de los límites del sistema.
  4. Haga doble clic en cerca de la TM de una de las secciones del ojo dentro de la hoja de ruta, la TM puede ser localizado cerca del vértice del ángulo iridocorneal (figura 5A). Una vez que la TM ha sido identificado, incrementar la magnificación 10 X y manualmente en el TM. Repetir con 20 X y 40 X objetivos. Cuando el TM está en foco con el objetivo 40 X (figura 5B), navegar en una zona en blanco cercana (enfoque puede necesitar ajustarse ligeramente), selecciona la "herramienta de dibujo a mano alzada" y trace una línea larga en un área en blanco de tejido.
  5. Configure los parámetros de láser para que la "velocidad de corte" es 34%, "focus" es del 58%, y "poder" es el 70% (figura 4), luego presione el botón "cortar". Hacer ajustes finos láser a la velocidad, foco y parámetros de la energía hasta una línea de corte claro y fino se observa (véase figura 5). Para un corte preciso, garantizar una acción de corte sigue la línea dibujada.
  6. La tapa de tubo de aislamiento de la carga en el soporte de la tapa y abrir el tubo. Instale el soporte del casquillo a la elevación de tapa y asegúrese de que el tubo se invierte. Asegurar que el material adhesivo de la tapa sobresale más allá de la punta de la PAC para asegurar que el tejido deseado es capturado correctamente.
  7. Seleccione el modo "Manual" de disección en el panel de software. Revisar cuidadosamente que el TM (figura 5B) es directamente debajo del tubo de aislamiento. El balance de blancos y ajuste de brillo para adquirir la calidad de imagen óptima (figura 4).
  8. Para empezar a cortar, manualmente ajustar el enfoque y dibujar una línea usando la herramienta a mano alzada, asegúrese de que la tapa de la colección permanece en la posición hacia arriba sin tocar la membrana. Dibujar círculos parciales cerca de donde la TM se une con la esclerótica (figura 5), luego presione "corte." Se hacen los primeros cortes, coloque la tapa en la posición hacia abajo y vuelva a ajustar el enfoque, y luego dibujar dos líneas en el espacio abierto o libre para conectar los dos círculos parciales completando el círculo alrededor de la TM, y luego pulse "cortar" y recoger el tejido de la sección , asegúrese de que la TM fue recogido por el microdissection tapón (Figura 5 D-F).
  9. Coloque la tapa en la posición hacia arriba y repita el procedimiento (5.2-5.8) en las secciones restantes. Ligeramente ajustar la posición de la tapa para que todas las muestras aisladas se encaja en la tapa y no se solapan (figura 5). Para la consistencia, la ventana de tiempo para una diapositiva es uso menos secciones por mascota deslizarán si se necesita más tiempo para aislar TM de todas las secciones de 20 minutos. Para la siguiente membrana de PET, inserte un nuevo tubo de aislamiento y repita la sección 5.

6. lisis del tejido de Microdissected TM

  1. Recién preparar buffer de lisis de RNA a lisar tejido LCM aislado. Añadir 10 μl de β-mercaptoetanol a cada 1 mL de la solución de lisis. Almacenar el buffer de lisis con β-mercaptoetanol a temperatura ambiente durante no más de 1 mes.
  2. Retire el tubo de aislamiento del soporte de la tapa dentro de 20 minutos desde el inicio de la microdisección. Visualizar la superficie de la tapa por el ojo para la captura de TM.
  3. Cuidadosamente pipetee 10 μl de tampón de lisis en la tapa del tubo de la colección asegurando el tampón de lisis cubre completamente el microdissected TM. Cierre adhesivo tapa e incubar el tubo de recogida de boca abajo a temperatura ambiente durante 10 minutos. Después de la incubación, Centrifugue a 800 x g durante 2 min y coloque el lisado en hielo seco. Almacenar lisados a-80 ° C para su posterior purificación y análisis.

7. ARN aislamiento y análisis de calidad

  1. Analizar la calidad del RNA por la descongelación de las muestras a temperatura ambiente. Piscina junto todas las muestras aislaron de un solo ratón en tubo de microcentrífuga de 1,5 mL libre de Rnasa uno.
    Nota: por ejemplo, para cada repetición biológica, tubos de 10-12 con microdissected en 10 μl lisado se generaron y los lisados fueron transferidos en un solo tubo para cada repetición biológica (100-120 μl lisado).
  2. Añadir un volumen de etanol al 70% recién preparada (hecha con agua libre de ARNasa) a cada solución lisado. Entonces, purificar RNA total siguiendo las directrices de usuario de kit de aislamiento de RNA. Asegurar la extracción de ADN genómico de cada muestra de RNA.
    Nota: ADN genómico puede interferir con los posteriores análisis de ARN.
  3. Medir la calidad de ARN aislado de lo TM a las muestras de cada ratón y analizar la integridad del ARN ribosómico (figura 6A).
    Nota: Debido al pequeño tamaño de TM, ARN ribosómico picos pueden no ser observable (Figura 6B) sobre el perfil de calidad de RNA (dos picos observados entre 1.000-4.000 bp en la figura 6A, C) que se utiliza para calcular el número de integridad del RNA (RIN) 47.
    1. Obtener una medida más precisa de la integridad del RNA por aislar RNA el tejido restante más abundante en la diapositiva de la membrana. Para obtener un representante RIN, RNA aislado del tejido ocular en la diapositiva de la membrana por Pipetear 10 μl lisis de búfer en la sección de un tejido y realizar aislamiento de RNA. Analizar calidad de RNA y calcular RIN (figura 6).
  4. Para aplicaciones posteriores de RNA, uso un kit de RNA entrado baja para la generación de la secuencia y del cDNA biblioteca ceder reproducibles los resultados de tan poco como 80 secciones de LCM aislado TM.

8. Análisis

  1. Para comprobar que el tejido recogido de hecho está enriquecido en genes asociados TM, recopila varias RNA adicional de microdissected todo ojo, esclerótica, iris, retina, córnea y lente de 3 ratones separados. Uso de que este ARN en combinación con LCM recogidos ARN aislado TM y el cuerpo ciliar de ratones separados 4.
  2. Convertir que el RNA de las muestras de microdissected fue a cDNA usando un kit de transcripción inversa de cDNA. Amplificación del RNA de las muestras aislada de LCM y convertir a cDNA mediante una entrada baja RNA a cDNA kit.
  3. Analizar todas las RNA para malla trabecular expresando genes, myocilin (MYOC) y alfa-actina-2 (ACTA2) y normalizar usando el gene del servicio de limpieza HSP90a1 por PCR digital (Figura 7A-B).

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Representative Results

LCM recogió RNA de la TM y del cuerpo ciliar de 4 ratones diferentes fue aislado para poder analizar la expresión génica y comparar la expresión con en todo ojo, esclerótica, iris, retina, córnea y lentes aisladas de tres ratones separados. TM expresando genes MYOC48 ACTA249 analizaron y en todos los tejidos recogidos para confirmar que las muestras aisladas de TM eran de hecho altamente enriquecidas en TM. Debido a la extremadamente baja cantidad de cDNA de las muestras de LCM PCR digital fue utilizado, que ha demostrado ser más reproducibles con menos material50. La expresión de MYOC y ACTA2 fue normalizada utilizando el gen de la limpieza de HSP90a1 , luego cada tejido fue comparada con la del ojo entero. Estos resultados muestran que MYOC (Figura 7A) y ACTA2 (figura 7B) son altamente expresada en las muestras de TM, confirmando el aislamiento exitoso de ARN de alta calidad de las muestras altamente enriquecidas de TM para ARN de aguas abajo Análisis. Como prueba de concepto, esta técnica se aplicó para el RNA aislado TM preparado de los ratones WT y de una cepa de ratones con un fenotipo de Pio elevado y analizado por microarreglos. Este análisis identificó muchos genes implicados en el glaucoma que se expresan diferencialmente entre los ratones TM de peso y los de los ratones con el fenotipo de glaucoma (figura 7).

