المنظفات مطابقة التباين في تجارب نثر النيوترون زاوية صغيرة لغشاء بروتين التحليل الهيكلي والنمذجة Ab منذ البداية

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

هذا البروتوكول يوضح كيفية الحصول على نموذج منخفضة الدقة منذ البداية وتفاصيل الهيكلية بروتين غشاء solubilized المنظفات في الحل باستخدام تشتت الزاوية الصغير النيوترون مع مطابقة على النقيض من مواد التنظيف.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Oliver, R. C., Naing, S. H., Weiss, K. L., Pingali, S. V., Lieberman, R. L., Urban, V. S. Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling. J. Vis. Exp. (140), e57901, doi:10.3791/57901 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

الصك ونثر البيولوجية زاوية صغيرة النيوترون في عالية-الجريان "النظائر المفاعل من مختبر أوك ريدج الوطني" مخصصة للتحقيق في المواد البيولوجية، وتجهيز الوقود الحيوي والمواد المستوحاة من السيرة الذاتية تغطي نانومتر إلى جداول طول ميكرومتر. الأساليب المقدمة هنا للتحقيق في الخواص الفيزيائية (أي، حجم وشكل) البروتينات الغشاء (هنا، مياب، حوزتي أسبارتيل إينتراميمبراني من ماريسنيجري ميثانوكوليوس) في إيجاد حلول لتشكيل مذيل المنظفات مناسبة تماما لهذا الصك تشتت النيوترونات زاوية صغيرة، بين أمور أخرى. تقنيات تحديد الخصائص الفيزيائية الأخرى تعيق قدرتهم على معالجة الاشتراكات المنظفات في هيكل معقد البروتين-المنظفات. بالإضافة إلى ذلك، يوفر الوصول إلى "مختبر" بيو-ديوتيريشن قدرات فريدة من نوعها لإعداد الزراعات الواسعة النطاق والتعبير عن البروتينات يسمى الديوتريوم لنثر معزز إشارة من البروتين. لئن كان هذا تقنية لا توفر تفاصيل الهيكلية في الاستبانة، وفجوة المعرفة الهيكلية للبروتينات الغشاء يحتوي على العديد من مجالات البحوث عنونة دون أن يتطلب ذلك القرار قرب الذري. وتشمل هذه المجالات على سبيل المثال، تحديد الدول أوليجوميريك، تشكيل معقدة، التغييرات conformational أثناء اضطراب، وقابلة للطي/تتكشف الأحداث. يمكن سهولة إنجاز هذه التحقيقات من خلال تطبيقات لهذا الأسلوب.

Introduction

بروتينات الغشاء تم ترميزها بما يقدر 30 في المائة من جميع الجينات1 وتمثل أغلبية قوية من أهداف للعقاقير الطبية الحديثة. 2 هذه البروتينات تنفيذ مجموعة واسعة من المهام الحيوية الخلوية،3 ولكن على الرغم من وفرة، وأهمية – لا تمثل سوى حوالي 1 في المائة من مجموع هياكل أودعت في "سيقتضي البحوث" للبروتين الهيكلي المعلوماتية الحيوية (ركسب) بنك البيانات. 4 نظراً لطبيعتها مسعور جزئيا، وقد تم التصميم الهيكلي للبروتينات الغشاء زمنياً صعبة جداً. 5 , 6 , 7

كما يتطلب العديد من التقنيات الفيزيائية الحيوية الجزيئات مونوديسبيرسي في حل للقياس، عزل البروتينات الغشاء من الأغشية الأصلية واستقرار هذه البروتينات في تقليد القابلة لذوبان في الأغشية الأصلية كانت منطقة نشطة للبحث في الآونة الأخيرة العقود. 8 , 9 , 10 هذه التحقيقات أدت إلى تطوير العديد من التجميعات amphiphilic رواية لجعل البروتينات الغشاء، مثل نانوديسكس،11،،من1213 بيسيليس،14،15 وأمفيبولس. 16 , 17 ومع ذلك، استخدام المنظفات المذيلات تظل واحدة من الأساليب الأكثر شيوعاً ووضوحاً لتلبية متطلبات القابلية للذوبان بروتين معين. 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 للأسف، لا واحد المنظفات أو السحر مزيج من المنظفات القائم حاليا الذي يفي بجميع بروتينات الغشاء؛ وبالتالي، يجب فحص هذه الشروط تجريبيا للمتطلبات الفريدة لكل البروتين. 26 , 27

الذاتي تجميع المنظفات في الحل أعلاه تركزها مذيل حرجة لتشكيل هياكل تجميعية تسمى المذيلات. المذيلات تتكون من العديد من مونومرات المنظفات (تتراوح عادة ما بين 20-200) مع سلاسل الألكيل مسعور تشكيل نواة مذيل ومجموعات رأسه ماء مرتبة في طبقة شل مذيل تواجه المذيب مائي. قد سلوك المنظفات وتشكيل مذيل كلاسيكي وصف تشارلز تانفورد في تأثير مسعور،28 والأحجام وأشكال المذيلات من المنظفات المستخدمة عادة في غشاء بروتين الدراسات ووصف استخدام تشتت الزاوية الصغير. 29 , ودرست أيضا 30 منظمة المنظفات حول بروتينات الغشاء، ومن المتوقع تشكيل مجمعات البروتين-المنظفات (PDCs) مع المنظفات الجزيئات المحيطة البروتين في ترتيب يشبه المنظفات أنيق المذيلات. 31

وأضاف أحد هو ميزة في استخدام المنظفات يمكن التلاعب بخصائص مذيل الناتجة بإدراج مواد التنظيف الأخرى. يحمل العديد من المنظفات خلط مثالية، واختر خصائص من المذيلات المختلطة قد حتى يمكن التنبؤ بها من مكونات ونسبة الاختلاط. 22 ولكن وجود المنظفات يمكن لا تزال تحديات للخصائص الفيزيائية بالمساهمة في الإشارة الإجمالية. على سبيل المثال، إشارة من المنظفات في PDC مع الأشعة السينية وتقنيات تشتت الضوء، لا يمكن تمييزها تقريبا من البروتين. 32 التحقيقات مع واحد-الجسيمات cryo-إلكترون مجهرية (cryo-م) تعتمد عادة على المحاصرين جزيئات (المجمدة)؛ تفاصيل الهيكلية من البروتين هي لا تزال تحجب بعض المنظفات أو تركيزات عالية من المنظفات التي تضيف إلى الخلفية. 33 نهج بديل نحو تفسير هيكل PDC كاملة (بما في ذلك مواد التنظيف) قد بذلت من خلال الطرق الحسابية التي تسعى إلى إعادة بناء المنظفات حول بروتين غشاء معين. 34

في حالة تشتت النيوترونات، تنتج ترتيب الأساسية-شل المنظفات في مذيل عامل نموذج الذي يسهم في تشتت ملاحظتها. لحسن الحظ، يمكن تغيير مكونات الحل بأنها لا تساهم في بعثرة الملاحظ الصافية. هذه العملية "على النقيض من مطابقة" يتحقق عن طريق استبدال الديوتريوم للهيدروجين لتحقيق كثافة طول تشتت الذي يتطابق مع الخلفية (المخزن). يجب أن يعتبر خياراً حكيما للمنظفات (مع نظرائهم الديوتيريوم المتاحة) ونسبة الاختلاط. المذيلات المنظفات، يمكن تنفيذ هذا الاستبدال باستخدام مطهر مع نفس مجموعة الرأس لكن بعد سلسلة الكيل الديوتيريوم (د-الذيل بدلاً من ذيل ح). نظراً للمنظفات جيدا مختلطة،35 على المجاميع سوف يكون بكثافة طول تشتت التي هي المرجحة الخلد-الجزء متوسط من العنصرين (ح-ذيول وذيول د). عندما هذا التباين المتوسط يتسق مع رئيس الفريق، يمكن أن يقابل هياكل تجميعية موحدة تماما لإزالة جميع المساهمات لنثر الملاحظة.

نحن الحاضرين هنا وضع بروتوكول للتعامل مع تباين النيوترون المذيلات المنظفات بدمج جزيئات المنظفات كيميائيا متطابقة مع سلاسل الألكيل يسمى الديوتريوم. 19 , 36 , 37 يسمح هذا التباين المتزامن كاملة مطابقة مذيل الأساسية وشل، وقدرة فريدة على تشتت النيوترونات. 35 , 38 مع هذا المستوى المكرر إلى حد كبير من التفصيل، مطابقة التباين يمكن تمكين الدراسات خلاف ذلك غير مجد للهياكل بروتين الغشاء. بالإضافة إلى ذلك، يمكن توسيع هذا النهج النقيض مطابقة للنظم الأخرى التي تنطوي على مواد التنظيف، مثل البوليمر تبادل ردود الفعل39 والزيت عن الماء المشتتات أو40 أو حتى غيرها من الوكلاء سولوبيليزينج، مثل بيسيليس،41 البوليمرات الإسهامية نانوديسكس أو42 أو كتلة. نهج مماثل 43 ألف كما ورد في هذه المخطوطة، ولكن استخدام أنواع منظفات واحد مع استبدال الديوتريوم الجزئي على مجموعة الألكيل سلسلة و/أو رئيس، صدر مؤخرا. 37 بينما يمكن توقع هذا إلى تحسين توزيع عشوائي للهيدروجين والديوتريوم في جميع أنحاء المنظفات بالمقارنة مع النهج الذي قدم هنا، عدد محدود من الوظائف المتاحة في مواد التنظيف للاستبدال وخطوتين مطلوب توليف المنظفات يطرح تحديات إضافية للنظر فيها.

الخطوات 1 و 2 من البروتوكول المفصلة أدناه وكثيراً ما تتداخل منذ التجربة الأولى التخطيط يجب أن يتم تقديم اقتراح نوعية. ومع ذلك، يعتبر تقديم الاقتراح هنا كخطوة أولى للتأكيد على أن هذه العملية ينبغي أن تبدأ قبل وقت كاف من تجربة نيوترون. كما تجدر الإشارة إلى أن خطوة أساسية، ينبغي إثبات أنه بهذا الاقتراح، أن يكون توصيف البيوكيميائية والفيزيائية (بما في ذلك الاستقرار والنقاء) من العينة التي تدعم الحاجة إلى دراسات النيوترونات. مناقشة عامة للتشتت النيوتروني زاوية صغيرة (بلا) خارج نطاق هذه المقالة. أ مقدمة موجزة ولكنها شاملة يتوفر في عمل مرجع تم مؤخرا نشر توصيف المواد كوفمان،44 والكتب المدرسية ركزت بيولوجية زاوية صغيرة حلاً شاملا نثر. 45 كذلك تعطي القراءة الموصى بها في جزء المناقشة. تشتت الزاوية الصغيرة يستخدم ناقل نثر ما يسمى Q كالكمية المركزية التي تصف عملية نثر. تستخدم هذه المقالة تعريف مقبول على نطاق واسع Q = 4π سين (θ)/λ، حيث θ هي نصف الزاوية بين الشعاع الوارد ومتناثرة و λ هو الطول الموجي للإشعاع النيوتروني في أنجسترومس. توجد تعاريف أخرى أن استخدام مختلف رموز مثل في ' لناقلات تشتت، والتي قد تختلف من 2π عامل أو بواسطة استخدام نانومتر بدلاً من انغستروم (انظر أيضا المناقشة من الشكل 10).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-إعداد وتقديم مرفق النيوترون شعاع الوقت والصك المقترح

  1. استشارة على شبكة الإنترنت لتحديد مرافق تشتت النيوترونات التي توفر وصول المستخدم العامة النيوتروني شعاع الوقت، مثل أوك ريدج الوطني المختبرات (رنل). خريطة النيوترون التسهيلات والمعلومات حول النيوترونات البحوث في جميع أنحاء العالم متاح على الإنترنت. 46 أن تدرك أن هذه المرافق قد عادة المكالمات العادية للمقترحات؛ وهذا يحدد عند شعاع في المرة القادمة سوف تكون متاحة. تستخدم النيوترونات لمجموعة متنوعة من التطبيقات؛ ابحث عن زاوية صغيرة النيوترون نثر (SANS) الصكوك، لا سيما تلك التي لديها قدرات للعينات البيولوجية.
  2. استخدام الموارد التي توفرها مرافق النيوترون للمساعدة في التنقل عملية تقديم اقتراح وقت شعاع النيوترون. التشاور مع النيوترون تشتت العلماء (NSS) المرتبطة الصك الذي سيتم تطبيق. استعراض للمرفق النيوترون المعلومات الحالية فيما يتعلق بالمواعيد النهائية، يدعو الاقتراح والمشورة لتقديمها؛ أوك ريدج وهذا متاح على الإنترنت. 47 يقدم الاقتراح الوقت شعاع بعد جميع المبادئ التوجيهية لتقديمها نجاح.
  3. إذا كان البروتين الديوتيريوم المطلوبة (انظر 2.2)، التي غالباً ما تدعمها النيوترون نثر مرافق المختبرات وخبرة مكرسة لإنتاج مواد الديوتيريوم. لطلب الوصول إلى مختبر بيو-ديوتيراتيون (المصرف) في رنل، حدد مصرف لبنان الصك الثاني في النظام المقترح. بينما هو استعراض الاقتراح بلا جدوى ولجنة استعراض علمي، يجري فحص طلبات مصرف لبنان فقط للجدوى. للمساعدة في استعراض جدوى مصرف لبنان، يقدم معلومات المستكملة طلب نموذج48 الذي يصف البروتوكول التعبير البروتين والعائد المقدر (متاح على شبكة الإنترنت).
  4. بعد نجاح استعراض الأقران لاقتراح وقت الحزم، تأكيد تاريخ منح وقت شعاع قبل التجربة. التأكد من أن جميع تفاصيل عينة والمخزن والصيغ مذكورة بشكل صحيح في الاقتراح المتعلق باستعراض مناسب. أية تغييرات على الخطة التجريبية المقترحة، بما في ذلك التغييرات في تكوين العينة والمخزن المؤقت، تتطلب إخطار مرفق.
    ملاحظة: ينبغي أن تناقش التغييرات وقت ممكن مع الاستراتيجية الوطنية للمأوى المخصصة.

