Évaluation du rôle de la fonction mitochondriale en Fatigue liée au Cancer

Cancer Research

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Summary

Notre objectif était d’élaborer un protocole pratique pour évaluer le dysfonctionnement mitochondrial associé de fatigue chez les patients atteints de cancer. Ce protocole novateur est optimisé pour l’usage clinique impliquant seulement standard phlébotomie et procédures de laboratoire de base.

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Feng, L. R., Nguyen, Q., Ross, A., Saligan, L. N. Evaluating the Role of Mitochondrial Function in Cancer-related Fatigue. J. Vis. Exp. (135), e57736, doi:10.3791/57736 (2018).

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Abstract

La fatigue est un commun et invalidante maladie qui affecte la plupart des patients de cancer. A ce jour, reste de fatigue mal caractérisé avec aucun diagnostic test pour mesurer objectivement la gravité de cette affection. Nous décrivons ici une méthode optimisée pour évaluer la fonction mitochondriale de PBMC provenant de patients atteints de cancer fatigué. Avec un système compact de flux extracellulaire et l’injection séquentielle des inhibiteurs respiratoires, nous avons examiné état fonctionnel mitochondrial PBMC par mesurer la respiration mitochondriale basale, rechange capacité respiratoire et le phénotype de l’énergie, qui décrit la voie de l’énergie préférée à réagir au stress. PBMC fraîches est facilement disponibles en milieu clinique à l’aide de phlébotomie standard. Le test complet décrit dans le présent protocole peut être complété en moins de 4 heures sans l’implication des techniques biochimiques complexes. En outre, les auteurs décrivent une méthode de normalisation qui est nécessaire pour l’obtention de données reproductibles. Les procédure ainsi que la normalisation des méthodes simples présentées permettent de prélèvement d’échantillons répétés du même patient et générer des données reproductibles qui peuvent être comparées entre points dans le temps d’évaluer les effets potentiels du traitement.

Introduction

La fatigue est une condition pénible et répandue qui a un impact négatif sur la qualité de vie des patients de cancer1. À ce jour, fatigue cancer reste mal défini et s’appuie uniquement sur les rapports subjectifs patients2. Par conséquent, il y a un besoin urgent d’identifier un test de laboratoire de diagnostic facilement adaptable pour caractériser objectivement la fatigue dans le contexte clinique3,4.

Plusieurs mécanismes sous-jacents, y compris le dysfonctionnement des mitochondries, ont été proposées pour causer fatigue5. Les mitochondries sont les organites de la centrale, qui fournit 95 % des besoins en énergie cellulaire par l’intermédiaire de la phosphorylation oxydative et jouent un rôle important dans la signalisation calcique, apoptose, signalisation immunitaire et régulation de la signalisation intracellulaire événements6 . En conséquence, bioénergétique mitochondriale avec facultés affaiblies et les défauts de production d’énergie peuvent contribuer à la fatigue. Faveur de cette hypothèse, des études antérieures ont observé des mutations de l’ADN mitochondrial chez les patients atteints de syndrome de fatigue chronique7. Alors qu’on ne sait toujours pas si l’origine physiopathologique de la fatigue se situe dans le système nerveux central ou des tissus périphériques, tels que les muscles squelettiques8,9, il n’y a actuellement aucune méthode directe d’évaluer avec précision dysfonctionnement mitochondrial lié à la fatigue dans les cellules vivantes, respiration.

À l’aide de cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) pour étudier la fonction mitochondriale offre plusieurs avantages. Tout d’abord, PBMC est facilement disponibles en milieu clinique à l’aide de phlébotomie standard et peut être isolée rapidement en utilisant des techniques de laboratoire de base. Deuxièmement, prélèvement de sang est moins invasif que la collecte d’autres tissus comme une biopsie musculaire. Ainsi, les échantillons de sang peuvent être recueillies chez le même patient à plusieurs reprises au fil du temps, ce qui facilite une évaluation longitudinale des effets du traitement. Fait intéressant, la fonction mitochondriale chez PBMC semblait être bien corrélée à statut mitochondrial rein dans un modèle animal de10. En outre, les mitochondries des cellules immunitaires ont servi en tant que proxy pour détecter des changements systémiques sous différentes maladies conditions11,12. Les mitochondries dans les cellules immunitaires circulantes sont particulièrement sensibles aux changements dans les fonctions immunitaires et immunitaire, signalisation des molécules telles que les cytokines13,14,15. Par exemple, on a observé que les PBMC de patients atteints de maladies inflammatoires rhumatismales aiguës pièce base élevées d’oxygène consommation14. En revanche, la consommation d’oxygène est réduite chez PBMC isolées de patients avec des conditions inflammatoires systémiques, y compris septicémie16. Dans des conditions inflammatoires, radicaux libres produits par les mitochondries dysfonctionnelles peuvent contribuer davantage à élevé de stress oxydatif et l’inflammation prolongée de17. Le rôle central des mitochondries dans la production d’énergie ainsi que dans le stress oxydatif suggère l’utilité potentielle de l’utilisation de la fonction mitochondriale comme un proxy pour l’étude de fatigue chez les patients de cancer 13.

