Haute résolution comparaison des fréquences de la conjugaison bactérienne

Genetics

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Summary

Dans le but de comprendre les comportements des divers éléments d’ADN conjugaison bactériennes dans des conditions différentes, les auteurs décrivent un protocole pour détecter les différences de fréquence de conjugaison, avec une haute résolution, pour estimer l’efficacité avec laquelle la bactérie donneur initie la conjugaison.

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Shintani, M., Ohkuma, M., Kimbara, K. High-Resolution Comparison of Bacterial Conjugation Frequencies. J. Vis. Exp. (143), e57812, doi:10.3791/57812 (2019).

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Abstract

La conjugaison bactérienne est une étape importante dans le transfert horizontal de gènes de résistance aux antibiotiques par un élément d’ADN conjugatif. Comparaisons approfondies de la fréquence de conjugaison dans des conditions différentes sont nécessaires pour comprendre comment l’élément conjugaison se répand dans la nature. Cependant, les méthodes conventionnelles pour comparer la fréquence de la conjugaison ne conviennent pas pour les comparaisons de profondeur à cause de l’arrière-plan élevé causé par la survenance d’événements de conjugaison supplémentaires sur la gélose sélective. Nous avons réussi à réduire le fond en introduisant une méthode le plus probable (NPP) nombre et une plus forte concentration d’antibiotiques pour prévenir toute nouvelle conjugaison en milieu liquide sélectif. En outre, nous avons développé un protocole pour estimer la probabilité de la façon dont souvent donneur cellules conjugaison initier en triant les cellules du donneur unique dans des pools de bénéficiaires par cellule activée par fluorescence triant (FACS). À l’aide de deux plasmides, pBP136 et pCAR1, les différences de fréquence de conjugaison dans les cellules de Pseudomonas putida pourraient être détectés dans un milieu liquide à différentes vitesses d’agitation. Les fréquences de l’initiation de conjugaison étaient plus élevés pour les pBP136 que pour pCAR1. En utilisant ces résultats, nous pouvons mieux comprendre les fonctionnalités de la conjugaison de ces deux plasmides.

Introduction

La conjugaison bactérienne des éléments génétiques mobiles, les plasmides conjugatifs et éléments intégratives et conjugatifs (Ice) est importante pour la propagation horizontale de l’information génétique. Il peut favoriser l’adaptation et l’évolution bactérienne rapide et transmettre des gènes de résistance multidrogue1,2. La fréquence de conjugaison peut être affectée par les protéines codées sur les éléments de conjugaison pour la mobilisation de l’ADN (MOB) et de la formation de la paire correspondante (MPF), y compris les pili sexuels, qui est classés selon le type de la MOB et MPF3,4, 5. Il peut également être affectée par le donneur et le receveur paire6 ainsi que les conditions de croissance des cellules7,8,9,10,11,(12 taux de croissance, densité cellulaire, surface solide ou liquide, température, la disponibilité des nutriments et la présence de cations). Pour comprendre comment les éléments de conjugaison se propager chez les bactéries, il est nécessaire de comparer la fréquence de la conjugaison en détail.

La fréquence de la conjugaison entre donateurs et bénéficiaires paires après l’accouplement sont généralement estimés par des méthodes conventionnelles comme suit. (i) tout d’abord, le nombre de colonies donneur et receveur est compté ; (ii) ensuite, les colonies destinataires, qui reçoit les éléments de conjugaison (= transconjugants) sont comptés ; (iii) et enfin, la fréquence de conjugaison est calculée en divisant la colonie formant des unités (UFC) de le transconjugants par ceux du donateur ou bénéficiaire13. Toutefois, lorsque vous utilisez cette méthode, le fond est élevé en raison des événements de conjugaison supplémentaire qui peuvent également se produire sur les géloses sélectives permet d’obtenir des transconjugants lorsque la densité cellulaire est élevé10. Par conséquent, il est difficile de détecter de petites différences dans la fréquence (sous une différence de 10 fois). Nous avons récemment introduit une méthode (MPN) numéro plus probable, à l’aide d’un milieu liquide contenant une concentration plus élevée d’antibiotiques. Cette méthode réduit le fond en inhibant plus conjugaison dans un milieu sélectif ; ainsi, la fréquence de conjugaison peut être estimée avec une résolution supérieure.