2-تحديد نقاط المباراة التباين النيوترون والتباين اللازم لقياس البروتين

  1. جمع المعلومات (من معلومات المنتج الخاصة بالمورد، وقواعد البيانات على الإنترنت، ونشر القيم، إلخ) فيما يتعلق بتركيبة الذري ووحدات التخزين لمكونات النظام المنظفات لتكون مطابقة على النقيض. يتم استخدام هذه المعلومات تحديد النيوترون نثر طول الكثافة (SLDs) وذلك على النقيض من نقاط المباراة (CMPs) في الحل، هو أمر حيوي للحصول على الجودة بلا معلومات البيانات والهيكلية لبروتين غشائي من الاهتمام في السياق الحزب الديمقراطي المسيحي. جدول يلخص النقاط تطابق خصائص والتباين البدني للمنظفات التي يشيع استخدامها في الدراسات البيولوجية الفيزيائية للبروتينات الغشاء تضمين (الجدول 1).
  2. تحديد SLDs النيوترون باستخدام تطبيق ويب المهاد: "وحدات للتحليل من التباين تباين البيانات"49 (50 متاحة على شبكة الإنترنت مجاناً مقابل). ارتباط إلى دليل المستخدم الموجود على الصفحة الرئيسية. الوصول إلى الموقع وقراءة الوثائق المصاحبة. الشكل 1 و الشكل 2 تقديم لمحة عامة عن التباين وحدة الإدخال والإخراج لاثنين من الأمثلة ذات الصلة.
    ملاحظة: مواقع أخرى لحساب SLDs متوفرة، مثل تلك التي يحتفظ بها المعهد الوطني للمعايير والتكنولوجيا (NIST) مركز "أبحاث النيوترون". 51
    1. فتح الوحدة النمطية التباين عن طريق النقر فوق 'التباين' الموجود في جزء التنقل الأيسر. تقديم نص لعنوان مشروع وإدخال التفاصيل أدناه لعنصرين هما (مثلاً المنظفات مجموعة الرأس والذيل) ك 'وحدة فرعية 1' و 'وحدة فرعية 2'.
    2. أدخل الصيغة الجزيئية لكل عنصر في مربع النص 'الصيغة'.
      ملاحظة: أنا الزر 'يجب أن يتم تحديد إطار' "نوع مضمون" ' لإدخال صيغة الجزيئية. بالإضافة إلى ذلك، استخدام حرف 'X' في الصيغة للإشارة إلى ذرات الهيدروجين سهولة تبديل. يمكن إدخال تسلسل البروتين، والجيش الملكي النيبالي، أو الحمض النووي إذا المقابلة 'P'، 'R'، أو أنه ' تحديد أزرار الراديو. في حالة وجود نسخ متعددة من عنصر ضمن وحدة فرعية، يمكن تغيير القيمة ل 'نموليكوليس' تبعاً لذلك. مثال عملي هنا يتعلق بالدهن مثل المنظفات التي تحتوي على اثنين ذيول متطابقة، السماح بصيغة ذيل واحد إدخالها مع نموليكوليس يساوي 2.
    3. أدخل الحجم في مكعب أنجسترومس لكل عنصر في المربع الموجود أسفل 'حجم (Å3)'. استخدام الصيغة في تانفورد28 لسلاسل الكيل من طول n, Vالذيل = 27.4 + n * 26.9، حساب حجم الذيل التقريبي، أو الحصول على وحدات التخزين الجزيئي من معلومات المنتج المقدمة أو نشر القيم في الأدب.
    4. أدخل تفاصيل لمكونات المخزن المؤقت. تغيير 'حل عدد الأنواع في المذيب' باستخدام القائمة المنسدلة لإضافة أو إزالة الصفوف لكل مكون من مكونات المخزن المؤقت. وفي حالة تشكيل مذيل المنظفات، تشمل مونومرات المنظفات مجاناً كمكونات منفصلة المخزن المؤقت في تركيز مذيل الحرجة للمنظفات (CMC).
    5. انقر فوق 'إرسال' لإجراء العمليات الحسابية على النقيض نيوترون وتوليد صفحة نتائج التي يوفر جدول لنقاط المباراة كثافة والتباين طول نثر فضلا عن الصيغ لتحديد هذه المعلمات في أي نسبة مئوية معينة من د2س في المخزن المؤقت. استعراض المعلمات نثر مع إيلاء اهتمام خاص إلى CMPs المكون. إذا نقاط المباراة متشابهة (في حدود 10% د2س) وتركيز مذيل الحرة منخفض، ثم المتوسط CMP يمكن استخدامه لمطابقة التباين مساهمات المنظفات. في معظم الحالات، سوف تختلف CMP المنظفات مجموعة رأس وذيل بأكثر من 10-15%، إنتاج عامل شكل شل الأساسية في البيانات بلا الذي يعتم مباشرة مجموعة من الإشارات ونثر من البروتين وحدها.
  3. تقدير التباين بين المنظفات مجموعة الرأس والذيل. عندما لا تكون المنظفات رئيس مجموعة الألكيل سلسلة الذيل و CMPs جيدا المتطابقة، توافر وإدماج مطهر محل الديوتريوم يمكن السماح لنثر كثافة طول لتحديد مكونات التلاعب بها. في معظم الحالات، هذا سيتطلب تشكيل مذيل مختلطة من خلال إدراج المنظفات متطابقة مع سلاسل الألكيل استبدال الديوتريوم. إضافة الديوتريوم يثير كثافة طول نثر الأساسية التي شكلتها ذيول سلسلة الألكيل. في هذه الحالة، نقطة النهاية المرجوة، حيث أنه رئيس مجموعة شل CMP والأساسية سلسلة الألكيل CMP قيم متساوية تقريبا.
    1. رفع إلى اجتماع الأطراف الأساسية مذيل المنظفات أن يكون مساوياً تقريبا للرهن العقاري شل رئيس الفريق بتحديد نسبة ملائمة من خلط بين ح-ذيول وذيول د الذي يحقق التباين الكامل مطابقة مع المجموعات الرأس. شرطا مسبقاً لهذا التحديد هو المعرفة إلى اجتماع الأطراف لذيل سلسلة الكيل استبدال الديوتريوم. يتوفر نظير متاحة تجارياً إلى n-دوديسيل β-د-مالتوسيدي (DDM) مع جميع الهيدروجين سلسلة الألكيل الاستعاضة عنها بالديوتريوم (d25-DDM). كرر تباين الحسابات المذكورة في الخطوة 2، 1 لذيل قد 'بدلاً من' ح-الذيل '.
    2. حساب نسبة الخلد ذيل ح د-ذيل المطلوبة لمطابقة التباين مع فريق رئيس اللجنة المعنية بالمفقودين. يمكن أن تساعد الصيغة التالية مع هذا التصميم:
      CMPالرأس = CMPذيل ح * χذيل ح + CMPالذيل د * χد-الذيل
      حيث CMP هو كثافة طول التشتت و χ هو الكسر حجم المكون رئيس المنظفات، ذيل ح، أو د-الذيل. لحلول مخزنة من DDM، تنتج إدماج نسبة 44 في المائة من حيث الوزن (43 في المائة بالخلد) من المنظفات مجموع ك d25-DDM مع سلاسل الألكيل الديوتيريوم-الاستعاضة عن CMP واحد في 48.5 ٪ د2س لمكونات كل من رأس وذيل.
  4. النظر في درجة الديوتريوم الاستعاضة عن بروتين غشائي. لقياس الإشارات نثر كافية من البروتين، إلى اجتماع الأطراف للبروتين ينبغي أن يكون على الأقل 15% د2س في الحل بعيداً عن المنظفات CMP وشروط القياس. الإشارة يزيد مع مربع هذا الفرق %. منذ اجتماع الأطراف البروتين غير مسمى يحدث عادة مع ~ 42% د2س في الحل (مشابهة للعديد من المجموعات رئيس المنظفات CMP)، وسم الديوتريوم من البروتين ضروري دائماً تقريبا. 52

