Bewertung der Rolle der mitochondrialen Funktion in krebsbedingte Fatigue

Cancer Research

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Summary

Unser Ziel war es, eine praktische Protokoll zur Bewertung der mitochondrialen Dysfunktion mit Müdigkeit bei Krebspatienten zu entwickeln. Dieses innovative Protokoll ist für die klinische Anwendung mit nur standard Aderlass und grundlegende Laborverfahren optimiert.

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Feng, L. R., Nguyen, Q., Ross, A., Saligan, L. N. Evaluating the Role of Mitochondrial Function in Cancer-related Fatigue. J. Vis. Exp. (135), e57736, doi:10.3791/57736 (2018).

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Abstract

Müdigkeit ist eine gemeinsame und schwächenden Erkrankung, die meisten Krebspatienten betroffen. Bisher testen Müdigkeit bleibt schlecht gekennzeichnet mit keine Diagnose Objektiv messen die Schwere dieser Erkrankung. Hier beschreiben wir eine optimierte Methode zur Beurteilung der Funktion der Mitochondrien der PBMCs von ermüdeten Krebspatienten gesammelt. Mit einem kompakten extrazelluläre Flux System und sequentielle Einspritzung der Atemwege Inhibitoren, untersuchten wir PBMC mitochondriale funktionellen Status durch Messung des basalen mitochondriale Atmung, Atemwege Kapazitätsreserven und Energie Phänotyp, der beschreibt die bevorzugte Energiepfad, auf stress zu reagieren. Frische PBMCs sind leicht zugänglich in der klinischen Einstellung mit standard Aderlass. Der gesamte Test beschrieben in diesem Protokoll kann in weniger als 4 Stunden ohne die Einbeziehung der komplexen biochemischen Techniken erfolgen. Darüber hinaus beschreiben wir eine Normalisierung Methode, die für den Erhalt reproduzierbare Daten notwendig ist. Vorgestellten einfachen Verfahren und Normalisierung Methoden ermöglichen wiederholte Probenentnahme aus dem gleichen Patienten und Generierung von reproduzierbaren Daten, die zwischen den Zeitpunkten auszuwertende potenzielle behandlungseffekte verglichen werden können.

Introduction

Müdigkeit ist eine weit verbreitet und bedrückende Bedingung, die eine negative Auswirkung auf die Lebensqualität von Krebs Patienten1hat. Zu diesem Zeitpunkt Krebs Müdigkeit bleibt schlecht definiert und verlässt sich nur auf subjektive Berichterstattung durch die Patienten2. Daher ist dringend notwendig, eine leicht anpassbar diagnostische Labortest zur Charakterisierung von Müdigkeit in der klinischen Einstellung3,4Objektiv zu identifizieren.

Mehrere zugrunde liegende Mechanismen, einschließlich der Dysfunktion der Mitochondrien, sind vorgeschlagen worden, um Müdigkeit5verursachen. Mitochondrien sind die Kraftpaket Organellen, Bereitstellung von 95 % der zellulären Energiebedarf über Oxidative Phosphorylierung und spielen eine wichtige Rolle im Kalzium-Signalisierung, Apoptose, immun-Signalisierung und Regulierung von anderen intrazellulären Signal Veranstaltungen6 . Dementsprechend können zu Müdigkeit beeinträchtigt mitochondriale Bioenergetik und Mängel in der Energieerzeugung beitragen. Diese Hypothese zu unterstützen, haben frühere Studien Mutationen in der mitochondrialen DNA bei Patienten mit chronischen Ermüdung-Syndrom7beobachtet. Während es unklar bleibt, ob der pathophysiologische Ursprung der Müdigkeit liegt innerhalb des zentralen Nervensystems oder der peripheren Geweben, z. B. Skelettmuskulatur8,9, gibt es derzeit keine direkte Methode zum einschätzen mitochondriale Dysfunktion im Zusammenhang mit Müdigkeit in live, atmenden Zellen.

Mit peripheren mononukleären Zellen (PBMCs) Funktion der Mitochondrien zu studieren, bietet mehrere Vorteile. Erstens PBMCs sind leicht zugänglich in der klinischen Einstellung mit standard Aderlass und können schnell mit grundlegende Labortechniken isoliert werden. Blutentnahme ist weniger invasiv als andere Gewebe wie ein Muskelbiopsie zu sammeln. So können Blutproben vom selben Patienten wiederholt im Laufe der Zeit gesammelt werden die longitudinalen Beurteilung der behandlungseffekte erleichtert. Interessanterweise schien mitochondriale Funktion in PBMCs mit Niere mitochondriale Status in einem Tiermodell10gut korreliert werden. Darüber hinaus wurden Immunzelle Mitochondrien als Proxy für systemische Veränderungen unter verschiedenen Krankheiten Bedingungen11,12verwendet. Mitochondrien in zirkulierenden Immunzellen sind besonders empfindlich auf Veränderungen der Immunfunktionen und immun Signalmoleküle wie Zytokine13,14,15. Zum Beispiel wurde beobachtet, dass PBMCs von Patienten mit akuten entzündlichen Rheumaerkrankungen hohe Ausgangswert Sauerstoff Verbrauch14aufweisen. Im Gegensatz dazu reduzierte Sauerstoffverbrauch in PBMCs von Patienten mit systemischen entzündlichen Erkrankungen einschließlich Sepsis16isoliert. Unter entzündlichen Erkrankungen können freie Radikale produziert von dysfunktionalen Mitochondrien erhöhten oxidativen Stress und längerer Entzündung17fördern. Die zentrale Rolle der Mitochondrien in der Energieerzeugung als auch oxidativen Stress schlägt den potenziellen Nutzen der mitochondrialen Funktion als Proxy für das Studium Müdigkeit bei Krebs Patienten 13.

Frühere Studien, die Funktion der Mitochondrien verwendet, biochemischen Techniken, mögliche Messung Mitochondrien-Membran oder Isolierung von bestimmten Zell-Populationen, die möglicherweise nicht bereitwillig anpassungsfähig in der klinischen Einstellung5, 14,18. In den letzten Jahren die Entwicklung von extrazellulären Flussmittel Assays hat konnten Forscher leicht und genau untersuchen Änderungen in Sauerstoff-Verbrauch (OCR) in Reaktion auf automatisierte Injektionen von Atmungs-Hemmer19,20 , 21 , 22. jedoch die meisten dieser Studien eignen sich für bestimmte Zelltypen und das große Hochdurchsatz-Format möglicherweise nicht anwendbar in einem klinischen Umfeld. In diesem Manuskript beschreiben wir ein optimiertes Protokoll für die Prüfung der Funktion der Mitochondrien für die klinische Anwendung.

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Protocol

Die aktuelle Studie (NCT00852111) wurde durch die institutionelle Review Board (IRB) des National Institute of Health (NIH), Bethesda, Maryland genehmigt. Teilnehmer an dieser Studie eingeschrieben waren euthymischen Männer, die 18 Jahre oder älter, wer nicht-metastatischem Prostatakrebs mit oder ohne vorherige Prostatektomie diagnostiziert wurden und wurden geplant, um externen Strahl Strahlentherapie (EBRT) erhalten. Potentielle Teilnehmer ausgeschlossen waren, hätten sie eine fortschreitende Krankheit, die erhebliche Müdigkeit verursachen können psychiatrische Erkrankungen innerhalb der letzten fünf Jahre, hatte unkorrigierte Hypothyreose oder Anämie, oder hatte eine zweite Malignität. Personen, die Sedativa, Steroide oder nicht-steroidalen Entzündungshemmern verwendet wurden ebenfalls ausgeschlossen. Gesunden Blutproben wurden am NIH-Abteilung der Transfusionsmedizin von gesunden Spendern unter ein IRB genehmigten Protokoll (NCT00001846) erhalten. Alle Teilnehmer werden am Magnuson Clinical Research Center an der NIH rekrutiert. Unterschriebene schriftliche informierte Einwilligungen wurden vor der Teilnahme an der Studie erhalten.

1. mitochondriale Funktion Messung Vorbereitung (1. Tag des Experiments)

  1. Sensorkassette-Hydrat (siehe Tabelle der Materialien; ungefähre Dauer: 5 min).
    1. Nehmen Sie Sensorkassette aus Verpackung. Fügen Sie 200 μL Kalibrator Lösung in jede Vertiefung der Dienstprogramm-Platte, dann füllen Sie jede Wassergraben mit 400 μl Kalibrator Lösung.
    2. Die Utility-Platte, die nun Kalibrator Lösung aufweist zurückzukehren Sie Sensorplatte. Hydrat die Patrone in einem Inkubator-CO2 37 ° C über Nacht.
      Hinweis: Sensorkassette muss für ein Minimum von 4 h und maximal 72 h hydratisiert werden.

2. klinische Probenvorbereitung (Tag 2 des Experiments)

  1. Messen Sie mit dem 13-Element Bewertung der chronischen Krankheit Funktionstherapie - Müdigkeit (FACIT-F)2,23,24 bei Baseline (vor EBRT Einleitung), Mittelpunkt und Vollendung des EBRT und 1 Jahr Post-EBRT Müdigkeit.
    1. Verwenden Sie einen 0 - 4 Maßstab für jedes Element Reaktion, wobei 0 für "überhaupt nicht" und ein 4 weist darauf hin, dass der Beschwerdegegner bezieht sich auf die zugehörige Anweisung "sehr viel." Gesamtnoten sollte zwischen 16-53, mit niedrigeren Punktzahlen spiegelt hohe Müdigkeit Intensität liegen.
    2. Definieren Sie Müdigkeit als ein FACIT-F-Wert niedriger als 43, mit einem FACIT-F-Score von ≥43, fehlender oder nicht klinisch bedeutsamen Müdigkeit2angibt.
      Hinweis: Ein FACIT-F-Wert von 43 besten teilt Müdigkeit Resultate von Krebs-Patienten und die allgemeine Bevölkerung2.
    3. Umfassen die folgenden 13 Artikel in der FACIT-Müdigkeit-Skala: 1) ich fühle mich müde; (2) Ich fühle mich ganz schwach; (3) Ich fühle mich lustlos, ("ausgewaschen"); (4) Ich fühle mich müde; (5) Ich habe Probleme beim Starten Dinge, weil ich müde bin; (6) Ich habe Probleme, die Dinge zu beenden, weil ich müde bin; (7) Ich habe Energie; (8) Ich bin in der Lage, meine üblichen Tätigkeiten zu tun; (9) ich müssen tagsüber schlafen. (10) Ich bin zu müde, um zu essen; (11) Ich brauche Hilfe meine üblichen Aktivitäten; (12) Ich bin frustriert zu tun, was ich tun möchte, zu müde; und 13) ich habe meine sozialen Tätigkeit zu begrenzen, weil ich müde bin.
  2. PBMC aus frisch gesammelten Blutproben zu isolieren (Dauer: 1 h).
    1. Sammeln Sie 8 mL Blut in eine mononukleären Zellen Vorbereitung Rohr (siehe Tabelle der Materialien).
      Hinweis: Blutproben sollten innerhalb von 2 h Kollektion verarbeitet werden. Die Qualität der PBMCs möglicherweise gefährdet, wenn Blutproben mehr als 2 h nach Musterkollektion verarbeitet werden.
    2. Zentrifugieren Sie bei 1.750 x g für 30 min bei Raumtemperatur (18-25 ° C). Übertragen Sie die trübe Schicht auf eine 15 mL konische Rohr. Fügen Sie bis zu 15 mL PBS und invertieren Sie 5 Mal zu.
    3. Zentrifugieren Sie bei 300 X g für 15 Minuten bei 4 ° C. Sorgfältig entfernen und entsorgen des Überstands ohne störende Pellet. Wieder aussetzen der Pellets durch Zugabe von bis zu 10 mL PBS, und 5 Mal zu invertieren.
    4. Zentrifuge bei 300 X g für 10 min bei 4 ° C. Verwerfen Sie Flüssigkeit überstand und auszusetzen Sie Zellen in 1 mL PBS wieder. Die PBMCs auf einem 1,5 mL Microfuge Rohr übertragen.
    5. Bei 610 X g für 10 Minuten zentrifugieren. Sorgfältig entfernen überstand und Aufschwemmen Pellet komplette RPMI-1640 (RPMI-1640 ergänzt mit 10 % FBS, 10 mM Penicillin/Streptomycin).
  3. Beschichten Zellplatten für nicht-anhaftende Zellen (Dauer: 30 min).
    1. Zell- und klebelösung vorzubereiten (siehe Tabelle der Materialien) durch eine Verdünnung der Stammlösung 0,1 M Natriumbicarbonat pH 8.0. Die Arbeitslösung sollte 3,5 µg/cm2 Fläche.
      Hinweis: Diese Lösung enthält Polyphenolen Proteine aus der marine Miesmuschel Mytilus Edulisgewonnen. Diese Proteine sind wichtige Komponenten des Klebers abgesondert von der Muschel, selbst auf Oberflächen zu verankern. Wir finden, dass Cell-Tak am besten mit PBMCs funktioniert.
    2. Jedes gut 100 μL der verdünnten Klebstoff-Lösung hinzu und mindestens 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Waschen Sie dreimal mit VE-Wasser und Luft trocknen.

3. die mitochondriale Funktion Messung

  1. Vorbereitung der Assay-Medien (Dauer: 10 min).
    Hinweis: Assay Medien müssen am Tag des Experiments frisch zubereitet werden.
    1. Hinzufügen von L-Glutamin, Pyruvat und Glukose Base-Medien (die gleichen Bestandteile wie Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM), aber ohne Natrium Bikarbonat, Glukose, Glutamin oder Natrium Pyruvat) Assay Medien machen. Medien Aufwärmen auf 37 ° C, dann pH auf 7,4 einstellen.
      Hinweis: Konzentrationen von L-Glutamin, Pyruvat und Glukose sind in der Regel identisch mit Konzentrationen in normales Wachstumsmedien, aber anhand der Assay ist einstellbar.
  2. Der Mito Stresstest PBMCs vorbereiten (Dauer: 2 h).
    1. Platte genug PBMCs aus Schritt2 in jede Vertiefung, 80-90 % Konfluenz zu erreichen. Nach unserer Erfahrung hat 1,5 x 105 Zellen/Well die konstantesten Ergebnisse ergeben.
      Hinweis: Wells A und H sind Hintergrund Brunnen und sollte nur Assay Medien mit keine Zellen enthalten. In Brunnen B bis G empfehlen wir die Beschichtung mindestens 3-6 Brunnen pro Patientenprobe um Ausreißer Rechnung zu tragen.
    2. Spin-down Platten 200 X g für 2 min damit Zellen an der Unterseite der Brunnen zu halten. Waschen Sie die Zellen einmal mit Assay Medien. Dieser Schritt entfernt das Wachstumsmedium Serum und Natriumbicarbonat.
      Hinweis: Nach unserer Erfahrung die Waschschritt entfernt in der Regel 20-30 % der Zellen.
    3. Hinzufügen von 180 μL Assay Medien in jedem Brunnen, einschließlich Hintergrund Brunnen A und H. Inkubation in einem nicht-CO2 -37 ° C-Inkubator für 45-60 min.
  3. Läuft die Mito-Stress-Test
    1. Rekonstruieren Sie Drogen im Mito Stress Kit mit Assay Medien wie folgt:
      1. Oligomycin: Fügen Sie 252 μL Assay Medien in das Fläschchen, eine Stammlösung auf 50 μM zu generieren hinzu.
      2. FCCP: Fügen Sie 288 μL der Assay-Medien in das Fläschchen eine Stammlösung auf 50 μM zu erzeugen.
      3. Antimycin A / Rotenone: Fügen Sie 216 μL der Assay-Medien in die Flasche, eine Stammlösung auf 25 μM zu generieren.
    2. Wirbel wieder ca. 1 Minute lang Drogen hergestellt. Verdünnen Sie in funktionierende Lösungen.
      Hinweis: Sollten Konzentrationen von der gebrauchslösungen titriert und vor dem Experiment je nach Zelltyp im Vorhinein festgelegt. Für PBMCs, finden wir, dass 1 μM Oligomycin, 1 μM FCCP und 0,5 μM Antimycin A / Rotenone arbeiten die besten.
    3. Pipette die Drogen in jedem Hafen in der sensorkassette nacheinander:
      1. Anschluss A: Pipette 20 μL von 10 μM Oligomycin für eine Endkonzentration in jede Vertiefung von 1 μM.
      2. Port B: Pipette 22 μL von 10 μM FCCP, für eine Endkonzentration in jede Vertiefung von 1 μM.
      3. Port C: Pipette 25 μL von 5 μM Antimycin A / Rotenon für eine Endkonzentration in jede Vertiefung von 0,5 μM.
  4. Wählen Sie "Mito-Stress-Test" auf einem extrazellulären Flux-Instrument. Folgen Sie Eingabeaufforderung, Instrument und legen Sie die Sensor-Patrone. Das Gerät wird automatisch Sensorkalibrierung durchführen. Setzen Sie die Zellplatte, nachdem Sensorkalibrierung und das Instrument den Rest des Tests zu beenden. Sauerstoff-Dynamik ist gemessen am 530 nm (Anregung) / 650nm (Emission), und Proton-Konzentration gemessen bei 470 nm (Anregung) / 530 nm (Emission).

(4) Normalisierung der Funktion der Mitochondrien Daten

  1. Bereiten Sie Cell Proliferation Assay-Lösung (Dauer: 5 min).
    1. 11,7 mL PBS 48 μL Nukleinsäure-Fleck (500 X) und 240 μL Hintergrund Suppressor hinzufügen (2 X). Der Nukleinsäure-Fleck ist eine Zelle-permeationsfähigen DNA-Bindung-Farbstoff, und die Hintergrund-Suppressor ist eine Maskierung Farbstoff, der abgestorbenen Zellen oder Zellen mit kompromittierten Zellmembran Integrität von gebeizt wird blockiert. Die Kombination aus der DNA-Bindung-Farbstoff und die Hintergrund-Suppressor sorgt dafür, dass nur lebende Zellen gefärbt sind.
    2. Fügen Sie gleiches Volumen von 2 x Arbeitslösung (180 μL hinzu) nach der Mito-Stress-Test abgeschlossen wurde direkt in das Medium in jede Vertiefung.
  2. Inkubieren Sie die Zellen in Anwesenheit von Zelle Verbreitung Assay Lösung in einem Inkubator 37 ° C für 45-60 min. Quantify die Anzahl von lebenden Zellen (fluoreszierend) auf eine Platte Leser bei 508 nm (Anregung) / 527 nm (Emission) und OCR-Daten zu normalisieren (Dauer: 10 min) .
    Hinweis: Zusätzlich zu der Nummer lebenden Zellen, Benutzer können auch ihre Daten mit der Gesamtzahl der Zellen, Höhe der Nukleinsäure, proteinkonzentrationen usw.zu normalisieren.

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Representative Results

Die Mito-Stress-Test beruht auf Messung der Sauerstoff-Verbrauch (OCR) nach sequentielle Einspritzung von verschiedenen Atemwege Inhibitoren ein vollständiges mitochondriale Profil zuordnen. OCR-Messungen nach jeder Injektion von Drogen verwendet werden kann, um die folgenden Parameter zu berechnen im Zusammenhang mit mitochondrialen Gesundheit: Basale OCR bemisst sich zunächst vor jeder Injektion von Drogen Sauerstoffverbrauch musste erfüllen ruht auf ATP-Bedarf einzuschätzen. Basalen Atmung wird durch Subtraktion nicht mitochondriale Atemfrequenz gegenüber dem Ausgangswert OCR vor der Injektion Oligomycin berechnet. Als nächstes wird Oligomycin eingespritzt, um den Proton-Kanal von der ATP-Synthase (Komplex V) hemmen. Der anschließende Rückgang der OCR nach Oligomycin Injektion stellt ATP-Produktion im Zusammenhang mit Sauerstoff-Verbrauch. FCCP (Carbonyl Zyanid 4-[Trifluoromethoxy] Phenylhydrazone), ein Ionophore verwendet, um die Proton Steigung und Mitochondrien-Membran Potenzial stören wird verwendet, um maximale Sauerstoff-Verbrauch zu entlocken. Maximale Atmung wird durch Subtraktion nicht mitochondriale Atmung aus der maximalen OCR nach FCCP Injektion berechnet. Freie Atemwege Kapazitäten ist die Differenz zwischen maximaler und basale Atmung. Zu guter Letzt Antimycin (Komplex-III-Hemmer) und Rotenon (komplexe ich Inhibitor) werden zur gleichen Zeit zum Abschalten der Elektronentransport-Kette injiziert. Per definitionem nicht mitochondriale Atmung ist unabhängig von der Elektronentransport-Kette (z. B. nicht mitochondriale NADPH Oxidase in Makrophagen, etc..) und wird als OCR-Werte nach Antimycin A dargestellt / Rotenon Injektion. Kupplung Effizienz beschreibt den Anteil der basalen mitochondriale Sauerstoffverbrauch für die ATP-Synthese verwendet, und errechnet sich als 100 % x (ATP Produktion im Zusammenhang mit OCR) /(basal respiration rate).

Zelldichte für jede Kultivierung Bedingung sollte optimiert werden, bevor Sie einen Mito-Stress-Test durchführen. Nach unserer Erfahrung ist 80-90 % Konfluenz erreicht durch Ausplattieren 1,5 x 105 Zellen/Brunnen des frisch isolierte PBMCs aus menschlichem Blut (Abb. 1A). Diese Beschichtung Dichte entfallen die Waschschritt im Schritt 3.2.3 beschrieben. Neben der Bestimmung der optimalen Beschichtung Dichte, muss FCCP Titration durchgeführt werden, um die Bestimmung der Konzentration erforderlich, um maximale OCR zu generieren. Bei der FCCP Konzentrationen getestet - 0,125 μM, 0,25 μm 0,5 μM, 1 μM und 2 μM - OCR mit FCCP Konzentration erreichen eines Plateaus auf 1 μm erhöht, sondern verringert bei 2 μM (Abbildung 1B). Dies bedeutet, dass 1 μM die optimale FCCP-Konzentration, die für die Prüfung von PBMC mitochondriale Funktion verwendet werden soll.

Wir testeten mitochondriale Funktion von der gleichen Charge von Zellen aus der gleichen Blutprobe eines gesunden Spenders zu verschiedenen Zeitpunkten gesammelt nach PBMC Isolierung. Basalen Sauerstoffverbrauch sowie maximale OCR verringert schon 3 h und weiterhin um 5 und 8 Uhr nach PBMC Isolierung (Abb. 2A) zu verringern. Nach 3 h maximale Atmung ausgelöst durch FCCP Injektion (Zeitpunkte 7-9) nicht mehr als basale OCR, was darauf hindeutet, dass auch in lebenden Zellen Mitochondrien Atemvolumen verringert sich schnell im Laufe der Zeit ersparen. Extrazelluläre Übersäuerung wurde (ECAR) gleichzeitig auf einem extrazellulären Flussmittel Instrument gemessen. Da Oligomycin mitochondrialen ATP-Synthase hemmt, wird Glykolyse innerhalb von Minuten um den Energiebedarf zu decken und zum Ausgleich des Mangels an ATP-Produktion über Oxidative Phosphorylierung eingestellt, wie durch die rasche Zunahme der ECAR nach oligomycin Injektion. Ab 3 Uhr nach PBMC Isolierung, gab es ein Rückgang der ECAR sowie OCR (Abbildung 2B). Obwohl wir keine bemerkenswerte Änderung im Zellviabilität bei 1, 3, 5 und 8 h nach PBMC Isolierung beobachten, verringert mitochondriale Funktion schnell, was darauf hindeutet, dass Timing entscheidend ist für die mitochondriale Profil der live, Erdreiches PBMCs erfassen.

Patientenprobe Sammlungen neigen dazu, zu verschiedenen Zeiten an verschiedenen Tagen auftreten; Daher ist es wichtig, die Daten zu vergleichen, verschiedene Muster und Zeitpunkte zu normalisieren. Während andere Normalisierung Methoden wie Protein assay und Nukleinsäure-Quantifizierung verwendet werden, finden wir, dass Färbung lebenden Zellen mit DNA-bindenden Farbstoff und Quantifizierung des grün fluoreszierenden Zellen in jede Vertiefung die effizientesten und zuverlässigsten Normalisierung Methode. Repräsentative Daten von PBMCs von zwei verschiedenen gesunden Spendern gesammelt, an zwei verschiedenen Tagen sind in Abbildung 3dargestellt. Einpresstiefe ist ein repräsentatives Bild einer Zelle Platte gut zeigen insgesamt Zellen (Phasenkontrast) und lebenden Zellen mit der DNA-Bindung Farbstoff (grün fluoreszierend) nach Mito Stresstest befleckt. Basalen Sauerstoff-Verbrauch, sowie Sauerstoff-Verbrauch nach jeder Injektion von Drogen auf Leben Zellen normalisiert waren ähnlich in zwei verschiedenen gesunden nicht ermüdet Spendern (Abbildung 3).

Repräsentative Funktion der Mitochondrien Daten eines ermüdeten Subjekts (FACIT-F-Wert < 43) mit Prostata-Krebs (rot) und ein Alter/Geschlecht/Rennen-entsprach nicht ermüdet gesunden Spenders (blau) sind in Abbildung 4dargestellt. Obwohl wir keinen Unterschied in der basalen OCR (Abbildung 4B) nicht beobachten, sank müde Gegenstand ausgestellt maximale Sauerstoff-Verbrauch sowie freie Atemwege Kapazität im Vergleich zur Kontrolle (Abbildung 4C, D). Müdigkeit erschien zur Reduzierung in Atemwege Kapazitätsreserven, verbunden zu sein, da gab es keine Unterschiede, die in nicht-mitochondriale Sauerstoffverbrauch (Abbildung 4E), ATP-bezogene Sauerstoffverbrauch (Abbildung 4F), oder Effizienz (Abb. 4G) der Kupplung. Basisdaten (vor jeder Injektion von Drogen) und maximale Atmung nach FCCP Injektion kann mit einer Energie Phänotyp Handlung, die den bevorzugten Weg (OCR Oxidative Phosphorylierung versus ECAR Glykolyse) zeigt in Anwesenheit von visualisiert werden erhöht Energiebedarf (Abbildung 4H). Leere Felder zeigen basale Energie Phänotyp und ausgefüllte Quadrate zeigen die Energie Phänotyp maximale ATP-Nachfrage. Der Abstand zwischen basalen (leeres Kästchen) und maximalen (ausgefülltes Quadrat) gibt Kapazitätsreserven, während die Neigung zellulären Präferenz in Richtung Oxidative Phosphorylierung versus Glykolyse anzeigt. Wie in Abbildung 4H, freie Kapazitäten im verringert Müdigkeit Betreff im Vergleich zum gesunden Steuerelement nicht ermüdet. Darüber hinaus erhöht der Energie-Phänotyp als Reaktion auf ATP Nachfrage schräg in Richtung Glykolyse in ermüdet Gegenstand im Vergleich zu den gesunden Regler (Abbildung 4H).

Figure 1
Abbildung 1 : PBMC Plattieren, Dichte und FCCP Dosis-Wirkungs-Kurve. (A) frisch isoliert wurden PBMCs bei 1,5 x 105 Zellen/Brunnen in CellTak-beschichtete Zelle Kultur miniplatte überzogen. Nach dem Waschen und Medienwechsel, Zellen wurden bei 80-90 % Konfluenz gleichmäßig verteilt. Maßstabsleiste = 100 μm. (B) OCR mit steigenden Konzentrationen von FCCP 0,125 μM, 0,25 μM, 0,5 μM, erreichte Höhepunkt OCR auf 1 μm erhöht. OCR fiel am 2 μM, anzeigend, dass 1 μM ist die optimale Dosis maximal Atmung in PBMCs.Error Bars zu entlocken zeigen die Standardabweichung der 3 sequentielle Messungen nach der ursprünglichen Droge-Injektion. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. 

Figure 2
Abbildung 2 : Mitochondriale Atmung sinkt im Laufe der Zeit in frisch isolierte PBMCs. OCR (A) sowie ECAR (B) verringert sich schnell im Laufe der Zeit nach PBMC Isolierung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. 

Figure 3
Abbildung 3 : Daten der repräsentativen mitochondriale Atmung mit Normalisierung. Mito-Stress-Test erfolgte mit frischen PBMCs isoliert von zwei verschiedenen gesunden Probanden an verschiedenen Tagen und normalisiert, mit einen fluoreszierenden Nukleinsäure-Fleck auf ein Lesegerät, fluoreszierende Platte quantifiziert. Einschub: ein repräsentatives Bild von lebenden Zellen (grün) und total Zellen (Phasenkontrast) in einen Brunnen. Maßstabsleiste = 1.000 μm Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur. 

Figure 4
Abbildung 4 : Repräsentative Analyse eines ermüdeten Subjekts im Vergleich zu einem gesunden Kontrolle. (A) repräsentative Mito Stress Test OCR-Diagramm eines ermüdeten Subjekts im Vergleich zur ein Alter/Geschlecht/Rennen-entsprach nicht ermüdet gesunde Kontrolle. Balkendiagramme der basalen OCR (B), maximale Atmung (C), freie Atemwege Kapazitäten (D), nicht-mitochondriale Sauerstoffverbrauch (E), ATP-Produktion (F)und Kupplung Effizienz (G) dargestellt sind. Die Energie Phänotyp Handlung ermüdet und gesunden Kontrolle ist (H)gezeigt. Leere Felder zeigen Grundlinie Energie Phänotyp, ausgefüllte Quadrate repräsentieren gestresst Energie Phänotyp nach FCCP Injektion gemessen. Fehlerbalken zeigen Standardabweichung von 3 verschiedenen Brunnen für jeden Teilnehmer der Studie. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. 

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Discussion

Fatigue bei Krebspatienten ist ein lähmenden Zustand, ist nicht klar definiert oder1gekennzeichnet. Diagnose von Müdigkeit setzt ganz auf subjektive Berichterstattung und gibt es keine aktuellen diagnostischen Standard oder Behandlung für diese Bedingung, vor allem auf einen Mangel an Verständnis in Pathobiologie2. Beeinträchtigung der Funktion der Mitochondrien ist die vorgeschlagenen Mechanismen, Müdigkeit bei Krebspatienten einer der am meisten therapeutisch Aktionsleisten Wege. Daher entwickelten wir eine schnelle und praktische Methode zur Messung der Funktion der Mitochondrien in klinischen Proben, die verwendet werden können, um proaktiv Patienten Risiko für die Entwicklung von Krebs Behandlung verbundenen Toxizitäten einschließlich Ermüdung, also so früh zu erkennen das Management kann ein.

Die extrazelluläre Flux Technologie in Kombination mit sequentieller Einspritzung der Atemwege Inhibitoren zur Beurteilung der mitochondrialen funktionellen Status und wird für beide in Vitro und in Vivo Modelle19, 20,21. Wir erweitert die bestehende Körper der Arbeit und entwickelte eine Methode zur Untersuchung der mitochondrialen Dysfunktion in klinischen Proben optimiert. Ein Vorteil der Studie ist die Nutzung des kompakten extrazelluläre Flussmittel Analyzer. Wie wir gezeigt haben, ist Timing des Experiments aus menschlichem Blut nach Isolierung des frischen PBMCs entscheidend. Während das größere Format (96-Well oder 24-Well-Format) die ideale Wahl für einen hohen Durchsatz-Experiment ist, ermöglicht das kompakte extrazelluläre Fluss-System, das welches 8 Brunnen enthält, für die individuelle Beurteilung jedes Patientenprobe19. Diese Methode ist praktischer und kostengünstiger (sowohl in Bezug auf das Instrument selbst und die Reagenzien verwendet, um den Test durchzuführen), weil Musterkollektion von verschiedenen Patienten neigen dazu, zu verschiedenen Zeiten an verschiedenen Tagen auftreten.

Die Nutzung der PBMCs mitochondriale Funktion bei ermüdeten Krebspatienten zu beurteilen hat mehrere Vorteile: 1) Biopsie Gewebe wie z. B. Skelettmuskulatur kann unpraktisch sein, zu Zeiten; (2) PBMCs sind leicht zugänglich und lassen sich problemlos mit Zelle Vorbereitung Rohre isoliert bietet einen praktischen Vorteil in einem klinischen Umfeld; und 3) haben wir gezeigt, dass die mitochondriale Funktion verringert sich nach frisch isolierte Zellen mehr als 3 Stunden in Kultur seit sind und Isolieren von bestimmten Zelltypen in der Regel mehrere Stunden (mehr als 3 Stunden dauert). PBMCs können innerhalb einer Stunde zubereitet werden, wodurch die Genauigkeit der Messung in Echtzeit mitochondriale Funktion. Während wir PBMCs für die erste klinische Untersuchung in zuvor fußgelenkes Patientengruppen empfehlen, können andere Zelltypen wie T-Lymphozyten, Thrombozyten, neutrophile und Monozyten auch mit dem aktuellen Protokoll nach der Optimierung verwendet werden der Überzug Dichte und Atemwege Inhibitor Konzentrationen15,25,26.

Vor dem Test Funktion der Mitochondrien in ein neues System, ist es wichtig, zunächst die optimale Zelldichte und FCCP Konzentrationen zu bestimmen. Nach unserer Erfahrung sorgt für Beschichtung 1,5 x 105 Zellen pro Bohrloch, das die Zelldichte nach Beschichtung und waschen Schritt bleibt 80-90 % Zusammenfluss. Darüber hinaus ist es entscheidend für die optimale FCCP Konzentrationen für jeden Zelltyp bestimmen. Eine Reihe von FCCP Konzentrationen getestet werden sollte und die FCCP-Konzentration, die maximale OCR produziert, ohne dabei die Gesundheit einer Zelle verwendet werden sollte. 1 μM FCCP führte in den Konzentrationen getestet maximale Atmung in PBMCs. Ein weiterer wichtiger Schritt ist das Timing des Experiments als mitochondriale Atmung Tropfen steil 3 Stunden nach PBMC Isolierung. Dies bedeutet, dass der Mito-Stress-Test soll, innerhalb von 3 Stunden nach der Entnahme von Proben ausgeführt werden, mitochondriale Funktion in einer klinischen Probe genau zu erfassen. Es ist erwähnenswert, dass viele Forscher nur Zugriff auf gefrorenen Proben haben. Wir haben zuvor PBMCs nach Einfrieren und Auftauen getestet, und die mitochondriale Funktionen dieser Zellen sind stark beeinträchtigt. Deshalb empfehlen wir, dass mit frisch PBMCs in klinischen Studien, isoliert, wenn es machbar ist.

Ein weiterer wichtiger Aspekt reproduzierbare Daten zu generieren ist die Methode der Datennormalisierung. Während einige Labore Erfolg mit BCA Protein Quantifizierung haben, um mitochondriale Atmung Daten zu normieren, finden wir, dass es nicht immer möglich, vor allem bei geringer Zelldichte. Die in diesem Protokoll beschriebene Normalisierung Methode stützt sich auf die lineare Korrelation zwischen Zellzahlen und die Fluoreszenz-Emission der Farbstoff Nuclein-Säure komplexe und kann 10 bis 50.000 Zellen27genau quantifizieren. Darüber hinaus ermöglicht die Normalisierung mit einer Kombination von fluoreszierenden Nukleinsäure-Fleck und eine fluoreszierende Platte Leser für schnelle Quantifizierung von lebenden Zellen nach Beendigung des Experiments. Darüber hinaus erfordert diese Methode keine Trypsinization adhärente Zellen oder mit einem Schaber Zelle.

Eine Einschränkung des Protokolls ist, dass wir nicht PBMCs in bestimmten Zelltypen trennen vor dem mitochondrialen Funktionsanalyse durchführen. Wie wir gezeigt haben, sinkt die mitochondriale Atmung schnell im Laufe der Zeit nach PBMC Isolierung. Dies deutet darauf hin, dass Unterschiede zwischen den Patienten möglicherweise ungenau, wenn das Experiment durchgeführt wurde, nach unterschiedlichen Zellpopulationen zu isolieren, die dauert in der Regel wenige Stunden. Auch wenn gemischte Populationen wie PBMCs nicht wichtig Zelle Typ-spezifischen Informationen preisgibt, kann Informationen aus Experimenten mit PBMCs Leitfaden künftige mechanistische Untersuchungen konzentrierte sich auf bestimmte Zelltypen helfen. PBMCs dienen als Proxy für systemische mitochondriale Dysfunktion, was ist relevant für systemische Erkrankungen wie Krebs Müdigkeit10,28. Im aktuellen Manuskript beschriebene Protokoll stellt nur eine grobe Messung der mitochondrialen Dysfunktion ohne Ermittlung der Ursache der Beobachtung. Daher Ergebnisse mit dieser Technologie und Verfahren sollten mit Vorsicht interpretiert werden und die multifaktorielle Art der Müdigkeit, wie seine gleichzeitige Auftreten mit anderen Verhaltensweisen (z. B. Depression, Schlaf, kognitive Beeinträchtigung) zu berücksichtigen und Bedingungen (z. B. Herz-Lungen-Status, polypharmazie). Zukünftige Studien sollten untersuchen, Veränderungen der mitochondrialen Funktionen in bestimmten Zelltypen (z. B. natürliche Killerzellen, T-Lymphozyten und Monozyten) und in verschiedenen klinischen Populationen (z. B. müde/nicht-ermüdet Krebspatienten und gesunden Kontrollpersonen). Es würde den Rahmen sprengen die aktuellen Manuskript ist, bestimmen wir die Zusammenhänge zwischen Krebs Müdigkeit Schweregrad sowie mitochondriale Dysfunktion und die Korrelation zwischen mitochondriale Funktion Messungen und physikalische Tests von Müdigkeit wie einen 6-minütigen Spaziergang Test, in Zukunft Untersuchungen. Darüber hinaus werden zukünftige Studien mitochondriale Dysfunktion bei anderen Krebsarten auch prüfen, um festzustellen, ob Müdigkeit über verschiedene Krebsarten mit mitochondrialen Dysfunktion einhergeht. Zusammenfassend haben wir ein Protokoll optimiert für eine schnelle Beurteilung der allgemeinen mitochondriale Funktionsstörungen mit klinischen Proben entwickelt. Weiter können mechanistische Untersuchungen durchgeführt werden, um die Einbeziehung von spezifischen wegen in dieser schwächenden Krankheit zu ermitteln.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Diese Studie wird durch die Division der intramuralen Forschung von der National Institute of Nursing Research des NIH, Bethesda, Maryland vollständig unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CPT Mononuclear Cells Preparation Tube  BD Biosciences 362761 For isolating PBMCs following phlebotomy
RPMI-1640  Corning 10-040 For making growth media for PBMCs
Fetal bovine serum (FBS) Corning 35-010-CV For making growth media for PBMCs
Penicillin/Streptomycin ThermoFisher 15140122 For making growth media for PBMCs
Cell-Tak Corning 354240 Cell and Tissue adhesive solution; allows suspension cells to adhere to the surface
Seahorse XF Calibrant Solution Agilent 103059-000 For hydrating cartridges
XFp Fluxpak (miniplates and sensor cartridges) Agilent 103022-100 Contains XFp cell culture miniplates and sensor cartridges
XF base media Agilent 103335-100 For making XF assay media
45% cell culture D-(+)-Glucose solution Corning 25-037-CI For making XF assay media
Sodium pyruvate solution Corning  25-000-CI For making XF assay media
L-glutamine solution ThermoFisher 25030081 For making XF assay media
Seahorse XFp Mito Stress Test Kit Agilent 103010-100 Contains oligomycin, FCCP, antimycin A/rotenone
CyQUANT Direct Cell Proliferation Assay ThermoFisher C35011 For quantification of live cells and data normalization
Seahorse XFp Analyzer Agilent S7802AEA For measuring mitochondrial function in live cells
Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (or any instrument that can quantify fluorescent cells in a plate) BioTek BTCYT5PV For quantification of live cells and data normalization

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References

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Comments

1 Comment

  1. Dear authors,

    I read this with a lot of interest as I work on PBMC mitochondrial function in neurodegeneration. I use the XFp and get good results but have had trouble with normalisation. I don't feel protein quantification is accurate. As such I've been trying to find a way to quantify DNA. I attempted the standard cyquant kit but on washing the media away I am sure cells are being detached from the cell tak. The direct kit seems to overcome this but I wanted to clarify a couple of things. In the text you say to add an equal volume of cyquant reagent mix (180ul) but you would have 247ul of media at the end of the run after addition of oligomycin, FCCP and rot/aa. Can you clarify how much reagent you added? Also, I would think that if 247ul was added to would overflow the XFp plate wells. You also state that cyquant is linear from 10-50,000 cells but you load 1.5x10^5 per well so do you find the relationship is still linear at such high cell numbers as I have had some problems non-linearity at high cell numbers with picogreen staining?

    Many thanks,

    Philip Campbell
    (MRC Fellow, UCL Queen Square Institute of neurology, London, UK)

    Reply
    Posted by: Philip C.
    October 11, 2018 - 3:20 PM

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