Conjugaison se divisent en trois étapes : (1) fixation du donateur-bénéficiaire paire (2) l’initiation du transfert conjugatif et (3) la dissociation de la paire14. Au cours des étapes (1) et (3), il y a une interaction physique entre le donneur et les cellules réceptrices ; ainsi, la densité cellulaire et les conditions environnementales peuvent influencer ces étapes, même si les caractéristiques des pili sexuels sont également importants. Étape (2) est probablement régulée par l’expression de plusieurs gènes impliqués dans la conjugaison en réponse aux changements externes qui pourraient être touchées par les diverses fonctionnalités du plasmide, le donneur et le receveur. Bien que l’attachement physique ou détachement des paires de donateur-bénéficiaire peut être simulé mathématiquement en utilisant une estimation de cellules sous forme de particules, la fréquence de l’étape (2) doit être mesurée expérimentalement. Il y a eu quelques rapports sur des observations directes de la façon dont souvent les donateurs peuvent initier conjugaison [étape (2)] à l’aide de la microscopie de fluorescence15,16; Cependant, ces méthodes ne sont pas haut débit, car un grand nombre de cellules doit être surveillé. Par conséquent, nous avons développé une nouvelle méthode pour estimer la probabilité d’apparition de l’étape (2) à l’aide de la cellule à fluorescence activé triant (FACS). Notre méthode peut être appliquée à n’importe quel plasmide, sans identification des gènes essentiels pour la conjugaison.

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Protocol

1. préparation d’un donneur avec une protéine fluorescente verte (GFP)- et la kanamycine résistance Gene-tag plasmides