3-التعبير عن وتنقية بروتين غشائي للفائدة

  1. إعداد متوسطة رطل (مرق ليسوجيني) وتنمو الإشريكيّة القولونية (كولاي) الخلايا التي تأوي متجه إيندوسيبلي تعبير عن تسلسل البروتين الهدف.
    1. إعداد الحد الأدنى من وسائل الإعلام. أما ح2س أو س د2، حل 7.0 غرام/لتر (NH4)2حتى4، ز 5.25/L Na2هبو4، 1.6 غرام/لتر خ2ص4، وسترات الهيدروجين ثنائي الأمونيوم 0.50 جرام/لتر، والغليسيرول 5.0 غرام/لتر، 1.0 مل/لتر من 20% w/v مجسو 4·7H2س، و 1.0 مل/لتر من المعادن النزرة Holme (0.50 غرام/لتر كاكل2·2H2س، 0.098 غ/لتر كوكل2، 0.102 غرام/لتر CuSO4، 16.7 غرام/لتر فيكل3·6H2س، 0.114 g/L منسو4· ح2س و 22.3 غرام/لتر Na2EDTA·2H2س و 0.112 غرام/لتر زنسو4· ح2س). 53 , 54
    2. إعداد الحلول مخزون المضادات الحيوية المناسبة استخدام ح2س أو2د. ب.
    3. تعد حلاً أسهم الأيزوبروبيل-β-د-1-ثيوجالاكتوبيرانوسيدي باستخدام ح2س أو د2o.
    4. العقيمة-تصفية جميع الحلول إلى جافة، وحاويات معقمة تستخدم فراغ أعلى زجاجة والمحاقن مرشحات مع حجم مسام 0.22 ميكرون.
  2. التكيف مع خلايا كولاي يسمى الديوتريوم متوسطة قبل الصعود ل overexpression بروتين الديوتيريوم.
    1. تطعيم 3 مل متوسطة رطل مع مستعمرة معزولة من صفيحة أجار ليسوجيني مرق (رطل) أو خلايا من مخزون والغليسيرول مجمدة. تنمو الخلايا في 37 درجة مئوية في حاضنة تهز 250 لفة في الدقيقة أو خفض درجة الحرارة إلى 30 درجة مئوية أو أقل لتجنب فرط ثقافة عند حضانة بين عشية وضحاها.
      ملاحظة: يمكن أن تختلف إجراءات التكيف. 55 , 56 , 57
    2. وبمجرد ثقافة رطل نمت كثافة بصرية في 600 نانومتر (OD600) ~ 1، تمييع 01:20 في 3 مل ح2س الحد الأدنى المتوسط وتنمو ل التطوير التنظيمي600 من ~ 1. كرر في 01:20 تخفيف استخدام متوسط الحد الأدنى الذي يحتوي على 50 و 75 و 100% د2س (أو ما يصل إلى2س د النسبة المئوية المطلوبة).
      ملاحظة: يتم زيادة المحتوى "د"2س، وستنخفض معدلات النمو. قد تم الإبلاغ عن العلاقة بين نسبة2س د في استبدال الوسائط والديوتريوم النمو في البروتين في الأدب. 58 , 59 , 60
    3. يستمر تزايد الثقافة في مفاعل حيوي زيادة عائد كتلة الخلية الديوتيريوم (الشكل 3).
      ملاحظة: وقد استعرضت إجراءات خطوة بخطوة لتشغيل مفاعل حيوي في أماكن أخرى. 61 , 62 , 63 , 64
  3. الحصاد والخلايا كولاي لتنقية البروتين واستخراج الغشاء
    1. بيليه الخلايا باستخدام الطرد المركزي في ~ 6,000 x ز ل ~ 30-45 دقيقة في 4 درجات مئوية.
    2. تنعيم بيليه الخلية التي نقع في المخزن المؤقت على الجليد ل ~ 30 دقيقة. ثم، ريسوسبيند برفق بيليه الخلية في المخزن المؤقت قبل بيبيتينج برفق مع بيبيت مصلية، أو لطيف هزاز في 2D الروك، إلى تركيز نهائي ~ 1 ز الخلية الرطب الجماهيري/10 مل المخزن المؤقت.
      ملاحظة: مخزن مؤقت لمثال 50 ملم حبيس (حمض-(2-hydroxyethyl)-1-بيبيرازينيثانيسولفونيك 4)، ودرجة الحموضة 7.5، 200 ملم كلوريد الصوديوم تستكمل مع قرص مثبط البروتياز.
    3. حراكه الخلايا مع ثلاثة يمر الخالطون الضغط العالي في هذه المبادرة 10,000 حين تقشعر لها اﻷبدان التدفق إلى الخارج.
      ملاحظة: اعتماداً على المستوى المطلوب، قد يكون تحلل الأساليب الأخرى المستخدمة (مثلاً، حسب الصحافة الفرنسية أو سونيكيشن).
    4. بيليه خلية الحطام بالطرد المركزي في ز x ~ 4,000-5,000 لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية. كرر هذه الخطوة حتى يتم توضيح المادة طافية.
    5. أولتراسينتريفوجي (~ 150,000 س ز لمدة 30-45 دقيقة) المادة طافية من الخطوة السابقة، الذي يحتوي الذوبان والغشاء الكسور. بيليه بعد تنبيذ فائق يحتوي على كسر الغشاء.
    6. ريسوسبيند بيليه الغشاء في الخالطون دونس كبيرة وعزل الكسر الغشاء مرة أخرى عن طريق تنبيذ فائق (الخطوة 3.3.5). كرر هذه الخطوة مرة واحدة على الأقل لإزالة البروتينات فضفاضة ملزمة.
    7. جعل الأغشية هزاز لطيف ل ~ 30 دقيقة في 4 درجات مئوية في المخزن مؤقت الذي يحتوي على مواد تنظيف مناسبة لتنقية. Solubilization الظاهر عند التعليق يتحول من غائم إلى شفاف. إزالة المواد غير قابلة للذوبان بواسطة تنبيذ فائق (~ 150,000 س ز لمدة 30-45 دقيقة).
      ملاحظة: مخزن مؤقت لمثال 50 مم هيبيس، درجة الحموضة 7.5، 500 ملم كلوريد الصوديوم، ايميدازول عيار 20 ملم و 4% (w/v) DDM لتنقية قبل ني2 + التقارب اللوني.
  4. تنقية البروتين بعد بروتوكول سبق أن وضعت لأشكال البروتونية.
    ملاحظة: انظر نينغ وآخرون لبروتوكول تنقية مثال لمعلم هيكساهيستيديني م. ماريسنيجري JR1 إينتراميمبراني أسبارتيل البروتياز (د-مياب). كان العائد النهائي 65 ~ 1 مغ من الديوتيريوم من نمو ثقافة الخلايا الديوتيريوم 5 لتر، التي استخدمت في التجربة بلا (الشكل 4).
  5. تبادل البروتين المنقي في "المخزن المؤقت للصرف النهائي" لمطابقة التباين.
    1. إعداد 200 مل من "مخزن الصرف النهائي" يحتوي على المزيج الصحيح للتباين مطابقة، مثلاً،20 مم حبيس، درجة الحموضة 7.5، 250 ملم كلوريد الصوديوم، و 0.05% إجمالي DDM (0.028% DDM و 0.022% d25-DDM) في 49% D2o.
    2. حجته عمود حجم استبعاد مع > 2 أحجام العمود (CV) "من المخزن المؤقت الصرف النهائي" في 3.5.1 باستخدام نظام سريع بروتين سائل لوني (فبلك).
    3. بعد الحقن العينة، تشغيل العمود وعزل الكسور المقابلة لبروتين الفائدة.
    4. تركيز البروتين إلى التركيز النهائي المطلوب (2-5 ملغ/مل).
      ملاحظة: حجم ~ 300 ميكروليتر مطلوب لملء ومبومو كوارتز أسطواني 1 مم المستخدمة لبلا.
    5. نحتفظ قاسمة للمخزن المؤقت مطابقة لبلا خلفية الطرح.
      ملاحظة: يمكن أن تؤخذ قاسمة مباشرة من المخزن المؤقت إعداد، أو من الناحية المثالية من كسر شطف نظيفة في نهاية تشغيل فبلك.

4-التحضيرات النهائية لشعاع الوقت وجمع بلا بيانات

  1. بعد أن تم قبول هذا الاقتراح وتمت الموافقة على الوصول إلى الموقع، استكمال كل ما يلزم من التدريب قبل الوقت المعين شعاع. هذا وتشمل prearrival، المستندة إلى ويب التدريب فضلا عن المختبر الإشعاعي، في الموقع، والتدريب الخاصة بالصك.
    ملاحظة: الاحتياجات التدريبية قد تملي وصول مقدما لأول مرة للمستخدمين. يتوفر مزيد من المعلومات على الإنترنت. 66
  2. تحميل عينات ومخازن لجمع البيانات.
    ملاحظة: لمحة عامة عن بعثرة البيولوجية زاوية صغيرة النيوترون (بيو-بلا) صك عينة بيئة المنطقة ويرد في الشكل 5.
    1. تحميل عينات والمخازن المؤقتة إلى خلايا الكوارتز. وتتوفر خلايا الكوارتز من عالم الصك أو مرفق. استخدام هلام-تحميل نصائح للوصول فتح معظم نماذج الخلايا ضيقة.
    2. التأكد من أن يتم إغلاق مصراع شعاع، ثم نهج مجال البيئة عينة ومكان الخلايا الكوارتز في المغير عينة. سجل موقف مغير عينة لكل خلية العينة.
    3. التحقق من المنطقة وضمان مسار الشعاع خالية من العرقلة، ثم ترك مجال البيئة عينة وفتح مصراع شعاع.
      ملاحظة: بعناية اتبع كل مرفق القواعد واللوائح واطاعة كافة منشورات، والنصيحة من العلماء الصك. قد لا تكون إزالتها من الشعاع عينات والتلاعب بعد التعرض للشعاع دون الاحتياطات الخاصة التالية. التشاور مع الإشعاعية مراقبة فني (RCT) قبل هذه الإجراءات.
  3. تنفيذ الجدول المسح الضوئي لجمع البيانات آليا
    1. وتعمل الأداة من خلال عنصر تحكم مخصص البرمجيات على أساس ابفيف، "مطياف أداة مراقبة البيئة" (التوابل). اتبع الإرشادات لعملية الصك المقدمة من "العلماء تشتت النيوترونات". لمحة عامة عن windows عملية مسح الجدول يرد في الشكل 6.
    2. بعد إدخال المعلومات المطلوبة في المجالات المناسبة، تنفيذ الجدول المسح الضوئي وسوف تبدأ عملية جمع بيانات آليا. رصد التقدم المحرز عن طريق علامة التبويب '"مركز مسح الجدول"'.

5-تقليل بلا بيانات من صورة ثنائية الأبعاد للأرض د 1

  1. تحديد كل ملف بيانات العينة والمخزن المؤقت من الأرقام المسجلة المسح الضوئي. سيتم تعيين كل قياس عدد مسح فريدة من نوعها. تعتبر هذه المعلومات مفيدة خلال الحد من البيانات التعرف على كل زوج المخزن المؤقت وعينه مقابلة.
  2. استخدام برنامج مانتيدبلوت وبرنامج نصي بايثون للحد
    1. وترد النيوترون "تشتت المستخدمين" مع تفاصيل الحساب الوصول إلى البيانات الخاصة بهم على "الكتلة التحليل البعيد". 67 الدخول إلى "الكتلة التحليل البعيد" وتنفيذ "مانتيدبلوت" من سطر الأوامر. يتم توفير رقم 7 و رقم 8 لمساعدة هذه الخطوات.
    2. الحصول على "برنامج نصي الحد المستخدم" من "عالم نثر النيوترون" (وعادة ما يحدث هذا خلال التجربة)؛ هذا البرنامج النصي هو أساس بيثون وسيحتوي كل المعايرة اللازمة وتسويات التحجيم تقليل صورة نثر 2D في مؤامرة د 1 من شدة متناثرة كدالة تشتت الزاوية، I(Q).
    3. فتح "البرنامج النصي الحد المستخدم" المتوفرة في مانتيدبلوت ووضع أرقام المسح المقابلة أو تحديد الهوية لأزواج عينة والمخزن المؤقت في القائمة المناسبة.
    4. تنفيذ البرنامج النصي لتوليد البيانات انخفاض كملف نص أربعة أعمدة (ترتيب العمود هو فاء، I(Q)، I(Q) خطأ، خطأ س) في الموقع المحدد. الحق انقر فوق مساحة عمل مناسبة في مانتيدبلوت وحدد "مؤامرة مع الأخطاء..." لإجراء دراسة أولية لنثر التشكيلات الجانبية.

6-تحليل البيانات للمعلمات الهيكلية تشتت الجسيمات

  1. نقل ملف البيانات انخفاض من التحليل server إلى كمبيوتر محلي باستخدام نقل الملفات FTP آمنة. يمكن إجراء ذلك باستخدام برامج مثل FileZilla أو CyberDuck. وترد إرشادات إضافية وتفاصيل الاتصال بنظام ملفات الملقم تحليل صفحة تسجيل الدخول analysis.sns.gov.
  2. تنزيل أتساس البرمجيات جناح65،68 (جناح أتساس كله). 69 البرامج الفردية70 متاحة أيضا على الإنترنت لتحليل البيانات بلا، إلا وهي تحديد المعلمات الهيكلية ونماذج منذ البداية .
    ملاحظة: وتتوفر العديد من الخيارات لبلا تحليل البيانات من بيوماكروموليكوليس. 45
  3. استخدام بريموس71 لرسم البيانات، المخزن المؤقت التحجيم والطرح، وتحليل جينر.
    1. شن أتساس '"تحليل البيانات ساس"' التطبيق وتحميل البيانات انخفاض الملفات المقابلة للزوج عينة والمخزن المؤقت.
      1. لتغيير حجم المخزن المؤقت بشكل صحيح, حدد نطاق بيانات في عالية Q (Q > 0.5-1) حيث كل ملامح متشابهة وشقة، وانقر فوق الزر 'النطاق' الموجودة ضمن 'عمليات' علامة التبويب. سيتم تطبيق عامل مقياس للمخزن المؤقت مثل ينبغي أن تتداخل هاتان المنطقتان مسطحة. استخدم تنبيه: ينبغي أن يكون هناك سببا معقولاً مادية التي تبرر زيادة كثافة المخزن المؤقت ليطابق النموذج. إذا كان التباين كبيرا، استشر عالمة صك للنهج صالحة للطرح الخلفية. 44 , 45 , 72
      2. زيادة نطاق البيانات لعرض كافة النقاط. انقر فوق 'طرح' للقيام بهذه العملية. انقر بالزر الأيمن في مكان آخر مطروح المخزن المؤقت في وسيلة الإيضاح وحفظ هذا الملف للتحليل اللاحق. ويوجز الشكل 9 استخدام علامة التبويب 'العمليات'.
    2. إجراء تحليل جينر عينة طرح المخزن المؤقت للبيانات باستخدام علامة التبويب 'تحليل' تطبيق '"تحليل البيانات ساس"'.
      1. تأكد من تحديد الملف الصحيح في القائمة وانقر فوق 'دائرة نصف قطرها Gyration'. محاولة الآلي لأداء جينر تناسب ستقدم عن طريق النقر فوق الزر 'أوتورج'.
      2. توسيع نطاق البيانات المستخدمة لتشمل كافة البيانات منخفضة-Q والبدء في تضييق نطاق البيانات بأخذ النقاط العالية-Q حتى Qmax * صز الحد أدناه 1.3. استخدام قطعة المخلفات للتحقق من أن البيانات الخطية في نطاق صالح. جينر تناسب غلة تقريبي Rg ، و0 تشتت الجسيمات.
      3. إجراء تعديلات صغيرة على احتواء المنطقة ورصد حساسية هذه القيم إلى نطاق البيانات المستخدمة في الاحتواء. يوضح الشكل 10A استخدام الأداة 'دائرة نصف قطرها Gyration'.
  4. الحصول على وظيفة التوزيع الاحتمالي (P(r)) في جنوم. 73 سيتم استخدام ملف الإخراج التي تم إنشاؤها هنا كمدخل أساسها عملية النمذجة.
    1. بدء "معالج توزيع المسافة" ضمن علامة التبويب 'تحليل' الحصول على حسن صالح للبيانات أمر ضروري للحصول على نموذج جودة. لمزيد من المعلومات حول كيفية الحصول على دقة يناسب، يرجى الاطلاع على استعراض74 من بوتنام، et al.
      ملاحظة: البرنامج "جنوم" يوفر معلومات إضافية حول الملاءمة تتجاوز "معالج توزيع المسافة". يوضح الشكل 10B الاستخدام السليم للأداة '"توزيع المسافة"'، و الرقم 11 ويوضح بعض الأخطاء الشائعة التي تواجه.
    2. تحديد Dmax، المسافة القصوى interatomic داخل الجزيء.
      1. تقدير قيمة ل Dmax بإلغاء تحديد المربع لإجبار رماكس = 0 وإدخال قيمة كبيرة ل Dmax (150، على سبيل المثال). العاشر-التقاطع الأول في مؤامرة P(r) غلة هذا التقدير.
      2. التغييرات التزايدية إلى هذه القيمة Dmax ومجموعة من البيانات المستخدمة أو عدد النقاط المستخدمة في الملاءمة لتحسين غنوم يصلح للبيانات ومنحني P(r) الناجمة عن ذلك.
    3. مواصلة صقل تناسب غنوم وحفظ ملفات الإخراج غنوم مع معلمات مناسبة جيدة للاحقة منذ البداية خطوات النمذجة.
  5. محاكاة بلا ملامح من نماذج PDB عالية الدقة باستخدام برنامج كريسون. 75
    1. افتح البرنامج وحدد الخيار '0'. حدد اسم ملف PDB في المستعرض الملف المنبثقة. اضغط enter لقبول الإعدادات الافتراضية، باستثناء تعيين سلسلة ديوتيريشن الكسور وجزء صغير من د2س في المذيب لتحقيق معالم التباين السليم.
    2. يصلح هذا النموذج إلى مجموعة البيانات تجريبية بإدخال 'ص' واختيار ملف البيانات في المستعرض الملف المنبثقة. قبول القيم الافتراضية المتبقية، وسيتم كتابة ملفات الإخراج في موقع ملف PDB. الملف '.fit' يحتوي على معلومات التشكيل الجانبي نثر المتوقعة من النموذج الثلاثي الأبعاد ذات الدقة العالية.

