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Aislamiento de células Stromal Endometrial humanas In Vitro Decidualization

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Developmental Biology

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Summary

Este estudio presenta un procedimiento optimizado y validado para el aislamiento y cultivo de células stromal endometriales humanas para llevar a cabo análisis de decidualization en vitro . Además, este estudio proporciona un método detallado para eficiente precipitación un gen específico usando siRNA en células stromal endometriales humanas.

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Michalski, S. A., Chadchan, S. B., Jungheim, E. S., Kommagani, R. Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization. J. Vis. Exp. (139), e57684, doi:10.3791/57684 (2018).

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Abstract

La diferenciación de células stromal endometriales humanas (HESC) de fibroblasto-como aspecto en decidua secretor es una transformación necesaria para la implantación del embrión en el revestimiento del útero de la matriz materna. Decidualization incorrecta se ha establecido como una causa de fallo de implantación y posterior aborto espontáneo del embrión temprano. Por lo tanto, entender los mecanismos moleculares subyacentes decidualization es ventajoso mejorar el índice de nacimientos exitosos. En vivo basado en estudios de decidualization artificial a menudo se limitan debido a dilemas éticos asociados a la investigación en humanos, así como complicaciones traslacionales en modelos animales. Como resultado, en vitro ensayos a través de cultivo celular primario son utilizados a menudo para explorar la modulación del decidualization a través de las hormonas. Este estudio proporciona un protocolo detallado para el aislamiento de células y posterior decidualization artificial mediante la suplementación de hormonas al medio de cultivo. Además, este estudio proporciona un método bien diseñado para caída cualquier gen de interés utilizando siRNA basado en lípidos transfecciones. Este protocolo permite la optimización de la pureza de la cultura, así como rendimiento del producto, maximizando así la capacidad para utilizar este modelo como un método confiable para entender los mecanismos moleculares subyacentes decidualization y la posterior cuantificación de agentes secretados por las células estromales del endometrio decidualized.

Introduction

Entre las etapas de la menarquia y la menopausia, las mujeres en edad reproductiva se someten a ciclos mensuales de la proliferación endometrial regulados por hormonas, la diferenciación y el posterior vertimiento en preparación para el embarazo en un proceso conocido como menstruación1 ,2. Las modificaciones físicas del endometrio humano son necesarias para la implantación adecuada del embrión en la pared uterina1. Alteraciones del endometrio, incluyendo adaptaciones tanto morfológicas como bioquímicas, son mediadas a través del ciclo menstrual a través de las hormonas esteroides ováricas estrógenos y progesterona (P4)3,4,5. Dentro de la fase proliferativa (o folicular), los niveles de estrógenos preovulatorio aumento, Inicio de engrosamiento del endometrio. Después de la ovulación, la fase secretora (o luteínica) promueve un aumento significativo en las concentraciones de P4, induciendo la transformación morfológica de células stromal endometriales (ESC) de aspecto fibroblasto-como redondeadas, epitelial-como las células decidual en un proceso conocido como decidualization4,6. Decidualization incorrecta se ha establecido como una causa de fracaso de implantación y posterior temprano embrión aborto4,7,8. Por lo tanto, entender los mecanismos moleculares subyacentes decidualization es ventajoso para el diagnóstico y tratamiento de la pérdida temprana del embarazo.

Actualmente, se utilizan varias metodologías para explorar los efectos subyacentes del decidualization en células stromal endometriales. In vivo, el útero de ratón puede ser inducida artificialmente para decidualization mediante estimulación mecánica (es decir, arañazos) o aceite de inyección en un útero preparado hormonal9. Distinto de los seres humanos, esta estimulación sintética promueve la diferenciación del lumen uterino proporcionando la apariencia de la presencia de blastocistos, un paso que se requiere para la iniciación del decidualization en roedores10,11. En consecuencia, debido a las complicaciones traslacionales asociadas con modelos animales y los dilemas éticos que rodean en vivo basado en estudios en seres humanos, con más éxito se estudian modelos decidualization basado en vitro.

En este estudio, los sujetos son reclutados a través de la colocación de anuncios en dos periódicos locales de inglés y español. Temas identificados como candidatos adecuados para este estudio se traen adentro para reunirse con el Coordinador de la investigación, en el que se discuten una divulgación completa de los riesgos potenciales. Sobre la confirmación de una comprensión completa de los riesgos potenciales involucrados, consentimiento de los sujetos se logró en forma escrita y verbal. Consentimiento del sujeto incluye permiso (1) almacenamiento (2) a largo plazo de flebotomía de sus tejidos para la investigación futura y (3) de acuerdo a la creación de cultivos primarios de muestras de tejido recogidas. Después de consentimiento, temas reciben un formulario para completar en que líos permitidos de raza/origen étnico y el derecho de confidencialidad. Una visita subsecuente está programada para obtener la biopsia de endometrio basada en el ciclo menstrual del sujeto. Voluntarios reclutados en este estudio reflejan la demografía étnica y racial de la región metropolitana de St. Louis como se documenta en el censo 2012 y no implicó la participación de todas las poblaciones vulnerables incluyendo mujeres embarazadas, fetos, embriones, niños menores de 18 años de edad, o de otros grupos vulnerables. Requisitos de elegibilidad para la participación en la toma de muestras de biopsia incluyen (1) ser entre las edades de 18-45 años (2) tener ciclos menstruales regulares (días 25-32) (3) no tener ningún embarazo actual o uso de dispositivo intrauterino/hormonales anticonceptivos 30 días antes de la inscripción (4) no actual infección vaginal o enfermedades de transmisión sexual (5) que no los tratamientos antibióticos actuales y (6) no que actual citología vaginal anormal.

Dentro de este estudio, las células stromal endometriales humanas (HESCS) son cultivadas y artificialmente inducidas a decidualization en vitro a través de la suplementación de hormonas (estradiol (E2), acetato de medroxiprogesterona (MPA) y adenosina cíclica monofosfato (cAMP)) al medio. En este método, el grado de decidualization se altera en base en el número total de días de tratamiento hormonal. Junto con el cambio de citoesqueleto, suplementación hormonal induce adaptaciones bioquímicas en el cual las células decidual experimentan cualidades secretores como2,4. La expresión de genes de la seña de identidad, como la prolactina (PRL) y la proteína de unión a factor de crecimiento insulínico tipo 1 (IGFBP1), puede ser utilizada para confirmar y cuantificar el grado de HESCS decidualization5,12, 13 , 14. lo importante, también se demuestra la viabilidad de este protocolo para llevar a cabo la caída específica del gene.

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Protocol

Todas las biopsias de endometrio humano recogidas para este estudio fueron logradas por la Universidad de Washington en St. Louis, Departamento de Obstetricia y Ginecología mediante una Junta de revisión institucional (IRB) había aprobado el formulario de consentimiento escrito.

1. preparación

  1. Preparar 500 mL de 1 x de Hank equilibrada solución de sal (HBSS) mediante la adición de 100 U/mL de penicilina y 100 μg/mL estreptomicina a la botella que contiene los medios de comunicación (más referenciada como HBSS + medio).
  2. Preparar 500 mL de medio de Eagle modificado de Dulbecco: mezcla de nutrientes F-12 (DMEM/F12) con rojo de fenol, L-glutamina y el ácido-(2-hydroxyethyl)-1--1-ácido 15 mM 4 (HEPES) mediante la adición de solución de antibiótico-antimicótico 1% (la concentración final es de 0.25 μg/mL, 100 U/mL de penicilina y 100 μg/mL estreptomicina Fungizone) a los medios que contienen botella (además hace referencia a como los medios de aislamiento de células).
  3. Preparar 500 mL de DMEM/F12 con rojo de fenol, L-glutamina y 15 mM HEPES agregando 10% suero bovino Fetal (FBS), 1 x Na2HCO3y 1% penicilina (10.000 U/mL) y estreptomicina (10.000 μg/mL) (Pen-Strep) a los medios de comunicación (más que contiene la botella hace referencia a como medio de HESCS).
  4. Preparar 500 mL de medio de suero reducido con L-glutamina, 2,4 g/L de bicarbonato y HEPES con 2% carbón despojado suero bovino Fetal (csFBS) y 1% Pen Strep a los medios que contienen botella (más referenciada como Decidualization medios).
  5. Preparar 500 mL de rojo de fenol libre DMEM/F12 mediante la adición de 2% carbón pelados suero bovino fetal (csFBS) en los medios de comunicación que contienen botella (más referenciada como medio de cambio).
  6. Preparar 10 nM estradiol (E2), acetato de medroxiprogesterona de 1 μm (MPA) y 50 μm cíclico del monofosfato de adenosina (cAMP) en un tubo cónico de polipropileno de 15 mL y añadir un 2 ml por pozo alícuota de medios decidualization previamente preparado para in vitro ensayo de decidualization (además hace referencia a como los medios de comunicación EPC).
  7. Preparar 50 mL de congelación medios con 90% FBS y 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) en el tubo cónico polipropileno 50 mL (referenciada adicional como medios de congelación).
  8. Pesan los 25 mg de colagenasa y 5 mg de DNasa I en un tubo cónico de polipropileno 50 mL y conservar a-20 ° C.

2. adquisición de biopsia de endometrio humano

  1. Obtener muestras de biopsia de endometrio humano recogidas en la fase proliferativa (día 9 - 12 días) del ciclo menstrual de la clínica de la IRB aprobado en HBSS.
  2. Lavar las muestras de biopsia con 1 mL de precalentado a 37 ° C HBSS + medio y agítelo suavemente para quitar el exceso de sangre y mucosas.

3. aislamiento de células Stromal Endometrial humanas (HESCS)

Nota: Este procedimiento de aislamiento se realiza en un ambiente estéril bajo una cabina de seguridad biológica.

  1. Transferencia de la biopsia con pinzas esterilizadas en un tubo de centrífuga cónico de polipropileno de 50 mL que contiene 10 mL fresco HBSS.
  2. Centrifugue la biopsia a temperatura ambiente a 500 x g por 90 s.
    1. Si las rupturas de pellet celular, volver a girar la biopsia a 2.000 x g por 90 s.
  3. Retire los medios utilizando una pipeta de 1 mL y lavar con 10 mL de 37 º C precalentado HESCS medios de aislamiento seguidos por centrifugación a 500 x g durante 90 s.
  4. Retire los medios utilizando una pipeta de 1 mL y vigorosamente, añadir 3 mL de medio de aislamiento de células frescas para desalojar a la biopsia.
  5. Decantar la biopsia en una placa Petri que contiene 5 mL de medio de aislamiento de células.
  6. Pique la biopsia en como pequeñas piezas como sea posible usando #5 pinzas y tijeras de fina puntada recta durante unos 20 minutos.
  7. Preparar la ADNasa I y enzimas colagenasa añadiendo 10 mL de medio de aislamiento de HESC a DNasa previamente pesado (0.5 mg/mL) y colagenasa (2,5 mg/mL). Mezclar con la pipeta.
  8. Pipeta de corta muestras de tejido utilizando una pipeta de 1 mL en un nuevo tubo de polipropileno cónico de 50 mL. Lavar con 7 mL de medio de aislamiento de células y añadir al tubo de polipropileno para adquirir la muestra completa.
  9. Centrifugar la muestra a temperatura ambiente a 800 x g durante 2 minutos Retire con cuidado el sobrenadante con una pipeta.
  10. Filtro de la DNasa I y solución de colagenasa con filtro de 0.2 μm al jeringa 10 mL directamente en pellets.
  11. Vortex por 10 s para Resuspender el pellet.
  12. Digest en baño de agua de 37 ° C durante 1,5 h, Vortex por 10 s completamente cada 10 minutos, hasta que se digiere el tejido.
  13. Filtrar la muestra a través de un colador de célula μm 40 apilados sobre un tubo de polipropileno de 50 mL cónico para quitar las células epiteliales y restos de tejido.
    Nota: Las células del estroma son en el tubo de polipropileno cónicos de 50 mL.
  14. Centrifugar el tubo de polipropileno de 50 mL cónico a 800 x g durante 2,5 min a temperatura ambiente. Retire con cuidado el sobrenadante con una pipeta de 1 mL.
  15. Resuspender el precipitado en 10 mL de medio de aislamiento de células.
  16. Centrifugue a 800 x g durante 2,5 min a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante y luego resuspender las células en 6 mL de HESCS medios y pipeta hacia adelante y hacia atrás para mezclar.
  17. Lentamente la capa en 3 mL de medio gradiente de densidad a las células resuspendidas para separar glóbulos restantes de las células del estroma, teniendo cuidado de no mezclar las capas.
  18. Centrifugar el tubo de polipropileno de 15 mL a 400 x g durante 30 min a temperatura ambiente.
  19. Recoger 5 mL del sobrenadante en un nuevo tubo de polipropileno de 50 mL y añadir un adicional 5 mL Media de HESCS para resuspender las células.
  20. Centrifugue a 800 x g durante 2,5 min a temperatura ambiente, seguida por eliminación del sobrenadante y adición de medios de comunicación de HESCS 6 mL. Vórtice de la muestra de 10 s y mezclar mediante pipeteo adelante y atrás 5 veces.
  21. Alícuota de 10 μl de células resuspendidas a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL para recuento de células.
  22. Añadir 10 μl de azul de tripano tinción celular alícuota y mezclar con la pipeta de 0,4%. Cargar 10 μl de la alícuota y contar las células usando un hemocitómetro.
  23. Las células en un frasco apropiado depende del conteo total en medios de comunicación de HESCS 15 mL de la placa.
    1. Si el número total de células es inferior a 1 millón, la placa de todas las celdas de 25 cm frasco con 6 mL de medio de HESCS. Si el número total de células es más de 1 millón, placa de todas las celdas de 75 cm frasco con 15 mL de medio de HESCS.
  24. Las células en una 5% CO2 incubadora a 37 ° C durante un mínimo de 6 h para asegurar la adhesión celular adecuada y cambiar los medios de comunicación a medios de comunicación de células de la cultura.
  25. La cultura las células aisladas en una 5% CO2 incubadora a 37 ° C por un período de 3-5 días hasta que las células forman una monocapa que alcanzar 80-90% de confluencia en un frasco plateado.
  26. Cambiar medios de HESCS cada dos días.
    1. Medios de HESCS caliente en un baño de agua de 37 ° C durante 15-20 min.
    2. Aspire los medios de comunicación del frasco y añadir Media células frescas al matraz (volumen de trabajo: 8 mL o 16 mL por frasco de 25 cm o 75 cm respectivamente).
    3. Frasco vuelva a colocar el 5% CO2 incubadora a 37 ° C hasta alcanza 80-90% de confluencia.
  27. Una vez células confluentes de 80-90%, transferencia de células de 25 cm a 75 cm matraz o frasco de 75 cm uno a tres frascos de 75 cm.
    Nota: HESCS pueden ser congelada y almacenada para uso posterior en este momento para la experimentación futura.

4. congelación y descongelación HESCs

  1. Aspire el medio del frasco de 75 cm y añadir 2 mL de tripsina-EDTA.
  2. Incubar en una incubadora 5% CO2 para 2-3 min a 37 ° C hasta desalojar a las células del frasco.
  3. Agregar 7 mL de HESCS Media y mezcla bien transfiriendo hacia adelante y hacia atrás.
  4. Centrifugue a 800 x g durante 2,5 min y aspirar el sobrenadante.
  5. Etiqueta los tubos con línea celular, fecha y número de paso de congelación.
  6. Resuspenda el precipitado de células en 5 mL de medio de congelación.
  7. Alícuota 1 mL de las células suspende de nuevo para cada tubo y transferencia tubos al congelador de-80 ° C.
  8. Transferir los tubos a nitrógeno líquido dentro de las 24 horas.
    Nota: Si planea descongelar las células en un futuro inmediato, guardar las células de-80 ° C durante un mes.
  9. Para descongelar las HESCs precalienta medios de HESCS por 20 min.
  10. Añadir 8 mL de medio de HESCS precalentado a matraz de 25 cm.
  11. Recuperar el tubo de congelación desde el tanque de nitrógeno líquido o -80 ° C y sumerja el tubo en baño de agua de 37 ° C durante 1-2 min descongelar las células.
  12. Transferencia de células descongeladas a un matraz de 25 cm con células e incubar en una incubadora 5% CO2 durante la noche a 37 ° C.
  13. Al día siguiente, cambiar el medio de HESCS y esperar 2-3 días hasta que HESCS ser confluente y transferir las células a matraz de 75 cm como se detalla a continuación en el protocolo 5.
    1. Medios de HESCS caliente en un baño de agua de 37 ° C durante 15-20 min.
    2. Aspire los medios de comunicación del frasco y añadir Media células frescas al matraz (volumen de trabajo: 8 mL o 16 mL por frasco de 25 cm o 75 cm respectivamente).
    3. Frasco vuelva a colocar el 5% CO2 incubadora a 37 ° C hasta alcanza 80-90% de confluencia.

5. cultivo de células Stromal Endometrial humanas (HESCS)

Nota: Este procedimiento de cultivo se realiza en un ambiente estéril bajo una cabina de seguridad biológica.

  1. Medios de comunicación de células pre-heat a 37 ° C en un baño de agua durante 20-30 min.
  2. Aspire los medios de comunicación del frasco y agregar 0.25% tripsina dihidratada del ácido (EDTA) (1 mL para el frasco de 25 cm o 2 mL para el frasco de 75 cm).
  3. Incubar en una 5% CO2 incubadora a 37 ° C durante 2-3 min hasta desalojar a las células.
  4. Golpee suavemente las paredes del matraz para desalojar las células restantes. Agregar 7 mL de HESCS Media y mezcla bien transfiriendo hacia adelante y hacia atrás.
  5. Pipeta de la mezcla de células en un tubo cónico de polipropileno 50 mL y centrifugar a 800 x g durante 2,5 min a temperatura ambiente.
  6. Aspirar el sobrenadante y Resuspenda el precipitado de células en medios de HESCS.
    1. Añadir 15 mL para el frasco de 25 cm o 45mL para el frasco de 75 cm (15 mL).
  7. Añadir 5 mL o 15 mL de suspensión de células en cada matraz de 25 cm o 75 cm respectivamente.
  8. La cultura las células aisladas en una 5% CO2 incubadora a 37 ° C por un período de 3-5 días hasta que las células forman una monocapa que alcanzar 80-90% de confluencia en un frasco plateado.
  9. Cambiar medios de HESCS cada dos días.
    1. Medios de HESCS caliente en un baño de agua de 37 ° C durante 15-20 min.
    2. Aspire los medios de comunicación del frasco y añadir Media células frescas al matraz (volumen de trabajo: 8 mL o 16 mL por frasco de 25 cm o 75 cm respectivamente).
    3. Frasco vuelva a colocar el 5% CO2 incubadora a 37 ° C hasta alcanza 80-90% de confluencia.

6. humana galjanoplastia de célula (HESC) Stromal Endometrial y siRNA transfección

Nota: Este procedimiento de transfección se realiza en un ambiente estéril bajo una cabina de seguridad biológica.

  1. Aspirar células medios del frasco de 75 cm y añadir 2 mL de solución al 0.25% tripsina-EDTA.
  2. Incubar de 5% CO2 incubadora a 37 ° C durante 2-3 min hasta desalojar a las células.
  3. Una vez que las células son desalojadas del frasco, agregar 7 mL de medio de células y mezclar suavemente transfiriendo hacia adelante y atrás 5 veces.
  4. Pipeta de la mezcla de células en un tubo cónico de polipropileno 50 mL y centrifugar a 800 x g durante 2,5 min a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante y Resuspenda el precipitado de células en 10 mL de medio de HESCS.
    Nota: Si las células de más de un frasco de la galjanoplastia, simplemente aumentar el volumen de medios de HESCS.
  5. Contar las células usando un hemocitómetro.
    1. Alícuota de 10 μl de células suspendidas de nuevo en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
    2. Añadir 10 μl de 0.4% azul de tripán mancha a celular alícuota y mezclar mediante pipeteo hacia adelante y atrás.
  6. Células por pocillo en placas de 6 pocillos en placa 0.8 x 105 . Después de dos días, las células deben ser confluente de 60-70% para transfección óptima.
  7. Para cada muestra de transfección de siRNA, preparar complejos usando siRNA (60 nanomoles) al reactivo de transfección.
  8. Diluir 5 μl de reactivo de transfección en 150 μL de medios libres de suero reducido e incubar durante 5 minutos.
  9. Diluir 60 nanomoles de siRNA en 100 μl de medios libres de suero reducido e incubar durante 5 minutos.
  10. Después de 5 minutos, combinar siRNA diluido con solución de reactivo de transfección diluido y mezclar suavemente transfiriendo hacia adelante y atrás 5 veces.
    Nota: Si transferencia de uno o varios siRNA en pozos múltiples, prepare la mezcla principal en 10 mL tubos de poliestireno.
  11. Incubar complejos de reactivo de transfección de siRNA durante 5 minutos a temperatura ambiente.
  12. Durante la incubación, añadir 1 mL de medio de cambio a cada pocillo.
  13. Después de 5 minutos de incubación, centrifugar los tubos a 500 x g durante 2 minutos recoger la solución y añadir 250 μl de complejos de reactivo de transfección de siRNA a cada uno que también contiene las células y los medios de comunicación.
  14. Mezclar, meciendo suavemente e incubar las células a 37° C en un incubador 5% CO2 para 5 h.
  15. Después de 5 h, cambiar los medios de comunicación a medios de HESCS.
  16. Incube las células a 37 ° C en un incubador de 5% CO2 durante 2 días en la preparación de un ensayo de decidualization en vitro .

7. in Vitro Decidualization ensayo

Nota: Este ensayo se realiza en un ambiente estéril bajo una cabina de seguridad biológica.

  1. Preparar los medios de comunicación EPC antes de iniciar el tratamiento in vitro decidualization como se describe en Camden et al. 3 (ver 1.6).
  2. Aspire los medios de comunicación de la hora del post-48 transfected línea de HESCS se incubaron de paso 6.16.
  3. Añadir 2 mL de medio de EPC en cada pozo.
    Nota: como control, dejar un conjunto de células sin trata con los medios de comunicación EPC. En su lugar, añadir 2 mL de células los pocillos de control.
  4. Incubar las células en 5% CO2 incubadora a 37 ° C durante 6 días.
    1. Cambiar los medios de comunicación EPC cada 48 horas.
      1. Calentar y preparar los medios de comunicación EPC en un baño de agua de 37 ° C durante 15-20 min.
      2. Aspire los medios de comunicación del pozo y agregar medios EPC fresco.
      3. Coloque la placa en el 5% CO2 incubadora a 37 ° C.
  5. Después del sexto día, analizar el grado de decidualization células estromales mediante ELISA y qRT-PCR (como se describe a continuación).

8. validación del Decidualization In Vitro utilizando PCR en tiempo Real cuantitativa (qRT-PCR)

Nota: qRT-PCR se completa como se describió anteriormente en Kommagani et al10.

  1. Aislar el ARN total de HESCS utilizando el protocolo de un kit de aislamiento de RNA comercialmente disponible.
    1. Analizar la cantidad de RNA y la pureza (un260/A280) usando un NanoDrop o metodología similar como se describe en Garcia-Elias et al15.
  2. Sintetizar el cDNA de 1 μg de ARN total a través de un protocolo del kit de transcripción reversa disponible en el mercado.
  3. Haga una reacción de qRT-PCR como se describe en un protocolo del kit disponible comercialmente de qRT-PCR.
    1. Realizar la reacción con un disponible en el mercado en tiempo real PCR Master Mix y sondas de genes específicos junto con controles internos del sistema (18s, PRLy IGFBP1).

9. validación del Decidualization In Vitro utilizando ELISA

  1. Cuantificar los niveles de prolactina secretados desde los medios de cultivo de tejido utilizando un kit de prolactina ELISA disponible comercialmente.

10. validación del Decidualization In Vitro utilizando Phalloidin tinción.

  1. Inserte el cubre-objetos estéril en cada pocillo de una placa bien 12.
  2. Repita los pasos 6.1-6.5.
  3. Células por pocillo de una placa de la pozo 12 en placa 0.8 x 105 .
  4. Incubar las células en 5% CO2 incubadora a 37 ° C durante 2 días.
  5. Aspire los medios de comunicación.
  6. Repita los pasos 7.3-7.4.
  7. Fijar las células en 4% paraformaldehido (PFA) en tampón fosfato salino (PBS) a temperatura ambiente durante 30 minutos.
  8. Aspire la solución de fijación y lavar 3 veces con 1 mL de PBS durante 5 minutos.
  9. Añadir éter de fenil 0.1% tensioactivo no iónico, glicol de polietileno terc-octil en PBS durante 5 minutos las células fija para aumentar la permeabilidad.
  10. Lavar 3 veces con 1 mL de PBS durante 5 minutos.
  11. Añada 100 μl de solución phalloidin por cubreobjetos e incubar a temperatura ambiente durante 90 minutos.
    1. Preparar la dilución 1: 100 en PBS de utilizar una solución madre de phalloidin en 1 unidad por 5 μl.
  12. Lavar 3 veces con 1 mL de PBS durante 5 minutos.
  13. Montar las diapositivas con medio de montaje que contiene 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI).
  14. Observar las células utilizando un microscopio confocal.

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Representative Results

Decidualization en cultivo de células

Tras aislamiento, las células stromal endometriales humanas fueron cultivadas a una formación de monocapa con 80-90% de confluencia e inducida por decidualization en vitro por tratar con 10 nM E2, 1 μm MPA y campamento de 50 μm (EPC). Cambios morfológicos asociados con en vitro decidualization fueron visualizados en la figura 1A. Sobre decidualization, HESCs se someten a cambio citoesqueleto de células fibroblásticas alargadas redondeadas las células epitelioides. Así, phalloidin coloración fue realizada para confirmar la reorganización citoesquelética durante decidualization de HESCS. Phalloidin es un péptido bicíclica altamente selectivo que se utiliza para teñir de filamentos de actina, visualizando así el citoesqueleto cambio consistente con en vitro decidualization (figura 1B).

A seis días de post tratamientos de EPC, PRL y los niveles de mRNA de IGFBP1 se evaluaron mediante qRT-PCR para confirmar el grado de decidualization (figura 2A). Niveles de PRL y IGFBP1 fueron significativamente mayores en comparación con células tratadas con vehículo de control (p < 0,001). También se evaluaron los cambios bioquímicos asociados con decidualization a través de la cuantificación de los niveles de PRL secretados desde el medio de cultivo (figura 2B). De acuerdo con los niveles de transcripción, los niveles de PRL fueron muy elevados en el EPC cultivadas células en comparación con el control (p < 0,001).

El efecto de la derogación del gen específico en los cambios celulares y moleculares de HESCs decidualization se evaluó mediante SRC-2 como gene del candidato (figura 3). Tras 48 horas de la transfección con control o siRNA SRC-2 , células fueron cultivadas en 6 días en los medios de comunicación EPC. SiRNA control transfected HESCS demostrados celulares y moleculares cambios constantes con decidualization apropiada, incluyendo un cambio morfológico de adoquines y los niveles de transcripción creciente de marcadores decidualization PRL y IGFBP1. Como era de esperar, con caída SRC-2 siRNA, HESC permanecido fibroblástica en apariencia en comparación con el siRNA control transfected HESCS (Figura 3A). De acuerdo con este cambio de celular, PRL y transcripción de IGFBP1 niveles fueron disminuidos perceptiblemente dentro de SRC-2 siRNA transfected HESC, indicando un descarrilamiento en programación decidualization con caída en fuente-2 (* **p < 0.001). Fuente-2 niveles de transcripción fueron disminuidos perceptiblemente en fuente-2 siRNA transfected HESCS comparados para controlar siRNA, indicando un silenciamiento eficiente con nuestro método (***p < 0.001) (figura 3B).

Figure 1
Figura 1 : Cambios celulares de las células stromal endometriales humanas durante en vitro decidualization. HESCs fueron aisladas y cultivadas durante seis días en los medios de comunicación que contiene el vehículo o E2, MPA y campamento (EPC). A) celular imágenes que ilustran los cambios en la morfología celular de fibroblástica a células epitelioides. B) Phalloidin manchados imágenes de HESCS ilustrando los cambios citoesqueléticos (en verde) asociados en vitro decidualization, donde el azul representa el núcleo (DAPI). La flecha roja representa las células decidualized. La flecha negra muestra las células fibroblásticas. Barra de escala: 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : Cambios moleculares en las células stromal endometriales humanas durante en vitro decidualization. A) ARN total fue aislado de HSECs cultivadas durante seis días en los medios de comunicación que contiene el vehículo o E2, MPA y campamento (EPC) y sometidos a análisis de qRT-PCR para detectar niveles de transcripción de IGFBP1 y PRL . B) niveles de PRL secretada en los medios de cultivo fueron medidos usando un análisis basado en ELISA de células cultivadas durante seis días en cualquier vehículo a EPC. p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 : Caída de la fuente-2 en células stromal endometriales humanas afecta a en vitro decidualization. A) cambios morfológicos en siRNA transfected HESCS tras 6 días de la cultura con los medios de comunicación EPC (top paneles: siRNA control en momento puntos de día 0 y día 6, paneles inferiores: SRC-2 siRNA al tiempo señala día 0 y día 6). B) niveles de transcripción de SRC-2, PRLy IGFBP1 en el día 0 y día 6 de EPC tratan células transfectadas con control o siRNA de fuente-2 . La flecha negra representa las células decidualized. La flecha blanca muestra las células fibroblásticas. Barra de escala: 200 μm. *** p < 0.001.  Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El ciclo menstrual reproductivo femenino se caracteriza por un aumento en los niveles de progesterona durante la fase lútea, de tal modo induciendo el decidualization del ESC en Ronda, epiteliales como células secretoras3,8. La iniciación del decidualization es especie dependiente. En los seres humanos, decidualization se produce espontáneamente tras el aumento de la concentración de progesterona, mientras que ratones requieren presencia de blastocistos10,11. Esta inconsistencia en el decidualization ejemplifica las ventajas traslacionales de estudiar celular diferenciación en líneas celulares humanas. Ensayos in vitro mediante cultivo de células primarias son a menudo utilizados para explorar la modulación del decidualization via hormonas4,6,10. Sin embargo, limitaciones de este método pueden ocurrir en la obtención de un tamaño de muestra grande de tejido humano sin variaciones significativas en la historia de ciclo de fase y el embarazo. Sin embargo, se pueden tomar medidas para asegurarse de limitaciones se reducen al mínimo por planificación el estudio suficiente antelación para garantizar amplias muestras y biopsias de programación en la fase proliferativa (día 9 - 12 días) del ciclo menstrual.

En este estudio, células cultivadas y decidualized artificialmente a través de un novedoso método que describió por primera vez en Brosens et al. 16 en que las hormonas E2, P4 y campo se complementan al medio de cultivo a lo largo de un período de incubación de 6 días. Por lo general, métodos alternativos de12,14 cebada célula culturas para decidualization artificial mediante la adición de E2 y MPA durante un período de incubación prolongado 14 días. La suplementación de campamento a los medios de cultivo sinérgico amplifica el decidualization del ESC en un marco de tiempo corto mientras simultáneamente regulando la expresión de genes que contiene regiones de promotor de campo elemento sensible (es decir, PRL y IGFBP1)12,13. Este método, basado en el protocolo descrito en Kommagani et al. 10, permite la optimización del aislamiento y cultivo de células. Pureza de la cultura de célula se optimizó utilizando un colador de célula μm 40 para separar células stromal y epiteliales. Además, se aplicó reactivo de Ficoll-Paque PLUS para garantizar un aislamiento viable, de alto rendimiento de las células estromales puros sobre la eliminación de las células de la sangre de la muestra. Un paso de centrifugación adicional (400 x g durante 30 min) fue incluido además de Ficoll siguientes para asegurar la eliminación completa de células de la sangre de la población de células. Finalmente, se optimizaron rendimiento y viabilidad de células en cultivo de células de hasta 95% de confluencia para el decidualization. En conjunto, estos pasos adicionales garantiza la cultura pura de viable, de alto rendimiento de HESCS.

El grado de decidualization se evaluó utilizando qRT-PCR y ELISA phalloidin tinción para observar el cambio del citoesqueleto y upregulation de los genes de la seña de identidad. En qRT-PCR, se evaluaron los niveles de transcripción de marcadores decidualization PRL y IGFBP1 . Sobre decidualization de HESC, niveles de PRL y IGFBP1 aumentaron en una forma dependiente del tiempo, como establecido a partir de investigaciones anteriores6. El incremento dependiente del tiempo de los niveles de PRL secretados también fue confirmado mediante el examen de los medios de cultivo de tejidos de células mediante ELISA. Además, alteraciones morfológicas de las células del estroma en las células decidual pueden visualizarse a través de la costaining de los filamentos de actina mediante phalloidin y marcador nuclear 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI)17. Juntos, estos resultados experimentales confirman la efectividad del cultivo de células a través de la suplementación de E2, MPA y el campo.

También se evaluó la capacidad de este protocolo para el estudio de precipitación específica gen utilizando siRNA contra fuente-2. Morfológicamente, SRC-2 transfectadas HESCS seguían siendo fibroblástico, mientras que células trataron con siRNA control decidualized en células epitelioides. SRC-2 precipitación eficacia se evaluó a través del nivel de transcripción y fue disminuida considerablemente, indicando un éxito silenciamiento de genes específicos con nuestro protocolo. Así, el protocolo puede ser un recurso útil para los investigadores interesados en delinear el papel de genes específicos en decidualization endometrial.

Mientras que se han hecho avances en la comprensión de los mecanismos moleculares subyacentes de decidualization, todavía existe una brecha de conocimiento significativo en los detalles. Decidualization incorrecta se ha establecido como una causa de fracaso de implantación y posterior temprano embrión aborto4,6,7,10. Por lo tanto, es necesaria para el diagnóstico y tratamiento de la insuficiencia de embarazo mayor exploración sobre los factores epigenéticos y caracterización de vías moleculares.

En conclusión, el protocolo presentado a lo largo de este estudio establece un método eficiente para aislar y una línea de células stromal endometriales humanas pura y viable de la cultura. Complementando las hormonas E2, MPA y campamento a los medios de cultivo, puede ser inducida artificial decidualization confirmado por qRT-PCR, ELISA y la coloración Phalloidin. Además, nuestro protocolo esboza pasos detallados necesarios para la eficiente caída de un gen específico de interés usando siRNA y transfecciones base de lípidos. En conjunto, este método presenta la posibilidad de estudiar los mecanismos celulares y moleculares subyacentes asociados con decidualization de HESCS.

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Disclosures

Este trabajo es apoyado por financiamiento de institutos nacionales de salud (NIH) / Instituto Nacional de salud infantil y desarrollo humano (NICHD) grant (R00 HD080742) y puesta en marcha de la escuela de medicina de la Universidad de Washington fondos a R.K. Nos gustaría agradecer a la clínica de fertilidad de la Universidad de Washington para proporcionar las muestras de biopsia endometrial.

Acknowledgments

Los autores no tienen nada que revelar.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Opti-MEM I (1X) Reduced Serum Medium Gibco 31985-070 For decidualization media
DMEM / F12 (1:1) (1X) Gibco 11330-032
Trypan Blue Stain (0.4%) Gibco 15250-061 For cell count
PureLink RNA Mini Kit Invitrogen 12183018A For RNA Isolation/Purification
TaqMan 2X Universal PCR Master Mix Applied Biosystems 4304437
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Applied Biosystems 4374967
Eukaryotic 18S rRNA Endogenous Control Life Technologies 4319413E For qPCR internal control
TaqMan Gene Expression Assay Prolactin Probe Applied Biosystems 4331182 For qPCR internal control
TaqMan Gene Expression Assay IGFBP1 Probe Applied Biosystems 4331182 For qPCR internal control
Phalloidin-iFluor 488 Reagent - CytoPainter Abcam ab176753
Human Prolactin ELISA Kit Invitrogen EHIAPRL
16% Paraformaldehyde Alfa Aesar 30525-89-4 Fixative
Lipofectamine RNAiMAX Invitrogen 13778150 Transfection Reagent
ProLong Gold antifade reagent with DAPI Invitrogen P36935 For mounting
0.25% Trypsin-EDTA (1X) Gibco 25200-056
Penicillin Streptomycin Gibco 15140-122
Charcoal Stripped Fetal Bovine Serum Sigma F6765-500ML
Sodium Bicarbonate (7.5%) Gibco 25080-094
Ficoll-Paque PLUS Reagent Fisher Scientific 45001749
Collagenase from Clostridium histolyticum Sigma C0130-1G
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas Sigma DN25-100MG
Medroxyprogesterone 17-acetate Sigma M1629-1G For EPC Media
Estradiol Sigma E1024-1G For EPC Media
cAMP Sigma A6885-100MG For EPC Media
Fine straight stitch scissors Fine Science Tools 15396-00
TaqMan Gene Expression Assay NCOA2 Probe Applied Biosystems 4351372
Fetal Bovine Serum, heat inactivated Gibco 10-082-147
Antibiotic-antimycotic Thermo Scientific 15240062
Hank’s Balanced Salt Solution  Corning 21-021-cv
50 mL conical polypropylene Falcon tube Corning 352098
Dumont #5/45 Forceps Fine Science Tools 11251-35
100 x 15 mm Glass Petri dish VWR 75845-546
40 micron cell strainer Midsci 229481
Isotemp 215 Water bath Fisher Scientific FS-215
LSE Centrifuge  Corning 6755
Human NCOA2 siRNA  Dharmacon L-020159-00 Gene specific qPCR probe
Steri-cycle i160 CO2 Incubator  Thermo Scientific 51030301
NanoDrop 2000 Thermo Scientific ND-2000 For RNA quantification
Phosphate Buffered Saline  Fisher Scientific 50146771
75 cm Canted Neck Cell Culture flask Corning 430641U
6 well Non-Pyrogenic Cell Culture Plate Corning 3506
Pipet Controller Ultra Corning 4099
Photoshop Adobe 19.0.1.334
25 cm Canted Neck Cell Culture flask Corning 7200876
Triton X-100 Sigma X100-1L
15 mL conical polypropylene Falcon tube Corning 352099
10 mL Syringe BD 302995
1300 Series A2 Biological Safety Hood Thermo Scientific 1377
accuspin Micro17 centrifuge Fisher Scientific 13100675
7500 Fast real time PCR system Applied Biosystems 3052632
EVOS FL Immunofluorescence Microscope Life Technologies 01414-155G-291
Leica Inverted Light Microscope Leica DMi1
Illrustrator Adobe 22.0.1.253
Excel Spreadsheets Microsoft 2016
Deckglaser 18 mm cover glasses NeuVitro GG-18
Reichert Bright-Line Hemacytometer Sigma Z359629-1EA
2-mercaptoethanol Fisher Bioreagents BP176-100 For RNA lysis buffer
1.2mL External Threaded Polypropylene Cryogenic Vial Corning 430658 For freezing HESC cells 
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma D2650-100mL For freezing media

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References

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