Figure 1
Figura 1: colocación de tejido congelado bloque en el criostato. (A) medio de montaje O.C.T se aplica a la parte de montaje de criostato. (B) bloque de muestras congeladas se coloca uniformemente sobre el mandril de montaje. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: sección procedimiento de tejido del ojo congelado en el criostato. (A) preparación de la superficie del corte para alcanzar el tejido del ojo. (B) corte de O.C.T. del bloque congelado antes de recoger secciones de Microdisección láser. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: preparación de secciones congeladas en el criostato. (A) 6 8 μm espesor secciones seriales son alineadas en el criostato. (B) secciones simultáneamente se montan en la diapositiva de la membrana de PET. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: captura de pantalla del software de Microdisección láser destacando rasgos importantes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: ubicación de la malla trabecular y configuración de los parámetros láser UV para el aislamiento adecuado de la malla trabecular. (A) ampliación de la baja (4 X) de una sola sección de la membrana de PET destacando la malla trabecular para Microdisección láser. (B) aumento de alto (40 X) de la malla trabecular y los tejidos adyacentes. (C) primer círculo parcial cortes de TM cerca de la región escleral con la tapa hacia arriba. (D) Final corta en el espacio libre que completa el círculo alrededor de la TM con la tapa hacia abajo. TM (E) de la sección y (F) unido a la tapa. (G) varias secciones corte cortan de la misma membrana de PET no superpuestas adheridas a la tapa. S (esclerótica), SC (Canal de Schlemm), TM (malla Trabecular), CA (cámara Anterior). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: estimación de rendimiento y calidad del ARN Total Obtenido de tejido de malla trabecular microdissected. (A) ARN Total de 80 secciones de malla trabecular (tamaño aproximado del área era de 0,8 mm2). (B) ARN Total de 20 sectores de la malla trabecular (tamaño aproximado del área era de 0,2 mm2). (C) ARN Total de tejido restante del ojo después de Microdisección láser. RIN, el número de la integridad del RNA; BP, pares de bases. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: Análisis de ARN aguas abajo de LCM aislaron malla trabecular. Cuantitativa análisis digital de PCR de genes asociados a TM en TM aislada por LCM. Los genes asociados a TM (A) MYOC (B) ACTA2 altamente expresada en el LCM capturó muestras de TM en comparación con otros tejidos del ojo. (C) mapa de calor generado a partir de datos obtenidos del análisis de microarray de malla trabecular RNA aislado de ratones WT y KO ratones con un fenotipo de Pio elevado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 8
Figura 8: comparación de la preparación de tejido antes y después de la optimización. Las secciones del ojo cortado y colocado en mascotas diapositivas membrana ya sea con (A) la preparación de deshidratación de etanol de 95% estándar (B) o la preparación de deshidratación de etanol 75% optimizado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El TM desempeña un papel vital en mantener activamente IOP homeostático y su disfunción es ampliamente aceptado como el principal factor causal para hipertensos glaucoma1,2,19. Un número de polimorfismos de nucleótido único en genes varios identificados por análisis GWAS se han relacionado con riesgo de glaucoma aumento y aumento de la resistencia al centro de la salida AH en el TM; sin embargo, los mecanismos moleculares precisos que dan lugar a esta enfermedad aún no están completamente entendidos21,22,23,24,25. Modelos de ratón genético pueden proporcionar una poderosa herramienta para el estudio de los mecanismos moleculares de glaucoma. Sin embargo, el pequeño tamaño del ratón tejido TM representa un reto formidable para el aislamiento de TM altamente enriquecido de ojos de ratón y RNA de alta calidad para análisis de expresión génica. LCM es una valiosa técnica para aislar a un sola o bajo número de células y puede utilizarse para el estudio de expresión génica en las muestras de tejido enriquecido para tipos específicos de la célula. En este estudio, un método reproducible y robusto de LCM se describe para aislar TM altamente enriquecido y ARN de alta calidad que puede utilizarse para estudiar la regulación de la expresión génica y celular en la TM. Además, el método descrito de LCM puede aplicarse también a otros tejidos dentro del ojo.

Tecnología de LCM y una alta atención al detalle para la optimización del manejo de tejido desempeñaron un papel vital en el desarrollo exitoso de este método. La metodología de preservación de tejidos y el aislamiento es un componente clave en el aislamiento de RNA de alta calidad para el perfil de expresión génica. LCM requiere una muy alta atención al detalle en disección, cryosectioning, fijación, tinción, deshidratación y la duración del tiempo de Microdisección láser para tener éxito en la obtención de calidad RNA51. Puede aumentar el espesor de la sección de tejido; sin embargo, a medida que el espesor aumenta lo el UV láser potencia necesaria. Aumento resultados de energía láser en una más amplia trayectoria del laser que puede causar degradación del RNA. Se encontró que la trayectoria del laser con 8 secciones μm era delgada y proporciona suficiente tejido para posteriores análisis de ARN. Figura 8 muestra como optimización de la preparación del tejido puede alterar drásticamente la capacidad de láser diseccionar la TM del ojo. La optimización de este paso en el protocolo (como se describe en la sección 4) rindió superior tejido ocular inmovilización y retiro completo del O.C.T. (figura 8B) utilizando simplemente el 75% en lugar de etanol al 95% (figura 8A) para deshidratar el tejido seguido por la incubación en agua libre de ARNasa a quitar medios de montaje. Más deshidratación y tinción se logra mediante el uso de reactivos de coloración a base de alcohol. Además, se encontró que a base de alcohol tinción reactivos rindió resultados en relación con los reactivos de tinción acuosos (violeta de cresilo basados en agua o hematoxilina) y además ayuda a preservar la integridad de RNA52. En general, procesamiento de tejidos oculares usando el protocolo optimizado con base de alcohol tinción reactivos rindió consistente tejido ocular secciones que estaban completamente inmovilizadas en la diapositiva de la membrana de PET.

Nuestro objetivo para este estudio fue desarrollar un método robusto y fiable para aislamiento de alta calidad mRNA de la TM de ojos de ratón para análisis de aguas abajo de la expresión para obtener ideas sobre los mecanismos moleculares que subyacen la elevada Pio y glaucoma. Como se muestra en el mapa de calor en la figura 7, el protocolo descrito de aislamiento TM por LCM proporciona un método muy confiable para aislar ARN de TM y estudiar las diferencias en la expresión génica en TM de tipo salvaje y mutantes ratones. El método descrito en este documento permitirá a los investigadores a realizar el análisis molecular de un tejido central de la patogenesia del glaucoma en un sistema en vivo que es relativamente fácil y confiable y puede ser aplicado al análisis de expresión génica.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ACTA2 ddPCR Primers (dMmuCPE5117282) BioRad 10031252 FAM
Agilent 2100 Bioanalyzer Agilent Technologies G2946-90004
Agilent RNA 6000 Pico kit Agilent Technologies 5067-1513
BioRad QX200 Droplet Digital PCR System BioRad
Small Paint Brush
Charged Glass Microscope Slide Thermo scientific 4951PLUS-001
Cresyl Violet Acetate Sigma Aldrich C5042
Curved Scissors
Eosin Y dye Thermo scientific 71204
Ethanol
Forceps Curved and Serrated tip (preferred tip size: 0.5 x 0.4 mm)
HemaCen American MasterTech STHEM30
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Applied Biosystems 4368814
Hsp90a ddPCR Primers(dMmuCPE5097465) BioRad 10031255 VEX
Leica CM1850 Cryostat Leica
Millex-GS filter unit EMD Millipore SLGS033SB 0.22 µm
MMI CellCut UV Cutting Model Molecular Machines & Industries LCM intrument
MMI CellTools Software Molecular Machines & Industries 50202 LCM software
Sample Tube for Laser Capture Microdisssection ASEE Products ST-LMD-M-500 Isolation Cap Tube/Manufactured by Microdissect GmBH in Germany and distrubted by ASEE Products
Sample Tube for Laser Capture Microdisssection (Alternative) Molecular Machines & Industries
modified Harris Hematoxylin Thermo scientific 7211 FAM
MYOC ddPCR Primers (dMmuCPE5095712) BioRad 10031252
PBS
Memebrane Slides, RNase Free ASEE Products FS-LMD-M-50r Polyethylene terephthalate (PET) membrane/Manufactured by Microdissect GmBH in Germany and distrubted by ASEE Products
Memebrane Slides, RNase Free (Alternative) Molecular Machines & Industries 50102
Rapid Fix Thermo scientific 6764212 H&E staining
RLT Buffer Qiagen 79216 lysis bufffer used for LCM samples
RNAseZap Sigma R2020 RNase decontamination solution
Protect RNA RNAse Inhibitor Sigma Aldrich R7397
RNeasy Micro Kit Qiagen 74004 RNA isolation kit
SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit Takara Clontech 634888 low input RNA to cDNA kit for LCM samples
SuperMix (no dUTP) BioRad 1863023 digital PCR master mix
Tissue-Tek Cryomold (25mm x 20mm x5mm) Sakura 4557
Tissue-Tek O.C.T. Compound Sakura 4583
Stratalinker UV Crosslinker Stratagene 400075
Xylene Macron 8668

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