7-إنشاء نماذج Ab منذ البداية من بلا بيانات.

ملاحظة: داميف76 ودامين77 داخل جناح البرمجيات أتساس يتم استخدامها لإعادة بناء ذرة دمية نماذج (السدود) باستخدام عملية محاكاة انلينغ من غنوم الإخراج، الذي يحتوي على البيانات P(r)، أو معلومات حول الاحتمال أو التردد إينتيراتوميك المسافات داخل تشتت الجسيمات. يمكن تشغيل هذه البرامج في الوضع الدفعي أو على ملقم ويب على الإنترنت أتساس.

  1. بدء تشغيل "معالج الشكل" بريموس من الزر 'داميف' في التبويب 'تحليل' من '"تحليل البيانات ساس"'، واستخدام تحديد يدوي للمعلمات. ويتضح في الشكل 12مدخلات للمعالج.
    1. تعريف النطاق جينر من الاحتواء (الخطوة 6.3.2) والمضي قدما إلى الخطوة التالية باستخدام أزرار التنقل. تعريف قيم تناسب من الأرض P(r) (الخطوة 6.4)، والمضي قدما إلى الخطوة التالية.
    2. وتوفر معلمات أساسه عملية النمذجة. أدخل بادئة لأسماء الإخراج النموذجي (مثلاً، سانسينفيلوبي)، اختر أما النمذجة وضع 'سريعة' أو 'بطيئة'، قم بإدخال قيمة لعدد نماذج (17 الموصى بدلالة إحصائية)، وحدد من الخيارات المتاحة للجسيمات التماثل، أنيسوميتري، ومقياس الزاوي (إذا كانت معروفة). ضمان أن المربعات يتم فحص نماذج متوسط مع دامافير وصقل النموذج النهائي مع دامين.
    3. بدء العملية باستخدام الزر 'الالتزام'. بمجرد اكتمال العملية، عرض وحفظ دليل العمل.
      ملاحظة: عملية النمذجة نموذجية واحدة، صغير البروتين يمكن أن يستغرق بضع ساعات مع كمبيوتر شخصي نموذجية. يتم تخزين الملفات في الدلائل المؤقتة حتى حفظه.
  2. تراكب وركب النهائي بلا المغلف مع نموذج الاستبانة ذات صلة باستخدام سوبكومب داخل أتساس. وضع نسخة من النموذج PDB الاستبانة إلى أن يكون مناسباً للظرف بلا في دليل العمل. تنفيذ سوبكومب من سطر الأوامر باستخدام أسماء ملفات PDB كوسيطتين مع هيكل قالب سرد أولاً: $ سوبكومب HiRes.pdb SANSEnvelope.pdb
    ملاحظة: سيتم كتابة اسم الملف الثاني سرد كملف جديد مع "r" إلحاق إلى نهاية وبعد الإحداثيات الجديدة لاستعلاء على بنية القالب.
  3. تصور أساسه نموذج نتائج استخدام بيمول (pymol.org)، برنامج عرض رسومات ثلاثية الأبعاد جزيئية. الرقم 13 يوفر لمحة عامة عن عمليات بيمول.
    ملاحظة: وهناك نشر المبادئ التوجيهية للنمذجة الهيكلية للبيانات تشتت الزاوية الصغير من الجزيئات الحيوية في الحل. 78
    1. بدء تشغيل التطبيق بيمول وفتح ملفات.pdb تناظر 3D بلا المغلف والانحياز سوبكومب بنية عالية الدقة ليتم عرضه.
    2. تصور المغلف بلا التي تمثل هذا النموذج كسطح. انقر فوق في 'الموجود بجانب نموذج وحدد' إظهار: ك: السطح '.
    3. تصور بنية العمود الفقري البروتين ذات الدقة العالية التي تمثل هذا النموذج كرسم كاريكاتوري. حدد في 'الزر الموجود بجانب هذا النموذج وحدد' إظهار: ك: الكرتون '. عرض السلسلة كقوس قزح من N-إلى ج-المحطة عن طريق تحديد الزر 'ج' و '"من سلسلة": تشينبووس.
    4. تعديل شفافية تمثيل السطحية للوضوح. من شريط القوائم 'الإعداد'، حدد 'الشفافية» سطح» 40%'.
    5. جعل خلفية بيضاء وغير مبهمة. من شريط القائمة 'عرض'، حدد 'خلفية»' وتحديد 'معتمة' إلغاء تحديد هذا الخيار و 'أبيض' بمناسبة هذا اللون للخلفية.
      ملاحظة: يمكن الاطلاع على عمليات إضافية واستخدامات بيمول في PyMolWiki.org.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ينبغي أن تنقل شعاع الوقت وصك مقترح وضوح كافة المعلومات اللازمة للجنة الاستعراض حيث أنه يمكن إجراء تقييم صحيح للتجربة المقترحة. الاتصالات مع استراتيجية الأمن القومي يقترح العالية للمستخدمين عديمي الخبرة. استراتيجية الأمن القومي تقييم الجدوى الأولية وتقديم الاقتراح دليل للتأكيد على جدوى وسلامة وإمكانات العلم عالية التأثير. ينبغي أن تتضمن المعلومات المقدمة في الاقتراح معلومات خلفية وسياق لأهمية البحوث؛ المعرفة التي من المتوقع أن يكون المكتسبة، وكيف يؤثر ذلك الفهم الحالي في ما يتصل مجال العلوم؛ وصف العمل وعينات، والأساليب، والإجراءات التي سيتم اتباعها؛ وكذلك، إذا كان ذلك ممكناً، الإنتاجية السابقة للفريق في المرفق، بما في ذلك المنشورات ذات الصلة ونتائج. موارد مفيدة، مثل قوالب اقتراح ونصائح لإعداد الاقتراح، تتوفر للمستخدمين عبر "المدخل المستخدم العلوم النيوترونية" (neutrons.ornl.gov/users).

تجربة التخطيط هو عملية دينامية التي غالباً ما تبدأ خلال المراحل الأولية لتقديم الاقتراح، ولكن قد لا يكون تصور تماما حتى قبل التجربة. ومع ذلك، نضع في اعتبارنا أن أي التغييرات التي تنحرف كثيرا عن الوصف الوارد في الاقتراح (بما في ذلك إدخال تغييرات على شروط المخزن المؤقت أو تكوين عينة) يجب أن توافق عليها المرفق قبل البدء التجربة.

ويفترض هذا البروتوكول أن أسلوب للتعبير عن وتنقية بروتين غشائي من الفائدة في المذيلات المنظفات في الحل وقد ثبت بنجاح. وفي هذه الحالة، هو بروتين غشائي من اهتمام حوزتي أسبارتيل إينتراميمبراني (IAP)، بروتوكول تنقية المنشأة، وقد حددت مسبقاً لتكون قابلة للذوبان والنشطة في المخزن المؤقت الذي يحتوي على المذيلات DDM.

هنا، علينا أن نبدي حسابات التباين النيوترون باستخدام نشارة: وحدة التباين لإيجاد حل للبروتين الأكاديميات في مطابقة التباين مختلطة DDM/المذيلات d25-DDM. كان أولاً تحديد درجة الاختلاط بين المنظفات اثنين اللازمة لتحقيق توافق على النقيض تام من مذيل الاستراتيجية المبينة في هذه الوثيقة. كانت النتيجة النهائية لتحديد التباين النسبي لكل مكون والخلفية (نسبة2س2الباب ح) اللازمة التباين-مباراة بعثرة من المنظفات الصناعية من أجل مراقبة بعثرة البروتين فقط.

يوضح الشكل 1 من مدخلات مناسبة للوحدة النمطية "مهاد التباين" والناتج لحساب التباين DDM المنظفات مجموعة الرأس والذيل كمفارز 1 و 2، على التوالي. الصيغة المستخدمة للفريق الرئيسي هو ج12ح14س7س11 بحجم 3483، وصيغة ذيل سلسلة الألكيل يرد وصفها ج12ح25 بحجم 3503.

ومن الواضح من إخراج وحدة التباين أن DDM المجموعة رأس وذيل نثر مختلفة الطول الكثافة، وسيتبع ذلك التباين بين هذين العنصرين. ل DDM، المجموعات رئيس لها CMP في 49% د2س بينما ذيول سلسلة الألكيل CMP في 2% د2س، مع بهم CMP المتوسط التي وقعت في 22% D2o. ولذلك، سيكون هدف الخطوة التالية لتصميم مذيل مختلطة تتضمن سلاسل الألكيل الديوتيريوم-الاستعاضة عن زيادة CMP متوسط من ذيول المنظفات لمطابقة CMP المجموعات الرأس. وأعيد حساب التباين مطهر المستبدلة، DDM مع ذيل الكامل الديوتيريوم (d25-DDM)، وبالمثل يؤدي في المقابل بين المجموعة رأس وذيل. ومع ذلك، على النقيض من قيم ح-الذيول وذيول د تختلف اختلافاً كبيرا. نذكر بأن المنظفات خلائط معروفة لإنتاج المذيلات المختلطة جيدا في الحل،22 وبالتالي ينبغي إنتاج مزيج من هذه ح ود-ذيول في صميم مذيل المساواة SLD متوسط لرئيس مجموعة شل، العائد من مذيل بمفرده CMP. نظراً لرئيس الفريق المشترك إلى DDM و d25-DDM، تتمثل الاستراتيجية في إيجاد خليط من هذه المنظفات التي تنتج قيمة متوسط تباين من ذيول المختلط الذي يطابق على النقيض المجموعات الرأس.

الهدف المتوسط CMP ذيول المنظفات أن الجماعات مالتوسيدي الرأس، أو 49% D2o. يجب أن يكون معروفا لتقدير نسبة خلط CMP متوسط لكل مكون من مكونات ح-الذيل والذيل د. وهذه القيم لبعض المنظفات الشائعة والمتوفرة تجارياً الديوتريوم المسمى النظراء وترد في الجدول 1. باستخدام هذه القيم CMP DDM و d25-DDM، الكسر الخلد ذيول ح وذيول د يرضي المعادلة المنصوص عليها في الخطوة 2، 2 χد-ذيول = 0.43.

يوضح الشكل 2 إسهاما أكثر تقدما "التباين مهاد" الوحدة النمطية التي يمكن استخدامها للتأكد من ظروف المباراة النهائية مذيل متباينة تباين وتحديد درجة ديوتيريشن اللازمة على البروتين. هنا، وحدة فرعية 1 يشير إلى مذيل مختلطة مطابقة التباين مع 2 من مكونات و DDM و d25-DDM، بينما يشير وحدة فرعية 2 بحوزتي أسبارتيل إينتراميمبراني ماريسنيجري م. JR1 (مياب) قدمها في تسلسل الأحماض الأمينية. تم رفع تحالف اليسار الديمقراطي البروتين بالتعبير في وسائط النمو الديوتيريوم تؤتي اجتماع الأطراف للبروتين في المخزن المؤقت الذي يحتوي على2~ 92% D o. وتقترح درجة الفصل بين المباراة نقطة البروتين في 92% د2س وشرط القياس (48.5 ٪ د2س) سيتم الحصول على تلك الإشارات ونثر كافية من البروتين.