Des études antérieures examinant la fonction mitochondriale utilisé des techniques biochimiques, mesure de potentiel de membrane mitochondrial ou l’isolement des populations de cellules spécifiques qui peuvent ne pas être facilement adaptable dans le contexte clinique5, 14,,18. Ces dernières années, le développement des analyses de flux extracellulaire a permis aux chercheurs de facilement et avec précision examiner les changements dans les taux de consommation d’oxygène (OCR) en réponse à des injections automatisées d’inhibiteurs respiratoire19,20 , 21 , 22. Toutefois, la plupart de ces études est conçue pour des types spécifiques de cellules et le grand format haut débit n’est peut-être pas applicable en milieu clinique. Dans ce manuscrit, les auteurs décrivent un protocole optimisé pour l’examen de la fonction mitochondriale pour l’usage clinique.

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Protocol

La présente étude (NCT00852111) a été approuvée par l’Institutional Review Board (IRB) de la National Institutes of Health (NIH), Bethesda, Maryland. Les participants inscrits dans cette étude étaient des hommes d’euthymique, 18 ans ou plus, qui ont été diagnostiqués avec cancer de la prostate non métastatique avec ou sans prostatectomie préalable et ont été à la demande de recevoir la radiothérapie externe (radiothérapie externe). Les participants potentiels ont été exclus s’ils avaient une maladie progressive qui pourrait causer la fatigue importante, avaient une maladie psychiatrique dans les cinq dernières années, avaient hypothyroïdie non corrigée ou une anémie, ou avait un deuxième cancer. Les personnes qui ont utilisé des sédatifs, des stéroïdes ou des agents anti-inflammatoires non stéroïdiens ont également été exclus. Les échantillons de sang de contrôle sain ont été prélevés à la médecine de NIH Department of Transfusion donneurs sains en vertu d’un protocole approuvé par la CISR (NCT00001846). Tous les participants sont recrutés au centre de recherche clinique Magnuson aux NIH. Signé consentements écrits de connaissance ont été obtenues avant la participation à l’étude.

1. préparation de mesure de fonction mitochondriale (1er jour de l’expérience)

  1. Hydrater la cartouche de sonde (voir Table des matières; durée approximative : 5 min).
    1. Sortir cartouche de sonde de l’emballage. Ajouter 200 μl de solution de Calibrant dans chaque puits de la plaque de l’utilitaire, puis remplir chaque fossé avec solution de Calibrant 400 μL.
    2. Plaque de contact retour sur la plaque de l’utilitaire, qui a maintenant la solution degré dedans. Hydrater la cartouche dans un incubateur à 37 ° C non-CO2 pendant la nuit.
      NOTE : Cartouche de sonde doit être hydratée pendant un minimum de 4 h et un maximum de 72 h.

2. préparation de l’échantillon clinique (le 2e jour de l’expérience)

  1. Mesurer la fatigue à l’aide de la 13-point fonctionnels évaluation de maladie thérapie chronique - Fatigue (FACIT-F)2,23,24 au départ (avant le début de la radiothérapie externe), milieu et fin de la radiothérapie externe et 1 an post-radiothérapie externe.
    1. Utilisation d’un 0 - 4 échelle pour chaque réponse point, où 0 représente « pas du tout » et un 4 indique que l’intimé a trait à l’instruction correspondante « beaucoup. » Scores totaux devraient aller de 16-53, avec des scores plus faibles, reflétant l’intensité de la fatigue élevée.
    2. Qualifier un score de FACIT-F inférieur à 43, avec un score de FACIT-F de ≥43 indiquant l’absence d’ou fatigue pas cliniquement significative2de fatigue.
      Remarque : Un score FACIT-F 43 meilleures divise les scores de fatigue des patients atteints de cancer et de la population générale2.
    3. Inclure les éléments suivants de 13 dans l’échelle de Fatigue FACIT : 1) je me sens fatigué ; 2) je me sens faible partout ; 3) je me sens apathique (« délavées ») ; 4) je me sens fatigué ; 5) j’ai du mal à partir de choses parce que je suis fatigué ; 6) j’ai mal à finir les choses parce que je suis fatigué ; 7) j’ai d’énergie ; 8) je suis capable de faire mes activités habituelles ; 9) j’ai besoin de dormir pendant la journée ; 10) je suis trop fatigué pour manger ; 11) j’ai besoin d’aide faire mes activités habituelles ; 12) je suis frustré par être trop fatigué pour faire les choses que je veux faire ; et 13) je dois limiter mes activités sociales parce que je suis fatigué.
  2. Isoler les PBMC provenant d’échantillons de sang fraîchement prélevés (durée approximative : 1 h).
    1. Recueillir 8 mL de sang dans un Tube de préparation de cellules mononucléées (voir Table des matières).
      Remarque : Les échantillons de sang doivent être traités dans les 2 h suivant le prélèvement. La qualité des PBMC peut être compromise si les échantillons de sang sont traitées plus de 2 h après le prélèvement de l’échantillon.
    2. Centrifuger à 1 750 g pendant 30 min à température ambiante (18-25 ° C). Transférer la couche nuageuse dans un tube conique de 15 mL. Ajouter jusqu'à 15 mL de PBS et renverser 5 fois.
    3. Centrifuger à 300 x g pendant 15 minutes à 4 ° C. Retirez délicatement et éliminer le liquide surnageant sans culot inquiétante. Resuspendre le culot en ajoutant jusqu'à 10 mL de PBS et inverser 5 fois.
    4. Centrifuger à 300 x g pendant 10 min à 4 ° C. Jeter le liquide surnageant et remettre en suspension les cellules dans 1 mL de PBS. Transférer les PBMC dans un tube de microtubes de 1,5 mL.
    5. Centrifuger à 610 x g pendant 10 minutes. Soigneusement, éliminer le surnageant et Resuspendre le culot dans complet RPMI-1640 (RPMI-1640 additionné de 10 % FBS, 10 mM la pénicilline/streptomycine).
  3. Enduire plaques de la cellule pour les cellules non adhérentes (durée approximative : 30 min).
    1. Préparer la solution adhésive cellulaire et tissulaire (voir Table des matières) en diluant la solution 0,1 M de bicarbonate de sodium pH 8.0. La solution de travail doit être à 3,5 μg/cm2 de surface.
      NOTE : Cette solution contient polyphénoliques protéines extraites de la moule Mytilus edulis. Ces protéines sont des éléments clés de la colle sécrété par la moule à ancrer aux surfaces. Nous trouvons que la cellule-Tak fonctionne le mieux avec PBMC.
    2. Ajouter 100 μL de la solution de colle diluée dans chaque puits et incuber pendant au moins 20 min à température ambiante. Laver trois fois avec l’eau distillée et de l’air sec.

3. mesure de la fonction mitochondriale

  1. Préparation de milieux d’essai (durée approximative : 10 min).
    NOTE : Les médias de test doivent être fraîchement préparées le jour de l’expérience.
    1. Ajouter L-glutamine, pyruvate et le glucose à la base des médias (les mêmes composants comme le moyen de l’aigle de la modification de Dulbecco (DMEM), mais sans bicarbonate de sodium, glucose, glutamine ou pyruvate de sodium) pour faire des médias de dosage. Réchauffer les médias à 37 ° C, puis ajuster le pH à 7,4.
      Remarque : Les Concentrations de glucose, L-glutamine et pyruvate sont généralement les mêmes que les concentrations dans les milieux de croissance normale, mais peuvent être réglées selon le test.
  2. Préparer le test de Stress de Mito PBMC (durée approximative : 2 h).
    1. Dans chaque puits pour atteindre 80-90 % confluence des tôles assez PBMC de l’étape 2. Dans notre expérience, 1. 5 x 105 cellules/puits ont donné les résultats les plus cohérents.
      Remarque : Les puits A et H sont puits de fond et ne doivent contenir que médias de dosage avec aucune cellule. Dans le puits B à G, nous vous recommandons de placage au moins 3-6 puits par échantillon du patient afin de tenir compte des valeurs aberrantes.
    2. Tournez en plaques bas à 200 x g pendant 2 min permettre aux cellules d’adhérer au fond des puits. Laver les cellules une fois avec les médias de dosage. Cette étape supprime sérum et bicarbonate de sodium de milieux de croissance.
      Remarque : D’après notre expérience, l’étape de lavage supprime généralement 20 à 30 % des cellules.
    3. Ajouter des éléments multimédias de dosage 180 μl dans chaque puits, y compris l’arrière-plan puits A et H. Incuber dans un incubateur à 37 ° C non-CO2 pendant 45-60 min.
  3. Exécutez le Test de Stress de Mito
    1. Reconstituer les drogues dans le Kit de Stress Mito avec les médias de dosage comme suit :
      1. L’oligomycine : Ajouter des éléments multimédias de dosage μL 252 dans la fiole pour générer une solution stock à 50 μM.
      2. FCCP : Ajouter 288 μL de médias d’essai dans la fiole pour générer une solution stock à 50 μM.
      3. Antimycine A / roténone : 216 ajouter μL de médias d’essai dans la fiole pour générer une solution mère à 25 μM.
    2. Médicaments de Vortex reconstituée pendant environ 1 minute. Diluer dans des solutions de travail.
      Remarque : Les Concentrations des solutions de travail devraient être titrées et déterminées à l’avance avant l’expérience selon le type de cellule. Pour PBMC, nous trouvons que 1 μM de l’oligomycine, 1 μM FCCP et 0,5 μM l’antimycine A / roténone fonctionnent le mieux.
    3. Pipetter les médicaments dans chaque port de la cartouche de la sonde dans l’ordre :
      1. A: port Pipette 20 μL de 10 μM l’oligomycine, pour une concentration finale dans chaque puits de 1 μM.
      2. Port b : Pipette 22 μL de 10 μM FCCP, pour une concentration finale dans chaque puits de 1 μM.
      3. C: port Pipette 25 μL de 5 μM l’antimycine A / roténone pour une concentration finale dans chaque puits de 0.5 μM.
  4. Sélectionnez « Mito Stress Test » sur un instrument de flux extracellulaire. Suivre la ligne de l’instrument et insérer la cartouche de capteur. L’appareil effectue automatiquement le calibrage de la sonde. Insérer la plaque cellulaire après que calibrage de la sonde et l’instrument finira le reste de l’essai. Dynamique de l’oxygène est mesurée à 530 nm (excitation) / 650nm (émission), et concentration de protons est évaluée à 470 nm (excitation) / 530 nm (émission).

4. normalisation de la fonction mitochondriale données

  1. Préparer la solution d’analyse de prolifération de cellules (durée approximative : 5 min).
    1. Ajouter 48 tache d’acide nucléique μL (x 500) et suppresseur de fond 240 μL à 11,7 mL PBS (x 2). La tache de l’acide nucléique est un colorant de liaison à l’ADN cellulaire perméable, et l’éliminateur de fond est un colorant de masquage qui bloque les cellules mortes ou des cellules avec intégrité compromise membrane cellulaire d’être taché. La combinaison de la teinture de liaison à l’ADN et l’éliminateur de fond assure que des cellules vivantes seulement sont colorées.
    2. Ajouter un volume égal de 2 x solution de travail (180 μL) directement dans le milieu de chaque puits après que le Test de Stress de Mito a terminé.
  2. Incuber les cellules en présence de la solution de dosage prolifération cellulaire dans un incubateur à 37 ° C pendant 45-60 min. quantifier le nombre de cellules vivantes (fluorescent) sur un lecteur de plaque à 508 nm (excitation) / 527 nm (émission) et normaliser les données OCR (durée approximative : 10 min) .
    Remarque : outre les numéros cellules vivantes, utilisateurs peuvent également choisir normaliser leurs données avec le nombre total de cellules, de la quantité d’acides nucléiques, les concentrations de protéine, etc..

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Representative Results

Mito Stress Test repose sur la mesure des taux de consommation d’oxygène (OCR) après injection séquentielle de divers inhibiteurs respiratoires pour mapper un profil mitochondrial complet. Mesures de l’OCR après chaque injection de drogue peut être utilisée pour calculer les paramètres suivants liés à la santé mitochondriale : OCR basale est d’abord mesuré avant toute injection de drogues afin d’évaluer la consommation d’oxygène nécessaire pour satisfaire la demande d’ATP niveau de repos. La respiration de base est calculée en soustrayant le taux de respiration non-mitochondriale de base OCR avant l’injection de l’oligomycine. Ensuite, l’oligomycine est injecté pour inhiber le canal de proton de l’ATP synthase (complexe V). La baisse subséquente de OCR après l’injection de l’oligomycine représente la consommation oxygène liés à la production d’ATP. FCCP (cyanure de carbonyle 4-[trifluorométhoxy] phénylhydrazone), un ionophore utilisé pour perturber le gradient de protons et le potentiel de membrane mitochondrial, est ensuite utilisé pour obtenir la consommation maximale d’oxygène. La respiration maximale est calculée en soustrayant la respiration non-mitochondriale de l’OCR maximale après injection FCCP. Rechange capacité respiratoire est la différence entre la respiration maximale et basale. Enfin, l’antimycine (complexe III inhibiteur) et la roténone (complexe j’ai inhibiteur) sont injectés en même temps pour couper la chaîne de transport d’électrons. Par définition, la respiration mitochondriale-non est indépendant de la chaîne de transport d’électrons (par exemple, non-NADPH oxydase mitochondriale dans les macrophages, etc..) et est représentée en tant que valeurs de OCR après l’antimycine A / injection de roténone. Efficacité de couplage décrit la fraction de la consommation d’oxygène mitochondriale basale utilisée pour la synthèse d’ATP et équivaut à 100 % x (OCR de liés à la production d’ATP) /(basal respiration rate).

La densité des cellules pour chaque condition de culture doit être optimisée avant d’effectuer un test de stress de mito. Dans notre expérience, confluence de 80 à 90 % est atteint par l’ensemencement de 1. 5 x 105 cellules/puits de PBMC fraîchement isolées du sang humain (Figure 1A). Cette densité d’électrodéposition représente l’étape de lavage indiqué au point 3.2.3. En plus de déterminer la densité optimale de placage, titrage FCCP doit être effectuée pour déterminer la concentration nécessaire pour générer les OCR maximale. Au FCCP concentrations testées - μM 0,125, 0,25 μM, 0,5 μM, 1 μM et 2 μM - OCR augmente avec la concentration FCCP pour atteindre un plateau à 1 μM, mais a diminué à 2 μM (Figure 1B). Cela indique que 1 μM est la concentration optimale de FCCP qui doit être utilisée pour l’examen de la fonction mitochondriale de PBMC.

Nous avons testé la fonction mitochondriale du même lot de cellules à partir du même échantillon de sang prélevé sur un donneur sain à divers moments après l’isolement des PBMC. La consommation d’oxygène basale ainsi que OCR maximale diminue dès 3 h et a continué à diminuer à 5 et 8 h après l’isolement des PBMC (Figure 2A). Après 3 h, la respiration maximale obtenue par injection FCCP (7-9 points dans le temps) ne dépassait pas OCR basale, ce qui laisse supposer que même dans des cellules vivantes, les mitochondries épargneraient la capacité respiratoire diminue rapidement avec le temps. Taux d’acidification extracellulaire (ECAR) a été mesurée en même temps un instrument de flux extracellulaire. Étant donné que l’oligomycine inhibe mitochondriale ATP synthase, la glycolyse est recrutée quelques minutes pour répondre à la demande d’énergie et pour compenser le manque de production d’ATP par phosphorylation oxydative, comme en témoigne l’augmentation rapide des ECAR après l’oligomycine injection. Aussi tôt que 3 h après l’isolement des PBMC, il y avait une diminution ECAR ainsi que OCR (Figure 2B). Bien que nous n’avons pas observé aucun changement notable dans la viabilité des cellules à 1, 3, 5 et 8 h après l’isolement des PBMC, la fonction mitochondriale diminue rapidement, ce qui suggère que le timing est clé pour capturer le profil mitochondrial de PBMC live, respiration.

Collections de l’échantillon de patients ont tendance à se produire à plusieurs reprises sur des jours distincts ; ainsi, il est crucial de normaliser les données pour comparer différents échantillons et points dans le temps. Alors que les autres méthodes de normalisation comme la protéine à doser et quantification d’acides nucléiques peut-être être utilisée, nous constatons que la coloration des cellules vivantes avec une teinture de liaison à l’ADN et la quantification des cellules fluorescentes vertes dans chaque puits est la normalisation plus efficace et fiable méthode. Des données représentatives des PBMC prélevé deux différents donneurs sains sur deux jours distincts sont indiquées à la Figure 3. Encadré est une image représentative d’une plaque de cellules montrant bien les cellules totales (contraste de phase) et des cellules vivantes colorée avec le colorant de liaison à l’ADN (vert fluo) après test d’effort de mito. Taux de consommation d’oxygène basale, ainsi que la consommation d’oxygène après que chaque injection de drogues normalisé à vivre les cellules était semblables dans deux différents non-vous êtes fatigué des donneurs sains (Figure 3).

Données de la fonction mitochondriale représentatif d’un sujet fatigué (score FACIT-F < 43) avec cancer de la prostate (rouge) et un âge/sexe/course correspondant non fatigué donneur sain (bleu) sont illustrés à la Figure 4. Bien que nous n’avons pas observé de différence dans l’OCR basale (Figure 4B), le sujet fatigué exposé a diminué la consommation maximale d’oxygène, mais aussi des capacités respiratoires par rapport au contrôle (Figure 4C, D). Fatigue semble être liée à la réduction de rechange capacité respiratoire, car il n’y a aucune différence dans la consommation d’oxygène non-mitochondriale (Figure 4E), consommation d’oxygène liée à l’ATP (Figure 4F), ou couplage d’efficacité (Figure 4G). Données de base (avant toute injection de drogue) et la respiration maximale après que injection FCCP peut être visualisée à l’aide d’une intrigue de phénotype de l’énergie, qui révèle la voie préférée (OCR de la phosphorylation oxydative versus la glycolyse ECAR) en présence d’augmenté demande d’énergie (Figure 4H). Cases vides indiquent phénotype énergétique basale et solides carrés indiquent le phénotype de l’énergie en réponse à la demande maximale d’ATP. La distance entre basale (case vide) et maximale (solid carré) indique capacités inutilisées, tandis que la pente indique une préférence cellulaire vers la phosphorylation oxydative versus la glycolyse. Comme illustré à la Figure 4H, des capacités de production inutilisées dans le sujet de la fatigue a diminué par rapport au contrôle sain non fatigué. En outre, le phénotype de l’énergie en réponse à augmentation de la demande d’ATP biaisée vers la glycolyse dans le sujet fatigué par rapport au contrôle sain (Figure 4H).

Figure 1
Figure 1 : PBMC placage de densité et la courbe dose-réponse FCCP. (A) fraîchement isolées PBMC ont été cultivées à 1,5 x 105 cellules/puits dans MINIPLAQUES de culture cellulaire enduit de CellTak. Après le lavage et changent de médias, les cellules sont uniformément distribués à la confluence de 80 à 90 %. Echelle = 100 μm. (B) OCR augmente avec l’augmentation des concentrations de FCCP μM 0,125, 0,25 μM, 0,5 μM, atteignant pic OCR à 1 μM. OCR a chuté à 2 μM, ce qui indique que 1 μM est la dose optimale pour susciter la respiration maximale dans les bars de PBMCs.Error indiquent l’écart-type de 3 mesures séquentielles après l’injection de drogues initial. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. 

Figure 2
Figure 2 : La respiration mitochondriale diminue au fil du temps dans les PBMC fraîchement isolées. OCR (A) ainsi que de l’ECAR (B) a diminué rapidement au fil du temps après l’isolement des PBMC. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. 

Figure 3
Figure 3 : Données représentatives de la respiration mitochondriale avec normalisation. Mito stress test a été effectué à l’aide de PBMC frais isolées de deux différents volontaires sains à des jours différents et normalisé à l’aide d’une tache fluorescente acide nucléique quantifiée sur un lecteur de plaque fluorescente. En médaillon : une image représentative de cellules vivantes (vert) et le total des cellules (contraste de phase) dans un puits. Echelle = 1 000 μm s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. 

Figure 4
Figure 4 : Une analyse représentative d’un sujet fatigué par rapport à un contrôle en bonne santé. (A) représentant Mito Stress test OCR graphique d’un sujet fatigué par rapport à un/sexe/race non-fatigué sains témoins du même âge. Graphiques à barres de basale OCR (B), (C), la respiration maximale de rechange capacité respiratoire (D), consommation d’oxygène non-mitochondriale (E), la production d’ATP (F)et l’efficacité de couplage (G) sont présentées. L’intrigue de phénotype d’énergie du sujet fatigué et contrôle sain est montré (H). Cases vides indiquent le phénotype de l’énergie de base, solides carrés représentent phénotype stressé énergie mesuré après l’injection FCCP. Barres d’erreur indiquent l’écart-type de 3 puits différents pour chaque participant à l’étude. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. 

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Discussion

Fatigue chez les patients atteints de cancer est une maladie débilitante qui n’est pas bien défini ou caractérisé1. Diagnostic de fatigue repose entièrement sur la déclaration subjective et il n’y a aucune norme actuelle de diagnostic ou traitement pour cette condition, en grande partie dû au manque de compréhension de sa pathologie2. Des mécanismes proposés qui sous-tendent la fatigue chez les patients cancéreux, altération de la fonction mitochondriale est l’une des voies plus thérapeutiquement targetable. Par conséquent, nous avons développé une méthode rapide et pratique pour mesurer la fonction mitochondriale dans les échantillons cliniques qui peut être utilisé pour identifier de façon proactive les patients à risque pour développer des toxicités liées au traitement de cancer y compris la fatigue, alors qu’au début gestion peut être mis en place.

La technologie de flux extracellulaire en combinaison avec injection séquentielle des inhibiteurs respiratoires permettant l’évaluation de l’état fonctionnel mitochondriale et a été utilisé pour les deux in vitro et in vivo modèles19, 20,,21. Nous avons élargi l’ensemble de règles de travail et mis au point une méthode optimisée pour l’examen des dysfonctionnement mitochondrial dans des échantillons cliniques. Des avantages de l’étude est l’utilisation de l’analyseur de flux extracellulaire compact. Comme nous l’avons démontré, calendrier de l’expérience est crucial après isolement de frais PBMC du sang humain. Alors que le plus grand format (format 96 puits ou 24 puits) est le choix idéal pour une expérience haut débit, le système de flux extracellulaire compact, qui contient 8 puits, permet une évaluation individuelle de chaque échantillon19. Cette méthode est plus pratique et plus économique (en ce qui concerne l’instrument lui-même et pour les réactifs utilisés pour effectuer le test), parce que le prélèvement d’échantillons de différents patients ont tendance à se produire à plusieurs reprises à des dates différentes.

L’utilisation de PBMC pour évaluer la fonction mitochondriale chez les cancéreux fatigue présente plusieurs avantages : 1) biopsie des tissus comme les muscles squelettiques peut être impraticable par moments ; 2) PBMC est facilement disponibles et peut facilement être isolés à l’aide de tubes de préparation cellulaire, qui offre un avantage pratique en milieu clinique ; et 3), nous avons démontré que la fonction mitochondriale diminue après les cellules fraîchement isolées ont été en culture pendant plus de 3 heures et types spécifiques de cellules d’isolement en général prend plusieurs heures (plus de 3 heures). PBMC peut être préparé dans une heure, assurant ainsi l’exactitude de la mesure en temps réel fonction mitochondriale. Alors que nous vous recommandons d’utiliser des PBMC pour l’examen clinique initial dans les populations de patients non définies auparavant, autres types de cellules comme les lymphocytes T, les plaquettes, les neutrophiles et les monocytes également utilisable avec le protocole actuel après optimisation de placage de densité et inhibiteur respiratoire des concentrations15,25,26.

Avant de tester la fonction mitochondriale dans un nouveau système, il faut d’abord déterminer la densité cellulaire optimale et des concentrations FCCP. Dans notre expérience, 1. 5 x 105 cellules / puits de placage veille à ce que la densité cellulaire après le placage et le confluent laver étape reste 80 à 90 %. En outre, il est crucial de déterminer les concentrations FCCP optimales pour chaque type de cellule. Une concentration de la gamme de FCCP doit être testés et la concentration de FCCP qui produit d’OCR maximale sans compromettre la santé d’une cellule doit être utilisée. Aux concentrations testées, 1 μM de FCCP a entraîné la respiration maximale dans les PBMC. Une autre étape critique est le moment de l’expérience, sous forme de gouttes de la respiration mitochondriale abruptement 3 heures après l’isolement des PBMC. Cela signifie que le test de stress de mito doit être exécuté dans les 3 heures après le prélèvement d’échantillons à saisir avec précision la fonction mitochondriale dans un échantillon clinique. Il est intéressant de souligner que de nombreux chercheurs ont seulement accès à des échantillons congelés. Nous avons testé précédemment PBMC après congélation-décongélation, et les fonctions mitochondriales de ces cellules sont fortement compromises. Par conséquent, nous recommandons utilisant fraîchement isolées PBMC dans les études cliniques, lorsque c’est faisable.

Un autre aspect important de produire des données reproductibles est la méthode de normalisation des données. Alors que certains laboratoires ont réussi à l’aide de quantification des protéines BCA pour normaliser les données de la respiration mitochondriale, nous trouvons qu’il n’est pas toujours possible, surtout à une faible densité. La méthode de normalisation décrite dans le présent Protocole s’appuie sur la corrélation linéaire entre le nombre de cellules et l’émission de fluorescence des complexes acides nucléique colorant et permet de quantifier avec précision les cellules de 10 à 50 00027. En outre, normalisation en utilisant une combinaison de tache d’acide nucléique fluorescent et un lecteur de plaque fluorescente permet la quantification rapide de cellules vivantes après la fin de l’expérience. En outre, cette méthode ne requiert pas la trypsinisation de cellules adhérentes ou à l’aide d’un grattoir de cellules.

Une mise en garde du protocole est que nous ne séparent pas PBMC en types cellulaires spécifiques avant d’effectuer une analyse fonctionnelle mitochondriale. Comme nous l’avons démontré, la respiration mitochondriale diminue rapidement avec le temps après l’isolement des PBMC. Ceci suggère que les différences entre les patients peuvent être inexacts si l’expérience a été réalisée après l’isolement des différentes populations cellulaires, qui prend habituellement quelques heures. Même si l’étude de populations mixtes comme les PBMC ne révèle pas d’informations spécifiques à un type cellulaire important, renseignements obtenus des expériences utilisant des PBMC peut aider de nouvelles études mécanistes guide axés sur les types spécifiques de cellules. PBMC service comme indicateur de dysfonctionnement mitochondrial systémique, qui est pertinente aux troubles systémiques telles que le cancer fatigue10,28. Le protocole décrit dans le manuscrit actuel fournit seulement une mesure brute du dysfonctionnement mitochondrial sans identifiant la cause de l’observation. Par conséquent, les résultats à l’aide de cette technologie et la procédure doivent être interprétés avec prudence et doit tenir compte de la nature multifactorielle de la fatigue, comme sa présence simultanée avec d’autres comportements (p. ex., dépression, sommeil, troubles cognitifs) et conditions (p. ex., cardiopulmonaires statut, polypharmacie). Les études futures devraient examiner les altérations des fonctions mitochondriales dans les types spécifiques de cellules (par exemple, les cellules NK, lymphocytes T et les monocytes) et dans diverses populations cliniques (p. ex., fatigué/non-fatigué cancéreux et témoins sains). Bien qu’il soit abordée dans le manuscrit actuel, nous déterminerons les associations entre la sévérité de fatigue cancer et dysfonctionnement mitochondrial, ainsi que la corrélation entre les mesures de la fonction mitochondriale et tests physiques de fatigue tels que un test de marche de 6 minutes, à l’avenir des enquêtes. En outre, les études futures examinera également dysfonctionnement mitochondrial dans d’autres types de cancer afin de déterminer si la fatigue à travers différents types de cancer est associé à un dysfonctionnement mitochondrial. En conclusion, nous avons développé un protocole optimisé pour une évaluation rapide du générales dysfonctions mitochondriales en utilisant des échantillons cliniques. Plus mécanistes enquêtes peuvent être effectuées afin de cerner l’implication des voies spécifiques à cette maladie débilitante.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Cette étude est entièrement pris en charge par la Division de la recherche intra-muros de la National Institute of Nursing Research des NIH, Bethesda, Maryland.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CPT Mononuclear Cells Preparation Tube  BD Biosciences 362761 For isolating PBMCs following phlebotomy
RPMI-1640  Corning 10-040 For making growth media for PBMCs
Fetal bovine serum (FBS) Corning 35-010-CV For making growth media for PBMCs
Penicillin/Streptomycin ThermoFisher 15140122 For making growth media for PBMCs
Cell-Tak Corning 354240 Cell and Tissue adhesive solution; allows suspension cells to adhere to the surface
Seahorse XF Calibrant Solution Agilent 103059-000 For hydrating cartridges
XFp Fluxpak (miniplates and sensor cartridges) Agilent 103022-100 Contains XFp cell culture miniplates and sensor cartridges
XF base media Agilent 103335-100 For making XF assay media
45% cell culture D-(+)-Glucose solution Corning 25-037-CI For making XF assay media
Sodium pyruvate solution Corning  25-000-CI For making XF assay media
L-glutamine solution ThermoFisher 25030081 For making XF assay media
Seahorse XFp Mito Stress Test Kit Agilent 103010-100 Contains oligomycin, FCCP, antimycin A/rotenone
CyQUANT Direct Cell Proliferation Assay ThermoFisher C35011 For quantification of live cells and data normalization
Seahorse XFp Analyzer Agilent S7802AEA For measuring mitochondrial function in live cells
Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (or any instrument that can quantify fluorescent cells in a plate) BioTek BTCYT5PV For quantification of live cells and data normalization

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Comments

1 Comment

  1. Dear authors,

    I read this with a lot of interest as I work on PBMC mitochondrial function in neurodegeneration. I use the XFp and get good results but have had trouble with normalisation. I don't feel protein quantification is accurate. As such I've been trying to find a way to quantify DNA. I attempted the standard cyquant kit but on washing the media away I am sure cells are being detached from the cell tak. The direct kit seems to overcome this but I wanted to clarify a couple of things. In the text you say to add an equal volume of cyquant reagent mix (180ul) but you would have 247ul of media at the end of the run after addition of oligomycin, FCCP and rot/aa. Can you clarify how much reagent you added? Also, I would think that if 247ul was added to would overflow the XFp plate wells. You also state that cyquant is linear from 10-50,000 cells but you load 1.5x10^5 per well so do you find the relationship is still linear at such high cell numbers as I have had some problems non-linearity at high cell numbers with picogreen staining?

    Many thanks,

    Philip Campbell
    (MRC Fellow, UCL Queen Square Institute of neurology, London, UK)

    Reply
    Posted by: Philip C.
    October 11, 2018 - 3:20 PM

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