  1. Introduction de gènes marqueurs dans le pBP136 de plasmide de cible
    Remarque : Le but du présent protocole est de générer pBP136 ::gfp. Les souches bactériennes et les plasmides utilisés dans cette étude sont énumérés au tableau 1.
    1. Cultiver des cultures de Escherichia coli DH10B hébergeant pBP13617 dans 5 mL de bouillon stérile de Luria (LB) et e. coli S17-1λpir18 nourrissait pJBA2819 [contenant un kanamycine (Km)-résistance génétique et gfp mut3 * gène avec son promoteur et terminateur dans un mini-AMT5] dans 5 mL de LB stérile contenant 50 μg/mL Km à 37 ° C pendant la nuit (O/N, 16 à 24 h) avec agitation à 200 tours / minute (tr/min).
    2. Récolte et lavage
      1. Récolte de 1 mL de chaque culture, placez-le dans un microtube 2 mL et centrifuger (10 000 × g, température ambiante, 2 min). Puis, éliminer le surnageant et resuspendre le culot dans 2 mL de solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS).
      2. Centrifuger à nouveau (10 000 × g, température ambiante, 2 min) et remettre en 500 μl de PBS stérile.
    3. Filtre d’accouplement
      1. Préparer stériles plaques LB (avec l’agar de 1,6 %) et placer un filtre à membrane stérile 0,22 μm pore taille là-dessus. Mix 500 μL d’e. coli S17-1λpir pJBA28 hébergeant avec e. coli DH10B abritent de pBP136 et place le mélange sur le filtre sur le plat de livre. Incuber la plaque O/N à 30 ° C. Retirer le filtre de la plaque de la LB, placez-le dans un tube en plastique stérile de 50 mL et ajouter 1 mL de PBS stérile.
        Remarque : pJBA28 peut répliquer en présence de la protéine Π, codée par le gène de pir 18et peut être transférée de S17-1λpir à DH10B. pBP136 porte pas de gène marqueur17 et peut être transféré de DH10B à S17-1λpir. Donc, nous ne pourrions pas distinguer S17-1λpir abritent de pBP136 et pJBA28 de DH10B renfermant pBP136 et le mini-AMT5 (transposée dans le chromosome ou pBP136) à ce stade. Ensuite, nous avons utilisé des mélanges d’eux comme donneurs dans les étapes suivantes (1.1.4.–1.1.5.).
    4. Développer une culture de l’O/N du mélange ci-dessus accouplement lb stérile contenant 50 μg/mL Km à 37 ° C sous agitation à 200 tr/min et une culture de Pseudomonas putida KT2440 [Km (Kms) sensibles, sensibles à la rifampicine (Rifs), sensibles à la gentamicine (Gms) et résistant à la tétracycline (Tcr)] dans un milieu contenant 12,5 μg/mL Tc à 30 ° C sous agitation à 200 tr/min.
    5. Après récolte et laver les cellules comme au point 1.1.2, utilisez-les (l’accouplement mélange et KT2440) pour le filtre de l’accouplement (O/N, 30 ° C) comme au point 1.1.3.
    6. Préparer les assiettes LB stériles contenant 50 μg/mL Km et 12,5 μg/mL Tc (LB + Km + Tc plaques).
    7. Diluer le mélange remises en suspension sur la membrane filtrante avec du PBS stérile (101-105-replier) et puis chaque dilution sur LB + Km + Tc plaques et incuber les boîtes à 30 ° C pendant 2 – 3 jours.
    8. Prélever des colonies des plaques, se développer une culture de O/N en LB stérile contenant Km et Tc ainsi que P. resinovorans CA10dm4RG (Rifr et Gmr)6 lb stérile contenant du Rif (25 μg/mL) et Gm (30 μg/mL) à 30 ° C et 200 tr/min.
      Remarque : Comme décrit dans la note précédente, les colonies sur la LB, Km + Tc plaques (à partir de 1.1.7.) peut être KT2440 renfermant pBP136 porteur d’un mini-AMT5 et KT2440 avec un mini-AMT5, parce que les pJBA28 pourraient être directement transférées de S17-1λpir hébergement pBP136 et pJBA28 à KT2440. C’est pourquoi un autre accouplement avec P. resinovorans CA10RG est requise pour obtenir la pBP136 de la cible avec un mini-AMT5 dans les étapes suivantes.
    9. Après récolte et laver les cellules comme au point 1.1.2, utilisez-les pour filtre accouplement (O/N, 30 ° C) comme au point 1.1.3.
    10. Préparer les assiettes LB stériles contenant du Rif, Gm et Km (LB + Rif + Km Gm assiettes).
    11. Resuspendre le mélange sur le filtre et puis le diluer 101-105-fold, étaler sur LB + Rif + Km Gm plaques et incuber les boîtes pendant 2 – 3 jours à 30 ° C.
    12. Prélever les colonies et vérifier si ils hébergent pBP136 par PCR avec des amorces spécifiques pour le plasmide.
  2. Introduction d’un gène marqueur sélective dans la cible plasmide pCAR1
    Remarque : Ce protocole vise à générer pCAR1 ::gfp
    1. Développer une culture de O/N de P. putida KT2440 héberger pCAR1 (Kms, Gms, Rifs, Tcr)20 à 200 tr/mn et 30 ° C et e. coli S17-1λpir18 nourrissait pJBA28 dans 5 mL stérile lb contenant 50 μg/mL Km à 200 tr/min et 37 ° C.
    2. Après récolte et laver les cellules comme au point 1.1.2, utilisez-les pour filtre accouplement (O/N, 30 ° C) comme au point 1.1.3.
    3. Retirer le filtre de la plaque de la LB, placez-le dans un tube en plastique stérile de 50 mL et ajouter 1 mL de PBS stérile.
    4. Diluer le mélange remises en suspension avec du PBS stérile (101-105-replier) et étaler le mélange dilué sur LB sélective stérile + Tc + Km plaques.
      Remarque : pCAR1 ne se répliquent pas dans e. coli; ainsi, P. putida KT2440 renfermant pCAR1 avec un mini-AMT5 peuvent être sélectionnés sur LB + Tc + Km plaques.
    5. Prélever une colonie sur la plaque et se développer une culture de O/N en LB stérile contenant Km et Tc et une culture de la P. resinovorans CA10dm4RG dans LB stérile contenant du Rif et Gm (200 tr/min, 30 ° C).
    6. Après la récolte et le lavage comme à l’étape 1.1.2, utilisent les cellules pour le filtre de l’accouplement (O/N, 30 ° C) comme au point 1.1.3.
    7. Resuspendre le mélange sur le filtre puis le diluer, étalé sur LB + Rif + Km Gm plaques et incuber les boîtes pendant 2 – 3 jours à 30 ° C.
    8. Prélever les colonies et vérifier si ils hébergent pCAR1 par PCR avec des amorces spécifiques pour le plasmide.
  3. Confirmer la transférabilité des plasmides-tag et préparer les bailleurs de fonds pour les prochaines étapes
    Remarque : Le but du présent protocole est de confirmer le transfert des plasmides construits ci-dessus et préparer les bailleurs de fonds pour les prochaines étapes.
    1. Développer une culture de O/N de P. resinovorans CA10dm4RG qui pBP136 ::gfp ou pCAR1 ::gfp dans LB stérile contenant Km et une culture de P. putida SMDBS [Kms, Gms, Rifr, Tcr, lacI q, dans laquelle PA1/O4/O3-gfpmut3* ne s’exprime pas en raison de son gène deq chromosomiques lacI]21 dans 3 mL de LB contenant Tc (200 tr/min, 30 ° C).
    2. Après récolte et laver les cellules comme au point 1.1.2, utilisez-les pour filtre accouplement (O/N, 30 ° C) comme au point 1.1.3.
    3. Placer le filtre dans un tube en plastique stérile de 50 mL et remettre en suspension avec 1 mL de PBS stérile. Diluer le mélange remises en suspension avec du PBS stérile (101-105-replier), étaler le mélange dilué sur LB sélective stérile + Tc + Km plaques.
    4. Prélever les colonies et vérifier si ils hébergent chacun des plasmides par PCR avec des amorces spécifiques.
      Remarque : Confirmation de la position d’insertion de la mini-AMT5 par séquençage direct après extraction de plasmide est facultative confirmer que l’insertion n’affecte pas la fonction de transfert des plasmides.

2. calcul de la fréquence de la conjugaison par la méthode NPP

  1. Préparer les stériles LB + Km et LB Gm assiettes.
  2. Cultiver une culture de l’O/N de P. putida SMDBS héberger pBP136 ::gfp ou pCAR1 ::gfp dans 3 mL de LB stérile contenant Km et une culture de P. putida KT2440RGD (Gmr, Rifr) dans 3 mL de LB contenant Gm (140 tr/mn, 30 ° C).
  3. Après récolte et laver les cellules comme au point 1.1.2, utilisez-les pour le filtre de l’accouplement à 30 ° C pendant 45 min comme au point 1.1.3.
  4. En série dilué le donneur et le receveur qui précède la culture (1 – 10 107) et étaler sur LB + Km (donneur) ou LB + Gm (destinataire) plaques (chacune en trois exemplaires) pour compter les colonies formant des unités (UFC). Incuber les plaques à 30 ° C pendant 2 jours.
  5. Resuspendre le mélange sur le filtre dans LB stérile contenant Km et Gm et diluer en série (de 21 224– 107.2) à l’aide d’une plaque de culture de cellules de 96 puits (en quatre exemplaires).
  6. Incuber les plaques 96 puits suffisamment de temps (2 jours à 30 ° C).
  7. Compter l’UFC le donneur et le receveur sur les plaques (étape 2.4.) et compter le nombre de puits dans lequel grandissent les transconjugants.
  8. Calculer le NPP et son écart-type en utilisant le programme de calcul de MPN développé par Jarvis et al. 22, qui est disponible à http://www.wiwiss.fu-berlin.de/fachbereich/vwl/iso/ehemalige/professoren/wilrich/MPN_ver5.xls.
    1. Entrez le nom de l’expérience (p. ex., « test »), la date de l’expérience (p. ex. 2018/4/9), le numéro de série de tests et le max. lol des dilutions (Entrez "24") dans la feuille de la ligne #7 du « Programme » de l’Excel fichier (« MPN_ver5.xls »).
    2. Entrez ' 2-1 (= 0,5) pour 2-24 (= 5.96 × 10-8) » dans la colonne « facteur de dilution d», « 0,01' dans la colonne « volume en ml ou g w» et 4' en ' no des tubes n' dans les tables automatiquement produits des « données d’entrée ».
    3. Entrez le nombre de puits dans lequel des transconjugants croître à chaque dilution de l’échantillon (0 – 4).
    4. Pousser le bouton « Calculer les résultats » bon et puis obtenir les résultats (en MPN/μL) et leurs limites de confiance à 95 % (inférieurs et supérieurs).
  9. Calculer la fréquence des plasmides de conjugaison en divisant le nombre des transconjugants (NPP/mL) par le nombre de donateurs et de cellules réceptrices (UFC/mL).

3. préparation pour l’Estimation de la probabilité de conjugaison initiée par donneur

  1. Cultiver une culture de l’O/N de P. putida SMDBS héberger pBP136 ::gfp ou pCAR1 ::gfp dans 3 mL de LB stérile contenant Km et une culture de P. putida KT2440RGD (Gmr, Rifr) dans 3 mL de LB stérile contenant de Gm à l’aide de 300 mL flacons (140 tr/mn, 30 ° C) comme précultures.
  2. Transférer 200 μl de la préculture dans 200 mL de frais LB stérile contenant Km ou Gm dans des flacons de 500 mL et incuber à 30 ° C sous agitation à 140 tr/mn.
  3. Mesurer la turbidité à 600 nm (OD600) de la culture à l’aide d’un spectrophotomètre UV-VIS et place la culture, dilué dans LB (101– 108-plier les dilutions), sur un plat de livre contenant Km ou grammes incuber ces LB les plaques à 30 ° C pendant 1 à 2 jours et déterminer l’UFC.
  4. Tracer les valeurs de600 OD et de l’UFC avec temps de croissance pour générer des courbes de croissance du donateur et du bénéficiaire.
  5. Cultiver des cultures de la souche du donneur et du receveur à la phase logarithmique, basée sur la courbe de croissance.
  6. Après récolte et laver les cellules, préparer 101– 103 UFC du donneur en 10 μL de LB et 105– 107 UFC du destinataire dans 100 μL de LB.
  7. Mix 10 μL de la donneuse et 100 μL des cultures bénéficiaires à différentes densités dans des plaques de 96 puits (en triple exemplaire). Par exemple, mélanger 101 UFC de la donneuse et 105 UFC du destinataire et l’ajouter à chacun des 96 puits et mélanger 101 UFC du donneur et 106 UFC du bénéficiaire dans une autre plaque à 96 puits, et ainsi de suite.
  8. Incuber le mélange à 30 ° C pendant 45 min et puis ajoutez des concentrations élevées d’antibiotiques (100 μg/mL Km et 60 μg/mL Gm) dans chaque puits d’inhiber davantage la conjugaison.
  9. Incuber les plaques à 30 ° C pendant 2 jours.
  10. Compter le nombre de puits dans lequel poussent des transconjugants.
  11. Choisir la densité de destinataire qui est appropriée pour l’estimation de la probabilité de conjugaison initiée par donateurs basée sur les données ci-dessus (transconjugants devrait être trouvées au moins 1 bien d’une plaque de 96 puits).
    Remarque : Transconjugants croîtront dans tous les puits, lorsque la densité des cellules donneur et receveur est élevée et plus d’une conjugaison se produit dans un puits. En revanche, aucun des transconjugants ne trouvera dans n’importe quel puits lorsque la densité cellulaire est trop faible. Dans la section suivante, une cellule de donneur unique est triée dans un puits. Par conséquent, la densité de destinataire doit être au maximum.

4. estimation de la probabilité de conjugaison initiée par donneur

  1. Préparer 200 mL d’une culture en phase logarithmique du donneur SMDBS P. putida nourrissait pBP136 ::gfp ou pCAR1 ::gfp et celle du destinataire P. putida KT2440RGD, tel que décrit dans 3,6 à 3,7.
  2. Placer 106 UFC du destinataire dans 100 μl de LB à chaque puits d’une plaque de 96 puits.
  3. Mettre en place le système FACS (trieuse écoulement cytometry et cellule avec un bras robotisé, un laser à argon 488 nm et un orifice de buse 70 μm). La valeur forward scatter (FSC), avec un seuil de 1 % comme le déclencheur de l’acquisition. Régler le gain H et un gain de FCS et diffusion latérale (SSC) à une sensibilité maximale, ce qui permet d’éliminer les signaux positifs fausses, à l’aide de PBS comme témoin négatif. Mis à la porte de tri basée sur FSC et SSC et goutte 0,5 mode de tri pour la pureté de la sorte maximale.
  4. Trier une cellule seul donneur de FACS sur un plat de livre (384 points différents), incuber la plaque à 30 ° C pendant 2 jours, puis de compter combien de colonies apparaître sur la plaque des cellules triées.
    Remarque : Cette procédure est pour la validation de la grille de jeu. Si il y a 384 colonies sur la plaque, cela signifie que 100 % des cellules triées pourraient constituer des colonies. La validité moyenne de tri est toujours de 90 à 95 %.
  5. Trier une cellule seul donneur de FACS dans chaque puits d’une plaque 96 puits avec le destinataire (4.2).
  6. Incuber les plaques pendant 45 min à 30 ° C et ensuite ajouter des concentrations élevées d’antibiotiques (100 μg/mL Km et 60 μg/mL Gm) dans chaque puits pour prévenir d’autres conjugaison.
  7. Incuber les plaques à 30 ° C pendant 2 jours.
  8. Compter le nombre de puits dans lequel des transconjugants a grandi comme déterminée par inspection visuelle à l’oeil nu.
  9. Calculer la probabilité de conjugaison initiée par donneur en divisant le nombre de puits avec des transconjugants par le nombre total de puits dans lequel le donneur a été réglé.

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Representative Results

Comparaison de la fréquence de la conjugaison par la méthode NPP

Dans notre précédent rapport, nous avons comparé la fréquence de la conjugaison des pBP136 ::gfp et pCAR1 ::gfp dans triple milieu liquide dilué LB (1/3 LB) avec des taux différents en remuant après un accouplement de 45 min à l’aide de 125 mL spinner flacons10. Nous avons comparé la fréquence de la conjugaison des pBP136 ::gfp et pCAR1 ::gfp avec 106 UFC/mL de souches donneur et receveur dans différentes conditions d’agitation (0-600 tr/min). La fréquence de la conjugaison de ces deux plasmides augmenté à des taux plus élevés en remuant et la différence maximale de la fréquence de conjugaison a < 10 fois pour pBP136 ::gfp (de 0 à 400 tr/min), tandis que celle des pCAR1 ::gfp a été ~ 25 fois (entre 0 et 200 tr/min ; Fig. 1).

Estimation de la probabilité de conjugaison initiée par donneur

La probabilité estimée précédemment de conjugaison initiée par donneur est indiquée dans le tableau 2. Pour déterminer la densité des cellules réceptrices pour comparer la probabilité de conjugaison, accouplement des essais ont été réalisés avec différentes densités du donneur et du receveur. Comme le montre le tableau 2, pBP136 :: transconjugantsgfp ont été détectés à 100 % (96/96) des puits contenant 103 UFC de donateurs et de5-10 107 UFC de destinataire et ceux avec 102 UFC de donateur et 106-107 CFU de destinataire, ce qui indique que la densité cellulaire était trop élevée. Accouplement des tests avec 101 UFC de donateur et 106 ou 105 UFC de destinataire a entraîné une diminution du nombre de puits transconjuguant-positive (66 % et 2,1 %, respectivement, tableau 2). Ainsi, > 105 UFC de destinataire était prévue pour être requis pour s’accoupler avec une cellule de donneur unique. De même, nous avons effectué les essais d’accouplements avec pCAR1 ::gfp à différentes densités de souches donneur et receveur. Les pourcentages de puits transconjuguant positif étaient bien inférieurs à ceux de pBP136 ::gfp (tableau 2). En supposant que les cellules du donneur et du receveur peuvent fixer les uns aux autres de la même façon, la probabilité d’ouverture de conjugaison pour le donneur de pCAR1 a été inférieure à celui du donneur de pBP136. Selon ces résultats, nous avons déterminé que 107 UFC de destinataire était nécessaire pour une cellule de donneur unique triée par FACS.

Ensuite, le nombre de puits transconjuguant séropositifs ont été dénombré. Le pourcentage de puits transconjuguant positif pour pBP136 ::gfp était plus grande (1,9 %) que celui des pCAR1 ::gfp (< 0,052 % ; Le tableau 2). Ainsi, il n’y avait plus qu’une 36-fold différence de la probabilité de donateurs initiée par conjugaison entre ces deux plasmides.

Figure 1
Figure 1. Comparaison de la fréquence de la conjugaison des pBP136 ::gfp et pCAR1 ::gfp avec 106 colonies formant unités (UFC) mL-1 du donneur (Pseudomonas putida SMDBS) et le destinataire (P. putida KT2440RGD) à différents en remuant les tarifs (0-600 tr/min). Les barres d’erreur ont été calculés selon les limites de confiance de 95 % par la méthode du NPP et l’écart-type de l’UFC du donneur et du receveur. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Souches bactériennes Phénotype génotype et pertinent Référence ou source
Escherichia coli DH10B F, mcrA, Δ (mrr-hsdRMS-mcrBC), Φ80d ΔM15lacZ, Δ,lacX74, deoR, recA1, araD139, Δ (ara leu) 7697, galU, galK , NupG , endA1, rpsL, λ Thermo
E. coli S17-1(λpir) TMrSmr, recA, thi, pro, hsdRM+, RP4 : 2-Tc : Mu : AMT Km7 λpir 18
Pseudomoans putida KT2440 Kms, Rifs, Gms, Tcr 25
Pseudomoans putida KT2440(pCAR1) KT2440 renfermant pCAR1 20
Pseudomoans putida KT2440RGD Kms, Rifr, Gmr, Tcr, miniTn7(Gm) PO3/O4/A1DsRedExpress-a est Parrallèlement au chromosome 10
Pseudomoans putida SMDBS Une souche dérivée de P. putida KT2440, dapB-supprimé, Kms, Gms, Rifr, Tcr, lacIq est inséré dans le chromosome 21
Resinovorans P. CA10RG Kms, Rifr, Gmr, Tcs 6
Plasmides
pBP136 IncP-1,Pde MOB, MPFT plasmide 17
pBP136 ::gfp pBP136 transportant Kmr et P03/04/A1-gfp cassette en parA (26 137 nt) 21
pCAR1 IncP-7, MOBH, MPFF, plasmide dégradation carbazole 26, 27
pCAR1 ::gfp pCAR1 transportant Kmr et P03/04/A1- cassettegfp dans ORF171 (182 625 nt) 21
pJBA28 Par, Kmr, plasmide de livraison pour le mini-AMT5Km-P03/04/A1- RBSII-gfpmut3*-T0T -1 18

Le tableau 1. Les plasmides et les souches bactériennes.

Plasmide un Bailleurs de fonds un Destinataire Le nombre de puits avec des transconjugants par 96 puits Pourcentage
[UFC ou cellule] [UFC] [%]
pBP136 ::gfp 103 107 96/96 100
106 96/96 100
105 96/96 100
102 107 96/96 100
106 96/96 100
105 54/96 56
101 107 71/96 74
106 63/96 66
105 2/96 2.1
1 107 23/1212 1,9
pCAR1 ::gfp 103 107 6/96 6.3
106 6/96 6.3
105 0/96 0
102 107 1/96 1
106 1/96 1
105 0/96 0
101 107 0/96 0
106 0/96 0
105 0/96 0
1 107 1/1920 0,052 <

Le tableau 2. Le nombre de puits, avec des densités différentes cellules, contenant des transconjugants pour comparer la probabilité de donateurs initiée par conjugaison entre pBP136 ::gfp et pCAR1 ::gfp.

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Discussion

Nous présentons ici un protocole haute résolution pour détecter les différences de fréquence de conjugaison dans des conditions différentes, en utilisant une méthode NPP pour estimer le nombre des transconjugants. Une étape importante dans le protocole est diluer le mélange du donneur et du receveur après l’accouplement jusqu'à ce qu’aucune des transconjugants ne grandir. Une autre étape est l’ajout des concentrations élevées d’antibiotiques dans le milieu liquid sélectif pour empêcher d’autres conjugaison. Ces procédures peuvent réduire le fond causé par autre conjugaison dans le milieu sélectif. Nous pouvons détecter avec succès de différences, même après une courte durée d’accouplement entre le donneur et le receveur. La conjugaison fréquence calculée par le présent protocole pourrait être modifiée par petites différences dans les conditions de croissance des souches donneur et receveur. Ainsi, ces conditions doivent être soigneusement conçues.

En outre, nous présentons un protocole pour l’estimation de la deuxième étape de la conjugaison à l’aide de FACS pour le donneur unique cellule tri. L’étape la plus importante dans le présent protocole est de déterminer la densité appropriée des cellules réceptrices pour une cellule de donneur unique triée. Lorsque le nombre de cellules réceptrices qui entoure une cellule seul donneur est assez grande un contact physique entre le donneur et le receveur est certain. Ensuite, la fréquence de conjugaison peut être influencée, non par la probabilité de combien de fois les cellules du donneur et du receveur contacter mutuellement, mais par la probabilité de conjugaison initiée par donneur. Une cellule de donneur unique de FACS de tri n’est pas difficile ; Toutefois, les 96 puits ne sont pas toujours suffisantes pour estimer la probabilité. Par conséquent, les plaques de 10 à 100 doivent être préparés. Une des limites du protocole est qu’il n’est pas approprié pour mesurer la probabilité de donateurs initiée par la conjugaison d’un plasmide avec transmissibilité de basse fréquence.

Basé sur ces méthodes et leurs résultats, nous avons récemment rapporté que deux plasmides a montré des fréquences différentes de conjugaison dans les milieux liquides en changeant les taux en remuant, qui peuvent influer sur les premières et troisième étapes de conjugaison, attachement et détachement de paires de donateur-bénéficiaire. En outre, nous avons également constaté des différences dans la probabilité de la deuxième étape10. Ces résultats démontrent l’évolution de la fréquence de conjugaison dans des conditions différentes. Ces protocoles sont utiles pour comparer les caractéristiques de la conjugaison des plasmides dans diverses conditions, y compris des conditions aérobies ou anaérobies, différentes paires de donateur-bénéficiaire, température différente ou pH et en présence ou en absence du particulier produits chimiques, tels que les cations, éléments nutritifs et des antibiotiques.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgements

Nous remercions le Dr K. Kamachi de l’Institut National des maladies infectieuses (Japon) prévoyant la fourniture de pCAR1 de pBP136 et Prof. Dr. H. Nojiri, de l’Université de Tokyo (Japon). Nous sommes également reconnaissants à Professor Dr. Molin Sølen de l’Université technique du Danemark pour fournir pJBA28. Ce travail a été soutenu par JSPS KAKENHI (Grant Numbers 15H 05618 et 15KK0278) à MS (https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15H05618/, https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15KK0278/).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MoFlo XDP Beckman-Coulter ML99030 FACS
IsoFlow Beckman-Coulter 8599600 Sheath solution
Fluorospheres (10 μm) Beckman-Coulter 6605359 beads to set up the FACS
Incubator Yamato Scientific Co. Ltd 211197-IC802
UV-VIS Spectrophotometer UV-1800 SIMADZU Corporation UV-1800
96-well plates NIPPON Genetics Co, Ltd TR5003
microplate type Petri dish AXEL 1-9668-01 for validation of sorting
membrane filter ADVANTEC C045A025A for filter mating
pippettes Nichiryo CO. Ltd 00-NPX2-20,
00-NPX2-200,
00-NPX2-1000
0.5-10 μL, 20-200 μL, 100-1000 μL
multi-channel pippetes Nichiryo CO. Ltd 00-NPM-8VP,
00-NPM-8LP
0.5-10 μL, 20-200 μL
Tryptone BD Difco 211705
Yeast extract BD Difco 212750
NaCl Sigma S-5886
Agar Nakarai tesque 01162-15
rifampicin Wako 185-01003
gentamicin Wako 077-02974
kanamycin Wako 115-00342
Petri dish AXEL 3-1491-51 JPND90-15
microtubes Fukaekasei 131-815C
500 mL disposable spinner flask Corning CLS3578

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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