إنتاج ممياب د أجريت مع الخلايا 2 رشيد كولاي إيواء متجه pET22b-ممياب. متوسط الحد الأدنى مع الجلسرين غير المسماة في 90% د2س وقد اختيرت المتوسطة النمو. بعد التكيف إلى متوسط الحد الأدنى 90% د2س، وكان حجم الثقافة تحجيم تصل إلى 400 مل ويستخدم لتطعيم 3.6 L الطازجة 90% د2س المتوسطة الدنيا في سفينة مفاعل حيوي ل 5.5.

ويوفر الشكل 3 تتبع القيم العملية أثناء زراعة دفعة بنك الاحتياطي الفيدرالي. وقت التطعيم، كان نقطة تعيين درجة حرارة 30 درجة مئوية، والأوكسجين الذائب (DO) تعيين نقطة 100%، والانفعالات مجموعة وأشير إلى 200 لفة في الدقيقة، وكان معدل تدفق الهواء المضغوط 4 لتر في الدقيقة. وعقدت درجة الحموضة أعلاه نقطة مجموعة من 6.9 باستخدام حل 10% w/v من هيدروكسيد الصوديوم في 90% D2سين مرة سبايك أشارت بدأ نضوب والغليسيرول الأولية 5 غرام/لتر، تغذية (30% w/v والغليسيرول، 0.2% مجسو4 في 90% D2O)، التي استمرت طوال الزراعة. بعد حوالي 7 ساعات من التغذية، وخفضت درجة الحرارة الثقافة إلى 18 درجة مئوية والايزوبروبيل-β-د-1-ثيوجالاكتوبيرانوسيدي تمت إضافة إلى تركيز نهائي من 1 مم. عند حصاد الثقافة، تم جمع حوالي 145 غرام من الوزن الرطب للصق الخلايا عن طريق الطرد المركزي (6,000 س ز لمدة 45 دقيقة)

وشرع تنقية مياب د أما بالنسبة للانزيم البروتونية إلا أن الغلة إنزيم كان أقل بكثير، ونقاء النهائي كان أقل نوعا ما من نموذجي. من 5 لتر، ~ 20 ز الأغشية الرطبة كانت معزولة، وجميعها كانت solubilized في DDM لتنقية وتحميلها على ني2 + تقارب العمود الأول. لتعظيم العائد تنقية، تضعف التدفق عن طريق الكسر وإعادة تشغيل في العمود ني2 + تقارب. وكرر هذا الإجراء لمرة ثالثة قبل التلميع العينة مياب د تتركز حجم الاستبعاد اللوني (الشكل 4).

يصور الشكل 5 خلية عينة كوارتز والإعداد مغير العينة ذات الصلة به. بيئات عينة يديرها الحيوية-بلا فريق العمليات والاستراتيجية الوطنية للمأوى. ويمكن ترتيب مجموعة متنوعة من بيئات مختلفة لإجراء القياسات مع التحكم في درجة الحرارة والرطوبة التحكم وتراجع الميكانيكية، ارتفاع درجة الحرارة والضغط المتواصل، بين أمور أخرى.

الشكل 6 يوضح بيو-بلا عمليات وتنفيذ الجدول الآلي بالأشعة. يتم تكوين الجدول المسح الضوئي لتكون بديهية وسهلة الاستعمال. ضمن علامة التبويب الأولى (تحميل العينات)، يتم توفير معلومات حول تبديل عينة والإعداد، مثل تحديد العينات في كل موضع في المغير عينة وسمك الخلية، ونوع العينة (شعاع مفتوحة، عينة، الخلفية، إلخ). ويمكن تطبيق علامات بيانات التعريف الإضافية هنا أيضا. على علامة التبويب التالية (خطة التجربة)، يتم تعريف التكوين الصك وأي من المعلمات المرتبطة (مثل التحكم في درجة الحرارة). هذه الخطوة يتم ترتيبه من قبل دوائر الأمن القومي في بداية التجربة. يجب إدخال المستخدم ببساطة مرات القياس لكل عينة (بالثواني). علامة التبويب النهائي (تنفيذ مسح) يقدم ملخصاً لبيانات مسح الجدول ويسمح الفحص الآلي ليتم تنفيذها.

بعد أن يتم تسجيل الصور نثر 2D، يجب أن تخفض هذه البيانات لمؤامرة د 1 من الكثافة مقابل Q-وظيفة من زاوية التشتت. خلال الحد من البيانات، يتم أيضا تطبيق تصحيحات الصورة مثل الأقنعة الواقية من الحساسية بكسل والطرح الخلفية المظلمة. صمم برنامج مانتيدبلوت لتفسير الحيوية الخام-بلا بيانات الصك. استراتيجية الأمن القومي عموما ستساعد في الحد واسترداد البيانات النهائية في نهاية التجربة.

الشكل 7 لمحة الكتلة التحليل البعيد بالوصول إلى مانتيدبلوت وإطار البرنامج النصي يستخدم للحد من البيانات. البيانات الخام موجوداً في المجموعة تحليل البعيد (analysis.sns.gov) عن طريق مصادقة المستخدم أوكامس/إكسكامس. بعد تسجيل الدخول إلى سطح المكتب البعيد، يمكن إطلاق البرنامج مانتيدبلوت من إطار المحطة طرفية ببساطة تنفيذ 'مانتيدبلوت' تحت أي مسار. فتح "إطار البرنامج النصي" في مانتيدبلوت وتحرير "البرنامج النصي للحد المستخدم" حسب توجيهات استراتيجية الأمن القومي. تنفيذ البرنامج النصي هذا سيقوم بإنشاء ملفات البيانات المخفضة، التي يمكن ثم نقلها إلى جهاز محلي للتحليل باستخدام FTP آمنة.

الشكل 8 يوضح التآمر وعرض البيانات بعد تنفيذ البيانات "المستخدم النصي تخفيض" سوف تظهر في نافذة مساحات العمل. بشكل افتراضي، سيكون البيانات المدمجة النهائية _f لاحقة الملحقة. انقر بزر الماوس سيتيح "الطيف مؤامرة" مع الأخطاء ليتم تحديده وبيانات رسم. يتم الوصول إلى تفضيلات العرض عن طريق تحديد تفضيلات من شريط القائمة 'عرض'. تنسيق المحاور والتآمر النطاق الوصول إليها بسهولة بواسطة النقر المزدوج المحاور. يجب أن تظهر ملامح نثر المخازن المؤقتة، التي تحتوي على لا تشتت الجسيمات ذات حجم كبير كخط ثابت نسبيا (كثافة ثابتة). للعينات، وينبغي أن تراعي كثافة في انخفاض نثر زوايا (Q) مع تحلل أسي على خلفية مسطحة غير متماسكة.

الرقم 9 يوفر لمحة عامة عن الطرح السليم المخزن المؤقت باستخدام حزمة برامج تحليل البيانات SAS (أو بريموسقت) عقب اختزال البيانات. في كثير من الأحيان الخلفية غير متماسكة (كثافة في عالية-Q) قليلاً غير متطابقة بين العينة والمخزن المؤقت. للطرح الصحيح، ينبغي أن تتداخل مع البيانات في هذه المنطقة. تصحيح مقياس ينطبق عامل مقياس كثافة البيانات الذي ينتج بيانات متداخلة، ويمكن أن يؤديها في الطرح. إذا كان عامل مقياس النتائج في المخزن المؤقت لبيانات النقاط بكثافة أكبر من النقاط المقابلة في العينة، هذه النقاط ستكون سلبية ولا المقدمة في مؤامرة سجل. إذا كانت القيم السلبية في الملف المخزن المؤقت طرح وفيرة، إجراء تخفيض طفيف في معامل حجم المخزن المؤقت وتنفيذ الطرح مرة أخرى.

يوفر الشكل 10 الأعراف المثال "جينر بريموس" و "المعالجات توزيع المسافة". ويوفر تحليلاً جوينير تقديراً أولياً لدائرة نصف قطرها الجسيمات gyration من البيانات ونثر زاوية منخفضة. بيانات نقترب من الصفر، ينبغي أن تكون منطقة خطية موجودة في البيانات. تركيب الخط في هذه المنطقة يسمح Rز يجب تحديد من المنحدر وأنا0 استقراء من التقاطع كثافة في Q = 0. اتجاها تصاعدياً في البيانات مع اقتراب Q صفر يشير إلى التجميع في العينة، بينما الاتجاهات النزولية عادة ما يدل على ريبولسيونس إينتيربارتيكلي. هذه الاتجاهات أكثر وضوحاً عندما يتم توزيع البواقي غير العشوائية. الحد الأعلى جينر صالح لجسيمات كروي مقيد بسبب ('s < 1.3ز ف * R ' يستخدم بدلاً من سؤال في البرنامج أتساس).

Rز يحدد مياب د من هذه تناسب جينر كان 15.4 ± 1.1 Å حيث قدرت أنا0 0.580 ± 0.001.

يسمح معالج توزيع المسافة إجراء تغييرات منهجية لمعلمات P(r) صالح. منحنى P(r) تحويل فورييه غير مباشرة المنحنى يصلح للبيانات التجريبية. ولذلك، من الضروري للتحقق من أن يصلح في اللوحة اليمنى يعكس بدقة البيانات التجريبية. للاحتواء هو موضح في هذا المثال، Dmax 46 تم الحصول عليها.

ويوضح الشكل 11 الأخطاء الشائعة في اختيار Dmax. Dmax مصطنع الكبيرة التي غالباً ما تكون الأسباب القيم P(r) لتصبح السلبية الدالة P(r) يتذبذب حول المحور س. Dmax مصطنع صغيرة يؤدي إلى منحنى P(r) مبتوراً الانتقال مفاجئ إلى رماكس = 0.

أولى الخطوات في "معالج الشكل بريموس" متطابقة إلى جينر والمعالجات توزيع المسافة. متى قدمت هذه المعلومات للحصول على نوبات جيدة للبيانات التجريبية، يتم تكوين الإعداد النموذجي منذ البداية .

ويوضح الرقم 12 من مدخلات مناسبة "معالج الشكل بريموس". هنا، تجريبية بلا بيانات للأكاديميات وزودت بمقياس في أنجسترومس، وأعطيت بادئة الملف المتوقعة من "سانسينفيلوبي". وطلب مجموعة من نماذج الذرة الدمية الأولى 17 إلى يتم إنشاؤها باستخدام وضع نموذج "سريع" مع لا التماثل (P1) تطبق ولا أنيسوميتري المحدد. مجموعة نماذج 17 سوف يكون الانحياز، بلغ متوسط، وتصفيتها مع دامافير، ونموذج متوسط المكررة باستخدام دامين. التفتيش على بادئة-damsel.log نص الوثيقة ملخصاً لمعيار الاختيار وأي التخلص من المجموعة من النماذج. نموذج المكرر النهائية المكتوبة بوصفها سانسينفيلوبي-1.pdb.

نموذج البرنامج يستخدم سوبكومب للقيام استعلاء المغلف بلا مع نموذج عالي الدقة، مع فقط اثنان PDB بنية الملفات كمدخل. بشكل افتراضي، يتم إلحاق اسم الملف إعادة توجيه وفرضه "r".

مرة واحدة بلا المغلف وبنية عالية الدقة وقد تم فرضه، ويمكن تصور هذه النماذج باستخدام الرسومات الجزيئية أي برنامج عرض. النتائج من بيمول هي مناسبة لنشر صور عالية الجودة ويمكن استخدامها لتأكيد النتائج الفيزيائية الحيوية المتصلة بالتحقيق في الهيكلية. هنا، علينا أن نظهر بضع عمليات بيمول الأساسية المستخدمة لتقديم تمثيلات ثلاثية الأبعاد ووجهات النظر لهياكل فرضه الناتجة عن ذلك.

الرقم 13 يوفر لمحة عامة عن عملية التصور بيمول. متى تم فتح ملفات PDB هيكل في بيمول، يجب أن تكون النماذج مرئية في إطار عارض بيمول. تغيير البيانات من كل نموذج باستخدام في ' الزر الموجود بجوار كل اسم ملف. استخدام تمثيل سطحية للمغلف بلا وتمثيل الكرتون للبروتين العمود الفقري من طراز عالي الدقة. حدد نظام ألوان مناسبة من الخيارات المتاحة تحت الزر 'ج'. لسلاسل البروتين، ويوفر تلوين "تشينبوو" تدرج لون من N-إلى ج-المحطة للمساعدة في تفسير. يتم تطبيق الشفافية على تمثيل السطحية للسماح لتصور أفضل لهيكل البروتين داخل المغلف. لنشر الصور، ينصح بخلفية بيضاء. بمجرد تطبيق قوائم الانتظار هذه التصور، يمكن دراسة هياكل ثلاثية الأبعاد. يمكن أن يؤديها التلاعب من منظور وجزيء التناوب/الترجمة بالنقر والسحب في الهيكل.

