Agarose आधारित फैलाना चिंतनशील स्पेक्ट्रोस्कोपी के लिए ऑप्टिकल प्रेतों नकल उतार ऊतक

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Bioengineering

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Summary

यहां, हम प्रदर्शन कैसे agarose आधारित ऊतक नकल उतार ऑप्टिकल प्रेतों बना रहे है और कैसे अपने ऑप्टिकल संपत्तियों एक एकीकृत क्षेत्र के साथ एक पारंपरिक ऑप्टिकल प्रणाली का उपयोग कर निर्धारित कर रहे हैं ।

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Mustari, A., Nishidate, I., Wares, M. A., Maeda, T., Kawauchi, S., Sato, S., Sato, M., Aizu, Y. Agarose-based Tissue Mimicking Optical Phantoms for Diffuse Reflectance Spectroscopy. J. Vis. Exp. (138), e57578, doi:10.3791/57578 (2018).

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Abstract

इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे agarose आधारित ऊतक-नकल उतार प्रेत बनाने के लिए और दर्शाता है कि कैसे उनके ऑप्टिकल एक एकीकृत क्षेत्र के साथ एक पारंपरिक ऑप्टिकल प्रणाली का उपयोग कर संपत्तियों का निर्धारण करने के लिए । फैलाना रिफ्लेक्टर के अधिग्रहण के लिए सिस्टम को मापने और कुल संप्रेषण स्पेक्ट्रा एक ब्रॉडबैंड सफेद प्रकाश स्रोत, एक प्रकाश गाइड, एक achromatic लेंस, एक एकीकृत क्षेत्र, एक नमूना धारक, एक ऑप्टिकल फाइबर जांच के साथ निर्माण कर रहे हैं, और एक मल्टी चैनल स्पेक्ट्रोमीटर । एक एक्रिलिक दो आयताकार एक्रिलिक टुकड़े से मिलकर मोल्ड और एक U-आकार एक्रिलिक टुकड़ा एक एपिडर्मल प्रेत और पूरे रक्त के साथ एक चमड़े का प्रेत बनाने के लिए निर्माण किया है । एक सोडियम dithionite के आवेदन (एनए2एस24) चमड़े का प्रेत को हल करने के लिए शोधकर्ता को चमड़े के प्रेत में वितरित लाल रक्त कोशिकाओं में हीमोग्लोबिन deoxygenate करने के लिए सक्षम बनाता है । एक एकीकृत क्षेत्र के साथ एक स्पेक्ट्रोमीटर द्वारा मापा फैलाना चिंतनशील और कुल संप्रेषण स्पेक्ट्रा के साथ व्युत्क्रम मोंटे कार्लो सिमुलेशन अवशोषण गुणांक स्पेक्ट्रम µएक(λ) का निर्धारण करने के लिए किया जाता है और प्रत्येक परत प्रेत के कम तितर बितर गुणांक स्पेक्ट्रम µs' (λ) । एक दो स्तरित प्रेत नकल उतार मानव त्वचा ऊतक के फैलाना प्रतिबिंबित करता है भी चमड़े का प्रेत पर एपिडर्मल प्रेत जमा द्वारा प्रदर्शन किया ।

Introduction

ऑप्टिकल प्रेतों जैविक ऊतकों के ऑप्टिकल गुणों नकल उतार वस्तुओं रहे है और व्यापक रूप से जैव चिकित्सा प्रकाशिकी क्षेत्र में इस्तेमाल किया गया है । वे डिज़ाइन किए गए है ताकि ऑप्टिकल गुण, जैसे कि प्रकाश कैटरिंग और अवशोषण गुणांक, मानव और पशु ऊतकों के रहने वाले लोगों के साथ मेल खाते हैं । ऑप्टिकल प्रेतों आम तौर पर निंनलिखित प्रयोजनों के लिए प्रयोग किया जाता है: जैविक ऊतकों में प्रकाश परिवहन अनुकरण, एक नव विकसित ऑप्टिकल प्रणाली डिजाइन जांचना, गुणवत्ता और मौजूदा प्रणालियों के प्रदर्शन का मूल्यांकन, प्रदर्शन की तुलना प्रणालियों के बीच, और ऑप्टिकल संपत्तियों की क्षमता को मांय करने के लिए ऑप्टिकल गुण मात्रा1,2,3,4,5। इसलिए, आसान पदार्थ पाने के लिए, एक सरल निर्माण प्रक्रिया, एक उच्च reproducibility, और ऑप्टिकल प्रेतों बनाने के लिए एक ऑप्टिकल स्थिरता की आवश्यकता है ।

विभिंन आधार सामग्री के साथ ऑप्टिकल प्रेतों के विभिंन प्रकार जलीय निलंबन6, जिलेटिन जेल7, agarose जेल8,9,10, polyacrylamide जेल11, राल12, 13,14,15,16, और कक्ष-तापमान-vulcanizing सिलिकॉन17 पिछले साहित्य में सूचित किया गया है । यह बताया गया है कि जिलेटिन और alginate आधारित जैल विषम संरचनाओं के साथ ऑप्टिकल प्रेतों के लिए उपयोगी हैं18. Alginate प्रेतों लेजर पृथक अध्ययन और लेजर आधारित अतिताप अध्ययन18के रूप में photothermal प्रभाव के मूल्यांकन के लिए एक उपयुक्त यांत्रिक और थर्मल स्थिरता है । Agarose जैल विषम संरचनाओं के निर्माण की क्षमता है, और उनके यांत्रिक और भौतिक गुण एक लंबे समय के लिए स्थिर हैं18. उच्च शुद्धता agarose जैल एक बहुत कम turbidity और एक कमजोर ऑप्टिकल अवशोषण है । इसलिए, agarose आधारित प्रेतों के ऑप्टिकल गुण आसानी से उपयुक्त प्रकाश बिखरने और अवशोषित एजेंटों के साथ डिजाइन किया जा सकता है । हाल ही में, styrene-ईथीलीन-butylene-styrene (SEBS) ब्लॉक copolymers19 और polyvinyl क्लोराइड (पीवीसी) जैल20 ऑप्टिकल और photoacoustic तकनीकों के लिए दिलचस्प प्रेत सामग्री के रूप में सूचित किया गया है ।

बहुलक microspheres7,12,21,22, टाइटेनियम ऑक्साइड पाउडर1, और लिपिड इमल्शन23,24,25,26 जैसे दूध और लिपिड पायस प्रकाश कैटरिंग एजेंटों के रूप में उपयोग किया जाता है, जबकि काली स्याही27,28 और आणविक रंजक29,30 प्रकाश अवशोषक के रूप में उपयोग किया जाता है । सबसे अधिक जीवित अंगों के रिफ्लेक्टर स्पेक्ट्रा फैलाना लाल रक्त कोशिकाओं में oxygenated और deoxygenated हीमोग्लोबिन के अवशोषण का प्रभुत्व है । इसलिए, हीमोग्लोबिन समाधान31,३२ और पूरे रक्त8,9,10,३३,३६ अक्सर में प्रकाश अवशोषक के रूप में उपयोग किया जाता है एक फैलाना चिंतनशील स्पेक्ट्रोस्कोपी और multispectral इमेजिंग के लिए प्रेतों ।

इस आलेख में वर्णित विधि जैविक ऊतकों में प्रकाश परिवहन नकल उतारने और अपने ऑप्टिकल गुणों को चिह्नित करने के लिए एक ऑप्टिकल प्रेत बनाने के लिए प्रयोग किया जाता है । एक उदाहरण के रूप में, एक दो स्तरित ऑप्टिकल प्रेत मानव त्वचा के ऊतकों के ऑप्टिकल गुणों नकल उतार प्रदर्शन किया है । वैकल्पिक तकनीक पर इस पद्धति का लाभ करने के लिए निकट अवरक्त तरंग दैर्ध्य क्षेत्र के लिए दृश्यमान में जैविक ऊतकों रहने का फैलाना रिफ्लेक्टर स्पेक्ट्रा का प्रतिनिधित्व करने की क्षमता है, साथ ही सादगी इसे बनाने के लिए, आसानी से उपलब्ध का उपयोग सामग्री और पारंपरिक ऑप्टिकल उपकरण । इसलिए इस विधि द्वारा निर्मित ऑप्टिकल प्रेतों को फैलाना चिंतनशील स्पेक्ट्रोस्कोपी और multispectral इमेजिंग के आधार पर ऑप्टिकल विधियों के विकास के लिए उपयोगी होगा ।

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Protocol

1. एक पारंपरिक फैलाना चिंतनशील और कुल संप्रेषण स्पेक्ट्रोस्कोपी प्रणाली का निर्माण

नोट: फैलाना चिंतनशील और कुल संप्रेषण स्पेक्ट्रा एक ब्रॉडबैंड सफेद प्रकाश स्रोत, एक प्रकाश गाइड, एक achromatic लेंस, एक एकीकृत क्षेत्र, एक नमूना धारक, एक ऑप्टिकल फाइबर, और एक मल्टी चैनल स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग करने के लिए मापने प्रणालियों का निर्माण । प्रकाश जाल की भूमिका चिंतनशील स्पेक्ट्रम से specular प्रतिबिंब घटक को दूर करने के लिए है । एकीकृत क्षेत्र के नमूना धारक एक बढ़ते प्लेट और एक सामंजस्य स्थापित और वसंत-लोड क्लैंप विधानसभा कि बंदरगाह के खिलाफ नमूना रखती के होते हैं । सामंजस्य स्थापित और स्प्रिंग लोड क्लैंप विधानसभा नमूना धारक से हटा रहे हैं और polystyrene फोम के एक हाथ से बना घन कुरसी के बजाय बढ़ते थाली से जुड़ा हुआ है । ऑप्टिकल घटकों के लेआउट, चित्र 1a और 1bमें दिखाया गया है, क्रमशः फैलाना चिंतनशील माप और कुल संप्रेषण मापन के लिए निर्माण प्रक्रिया के लिए भेजा जा सकता है ।

  1. स्पेक्ट्रोमीटर और एक पर्सनल कंप्यूटर यूनिवर्सल सीरियल बस (यूएसबी) केबल का उपयोग कर कनेक्ट प्रदान की है ।
  2. एकीकृत क्षेत्र के एक डिटेक्टर बंदरगाह के लिए बंदरगाह एडाप्टर संलग्न । स्पेक्ट्रोमीटर और एकीकृत क्षेत्र के बंदरगाह अनुकूलक एक ऑप्टिकल फाइबर का उपयोग कर कनेक्ट करें । कनेक्ट १५० डब्ल्यू हैलोजन दीपक प्रकाश स्रोत और प्रकाश गाइड ।
  3. नमूना धारक एकीकृत क्षेत्र का एक नमूना बंदरगाह के लिए संलग्न करें । एकीकृत क्षेत्र के एक उपयुक्त बंदरगाह के लिए प्रकाश जाल संलग्न जब फैलाना चिंतनशील माप प्रदर्शन. प्रकाश गाइड और achromatic लेंस के माध्यम से एक नमूना रोशन करने के लिए हैलोजन लैंप प्रकाश स्रोत पर बारी ।
  4. स्पेक्ट्रोमीटर का ऑपरेटिंग सॉफ़्टवेयर खोलें ।

2. एक एक्रिलिक मोल्ड की तैयारी

नोट: एक एक्रिलिक मोल्ड है कि दो आयताकार एक्रिलिक टुकड़े और एक U-आकार एक्रिलिक टुकड़ा के होते है एक monolayer जेल प्रेत बनाने के लिए निर्माण किया है । चित्रा 2 इस निर्माण प्रक्रिया के लिए भेजा जा सकता है ।

  1. एक 2-mm-मोटी एक्रिलिक प्लेट से एक वैकल्पिक आकार के लिए दो आयताकार एक्रिलिक टुकड़े काट ।
  2. एक 1-mm मोटी एक्रिलिक प्लेट से एक वैकल्पिक आकार के लिए एक एक्रिलिक टुकड़ा काट । 1 मिमी मोटी एक्रिलिक टुकड़ा काट इतना है कि यह एक U-आकार टुकड़ा करने के लिए मोल्ड के लिए इस्तेमाल किया जा 1-mm मोटा एपिडर्मल प्रेतों बना हो जाता है ।
  3. एक 5 मिमी मोटी एक्रिलिक प्लेट से एक वैकल्पिक आकार के लिए एक एक्रिलिक टुकड़ा काट । 5 मिमी मोटी एक्रिलिक टुकड़ा काट इतना है कि यह एक U-आकार टुकड़ा एक मोल्ड के रूप में इस्तेमाल किया जा करने के लिए 5 मिमी मोटी चमड़े का प्रेतों बनाने के लिए हो जाता है ।
  4. एक धातु फ़ाइल का उपयोग कर प्रत्येक एक्रिलिक टुकड़ा से किसी भी burrs निकालें ।
  5. दो 2-mm-मोटी एक्रिलिक टुकड़ों के साथ 1-mm-मोटी U-आकार का टुकड़ा पकड़ कर एपिडर्मल प्रेत मोल्ड बनाएं और उंहें पांच foldback क्लिप्स के साथ फिक्सिंग करें ।
  6. दो 2 मिमी मोटी एक्रिलिक टुकड़े के साथ 5 मिमी मोटी यू के आकार का टुकड़ा धारण करके चमड़े का प्रेत मोल्ड बनाओ और उंहें पांच foldback क्लिप के साथ फिक्सिंग ।

3. आधार सामग्री तैयार करना

  1. एक फली में ०.९% (डब्ल्यू/वी) NaCl के साथ मानक खारा के ५०० मिलीलीटर रखो । इस मिश्रण को झुरमुट से बचने के लिए चमचे से हिलाते हुए ५ ग्राम agarose का चूर्ण डालकर धीरे से डालें.
  2. एक १,००० डब्ल्यू 5 मिनट के लिए बिजली की स्थापना के साथ एक इलेक्ट्रिक खाना पकाने हीटर द्वारा agarose पाउडर और खारा के मिश्रण गर्मी ।
  3. एक बार मिश्रण फोड़े, कम गर्मी पर 3 मिनट के लिए मिश्रण रखें ।
  4. मिश्रण के बारे में ७० डिग्री सेल्सियस के तापमान को ठंडा । फिर एक कंटेनर में मिश्रण डालो और एक प्रेत बनाने से पहले 30 मिनट के लिए ६० डिग्री सेल्सियस पर एक निरंतर तापमान स्नान में रखने के लिए ।

4. त्वचा नकल उतार ऑप्टिकल प्रेतों की तैयारी

नोट: एक कॉफी समाधान के लिए मेलेनिन के अवशोषण स्पेक्ट्रम नकल किया जाता है । कॉफी समाधान एक भूरे रंग वर्णक melanoidin बुलाया शामिल हैं । melanoidin के अवशोषण स्पेक्ट्रम के लिए10मेलेनिन के समान होने की सूचना दी गई है ।

  1. एक एपिडर्मल प्रेत तैयार
    1. कॉफी निर्माता जलाशय में शुद्ध पानी की १०० मिलीलीटर डालो । कॉफी निर्माता टोकरी में एक फिल्टर प्लेस । फिल्टर में जमीन कॉफी के 24 जी जोड़ें । कॉफी निर्माता पर बारी और काढ़ा बटन दबाएं पक शुरू करने के लिए ।
    2. पीसा हुआ कॉफी के 4 मिलीलीटर और एक गिलास की बोतल में खारा के 16 मिलीलीटर डाल एक कॉफी समाधान करने के लिए ।
    3. लिपिड पायस के 5 मिलीलीटर (जैसे, intralipid 10%) और एक पारदर्शी प्लास्टिक कप में कॉफी समाधान के 10 मिलीलीटर रखो । धीरे से इस मिश्रण को आधार सामग्री की ३५ मिलीलीटर जोड़ें, जबकि सरगर्मी ।
    4. महाप्राण एक सिरिंज में मिश्रण और यह सुई धीरे एपिडर्मल प्रेत मोल्ड में जबकि किसी भी बुलबुला गठन से परहेज । 5 ° c पर 20 मिनट के लिए मिश्रण युक्त एक्रिलिक मोल्ड कूल ।
    5. मोल्ड से foldback क्लिप्स निकालें । एक्रिलिक टुकड़े जावक में से एक स्लाइड और यह मोल्ड से हटा दें । 1 मिमी मोटी जम जेल प्रेत मोल्ड से बाहर ले लो और यह एक शल्य स्केलपेल का उपयोग कर वांछित आकार में कटौती ।
    6. प्लेस और दो स्लाइड चश्मे के बीच जेल प्रेत पकड़ो ।
  2. oxygenated रक्त युक्त एक चमड़े का प्रेत तैयार
    1. ५.० मिलीलीटर के लिपिड पायस और 45%-हेमाटोक्रिट के साथ पूरे घोड़े का खून ०.४ मिलीलीटर ले लो और एक पारदर्शी प्लास्टिक कप में डाल दिया । धीरे मिश्रण उभारते हुए बेस सामग्री के ४४.६ मिलीलीटर जोड़ें ।
    2. एक सिरिंज में मिश्रण महाप्राण और इसे धीरे से इंजेक्शन चमड़े का प्रेत मोल्ड में जबकि किसी भी बुलबुला गठन से परहेज । 5 ° c पर 20 मिनट के लिए मिश्रण युक्त एक्रिलिक मोल्ड कूल ।
    3. मोल्ड से foldback क्लिप्स निकालें । एक्रिलिक टुकड़े जावक में से एक स्लाइड और यह मोल्ड से हटा दें । 5 मिमी मोटी जम जेल प्रेत मोल्ड से बाहर ले लो और यह एक शल्य स्केलपेल का उपयोग कर वांछित आकार में कटौती ।
    4. प्लेस और दो स्लाइड चश्मे के बीच जेल प्रेत पकड़ो ।
  3. deoxygenated रक्त युक्त एक चमड़े का प्रेत तैयार
    1. एक चमड़े के जेल प्रेत युक्त oxygenated रक्त (कदम 4.2.3 से) एक गिलास पकवान पर रखो ।
    2. एक गिलास की बोतल में खारा के 20 मिलीलीटर में सोडियम dithionite (एनए2एस24) के 1 जी भंग ।
    3. प्रेत में रक्त deoxygenate करने के लिएएक सिरिंज का उपयोग कर प्रेत पर 2 एस2हे4 समाधान के ०.०५ g/
    4. प्लेस और दो स्लाइड चश्मे के बीच प्रेत पकड़ इसे बाहर सुखाने को रोकने के ।
  4. एक दो लेयर वाला फैंटम तैयार करें
    1. एपिडर्मल और चमड़े की परतों के बीच ऑप्टिकल युग्मन सुनिश्चित करने के लिए एक चमड़े का प्रेत पर खारा के ०.१ मिलीलीटर ड्रॉप । एपिडर्मल प्रेत को अधययन करने वाले प्रेत पर लगाएं ।
    2. किसी भी हवा के बुलबुले परतों के बीच मौजूद हैं, तो एक उंगलियों के साथ दो स्तरित प्रेत की सतह को पथपाकर द्वारा उन्हें बाहर धक्का.
    3. दो-लेयर्ड फैंटम को दो स्लाइड चश्मे के बीच पकड़ कर इसे बाहर सुखाने के लिए रखें ।

5. फैलाना चिंतनशील स्पेक्ट्रा का अधिग्रहण

  1. डार्क स्पेक्ट्रा का अधिग्रहण
    नोट: स्पेक्ट्रोमीटर में आरोप-युग्मित डिवाइस (सीसीडी) संवेदक प्रकाश तीव्रता घटना के जवाब में उत्पंन एक बिजली के संकेत के आधार पर अनुमान कर सकते हैं । हालांकि, वहां अंधेरे शोर३७ जो फोटॉनों द्वारा उत्पंन संकेतों से स्वतंत्र है, लेकिन डिवाइस के तापमान पर निर्भर है, भले ही संवेदक प्रकाश का पता नहीं लगाता है । सही प्रकाश की वर्णक्रमीय तीव्रता को मापने के लिए, डार्क वर्तमान संकेत एक अंधेरे स्पेक्ट्रम के रूप में मापा और फिर नमूना स्पेक्ट्रम से घटाया जाना चाहिए. डार्क स्पेक्ट्रम ब्लॉक किए गए प्रकाश पथ के साथ लिया गया स्पेक्ट्रम है ।
    1. फैलाना चिंतनशील माप (आंकड़ा 1a) के लिए एक इष्टतम स्थिति में घालमेल क्षेत्र स्थिति ।
    2. हैलोजन लैंप प्रकाश स्रोत बंद कर दें । एक बंदरगाह प्लग या एक ढाल प्लेट का उपयोग कर स्पेक्ट्रोमीटर के लिए प्रकाश पथ ब्लॉक.
    3. डार्क स्पेक्ट्रम संग्रहीत करने के लिए फ़ाइल मेनू से ' डार्क स्टोर ' आदेश का चयन करें ।
    4. मापा नमूना स्पेक्ट्रम से डार्क स्पेक्ट्रम घटाना (नीचे देखें) के लिए फ़ाइल मेनू से डार्क स्पेक्ट्रम घटाना आदेश का चयन करें.
  2. संदर्भ स्पेक्ट्रा के अधिग्रहण
    नोट: प्रकाश स्रोत, लाइट गाइड, achromatic लेंस, ऑप्टिकल फाइबर, और स्पेक्ट्रोमीटर के रूप में इस प्रयोग में इस्तेमाल घटकों के ऑप्टिकल गुणों, अपने स्वयं के तरंग दैर्ध्य-निर्भरता है । इसलिए, इन ऑप्टिकल घटकों के माध्यम से पारित प्रकाश की वर्णक्रमीय तीव्रता एक संदर्भ स्पेक्ट्रम के रूप में मापा जाना चाहिए । एक फैलाना चिंतनशील स्पेक्ट्रम की माप के लिए, संदर्भ स्पेक्ट्रम प्रकाश स्रोत से प्रकाश के साथ प्रबुद्ध एक मानक सफेद विसारक के साथ लिया एक स्पेक्ट्रम है ।
    1. पावर बटन दबाकर हैलोजन लैंप लाइट स्रोत चालू करें । एक संदर्भ स्पेक्ट्रम प्राप्त करने से पहले कम से कम 10 मिनट के लिए दीपक गर्म ।
    2. एकीकृत क्षेत्र के नमूना बंदरगाह पर एक मानक सफेद विसारक (जैसे, Spectralon) प्लेस ।
    3. पीक सिग्नल तीव्रता स्पेक्ट्रोमीटर तीव्रता अधिकतम के लगभग ७५% है ताकि स्पेक्ट्रोमीटर ऑपरेटिंग सॉफ्टवेयर में ड्रॉप-डाउन सूची से उपयुक्त मान का चयन करके स्पेक्ट्रोमीटर के एकीकरण समय समायोजित करें ।
    4. संदर्भ स्पेक्ट्रम संग्रहीत करने के लिए फ़ाइल मेनू से संदर्भ संग्रहीत करें आदेश चुनें ।
  3. नमूना स्पेक्ट्रा का अधिग्रहण
    नोट: नमूना के प्रसार को प्रतिबिंबित करता है की एक स्पेक्ट्रम अधिग्रहण और एक ही अधिग्रहण की शर्तों का उपयोग कर एक पर्सनल कंप्यूटर की हार्ड ड्राइव पर सहेजा जाता है ।
    1. नमूना बंदरगाह पर दो स्लाइड चश्मा द्वारा सैंडविच एपिडर्मल प्रेत प्लेस । किसी फ़ाइल में फैलाना चिंतनशील स्पेक्ट्रम सहेजने के लिए फ़ाइल मेनू से सहेजें आदेश का चयन करें ।
    2. अधययन और दो लेयर वाले प्रेतों के लिए स्टेप 5.3.1 दोहराएं ।

6. कुल संप्रेषण स्पेक्ट्रम का अधिग्रहण

  1. डार्क स्पेक्ट्रा का अधिग्रहण
    नोट: स्पेक्ट्रोमीटर में सेंसर एक बिजली के घटना प्रकाश के जवाब में उत्पंन संकेत के आधार पर प्रकाश तीव्रता का अनुमान कर सकते हैं । हालांकि, वहां अंधेरे शोर जो फोटॉनों द्वारा उत्पंन संकेतों से स्वतंत्र है, लेकिन डिवाइस के तापमान पर निर्भर है, भले ही सेंसर प्रकाश का पता नहीं लगाता है । सही प्रकाश की वर्णक्रमीय तीव्रता को मापने के लिए, डार्क वर्तमान संकेत एक अंधेरे स्पेक्ट्रम के रूप में मापा और फिर नमूना स्पेक्ट्रम से घटाया जाना चाहिए. डार्क स्पेक्ट्रम ब्लॉक किए गए प्रकाश पथ के साथ लिया गया स्पेक्ट्रम है ।
    1. कुल संप्रेषण माप (आंकड़ा 1b) के लिए एक इष्टतम स्थिति में घालमेल क्षेत्र स्थिति ।
    2. एकीकृत क्षेत्र के बंदरगाह से प्रकाश जाल निकालें और बंदरगाह के लिए एक बंदरगाह प्लग संलग्न ।
    3. हैलोजन लैंप प्रकाश स्रोत बंद कर दें । एकीकृत क्षेत्र के लिए एक बंदरगाह प्लग या ढाल प्लेट का उपयोग प्रकाश पथ ब्लॉक ।
    4. डार्क स्पेक्ट्रम संग्रहीत करने के लिए फ़ाइल मेनू से ' डार्क स्टोर ' आदेश का चयन करें ।
    5. मापा नमूना स्पेक्ट्रम से डार्क स्पेक्ट्रम घटाना (नीचे देखें) के लिए फ़ाइल मेनू से डार्क स्पेक्ट्रम घटाना आदेश का चयन करें.
  2. संदर्भ स्पेक्ट्रा के अधिग्रहण
    नोट: प्रकाश स्रोत, लाइट गाइड, achromatic लेंस, ऑप्टिकल फाइबर, और स्पेक्ट्रोमीटर के रूप में इस प्रयोग में इस्तेमाल घटकों के ऑप्टिकल गुणों, अपने स्वयं के तरंग दैर्ध्य-निर्भरता है । इसलिए, इन घटकों के माध्यम से पारित प्रकाश की वर्णक्रमीय तीव्रता एक संदर्भ स्पेक्ट्रम के रूप में मापा जाना चाहिए । कुल संप्रेषण स्पेक्ट्रम की माप के लिए, संदर्भ स्पेक्ट्रम एक स्पेक्ट्रम लिया जाता है जब प्रकाश स्रोत से प्रकाश सीधे नमूना बंदरगाह के माध्यम से एकीकृत क्षेत्र में प्रवेश कर रहा है ।
    1. पावर बटन दबाकर हैलोजन लैंप लाइट स्रोत चालू करें । एक संदर्भ स्पेक्ट्रम प्राप्त करने से पहले कम से कम 10 मिनट के लिए दीपक गर्म ।
    2. स्पेक्ट्रोमीटर के ऑपरेटिंग सॉफ्टवेयर में एकीकरण बार की ड्रॉप-डाउन सूची से उपयुक्त मान का चयन करके स्पेक्ट्रोमीटर के एकीकरण समय को विनियमित ताकि सबसे बड़ी प्रकाश तीव्रता एक संकेत है कि अधिकतम के लगभग ७५% है दिखाता है मान.
    3. संदर्भ स्पेक्ट्रम संग्रहीत करने के लिए फ़ाइल मेनू से संदर्भ संग्रहीत करें आदेश चुनें ।
  3. नमूना स्पेक्ट्रा का अधिग्रहण
    नोट: नमूना के कुल संप्रेषण के स्पेक्ट्रम अधिग्रहण और एक ही अधिग्रहण की शर्तों का उपयोग कर एक पर्सनल कंप्यूटर की हार्ड ड्राइव पर सहेजा जाता है ।
    1. नमूना बंदरगाह पर दो स्लाइड चश्मा द्वारा सैंडविच एपिडर्मल प्रेत प्लेस । किसी फ़ाइल में कुल संप्रेषण स्पेक्ट्रम सहेजने के लिए फ़ाइल मेनू से सहेजें आदेश का चयन करें ।
    2. अधययन और दो लेयर वाले प्रेतों के लिए स्टेप 6.3.1 दोहराएं ।

7. अवशोषण और प्रकाश बिखरने गुण का आकलन

नोट: फैलाना चिंतनशील स्पेक्ट्रम और कुल संप्रेषण स्पेक्ट्रम का एक सेट एक पर्सनल कंप्यूटर की हार्ड ड्राइव करने के लिए बचाया और ऑफ़लाइन विश्लेषण किया है । एक व्युत्क्रम मोंटे कार्लो सिमुलेशन8,३८,३९,४० तो अवशोषण गुणांक स्पेक्ट्रम µएक(λ) और कम बिखरने गुणांक अनुमान करने के लिए प्रदर्शन किया है स्पेक्ट्रम µएस'(λ) । इस व्युत्क्रम मोंटे कार्लो सिमुलेशन में, अनुमानित तितर बितर गुणांक µएस, धारणा है कि anisotropy कारक जी 0 है के तहत, कम तितर बितर गुणांक µएसके रूप में माना जाता है . दोनों चिंतनशील और संप्रेषण डेटा एक एकल सिमुलेशन चलाने के लिए उपयोग किया जाता है । इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त विस्तृत एल्गोरिथ्म को पिछले साहित्य8,३९में सूचित किया गया है । हम अवशोषण गुणांक स्पेक्ट्रम µएक(λ) और कम कैटरिंग गुणांक स्पेक्ट्रम µs'(λ) एक एपिडर्मल परत के एक सेट से फैलाना प्रतिबिंबित करता है का अनुमान स्पेक्ट्रम और एपिडर्मल परत से प्राप्त कुल संप्रेषण स्पेक्ट्रम । इसी तरह से, हम अनुमान µएक(λ) और µs'(λ) एक चमड़े की परत के एक सेट से फैलाना चिंतनशील स्पेक्ट्रम और अधययन से प्राप्त कुल संप्रेषण स्पेक्ट्रम परत.

  1. मोंटे कार्लो सिमुलेशन के लिए एक इनपुट फ़ाइल खोलें ।
  2. मापा फैलाना प्रतिबिंबित करता है और विशिष्ट तरंग दैर्ध्य सीमा पर कुल संप्रेषण के मूल्यों में भरें ४०० से ७०० एनएम के लिए 10 समुद्री मील की दूरी पर इनपुट डेटा फ़ाइल में अंतराल । इनपुट डेटा फ़ाइल में प्रेत मोटाई के मूल्य में भरें ।
  3. इनपुट डेटा फ़ाइल (उदा., n = १.३३ पर ५५० एनएम) में एक उचित मान के लिए एक परत के अपवर्तन सूचकांक n सेट करें । इनपुट डेटा फ़ाइल में 0 होने के लिए anisotropy फ़ैक्टर g का मान सेट करें ।
  4. के प्रारंभिक मान सेट करें अवशोषण गुणांक µa और स्कैटरिंग गुणांक µइनपुट डेटा फ़ाइल में उपयुक्त मान होने के लिएs (उदा., µa = ०.०१, µs = ०.१ ).
  5. उलटा मोंटे कार्लो सिमुलेशन कार्यक्रम निष्पादित ।
  6. इनपुट फ़ाइल नाम टाइप करें, और उसके बाद सिमुलेशन चलाएँ ।
  7. आउटपुट फ़ाइल खोलें और चलने सिमुलेशन समाप्त होने के बाद µa और µs के अंतिम मानों की जाँच करें ।
  8. दोहराएँ चरण ७.१-७.७ अन्य वांछित तरंग दैर्ध्य के लिए.

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Representative Results

चित्रा 3 प्रतिनिधि के अनुमानित स्पेक्ट्रा कम तितर बितर गुणांक और एपिडर्मल प्रेत और चमड़े का प्रेत के लिए अवशोषण गुणांक का अनुमान है । चित्रा 3 में दिखाया परिणाम दोनों चिंतनशील और संप्रेषण स्पेक्ट्रा के दस माप के औसत रहे हैं. कम तितर बितर गुणांक µएस' एक व्यापक बिखरने स्पेक्ट्रम है, छोटे तरंग दैर्ध्य में एक उच्च परिमाण का प्रदर्शन । वर्णक्रमीय सुविधाओं कोमल ऊतकों के ठेठ कैटरिंग स्पेक्ट्रा के अनुरूप है । अवशोषण गुणांक µएपिडर्मल प्रेत केएक तरंग दैर्ध्य बढ़ता है, जो मेलेनिन के अवशोषण स्पेक्ट्रम के समान है के रूप में तेजी से क्षय । अवशोषण एपिडर्मल प्रेत परत के गुणांक स्पेक्ट्रम और मेलेनिन४१ की है कि एक घातीय समारोह के रूप में फिट थे:
Equation

एपिडर्मल परत के लिए बी का मूल्य ०.०११, जबकि मेलेनिन के लिए ०.००९ होने का अनुमान था की गणना की गई थी । अवशोषण गुणांक की तरंग दैर्ध्य निर्भरता oxygenated रक्त और deoxygenated रक्त युक्त चमड़े का प्रेत के लिएएक µoxygenated हीमोग्लोबिन और deoxygenated हीमोग्लोबिन की वर्णक्रमीय विशेषताओं का प्रभुत्व है, क्रमशः.

चित्रा 4 प्रतिनिधि डिजिटल दो स्तरित त्वचा प्रेतों के रंग तस्वीरों से पता चलता है । चित्रा 4a दो स्तरित त्वचा प्रेत की एक क्रॉस-अनुभागीय छवि से पता चलता है । चित्रा 4b और 4c 3-by-3 प्रेत मैट्रिक्स oxygenated रक्त और deoxygenated रक्त युक्त, क्रमशः के शीर्ष दृश्य दिखाते हैं । ऊपर से नीचे तक की पंक्तियों में कॉफी समाधान सांद्रता cc 5%, 10%, और 20% है । बाएं से दाएं कॉलम रक्त सांद्रता है Cb ०.२%, ०.४%, और ०.६% । प्रेत का रंग एपिडर्मल परत में सी सी के मूल्य के रूप में गहरा हो जाता है, जबकि यह सीबी के मूल्य बढ़ जाता है के रूप में गुलाबी हो जाता है । oxygenated रक्त के साथ प्रेत कि deoxygenated रक्त के साथ एक से अधिक लाल रंग की है । उन रूपों में त्वचा के रंग में परिवर्तन का प्रतिनिधित्व शारीरिक स्थितियों के कारण जैसे कमाना और hypoxemia, क्रमशः ।

चित्रा 5 प्रतिनिधि मापा प्रसार के एक उदाहरण से पता चलता है स्पेक्ट्रा दो स्तरित त्वचा ऊतक प्रेतों के लिए अलग शर्तों होने से प्राप्त (चित्रा 5) कॉफी समाधान सीसीकी एकाग्रता, ( चित्रा 5b) पूरे रक्त सीबीकी एकाग्रता, और (चित्रा 5c) रक्त की oxygenated राज्य । चित्रा 5में, एक छोटे तरंग दैर्ध्य क्षेत्र में फैलाना प्रतिबिंबित करता है कि एक लंबी तरंग दैर्ध्य क्षेत्र में के साथ तुलना में काफी कमी आई सी सी के मूल्य बड़ा हो जाता है । इस छोटे तरंग दैर्ध्य क्षेत्र में कॉफी समाधान द्वारा मजबूत प्रकाश अवशोषण के कारण है ( चित्र बीदेखें) । चित्रा 5b सीबी, जो तरंग दैर्ध्य रेंज में हीमोग्लोबिन द्वारा मजबूत प्रकाश अवशोषण का प्रतिनिधित्व करता है के मूल्य के साथ मध्य तरंग दैर्ध्य क्षेत्र में उल्लेखनीय परिवर्तन से पता चलता है ५०० ६०० एनएम । oxygenated हीमोग्लोबिन और deoxygenated हीमोग्लोबिन और हीमोग्लोबिन के isosbestic अंक के बीच वर्णक्रमीय सुविधा में अंतर स्पष्ट रूप से चित्र 5cमें दिखाए गए फैलाना रिफ्लेक्टर स्पेक्ट्रा में मनाया जाता है ।

Figure 1
चित्रा 1: प्रयोगात्मक तंत्र के योजनाबद्ध आरेख । इन पैनलों सेट को मापने के लिए दिखाने के (एक) फैलाना चिंतनशील स्पेक्ट्रा और () कुल संप्रेषण स्पेक्ट्रा । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: agarose आधारित ऑप्टिकल प्रेतों की तैयारी में कदम । इन पैनलों शो () एक एपिडर्मल परत प्रेत का निर्माण और () एक चमड़े का बना परत प्रेत की । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: प्रतिनिधि प्रेतों के ऑप्टिकल गुणों का अनुमान है । () यह पैनल एपिडर्मल और चमड़े की परतों का औसत कम स्कैटरिंग गुणांक स्पेक्ट्रम µएस' (λ) दिखाता है. () यह पैनल एपिडर्मल परत और अधययन की परतों के अवशोषण गुणांक स्पेक्ट्रा µ(λ) दिखाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: प्रतिनिधि डिजिटल दो स्तरित त्वचा प्रेतों के रंग तस्वीरें । () यह पैनल दो लेयर वाली स्किन फैंटम का क्रॉस-सेक्शनल व्यू दिखाता है । () यह पैनल oxygenated रक्त युक्त 3-बाय-3 प्रेत मैट्रिक्स के शीर्ष दृश्य को दिखाता है । () यह पैनल deoxygenated रक्त युक्त 3-बाय-3 प्रेत मैट्रिक्स के शीर्ष दृश्य को दिखाता है । ऊपर से नीचे तक की पंक्तियों में कॉफी समाधान सांद्रता cc 5%, 10%, और 20% है । बाएं से दाएं कॉलम रक्त सांद्रता है Cb ०.२%, ०.४%, और ०.६% । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: प्रतिनिधि मापा फैलाना दो-स्तरित त्वचा ऊतक प्रेतों से प्राप्त किया गया चिंतनशील स्पेक्ट्रा. इन पैनलों के विभिंन स्थितियों के साथ प्रेतों के फैलाना चिंतनशील स्पेक्ट्रा शो () कॉफी समाधान सीसी की एकाग्रता, () पूरे oxygenated रक्त सीबीकी एकाग्रता, और () रक्त की oxygenated अवस्था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम आधार सामग्री का तापमान नियंत्रण है । आधार सामग्री को बनाए रखने के लिए तापमान ५८ से ६० डिग्री सेल्सियस से लेकर । तापमान ७० डिग्री सेल्सियस से अधिक है, तो लिपिड पायस और पूरे रक्त दोनों का एक विकार हो जाएगा । एक परिणाम के रूप में, प्रेत के ऑप्टिकल गुण खराब हो जाएगा । तापमान ४० डिग्री सेल्सियस से कम है, तो आधार सामग्री ununiform जाएगा और, इस प्रकार, प्रकाश बिखरने और अवशोषण एजेंटों विषम प्रेत में वितरित किया जाएगा । हालांकि आधार सामग्री ६० डिग्री सेल्सियस पर रखा है, यह एक सिरिंज के साथ सक्शन तापमान कम करती है । यह रक्त समाधान करने के लिए जोड़ा जाता है जब आधार सामग्री का तापमान ५० ° c करने के लिए कम करती है ।

इस लेख में वर्णित ऑप्टिकल प्रेतों कम useable जंमों जो आमतौर पर एक दिन से अधिक नहीं तक सीमित है से ग्रस्त हैं । useable जंमों को सील कंटेनर में आधार सामग्री के साथ प्रेत encapsulating द्वारा या एक परिरक्षक का उपयोग करके बढ़ाया जा सकता है । 1 मिमी मोटी एपिडर्मल परत प्रेत मानव एपिडर्मल मोटाई से अधिक परिमाण के एक आदेश है । एक्रिलिक मोल्ड के साथ इस प्रोटोकॉल में, तथापि, यह एक परत मोटाई से कम ०.५ mm बनाने के लिए मुश्किल था । प्रेतों के मापा फैलाना चिंतनशील स्पेक्ट्रा पर इस मोटाई के अपेक्षित प्रभाव को कम करने के लिए, तितर बितर और एपिडर्मिस प्रेत के अवशोषण के गुणांक को विनियमित किया गया ताकि फैलाना चिंतनशील स्पेक्ट्रम समान स्पेक्ट्रम दिखाया मानव त्वचा की है कि करने के लिए । एक स्पिन-कोटिंग विधि४२ ०.५ mm से पतले एक परत बनाने के लिए होनहार लग रहा है । मानव त्वचा के लिए µ (λ) और µएस' (λ) के मूल्यों को साहित्य४३में बताया गया है ।

एक आगर प्रेत परत में मेलेनिन या बिलीरुबिन के समान वितरण मुश्किल हो सकता है यहां वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग कर क्योंकि उन chromophores पानी में पूरी तरह से घुलनशील नहीं हैं । भुना हुआ कॉफी सेम और tartrazine से निकाले melanoidin का उपयोग तुलनीय या मेलेनिन और बिलीरुबिन के लिए विकल्प सामग्री, क्रमशः के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । उलटा मोंटे कार्लो सिमुलेशन मापा फैलाना प्रतिबिंबित करता है और कुल संप्रेषण से ऑप्टिकल संपत्तियों का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया अपेक्षाकृत समय अपने चलने फैशन के कारण लेने वाली है । जोड़ने-दोहरीकरण विधि४४ के रूप में एक और प्रकाश परिवहन परिकलन मॉडल परिकलन समय को छोटा करने के लिए उपयोग किया जा सकता है । कम स्कैटरिंग गुणांक µएस' एक मुश्ती ऑप्टिकल µ को शामिल करने वाली संपत्ति है और anisotropy फैक्टर जी. µएस और जी अलग से अनुमान लगाने के लिए, एक प्रेत के collimated संप्रेषण के कुल संप्रेषण और फैलाना चिंतनशील३८,४०के अलावा मापा जाना चाहिए । वर्तमान अध्ययन में हमने प्रत्येक परत के लिए अपवर्तन सूचकांक का उपाय नहीं किया. हम agarose जेल के बाद से व्युत्क्रम मोंटे कार्लो सिमुलेशन के लिए इनपुट डेटा फ़ाइल में४५ साहित्य में प्रकाशित के रूप में पानी की अपवर्तन सूचकांक सेट पानी की मुख्य रूप से होते हैं । हमने मान लिया कि दो परतों के बीच अपवर्तन सूचकांकों में कोई अंतर नहीं है. हम भी कांच के अपवर्तन सूचकांक के लिए नाममात्र मूल्य का इस्तेमाल किया (जैसे, n = १.५२४ λ पर = ५४६.१ एनएम) मोंटे कार्लो सिमुलेशन के लिए ।

यह लाभप्रद है कि इस प्रोटोकॉल, एक एकीकृत क्षेत्र के बजाय दो एकीकृत क्षेत्रों के साथ, लागत प्रभावी है । दूसरी ओर, एक एकल घालमेल क्षेत्र का उपयोग कर समय लेने के बाद से घालमेल क्षेत्र की व्यवस्था है कि क्या माप एक कुल संप्रेषण के लिए या एक फैलाना चिंतनशील के लिए है के अनुसार बदला जाना चाहिए है । यह लाभप्रद है कि इस लेख में वर्णित प्रोटोकॉल के लिए विभिंन आकार, आकार के साथ monolayer या बहुपरत ऑप्टिकल प्रेतों बनाने का विस्तार कर सकते हैं, और molds के डिजाइन बदलकर समावेशन । प्रेत परतों की सतहों के तुरंत बाद वे अपने सांचे में ढालना बाहर ले जाया गया गीला कर रहे थे । इसलिए, एपिडर्मल परत और चमड़े का परत पहली परत पर बारीकी से दूसरी परत स्टैकिंग द्वारा एक साथ पालन किया गया । यह पहले एक पर सीधे दूसरी परत जमना संभव हो सकता है, बजाय उंहें अलग बनाना और उंहें बाद में संलग्न । उस मामले में, तथापि, यह सही एक समान परत मोटाई के साथ एक पतली एपिडर्मल परत बनाने के लिए मुश्किल हो सकता है । हमने फैंटम के बीच वाले प्रेत को सूखने से रोकने के लिए उस प्रेत का सैंडविच पहना । हम ऑप्टिकल गुण और व्युत्क्रम मोंटे कार्लो सिमुलेशन में कांच की मोटाई पर विचार किया । इसलिए, प्रेतों के अनुमानित ऑप्टिकल गुणों पर कोई प्रभाव नहीं पड़ता । मौजूदा तरीकों के संबंध में वर्तमान तकनीक के महत्व को अपने निकट अवरक्त तरंग दैर्ध्य क्षेत्र के लिए दृश्यमान में रहने वाले ऊतकों के प्रसार को प्रतिबिंबित करता है स्पेक्ट्रा का प्रतिनिधित्व करने की क्षमता है । इस प्रोटोकॉल द्वारा निर्मित ऑप्टिकल प्रेतों को फैलाना चिंतनशील स्पेक्ट्रोस्कोपी और spectrocolorimetry के आधार पर नव विकसित ऑप्टिकल विधियों के सत्यापन के लिए उपलब्ध होगा ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम का हिस्सा एक अनुदान द्वारा समर्थित था वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए सहायता (सी) विज्ञान के संवर्धन के लिए जापानी समाज से (२५३५०५२०, २२५००४०१, 15K06105) और अमेरिका-सेना आईटीसी-पीएसी अनुसंधान और विकास परियोजना (FA5209-15-p-०१७५, FA5209-16-p-०१३२) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
150-W halogen-lamp light source Hayashi Watch Works Co., Ltd, Tokyo, Japan LA-150SAE
Light guide Hayashi Watch Works Co., Ltd, Tokyo, Japan LGC1-5L1000
Integrating Sphere Labsphere Incorporated, North Sutton, NH, USA RT-060-SF
Port adapter Labsphere Incorporated, North Sutton, NH, USA PA-050-SMA-SF
Light trap Labsphere Incorporated, North Sutton, NH, USA LTRP-100-C
Spectralon white standard with 99% diffuse reflectance Labsphere Incorporated, North Sutton, NH, USA SRS-99-020
Optical fiber Ocean Optics Inc., Dunedin, Florida, USA P400-2-VIS-NIR
Miniature Fiber Optic Spectrometer Ocean Optics Inc., Dunedin, Florida, USA USB2000
Achromatic lens Chuo Precision Industrial Co.,Ltd, Tokyo, Japan ACL-50-75M
Intralipid Fresenius Kabi AB, Uppsala, Sweden Intralipid 10%
Coffee
(Blendy Mocha Blend Regular Coffee)
Ajinomoto AGF, Inc. Tokyo, Japan Unavailable
Whole blood Nippon Bio-Test Laboratories Inc. Saitama, Japan 0103-2
Agarose Nippon Genetics Co., Ltd, Tokyo, Japan NE-AG02
Cooking heater TOSHIBA CORPORATION Tokyo, Japan HP-103K

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