Figure 1
رقم 1. استخدام "التباين مهاد" للوحدة النمطية لتحديد معلمات التباين لمكونات دوديسيل مالتوسيدي (DDM)- تظهر قيم الإدخال في الشاشة على اليسار مع الإخراج اللاحقة إلى اليمين. يتم الوصول إلى الصفحة إدخال وحدة التباين بواسطة النقر فوق 'التباين' (دائرة خضراء) من الملاحة القائمة على الجانب الأيسر من كل شاشة. مناطق الإدخال لعنوان المشروع ومكونات المخزن المؤقت، والوحدات الفرعية 1 و 2 هي وصفت على هذا النحو. إخراج الصفحات تحتوي على خصائص الجسيمات الهامة المعلومات والتباين لوصف النظام. الجداول ذات الصلة والمحسوبة مطابقة النقاط قد تم محاصر في أورانج للوضوح. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2. استخدام "التباين مهاد" للوحدة النمطية لتحديد معلمات التباين لمكونات المجمع البروتين-المنظفات الغشاء. في هذه الحالة، قد أعطيت الإدخال لوصف نظام PDC عموما في حل مخزنة بشكل مؤقت. وصف وحدة فرعية 1 النقيض يقابل مختلطة تتألف من DDM مع 43% بالخلد ك d25 DDM مذيل. ويصف وحدة فرعية 2 بروتين غشائي، مع تسلسل الأحماض الأمينية للإدخال مياب كالصيغة. على مستوى ديوتيريشن (دائرة خضراء) يصف درجة البروتين من استبدال الديوتريوم، وله تأثير مباشر على اليسار ومحسوب نقطة المباراة التي سوف يقدر للبروتين. وتبين النتائج (المربع البرتقالي) أن المباراة نقطة للمنظفات مختلطة سوف تحدث في 48.5 ٪ د2س، بينما يحدث نقطة المباراة البروتين ~ 90% D2سين في الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3. إعداد عينة – تتبع مفاعل حيوي. القيم العملية المعروضة هي درجة الحرارة تعيين نقطة (خط برتقالي) والأوكسجين الذائب (DO) تعيين نقطة (الخط الأزرق) والانفعالات تعيين نقطة (الخط الأحمر)، ومعدل تدفق الهواء المضغوط (الخط الوردي). وكان استخدام مضخة 1 (الخط الأخضر) لمراقبة درجة الحموضة. سبايك الساعة 18:40 يشير إلى نضوب والغليسيرول الأولى وكانت تستخدم للبدء في إطعام والغليسيرول الحل عن طريق مضخة 2 (خط أسود). المحور س ترمز إلى ساعات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4. نموذج إعداد – توصيف فبلك والحزب الديمقراطي الصربي صفحة العينة. Chromatogram الاستبعاد الحجم النهائي مداكويليبراتيد-ممياب مع 20 مم هيبيس، درجة الحموضة 7.5، 250 ملم كلوريد الصوديوم، 48.5 ٪ د2س و 0.05% إجمالي DDM، الذي هو 44% (w/v) ذيل الديوتيريوم d25-DDM. داخلي: الحزب الديمقراطي الصربي صفحة التحليل مع أخذ تلطيخ. الكسور المجمعة المسماة A، B، وكان يستخدم المنطقة جيم "ب" في التجربة بلا. ومن علامة الوزن الجزيئي المشروح كاتشين. صورة مستنسخة بإذن من ناينغ et al. 65 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- 

Figure 5
الرقم 5. نموذج جمع البيانات – بانجو الكوارتز إعداد الخلايا وأوتوسامبلير. (أ) يظهر خلية بانجو كوارتز فارغة يستريح ضد كتلة أوتوسامبلير. خلايا مليئة بعينه وإدراجها في أحد المواقع المتاحة 15. (ب) شنت كتلة عينة وراء محدد فتحه (غير معروضة) بين "موسع أنبوب شعاع" ونافذة السيليكون عند مدخل الخزان كاشف. خراطيم توصيل إلى حمام مائي درجة الحرارة التي تسيطر، والقنوات في جميع أنحاء كتلة العينة توفير تنظيم درجة الحرارة في مواقف عينة. يشير السهم إلى اتجاه شعاع النيوترون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
الشكل 6. جمع البيانات – لمحة عامة عن عمليات التوابل ومسح الجدول. عمليات التفحص الجدول يتم الوصول إليها من الزر '"مسح الجدول"' على القائمة برنامج حاسوبي لمراقبة صك التوابل في أقصى اليسار. الأسهم الخضراء تدل على علامة التبويب النشطة في الجزء العلوي من الشاشة، وصناديق البرتقال تسليط الضوء على المناطق في الجدول لمدخلات المستخدم النشط. (أ) علامة التبويب الأولى لمسح الجدول يستخدم لتوفير معلومات حول تبديل عينة وعينه خلية المواقف. تقديم تسميات وسمك العينة، وأنواع العينة لكل موقف يستخدم في المغير عينة. التحقق من مربع '"القيام بمسح"' سيتم إضافة الصف المطابق إلى قائمة انتظار الجدول المسح الضوئي. (ب) في علامة التبويب الثانية، يتم تسجيل تفاصيل حول أداة تكوين وقياس الوقت لكل عينة (بالثواني). تكوينات صك تم تكوينها مسبقاً "عالم تشتت النيوترونات" والمقدمة إلى المستخدمين استناداً إلى التفاصيل الواردة في شعاع الوقت والصك المقترح. يمكن إضافة معلمات إضافية لعنصر التحكم الصك، مثل القدرة على تحديد درجة الحرارة سيتبوينتس وتعقد مرات، طوال انتظار القياس. (ج) علامة التبويب النهائي يوفر لمحة عامة عن القياسات لكل صف في الجدول. إذا كانت هناك حاجة إلى إدخال أي تغييرات، يتم بدء الفحص الآلي بواسطة النقر فوق الزر '"تنفيذ مسح"'. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 7
رقم 7. اختزال البيانات – لمحة عامة عن عمليات مانتيدبلوت والحد من البرنامج النصي. برنامج مانتيدبلوت موجوداً في المجموعة تحليل بكتابة "مانتيدبلوت" في موجه الأوامر المحطة طرفية في أي خدمة active directory (يتم إضافة دائرة صفراء والسهم للتأكيد). بمجرد فتح البرنامج، الوصول إلى نافذة البرنامج النصي (مثبت بزر علامة باللون الأخضر) وفتح البرنامج النصي يقدمها "عالم تشتت النيوترونات". اتبع الإرشادات المتوفرة في البرنامج النصي، الذي ينبغي أن لا تتطلب سوى أرقام المسح الضوئي لكل عينة والمخزن المؤقت لإدخالها في قائمة للحد من الآلي، فضلا عن مسح الأرقام للخلية الفارغة للطرح وشعاع فارغة للإرسال وشعاع مركز التصميم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 8
الرقم 8. تحليل البيانات – Plotting للبيانات باستخدام مانتيدبلوت. بيانات يتم الرجوع إليها بوصفها 'مساحات' في مانتيدبلوت. سيتم ملء منطقة مساحة العمل مع أسماء الملفات كما أنتج البرنامج النصي من الحد من المستخدم. يمكن رسم البيانات مساحة العمل لمجموعات البيانات د 1 بزر الماوس الأيمن فوق مساحة العمل، وتحديد "مؤامرة الطيف مع الأخطاء...". يمكن إضافة بيانات إضافية لهذه المؤامرة الحالية ببساطة سحب وإسقاط مساحات العمل. يمكن إجراء تنسيق إطار الأرض (مثل سجل تسجيل قطع الأراضي) بتحديد 'تفضيلات' من شريط القائمة 'عرض'، أو بالنقر نقراً مزدوجاً فوق تسميات المحور. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 9
الرقم 9. تحليل البيانات – البرامج أتساس: العمليات الأساسية والطرح المخزن المؤقت. يوفر التطبيق بريموسقت (تحليل البيانات ساس) التصور للطرح الخلفية المناسبة (المخزن). الملف المخزن المؤقت يجب أن يكون قياس للطرح مثل بيانات تتداخل في عالية-Q (حيث نثر شقة نتيجة الإشارات المتبقية من خلفية غير المتماسكة). عندما يتم تحديد هذا النطاق عالية-Q البيانات، سيتم تطبيق العملية مقياس عامل مقياس إلى ملف بيانات أقل في الجدول الذي ينتج التداخل في منطقة محددة. بعد القياس، يمكن طرح الملف المخزن المؤقت تسفر عن الشخصية صافي تشتت الجسيمات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 10
الرقم 10. تحليل البيانات – تصميم (توزيع المسافة) جينر و P(r). (أ) يستخدم معالج جينر بريموس لإجراء تحليل جينر، تقديم تقديرات أولية لانا0 و Rg. نوع الجسيمات ونطاق البيانات لتناسب تستخدم لتعريف مناسباً. مؤامرة الاحتواء والمتخلفات المقابلة تظهر إلى اليسار، بينما شروط جوينير (أنا0 و Rز)، يتم توفير حدودز ف * R، ونوعية تناسب الخطي كإخراج في منطقة تتسم بالمربع البرتقالي. (ب) بريموس المسافة التوزيع يستخدم معالج للقيام بتحليل توزيع المسافة، توفير المنحنى P(r) الذي يعرف احتمال interatomic المسافات داخل تشتت الجسيمات ويشمل Dmax أو الحد الأقصى إينتيراتوميك المسافة. المعلمات التي أشارت إلى جانب المربع البرتقالي يمكن أن يحقق بشكل منهجي لتحديد دالة توزيع مسافة مناسبة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 11
رقم 11. نتائج غير سليمة من خلال تحليل توزيع المسافة. يجب أن تنتج Dmax محدد بشكل صحيح منحنى P(r) قمم مع اضمحلال تدريجي للصفر. Dmax القيم التي تكون كبيرة جداً سوف يرجح أن تنتج القيم السالبة P(r) أو ذبذبات قرب المحور السيني في قيم عالية ر Dmax القيم التي صغيرة بشكل مصطنع غالباً ما يسفر عن المنحنيات P(r) حيث يظهر الحد الأعلى مبتوراً. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 12
الرقم 12. النمذجة – منذ البداية إعداد نموذج باستخدام "معالج الشكل بريموس". وترد منذ البداية النمذجة المعلمات في إطار إدخال واحد. يتم توفير بادئة لأسماء الملفات الإخراج مع خيارات أخرى لمعالجة متوفرة. الصلب الداخلي يمكن أن يكون سريع (الخرز أكبر مع التبريد أسرع) أو بطيئة (حبات صغيرة مع التبريد أبطأ). يجب أن يكون عدد التكرار ذات حجم كاف للنظر في إمكانية تكرار نتائج ميزات طراز. يمكن تقديم التماثل الجسيمات وأنيسوميتري، إذا كانت معروفة. وينبغي أن تتوافق مع الحجم الزاوي لوحدات البيانات المقاسة. دامافير المتوسط سوف محاذاة ومتوسط كل ذرة دمية نماذج ثم قم بتطبيق معيار اختيار الذي يستبعد أي نماذج الخارجة. سوف تكون نواة الذرة الثابتة من طراز متوسط زيادة المكررة باستخدام دامين إذا تم تحديد هذا الخيار. ينبغي أن يمثل هذا النموذج المكرر المغلف منخفضة الدقة 3D التجريبي بلا الشخصية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 13
الشكل 13. التصور – المغلف "بلا التجريبية" وتراكب مع نموذج الاستبانة باستخدام بيمول. بعد فتح ملفات PDB هيكل في بيمول، تظهر نماذج في عارض بيمول. يتم سرد النماذج النشطة في الجدول إلى اليمين، جنبا إلى جنب مع أزرار الإجراءات التي يمكن استخدامها للتعامل مع هذا النموذج وتمثيلها. وتقدم العمليات الأساسية لتصور هذه النماذج التي تسمح لمناطق هيكل الاتفاق (أو عدم تطابق) بين المغلف بلا وعالية الاستبانة التعرف. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الجدول 1. الخصائص الفيزيائية للمنظفات التي يشيع استخدامها في غشاء بروتين التحقيقات. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

البيولوجيا الهيكلية الباحثين الاستفادة من التقنيات الهيكلية التكميلية مثل نثر الحل للحصول على تفاصيل البيوكيميائية والهيكلية (مثل الشكل والحجم الكلي) من الجزيئات الحيوية في الحل. بلا أسلوب جاذبية خاصة لتحديد هياكل منخفضة الدقة من بروتينات الغشاء، وتركيز أساسية لعلم الأحياء الهيكلية الحديثة والكيمياء الحيوية. بلا يتطلب كميات من البروتينات المنقاة مماثلة لتلك المحاكمات بلورية (1 ملغ في عينة). توافر عالية النقاء الديوتيريوم المنظفات ذات الصلة بدراسات البروتين غشاء التجارية مؤخرا توسيع يجعل الوصول إليها وسيلة التعامل مع هذا المحتوى لبلا تجارب مجمعات البروتين-المنظفات غشاء، الهيدروجين/الديوتريوم السماح إشارة البروتين بتسجيلها مباشرة. عندما تكون ناجحة، يمكن حساب مغلف جزيئية منذ البداية إلى نموذج من البيانات التي تم جمعها على مدى ساعات عدة فقط. وهكذا، غشاء بروتين المعلوماتيين، وبيوفيسيسيستس، وعلماء الأحياء الهيكلية يمكن سهولة الاستفادة من بلا للحصول على نماذج ثلاثية الأبعاد الأولية مطمعا بروتينات الغشاء في الحل، وهياكل في المجمع مع ربط الشركاء أو ركائز، والنماذج التي تم الحصول عليها بها بلا يمكن استخدامها لبيانات الحيود التدريجي. الاستخدام الروتيني لبلا تميز البروتينات الغشاء تحويلية لميدان الكيمياء الحيوية بروتين الغشاء وآثار متتالية من وظيفة الهيكل الأساسي لاكتشاف المخدرات والتنمية. يجعل ميزة إضافية لتباين النيوترونات مطابقة مع استبدال الديوتريوم بلا تقنية قيمة لدراسة البروتين-بروتين، والبروتين-الحمض النووي، أو المجمعات الجزيئية البيولوجية الأخرى، التي يمكن سهولة التلاعب في مضمونها الهيدروجين/الديوتريوم.

للحصول على تفاصيل إضافية حول تصميم أداة تشتت الزاوية الصغير ونظرية، ينصح ملاحظات التالية: الحيوية-بلا أداة "عالية الجريان النظائر المفاعل من مختبر أوك ريدج الوطني"، نثر79 زاوية صغيرة ل علم الأحياء الهيكلي – توسيع الحدود مع تجنب المزالق،72 والدراسات ونثر زاوية صغيرة من الجزيئات البيولوجية في الحل. 80 يمكن أيضا مناقشة "عالم تشتت النيوترونات" الحالية صك تكوينات والمعلمات الأمثل لنظام معين. على سبيل المثال، البيانات في Q السفلي (ودالة تشتت الزاوية والنيوترون الطول الموجي) عموما المطلوب لنظم أكبر. تكوين الأداة الأكثر شيوعاً في الحيوية-بلا يوفر سدقيقة من 0.003-1 وهي مناسبة لأكبر مجمعات البروتين تصل إلى مئات كاتشين. محلول يحتوي على mg ~ 3 مل-1 من بروتين غشائي الحجم التقريبي كاتشين 30 (مونومر) في المذيلات مطابقة التباين مع 48.5 ٪ د2س في الحل يتطلب وقتاً قياس نموذجي حوالي 8 ساعات للعينة، والمخزن وخلية فارغة (24 ساعات = مجموع 1 يوم). يمكن تغيير أداة قياس مرات على شرط معين على النقيض تقريبا وفقا للمنتج من الكتلة الجزيئية تشتت الجسيمات وتركيز. ومع ذلك، يجب أن يقاس تشتت الجسيمات تحت ظروف غير التفاعل، بما في ذلك أي تجميع البروتين غير محددة، مما يضع حد أعلى عملية على تركيز العينة. قياسات استغرقت ساعة واحدة تضع حدوداً على الاستقرار في بعض البروتينات. لحسن الحظ، بلا قياسات يمكن القيام به بشكل روتيني في درجات حرارة مبردة تحسين وقت الحياة البروتين، وشعاع العاملين للنيوترونات الطاقة المنخفضة لا تسبب أي أضرار الإشعاع أثناء أخذ القياس.

وترد لمحة عامة عن هذه العملية وتحديد العديد من العوامل الرئيسية نحو تسجيل ناجحة من تشتت النيوترونات من عينة يقاس عند نقطة المباراة على النقيض من مواد التنظيف في هذه المخطوطة. ويشمل ذلك خطوة حاسمة نحو الحصول على مطابقة كاملة للمنظفات الصناعية الإجمالية بتصميم خليط مسحوق الغسيل مع تباين نيوترون موحدة بين فريق رئيس المنظفات ومكونات سلسلة الألكيل. القياسات في هذه المباراة المنظفات نقطة واحدة توفير ملف تعريف نثر تعزى إلى بروتين غشائي فقط للفائدة وسمحت منذ البداية مغلف يمثل بروتين غشائي يتم بناؤها من البيانات. تحليل البيانات و أساسه النمذجة البروتوكولات أيضا إثبات المعلومات المحتملة التي تم الحصول عليها من هذه التحقيقات، التي يمكن أن تهدف إلى معالجة الهيكل العام، والتغيرات كونفورماشونال، أوليجوميريك الدول، بين أمور أخرى. حد واحد أن حتى الآن سوى قلة المنظفات القليلة المتاحة تجارياً مع استبدال الديوتريوم. 19

بينما بيرديوتيريشن قد لا يكون ضروريا، في هذه الحالة ينبغي أن يكون الهدف تحقيق نسبة بروتين مع > تصنيف الديوتريوم 65% في البروتين. بدلاً من ذلك، إذا المنظفات بشكل انتقائي-الديوتيريوم تتوفر مجموعات الرأس والذيول، والرهن العقاري مذيل المنظفات يحدث قرب 100% د2س، ثم تباين كافي من البروتين يمكن أن يتحقق دون الحاجة إلى وسم الديوتريوم. تحديد مستوى ديوتيريشن المناسبة من البروتين لتحقيق نثر كافية عندما يقاس عند نقطة المباراة على النقيض من مواد التنظيف. وهناك العديد من التحديات المرتبطة بغشاء بروتين التعبير وتنقية،81 التي ما زالت خارج نطاق هذه المقالة. ولسوء الحظ، مستويات عالية من ديوتيريشن ليست حاليا (بعد) الممكنة لنظم حقيقية النواة. وفي حين أننا ندرك أن هذا حد لبعض البروتينات حقيقية النواة، قد معظم بروتينات الغشاء أورثولوجس البكتيرية التي هذا الأسلوب مناسبة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يتم التعاقد مع المؤلف ساي عبدالله Pingali وكيفن ل. فايس، فولكر س. الحضرية وريان جيم أوليفر عن طريق UT-Battelle مع "وزارة الطاقة الأميركية" لدعم البرنامج المستخدم العلوم النيوترونية والحيوية-بلا صك في "مختبر أوك ريدج الوطني" المستخدمة في هذه المقالة.

هذه المخطوطة قد تم شارك في تأليف UT-Battelle، شركة ذات مسؤولية محدودة، وبموجب العقد دي-AC05-00OR22725 مع لنا الطاقة (وزارة). وتحتفظ حكومة الولايات المتحدة والناشر، بقبول المادة للنشر، تعترف بأن حكومة الولايات المتحدة يحتفظ بترخيص وحدك، المدفوع، ولا رجعة فيه، في جميع أنحاء العالم لنشر أو استنساخ النموذج المنشور من هذه المخطوطة، أو السماح الآخرين للقيام بذلك، لأغراض حكومة الولايات المتحدة. ستوفر دو وصول الجمهور إلى نتائج هذه البحوث التي ترعاها الحكومة الاتحادية وفقا "خطة" وزارة الطاقة وصول الجمهور. 82

Acknowledgments

مكتب البيولوجية، والبحوث البيئية ودعم البحوث في مركز رنل للبيولوجيا الجزيئية الهيكلية (كسمب) والحيوية-بلا استخدام مرافق دعم "شعبة المرافق المستخدم العلمي"، "مكتب العلوم الأساسية في الطاقة"، و "الإدارة الأميركية" للطاقة. حظي بدعم الأعمال الإنشائية على بروتينات الغشاء في مختبر ليبرمان من المعاهد الوطنية للصحة (DK091357، GM095638) وجبهة الخلاص الوطني (0845445).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amicon Ultra MWCO 50KDa concentrator  EMD Millipore UFC905096 labware
Ammonium citrate dibasic Fisher Scientific A663 medium component
Ammonium sulfate EMD Millipore 2150 medium component
Bioflo 310 Bioreactor System Eppendorf M1287-2110 equipment
Calcium chloride dihydrate Acros 423525000 medium component
Carbenicillin IBI Scientific IB02025 antibiotic
Chloramphenicol EMD Millipore 3130 antibiotic
Cobalt (II) chloride Acros AC21413-0050 medium component
Copper (II) sulfate Acros AC19771-1000  medium component
Deuterium oxide Sigma-Aldrich 756822 medium component
Drierite Gas Purifier W.A. Hammond Drierite Co. Ltd. 27068
EDTA, disodium, dihydrate EMD Millipore 4010 medium component
Emulsiflex-C3 Avestin EF-C3 equipment
Äkta Purifier UPC100 GE Healthcare  equipment
Glycerol Sigma-Aldrich G5516 medium component
HEPES Sigma-Aldrich H4034
HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR column GE Healthcare  17116701
Imidazole VWR 97064-622
IPTG Teknova I3325
Iron(III) chloride hexahydrate MP Biochemicals ICN19404590 medium component
LB Agar Miller Fisher Scientific BP1425-2
Magnesium sulfate heptahydrate VWR 97062-134 medium component
Manganese(II) sulfate monohydrate Acros AC20590-5000 medium component
MaxQ 6000 Incubated/Refrigerated Shaker Thermo Scientific SHKE6000-7  equipment
n-Dodecyl-d25-β-D-maltopyranoside Anatrace D310T
n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside Anatrace D310A
Potassium phosphate monobasic VWR 97062-346 medium component
RC 6 Plus Centrifuge Thermo Scientific Sorvall 46910 equipment
SIGMAFAST protease inhibitor cocktail tablets, EDTA-free Sigma-Aldrich S8830
Sodium chloride Sigma-Aldrich S3014
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 795429
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich S7907 medium component
Sterile 25mm syringe filter with 0.2µm PES membrane VWR 28145-501 labware
Sterile disposable bottle top filter with 0.2µm PES membrane Thermo Scientific 596-4520  labware
Superdex 200 10/300 GL  GE Healthcare  17517501
Superose-12 10/300 GL column  GE Healthcare  17517301
Ultrospec 10 Cell Density Meter GE Healthcare  80211630 equipment
Zinc sulfate monohydrate Acros AC38980-2500  medium component

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wallin, E., Heijne, G. V. Genome-wide analysis of integral membrane proteins from eubacterial, archaean, and eukaryotic organisms. Protein Science. 7, (4), 1029-1038 (1998).
  2. Tautermann, C. S. GPCR structures in drug design, emerging opportunities with new structures. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 24, (17), 4073-4079 (2014).
  3. Cournia, Z., et al. Membrane protein structure, function, and dynamics: A perspective from experiments and theory. The Journal of Membrane Biology. 248, (4), 611-640 (2015).
  4. Doerr, A. Membrane protein structures. Nature Methods. 6, 35 (2008).
  5. Bill, R. M., et al. Overcoming barriers to membrane protein structure determination. Nature Biotechnology. 29, 335 (2011).
  6. Carpenter, E. P., Beis, K., Cameron, A. D., Iwata, S. Overcoming the challenges of membrane protein crystallography. Current Opinion in Structural Biology. 18, (5), 581-586 (2008).
  7. Sanders, C. R., Sönnichsen, F. Solution NMR of membrane proteins: Practice and challenges. Magnetic Resonance in Chemistry. 44, (S1), S24-S40 (2006).
  8. Garavito, R. M., Ferguson-Miller, S. Detergents as tools in membrane biochemistry. Journal of Biological Chemistry. 276, (35), 32403-32406 (2001).
  9. Privé, G. G. Detergents for the stabilization and crystallization of membrane proteins. Methods. 41, (4), 388-397 (2007).
  10. Wessel, D., Flügge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids. Analytical Biochemistry. 138, (1), 141-143 (1984).
  11. Bayburt, T. H., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. Self-assembly of discoidal phospholipid bilayer nanoparticles with membrane scaffold proteins. Nano Letters. 2, (8), 853-856 (2002).
  12. Bayburt, T. H., Sligar, S. G. Membrane protein assembly into Nanodiscs. FEBS Letters. 584, (9), 1721-1727 (2010).
  13. Skar-Gislinge, N., et al. Elliptical structure of phospholipid bilayer nanodiscs encapsulated by scaffold proteins: Casting the roles of the lipids and the protein. Journal of the American Chemical Society. 132, (39), 13713-13722 (2010).
  14. Sanders, C. R., Schwonek, J. P. Characterization of magnetically orientable bilayers in mixtures of dihexanoylphosphatidylcholine and dimyristoylphosphatidylcholine by solid-state NMR. Biochemistry. 31, (37), 8898-8905 (1992).
  15. Vestergaard, M., Kraft, J. F., Vosegaard, T., Thøgersen, L., Schiøtt, B. Bicelles and other membrane mimics: comparison of structure, properties, and dynamics from MD simulations. The Journal of Physical Chemistry B. 119, (52), 15831-15843 (2015).
  16. Popot, J. -L., et al. Amphipols From A to Z. Annual Review of Biophysics. 40, (1), 379-408 (2011).
  17. Tribet, C., Audebert, R., Popot, J. -L. Amphipols: Polymers that keep membrane proteins soluble in aqueous solutions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 93, (26), 15047 (1996).
  18. Fernández, C., Wüthrich, K. NMR solution structure determination of membrane proteins reconstituted in detergent micelles. FEBS Letters. 555, (1), 144-150 (2003).
  19. Hiruma-Shimizu, K., Shimizu, H., Thompson, G. S., Kalverda, A. P., Patching, S. G. Deuterated detergents for structural and functional studies of membrane proteins: Properties, chemical synthesis and applications. Molecular Membrane Biology. 32, (5-8), 139-155 (2015).
  20. Krueger-Koplin, R. D., et al. An evaluation of detergents for NMR structural studies of membrane proteins. Journal of Biomolecular NMR. 28, (1), 43-57 (2004).
  21. Linke, D. Methods in Enzymology. Burgess, R. R., Deutscher, M. P. 463, Academic Press. 603-617 (2009).
  22. Oliver, R. C., et al. Tuning micelle dimensions and properties with binary surfactant mixtures. Langmuir. 30, (44), 13353-13361 (2014).
  23. Orwick-Rydmark, M., Arnold, T., Linke, D. The use of detergents to purify membrane proteins. Current Protocols in Protein Science. 84, (1), (2016).
  24. Tanford, C., Reynolds, J. A. Characterization of membrane proteins in detergent solutions. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Biomembranes. 457, (2), 133-170 (1976).
  25. Tulumello, D. V., Deber, C. M. Efficiency of detergents at maintaining membrane protein structures in their biologically relevant forms. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1818, (5), 1351-1358 (2012).
  26. Arachea, B. T., et al. Detergent selection for enhanced extraction of membrane proteins. Protein Expression and Purification. 86, (1), 12-20 (2012).
  27. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: Not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1666, (1), 105-117 (2004).
  28. Tanford, C. The Hydrophobic Effect: Formation of Micelles and Biological Membranes. 2nd edn, John Wiley. (1980).
  29. Littrell, K., Urban, V., Tiede, D., Thiyagarajan, P. Solution structure of detergent micelles at conditions relevant to membrane protein crystallization. Journal of Applied Crystallography. 33, (3 Part 1), 577-581 (2000).
  30. Oliver, R. C., et al. Dependence of micelle size and shape on detergent alkyl chain length and head group. PLOS ONE. 8, (5), e62488 (2013).
  31. Maire, M., Champeil, P., Møller, J. V. Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1508, (1), 86-111 (2000).
  32. Hong, X., Weng, Y. -X., Li, M. Determination of the topological shape of integral membrane protein light-harvesting complex LH2 from photosynthetic bacteria in the detergent solution by small-angle X-ray scattering. Biophysical Journal. 86, (2), 1082-1088 (2004).
  33. Vinothkumar, K. R. Membrane protein structures without crystals, by single particle electron cryomicroscopy. Current Opinion in Structural Biology. 33, 103-114 (2015).
  34. Pérez, J., Koutsioubas, A. Memprot: A program to model the detergent corona around a membrane protein based on S-SAXS data. Acta Crystallographica Section D. 71, (1), 86-93 (2015).
  35. Oliver, R. C., Pingali, S. V., Urban, V. S. Designing mixed detergent micelles for uniform neutron contrast. The Journal of Physical Chemistry Letters. 8, (20), 5041-5046 (2017).
  36. Hiruma-Shimizu, K., Kalverda, A. P., Henderson, P. J. F., Homans, S. W., Patching, S. G. Synthesis of uniformly deuterated n-dodecyl-β-D-maltoside (d39-DDM) for solubilization of membrane proteins in TROSY NMR experiments. Journal of Labelled Compounds & Radiopharmaceuticals. 57, (14), 737-743 (2014).
  37. Midtgaard, S. R., et al. Invisible detergents for structure determination of membrane proteins by small-angle neutron scattering. The FEBS Journal. 285, (2), 357-371 (2018).
  38. Gabel, F. Biological Small Angle Scattering: Techniques, Strategies and Tips. Chaudhuri, B., Muñoz, I. G., Qian, S., Urban, V. S. Springer. Singapore. 201-214 (2017).
  39. Schantz, A. B., et al. PEE-PEO Block copolymer exchange rate between mixed micelles is detergent and temperature activated. Macromolecules. 50, (6), 2484-2494 (2017).
  40. Liyana-Arachchi, T. P., et al. Bubble bursting as an aerosol generation mechanism during an oil spill in the deep-sea environment: Molecular dynamics simulations of oil alkanes and dispersants in atmospheric air/salt water interfaces. Environmental Science: Processes & Impacts. 16, (1), 53-64 (2014).
  41. Dos Santos Morais, R., et al. Contrast-matched isotropic bicelles: A versatile tool to specifically probe the solution structure of peripheral membrane proteins using SANS. Langmuir. 33, (26), 6572-6580 (2017).
  42. Maric, S., et al. Stealth carriers for low-resolution structure determination of membrane proteins in solution. Acta Crystallographica Section D. 70, (2), 317-328 (2014).
  43. Pedersen, J. S., Svaneborg, C., Almdal, K., Hamley, I. W., Young, R. N. A small-angle neutron and x-ray contrast variation scattering study of the structure of block copolymer micelles: Corona shape and excluded volume interactions. Macromolecules. 36, (2), 416-433 (2003).
  44. Urban, V. S. Characterization of Materials. Kaufmann, E. N. John Wiley and Sons. (2012).
  45. Chaudhuri, B., Muñoz, I. G., Qian, S., Urban, V. S., et al. Advances in Experimental Medicine and Biology. Cohen, I. R. 1009, Springer Singapore. Singapore. 1-268 (2017).
  46. Neutron Facilities WorldWide. Available from: http://neutronsources.org (2018).
  47. Submitting a Research Proposal. Available from: https://neutrons.ornl.gov/users/proposals (2018).
  48. Accompanying Bio-Deuteration Laboratory Proposal. Available from: https://www.ornl.gov/sites/default/files/BDL_info_request.docx (2014).
  49. Whitten, A. E., Cai, S., Trewhella, J. MULCh: Modules for the analysis of small-angle neutron contrast variation data from biomolecular assemblies. Journal of Applied Crystallography. 41, (1), 222-226 (2008).
  50. MULCh: ModULes for the Analysis of Contrast Variation Data. Available from: http://smb-research.smb.usyd.edu.au/NCVWeb/ (2018).
  51. Scattering Length Density Calculator by National Institute of Standards and Technology (NIST) Center for Neutron Research. Available from: https://www.ncnr.nist.gov/resources/activation/ (2018).
  52. Ibel, K., Stuhrmann, H. B. Comparison of neutron and X-ray scattering of dilute myoglobin solutions. Journal of Molecular Biology. 93, (2), 255-265 (1975).
  53. Holme, T., Arvidson, S., Lindholm, B., Pavlu, B. Enzymes: Laboratory-scale production. Process Biochemistry. 5, (9), 62-66 (1970).
  54. Larsson, G., Enfors, S. -O. Protein release and foaming in Escherichia coli cultures grown in minimal medium. Bioprocess Engineering. 15, (5), 231-237 (1996).
  55. Artero, J. -B., Hartlein, M., McSweeney, S., Timmins, P. A comparison of refined X-ray structures of hydrogenated and perdeuterated rat [gamma]E-crystallin in H2O and D2O. Acta Crystallographica Section D. 61, (11), 1541-1549 (2005).
  56. Paliy, O., Bloor, D., Brockwell, D., Gilbert, P., Barber, J. Improved methods of cultivation and production of deuteriated proteins from E. coli strains grown on fully deuteriated minimal medium. Journal of applied microbiology. 94, (4), 580-586 (2003).
  57. Sivashanmugam, A., et al. Practical protocols for production of very high yields of recombinant proteins using Escherichia coli. Protein Science. 18, (5), 936-948 (2009).
  58. Hoopes, J. T., Elberson, M. A., Preston, R. J., Reddy, P. T., Kelman, Z. Methods in Enzymology. Kelman, Z. 565, Academic Press. 27-44 (2015).
  59. Leiting, B., Marsilio, F., O'Connell, J. F. Predictable deuteration of recombinant proteins expressed in Escherichia coli. Analytical Biochemistry. 265, (2), 351-355 (1998).
  60. Perkins, S. J. Estimation of deuteration levels in whole cells and cellular proteins by 1H n.m.r. spectroscopy and neutron scattering. Biochemical Journal. 199, (1), 163-170 (1981).
  61. Obom, K. M., Magno, A., Cummings, P. J. Operation of a benchtop bioreactor. Journal of Visualized Experiments. (79), e50582 (2013).
  62. Duff, A. P., Wilde, K. L., Rekas, A., Lake, V., Holden, P. J. Methods in Enzymology. Kelman, Z. 565, Academic Press. 3-25 (2015).
  63. Haertlein, M., et al. Methods in Enzymology. Kelman, Z. 566, Academic Press. 113-157 (2016).
  64. Meilleur, F., Weiss, K. L., Myles, D. A. A. T Micro and Nano Technologies in Bioanalysis. Methods in Molecular Biology. 544, 281-292 (2009).
  65. Naing, S. -H., Oliver, R. C., Weiss, K. L., Urban, V. S., Lieberman, R. L. Solution structure of an intramembrane aspartyl protease via small angle neutron scattering. Biophysical Journal. 114, (3), 602-608 (2018).
  66. Training Requirements for First Time and Repeat Users. Available from: https://neutrons.ornl.gov/users (2018).
  67. Remote Analysis Cluster. Available from: https://analysis.sns.gov (2018).
  68. Franke, D., et al. ATSAS 2.8: A comprehensive data analysis suite for small-angle scattering from macromolecular solutions. Journal of Applied Crystallography. 50, (4), 1212-1225 (2017).
  69. Software Suite. Available from: https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html (2018).
  70. Software Individual Programs. Available from: https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/software.html (2018).
  71. Konarev, P. V., Volkov, V. V., Sokolova, A. V., Koch, M. H. J., Svergun, D. I. PRIMUS: A Windows PC-based system for small-angle scattering data analysis. Journal of Applied Crystallography. 36, (5), 1277-1282 (2003).
  72. Jacques, D. A., Trewhella, J. Small-angle scattering for structural biology-Expanding the frontier while avoiding the pitfalls. Protein Science. 19, (4), 642-657 (2010).
  73. Svergun, D. Determination of the regularization parameter in indirect-transform methods using perceptual criteria. Journal of Applied Crystallography. 25, (4), 495-503 (1992).
  74. Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution. Quarterly Reviews of Biophysics. 40, (3), 191-285 (2007).
  75. Svergun, D. I., et al. Protein hydration in solution: Experimental observation by x-ray and neutron scattering. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, (5), 2267-2272 (1998).
  76. Franke, D., Svergun, D. I. DAMMIF, a program for rapid ab-initio shape determination in small-angle scattering. Journal of Applied Crystallography. 42, (2), 342-346 (2009).
  77. Svergun, D. I. Restoring Low Resolution Structure of Biological Macromolecules from Solution Scattering Using Simulated Annealing. Biophysical Journal. 76, (6), 2879-2886 (1999).
  78. Jacques, D. A., Guss, J. M., Svergun, D. I., Trewhella, J. Publication guidelines for structural modelling of small-angle scattering data from biomolecules in solution. Acta Crystallographica Section D. 68, (6), 620-626 (2012).
  79. Heller, W. T., et al. The Bio-SANS instrument at the High Flux Isotope Reactor of Oak Ridge National Laboratory. Journal of Applied Crystallography. 47, (4), 1238-1246 (2014).
  80. Svergun, D. I., Koch, M. H. J. Small-angle scattering studies of biological macromolecules in solution. Reports on Progress in Physics. 66, (10), 1735 (2003).
  81. Johnson, J. L., Kalyoncu, S., Lieberman, R. L. Heterologous Expression of Membrane Proteins: Methods and Protocols. Mus-Veteau, I. Springer. New York. 281-301 (2016).
  82. Department of Energy Public Access Plan. Available from: http://energy.gov/downloads/doe-public-access-plan (2018).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics