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पुरुषों और महिलाओं से नादान साथियों के लिए अमेरिकी Trypanosomes का यौन संचरण

Immunology and Infection

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Summary

Chagas रोग के Trypanosoma cruzi एजेंट लंबे समय से स्थाई स्पर्शोन्मुख संक्रमण है कि अचानक नैदानिक मांयता प्राप्त विकृति में विकसित पैदा करता है । निंनलिखित अनुसंधान प्रोटोकॉल का वर्णन एक लघु आधारित महामारी विज्ञान के अध्ययन के लिए टी cruzi संक्रमण सुलझाना माता पिता से संतति के लिए यौन संचारित ।

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Almeida, A. B., Araújo, P. F., Bernal, F. M., Rosa, A. d., Valente, S. A., Teixeira, A. R. Sexual Transmission of American Trypanosomes from Males and Females to Naive Mates. J. Vis. Exp. (143), e57985, doi:10.3791/57985 (2019).

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Abstract

अमेरिकी trypanosomiasis दूषित भोजन की घूस के माध्यम से triatomine कीड़ों द्वारा मनुष्यों को प्रेषित किया जाता है, रक्त आधान या अकस्मात अस्पतालों और अनुसंधान प्रयोगशालाओं में द्वारा । इसके अलावा, Trypanosoma cruzi संक्रमण जन्मजात एक chagasic मां से उसके वंश के लिए फैलता है, लेकिन utero संदूषण में पुरुष साथी के योगदान अज्ञात है । amastigotes और अंडाशय के theca कोशिकाओं में trypomastigotes के घोंसले और झुरमुट के निष्कर्षों, goniablasts में और सेमिनीफेरस नलिकाओं के लुमेन में सुझाव है कि cruzi संक्रमण यौन संचारित कर रहे हैं । अनुसंधान प्रोटोकॉल के साथ एक परिवार के अध्ययन की जनसंख्या द्विगुणित रक्त mononuclear कोशिकाओं में और मानव विषयों के अगुणित gametes में दिखा परजीवी परमाणु डीएनए के परिणाम प्रस्तुत करता है । इस प्रकार, तीन स्वतंत्र जैविक नमूने एक वर्ष के अलावा एकत्र की पुष्टि की है कि cruzi संक्रमण यौन संतति को प्रेषित किया गया । दिलचस्प है, विशिष्ट cruzi एंटीबॉडी परिवार संतति के बहुमत है कि परजीवी प्रतिजन के लिए प्रतिरक्षा सहिष्णुता बोर में अनुपस्थित था । प्रतिरक्षा सहिष्णुता cruzi को चिकन दुर्दम्य में भ्रूण विकास के पहले सप्ताह के बाद प्रदर्शन किया गया था, और flagellate-inoculated अंडे से रची लड़कियों के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी उत्पादन करने में असमर्थ थे । इसके अलावा, मानव के वीर्य को जगाकर intraperitoneally या भोले चूहों की योनि में cruzi amastigotes, अधिवृषण, सेमिनीफेरस tubule, वॉज deferens और गर्भाशय ट्यूब में भड़काऊ की अनुपस्थिति के साथ झुकेंगे प्रजनन के प्रतिरक्षा विशेषाधिकार प्राप्त अंगों में प्रतिक्रियाओं । cruziके प्रजनन-संक्रमित पुरुष और मादा चूहों भोली साथियों के साथ संक्रमण के अधिग्रहण के परिणामस्वरूप, जो बाद में संतति को प्रेषित किया गया । इसलिए, एक मजबूत शिक्षा, सूचना और संचार कार्यक्रम है कि जनसंख्या और सामाजिक संगठनों शामिल Chagas रोग को रोकने के लिए आवश्यक समझा जाता है ।

Introduction

प्रोटोजोआ परजीवी Trypanosoma cruzi परिवार Trypanosomatidae से संबंधित trypomastigote और amastigote मेजबानों में जीवन चक्र के चरणों में आता है और कीट में स्तनधारी के रूप में मौजूद है-सदिश (epimastigotes: Reduviid) आंत और में axenic संस्कृति । हाल के दशकों में, कई अध्ययनों से पता चला है देशों में Chagas रोग की उपस्थिति चार महाद्वीपों पर माना जाता triatomine बग नि: शुल्क1,2,3,4,5, 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13; अमेरिकी trypanosomes के फैलाव शुरू में उत्तरी गोलार्द्ध के लिए लैटिन अमेरिकी आप्रवासियों के लिए जिंमेदार ठहराया गया था, लेकिन संभावना है कि कुछ Chagas रोग के autochthonous मामलों रहे है अब3से वंचित नहीं किया जा सकता है,4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14. cruzi संचरण का एकमात्र पहचानने योग्य अंतर्जात स्रोत गर्भधारण के लगभग 10% में वंश को परजीवी के chagasic माता के स्थानान्तरण को जिंमेदार माना गया है15; वीर्य बोल पड़ना के माध्यम से utero संक्रमणों में पुरुष साथी का योगदान अपरिचित रह गया है.

एक सदी से अधिक पहले, जांचकर्ताओं16,17 मनाया intracellular टी cruzi amastigotes अंडाशय की theca कोशिकाओं में और Chagas रोग के तीव्र मामलों के अंडकोष के रोगाणु लाइन कोशिकाओं में । cruzi trypomastigotes और अंडाशय के theca कोशिकाओं में amastigotes के घोंसले और झुरमुट, goniablasts में और सेमिनीफेरस नलिकाओं के लुमेन में (चित्रा 1) घातक तीव्र Chagas रोग के मामलों के अंगों में प्रतिरक्षा विशेषाधिकार विकसित भड़काऊ घुसपैठ18,19के अभाव में प्रजनन । हाल के दशकों में, कुछ प्रयोगात्मक अध्ययन सेमिनीफेरस tubule, अधिवृषण, और वॉज deferens के रूप में अच्छी तरह के रूप में गर्भाशय, ट्यूबों और अंडाशय में cruzi के दौर amastigote रूपों के घोंसले दिखाया है तीव्र संक्रमित चूहों की कोशिकाओं theca 1,20,21,22. इसके अलावा, परिवार के अध्ययन के पाठ्यक्रम में पैतृक Chagas रोगियों से उनके वंश के लिए प्रोटोजोआ mitochondrial डीएनए के हस्तांतरण दस्तावेज़, cruzi परमाणु डीएनए (nDNA) मानव अगुणित रोगाणु लाइन कोशिकाओं23में सत्यापित किया गया था, और परजीवी जीवन चक्र चरणों chagasic चूहों24के बोल पड़ना में मनाया गया । इन निष्कर्षों को विशिष्ट एंटीबॉडी1,25,26के अभाव में T. cruzi-संक्रमित मेजबान की संतति द्वारा प्राप्त प्रतिरक्षा सहिष्णुता पर रिपोर्टों के साथ समझौते में हैं । इसके अतिरिक्त, महामारी विज्ञान की रिपोर्ट है कि अंय महाद्वीपों के लिए स्थानिकमारी वाले Chagas रोग के प्रसार का सुझाव दिया3,4,5,6,7,8 ,9,10,11,12,13 अब प्रयोगात्मक अध्ययन दिखा रहा है कि Chagas रोग यौन 1 प्रेषित किया जा सकता द्वारा समर्थित है . वर्तमान जांच एक epidemiologic परिवार के अध्ययन प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है और पता चलता है कि cruzi संक्रमण संभोग द्वारा प्रचार करती है ।

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Protocol

मानव और पशु ब्रासीलिया विश्वविद्यालय के चिकित्सा संकाय के अनुसंधान समितियों मानव विषयों और प्रयोगशाला पशुओं के साथ सभी प्रक्रियाओं को मंजूरी दी, क्रमशः, अनुसंधान प्रोटोकॉल में २५००.१६७५६७ और 10411/2011 । सार्वजनिक फाउंडेशन अस्पताल Gaspar Vianna (प्रोटोकॉल n º 054/2009 और CONEP 11163/2009) की एथिक्स कमेटी ने मानव अनुसंधान पर स्वास्थ्य मंत्रालय (CONEP 2585/04) को विस्तार के साथ क्षेत्र अध्ययन के लिए मुक्त सहमति प्रपत्रों को मंजूरी दी । प्रोटोकॉल cruzi डीएनए का आकलन द्विगुणित रक्त mononuclear कोशिकाओं में और वीर्य बोल पड़ना के अगुणित gametes में समायोजित किया गया. प्रयोगशाला पशुओं मानव देखभाल प्राप्त; चूहों, बलिदान से पहले दिल पंचर के अधीन, संज्ञाहरण के तहत किया गया ।

1. मानव प्रतिभागियों की भर्ती

  1. यह सुनिश्चित करें कि शोध टीम Chagas रोगियों को स्वास्थ्य परिचर्या देने के लिए एक स्वास्थ्य प्रणाली Chagas रोग कार्यक्रम में भाग लेती है.
  2. कार्यक्रम में नामांकित परिवारों से भर्ती मानव प्रतिभागियों, बुखार, अस्वस्थता, सिर दर्द, क्षिप्रहृदयता, और शोफ, तीव्र Chagas रोग14के मुख्य नैदानिक लक्षण के साथ कम से एक मामला दिखा ।
  3. पांच साल की अवधि के लिए अध्ययन परिवारों में लोगों के लिए स्वास्थ्य देखभाल उद्धार ।
  4. तीन अवसरों पर अध्ययन प्रतिभागियों से शिरापरक रक्त की 15 मिलीलीटर प्राप्त करें एक साल के अलावा, तीन 5 मिलीलीटर aliquots में नमूना विभाजित है, और उंहें 4 डिग्री सेल्सियस पर रेफ्रिजरेटर में स्टोर ।
  5. वयस्क स्वयंसेवक परिवार के सदस्यों से वीर्य बोल पड़ना के 2 मिलीलीटर लीजिए और कदम ३.३ में वर्णित के रूप में आगे बढ़ना ।

2. परजीवी की वृद्धि

  1. १.४ कदम से aliquot का उपयोग कर, anticlotting सोडियम हेपरिन की 5 इकाइयों के साथ रक्त मिश्रण; एक्यूट Chagas रोग के निदान के साथ परिवार के प्रतिभागियों से रक्त की टीका द्वारा एक ढलान संस्कृति बनाओ ।
    1. Inoculate unclotted मानव रक्त की एक ५० मिलीलीटर पेंच कैप ट्यूब रक्त में 5 मिलीलीटर-आगर तिरछा प्लस जिगर अर्क के 5 मिलीलीटर-tryptose मध्यम (जलाया), और 3 महीने के लिए 27 डिग्री सेल्सियस पर एक शेखर में नमूना मशीन ।
    2. प्लेस १०० ग्लास स्लाइड के शीर्ष पर supernatant माध्यम के µ एल, स्लिप के साथ कवर और माइक्रोस्कोप के तहत रक्त टी cruzi epimastigotes के लिए खोज, हर चार सप्ताह.
    3. फसल epimastigote 27 डिग्री सेल्सियस पर axenic जलाया माध्यम के supernatant में अलग; पंजाब में कोशिकाओं पीएच ७.४ धो, 10 मिनट के लिए १,००० x g पर केंद्रापसारक; Dulbecco के संशोधित आवश्यक माध्यम (DMEM) के 5 मिलीलीटर में गोली में epimastigotes पतला ।
    4. Inoculate के साथ धाराप्रवाह L6 मांसपेशी सेल संस्कृति कुप्पी 1 x 106 ECI1-to-ECI21 T. cruzi epimastigote अलग ।
    5. ७५ मिलीलीटर संस्कृति कुप्पी में trypomastigotes मांसपेशी कोशिका संस्कृतियों में टी. cruzi ECI1-टू-ECI21 और Berenice आदर्श L6 बढ़ाएँ ।
    6. पीएच ७.४ पर DMEM के 15 मिलीलीटर के साथ फ़ीड कोशिकाओं 5% भ्रूण गोजातीय सीरम, १०० IU/एमएल पेनिसिलिन, १०० µ g/एमएल streptomycin, २५० एनएम एल glutamine, और 5% सह2 पर ३७ ° c1से पूरक ।
    7. ५.२ चरण में बताए गए अनुसार टिशू कल्चर से ECI1-टू-ECI21 अलग phenotype करने के लिए पॉजिटिव कंट्रोल टी. cruzi Berenice trypomastigotes का प्रयोग करें ।
    8. केवल 20% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक DMEM में नकारात्मक नियंत्रण Leishmania braziliensis27 बढ़ाएँ, और एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में परजीवी promastigotes का उपयोग करें.
    9. उपयोग 1 x 106 T. cruzi ECI1-to-ECI21 trypomastigotes सेल कल्चर से supernatant में चूहों को संक्रमित करने के लिए ।
    10. संक्रमण के पहले सप्ताह के बाद पूंछ रक्त में cruzi trypomastigotes के लिए खोजें ।
    11. दिल, कंकाल की मांसपेशी, और संक्रमित चूहों के प्रजनन अंगों, एक महीने के बाद के hematoxylin-eosin सना हुआ वर्गों में amastigotes के घोंसले खोजें ।

3. डीएनए निष्कर्षण और पीसीआर विश्लेषण

  1. एक बाँझ EDTA ट्यूब में रक्त (१.४ कदम) aliquot के 5 मिलीलीटर प्लेस, और ३,००० एक्स जीमें ४५ मिनट के लिए घनत्व ढाल केंद्रापसारक प्रदर्शन लाल कोशिकाओं के ऊपर सफेद चरण से mononuclear कोशिकाओं फसल के लिए एक पिपेट का प्रयोग करें, एक अलग 15 मिलीलीटर ट्यूब में दो बार पंजाब के 5 मिलीलीटर में व्हाइट कोशिकाओं को धोने, ७.४ पीएच, 10 मिनट के लिए १,५०० एक्स जी में केंद्रापसारक द्वारा, और डीएनए निष्कर्षण के लिए कोशिकाओं का उपयोग करें ।
  2. चुनाव आयोग से डीएनए को निकालें-1 से निर्वाचन आयोग-21 टी. cruzi, सकारात्मक नियंत्रण से Berenice टी cruzi, नकारात्मक नियंत्रण से braziliensis (कदम 2.1.8), और परीक्षण रक्त mononuclear कोशिकाओं से १०९ मानव परिवार के अध्ययन के विषयों1 , 27 , २८.
  3. पतला शुक्राणु DMEM में १.५ चरण में प्राप्त नमूनों की 2 मिलीलीटर (1:4, v/ 5% CO2 और ३७ ° c में ४५ मिनट के लिए मशीन, १३,००० एक्स जीमें 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक के बाद supernatant से शुक्राणु ठीक है, और अगुणित डीएनए निकालने23
  4. निष्कर्षण बफर में कोशिकाओं के 1 मिलीलीटर प्लेस (10 µ एम NaCl, 20 µ एम EDTA, 1% एसडीएस, ०.०४% proteinase-K, और 1% dithiothreitol), और मिश्रण से समाधान और मिलाते हुए ।
    1. १३,००० x g और 25 ° c पर 10 मिनट के लिए समाधान केंद्रापसारक, और एक स्पिन कॉलम के लिए चिपचिपा supernatant हस्तांतरण ।
    2. १०,००० x g पर 1 मिनट के लिए स्पिन कॉलम केंद्रापसारक और eluate त्यागें; स्पिन कॉलम (सामग्री की तालिका) के लिए ५०० µ एल बाइंडिंग बफर जोड़ें, यह 1 मिनट के लिए १२,००० x gपर केंद्रापसारक, और eluate त्यागें ।
    3. स्पिन कॉलम के लिए ६०० µ एल धोने बफर जोड़ें, यह 1 मिनट के लिए १२,००० x gपर केंद्रापसारक, और eluate त्यागें ।
    4. दोहराएं इस कदम दो बार, और एक बाँझ १.५ एमएल माइक्रो केंद्रापसारक ट्यूब के लिए स्पिन कॉलम हस्तांतरण ।
    5. ते बफर के १०० µ एल जोड़ें, 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ट्यूब मशीन, और फिर १२,००० एक्स जीमें 1 मिनट के लिए ट्यूब केंद्रापसारक microcentrifuge ट्यूब में बफर डीएनए होता है ।
    6. एक ०.८% agarose जेल पर aliquots चलाकर और एक spectrophotometer के साथ २६० एनएम पर अवशोषक पढ़ने के द्वारा डीएनए सांद्रता उपाय । पीसीआर विश्लेषण में उपयोग तक-20 डिग्री सेल्सियस पर डीएनए नमूनों की दुकान ।
  5. का प्रयोग करें cruzi Tcz1/2 प्राइमरों annealed विशिष्ट १८८-nt विशिष्ट telomere अनुक्रम जांच29 और परिवार के अध्ययन विषयों ' रक्त और शुक्राणु से डीएनए के साथ पीसीआर चलाने Berenice टी. cruzi सकारात्मक नियंत्रण से और L. braziliensis नकारात्मक नियंत्रण.
    1. 10 एनजी खाका डीएनए के साथ पीसीआर मिश्रण तैयार, प्राइमरों के प्रत्येक जोड़ी के ०.४ µ मीटर, 2 Taq डीएनए पोलीमरेज़ के यू, ०.२ µ एम dNTPs, और 15 µ एम MgCl2 में एक 25 µ एल अंतिम मात्रा ।
    2. 30 एस के लिए ९४ ° c पर डीएनए प्रवर्धन कार्यक्रम आरंभ करने के लिए टेंपलेट स्वभाव, और 30 एस के लिए ५५ डिग्री सेल्सियस के लिए नमूनों ठंडा । फिर, annealed प्राइमरों का विस्तार करने के लिए ९० एस के लिए ९४ डिग्री सेल्सियस पर नमूनों की मशीन । 30 एस के लिए ९४ ° c के लिए तापमान वापसी अगले चक्र शुरू करने के लिए, और नमूने एक अतिरिक्त ७२ डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट की मशीन । ३२एन डी चक्र के अंत में, कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए नमूनों को शांत, और 4 ° c29पर फ्रिज में उन्हें स्टोर.
    3. बढ़ाना एक T. cruzi डीएनए telomere दोहराने अनुक्रम annealed Tcz1/2 प्राइमरों पर दोनों अतिवादियों ।
    4. एक १.३% agarose जेल पर प्रवर्धन उत्पादों का विश्लेषण और एक यूवी प्रकाशक पर १८८-nt डीएनए बैंड का पालन ।

4. दक्षिणी संकरण

नोट: दक्षिणी संकरण agarose जेल में झूठी सकारात्मक पीसीआर amplicons के अधिकांश त्यागने के लिए इस्तेमाल किया गया था ।

  1. अनसंक्रमित नियंत्रणों से पीसीआर प्रवर्धन उत्पादों विषय, Chagas मामले सकारात्मक नियंत्रण से, १०९ के परीक्षण के नमूनों से द्विगुणित डीएनए और 21 अध्ययन परिवार प्रतिभागियों के अगुणित डीएनए से दक्षिणी hybridizations करने के लिए.
  2. cruzi १८८-nt डीएनए-विशिष्ट telomere अनुक्रम जांच annealed Tcz1/2 प्राइमरों के लिए रोजगार; जांच को लेबल [α-३२P] 2 ' के साथ-deoxyadenosine ट्राइफॉस्फेट (dATP) एक यादृच्छिक प्राइमर लेबलिंग किट का उपयोग कर, और एक १.३% agarose जेल पर ६० V रात में 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रवर्धन उत्पादों का विश्लेषण ।
  3. एक सकारात्मक चार्ज नायलॉन झिल्ली रात भर केशिका विधि का उपयोग करने के लिए जेल स्थानांतरण ।
  4. संकरण डीएनए radiolabeled १८८-nt जांच के साथ नायलॉन झिल्ली को हस्तांतरित बैंड है, जो जीनोमिक डीएनए के 25 µ एल में पर्यावरणR1 पचा बाइंड कर देता है चर अवधि के लिए एंजाइम विशेष बफर ।
  5. 2x एसएससी और ०.१% एसडीएस के साथ ६५ डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए दो बार झिल्ली धो लो ।
  6. नायलॉन झिल्ली के लिए एक्स-रे फिल्मों का पर्दाफाश और एक सप्ताह के लिए झिल्ली पर बैंड autoradiograph ।
  7. cruzi पीसीआर प्रवर्धन उत्पादों, जो विशिष्ट radiolabeled डीएनए जांच के साथ संकर रहे है के साथ पीसीआर और दक्षिणी संकरण से चयनित क्लोन हो जाना ।
  8. वाणिज्यिक अनुक्रम Tcz1/2 प्राइमरों के लिए annealed सेट का उपयोग कर क्लोन टी cruziविशिष्ट telomere पदचिह्न2,23

5. प्रतिरक्षा की परख

नोट: की संवेदनशीलता और विशिष्टता अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस (IIF) और एंजाइम से जुड़े immunosorbent परख (एलिसा) के छह Chagas रोगियों से सीरम में मूल्यांकन किया गया प्रत्यक्ष parasitemia और छह Chagas से मुक्त, अज्ञात सीरम बैंक के नमूने लिए । पंजाबियों में डबल सीरम कमजोर पड़ने के साथ आयोजित की परख, पीएच ७.४, पता चला कि 1:100 कमजोर पड़ने पर IIF और एलिसा ऑप्टिकल घनत्व (ODs) ०.१५० में और ऊपर नकारात्मक परिणामों से सकारात्मक अलग ।

  1. 1 एच के लिए कमरे के तापमान पर रखा unclotted रक्त aliquot (चरण १.४) के 5 मिलीलीटर का उपयोग करें, और supernatant में सीरम अलग करने के लिए 30 मिनट के लिए १,५०० x g पर यह केंद्रापसारक ।
  2. प्रदर्शन IIF और एलिसा तपसिल 1:100 सीरम कमजोर पड़ने के लिए टी. cruzi और एल braziliensis एंटीजन का पता लगाने के रूप में पहले28वर्णितहै ।
  3. Iif
    1. १०९ अध्ययन विषयों के नमूने के तीन अवसरों पर एक साल के अलावा प्राप्त की तपसिल सीरम कमजोर पड़ने में IIF परख आचरण ।
    2. 5 µ l का formalin 1%-स्वास्थ्यकर्मी T. cruzi epimastigotes या l. braziliensis promastigotes ग्लास स्लाइड पर रखें; चलो परजीवी कमरे के तापमान पर एक डाकू में रातोंरात सूखी और ग्लास स्लाइड की दुकान पर-20 ° c उपयोग तक ।
    3. जगह 20 µ एल रोगियों के सीरम कमजोर पड़ने के शीर्ष पर ग्लास स्लाइड के साथ लेपित 5 µ l के formalin-मारे गए (10 परजीवी/µ l) T. cruzi epimastigotes or l. braziliensis promastigotes.
    4. ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक नम कक्ष में 1 ज के लिए एक पर्ची के साथ कवर गिलास स्लाइड गर्मी और पंजाबियों के साथ तीन बार धो ।
    5. ३७ डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए मानव आईजीजी के लिए एक fluorescein-लेबल खरगोश एंटीबॉडी (सामग्री की तालिका) के एक 1:1000 कमजोर पड़ने के साथ हवा-सूखे गिलास स्लाइड की मशीन; स्लाइड को धोकर सुखा लें ।
    6. एक कवर पर्ची के साथ स्लाइड माउंट और यह एक यूवी प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत की जांच ।
      नोट: एक सकारात्मक परीक्षा एक सेब ग्रीन टी cruzi epimastigote सिल्हूट, वीडियो में दिखाया गया है ।
  4. एलिसा
    1. cruzi और एल braziliensis घुलनशील एंटीजन का पता लगाने के लिए एक एलिसा भागो (1 µ g/100 µ एल में ०.१ मीटर कार्बोनेट बफर, लेपित microplate कुओं पर पीएच ९.६) ।
    2. कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए तपसिल लेपित कुओं में 1:100 सीरम कमजोर पड़ने की मशीन ।
    3. PBST के साथ तीन बार प्लेटें धो लें (०.५% के बीच-20), पीएच ७.४, सुखाने से पहले समाधान ।
    4. एक 1 के ५० µ एल के साथ प्लेट्स की मशीन: 1000 के कमजोर पड़ने के लिए खरगोश विरोधी मानव आईजीजी एंटीबॉडी ३७ डिग्री सेल्सियस पर ९० मिनट के लिए ।
    5. PBST समाधान के साथ तीन बार प्लेटें धोने और उन्हें कमरे के तापमान पर शुष्क करने के लिए अनुमति देते हैं ।
    6. 1 के १०० µ एल के साथ प्लेटें: क्षारीय फॉस्फेट के 1000 कमजोर पड़ने-संयुग्मित बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी (सामग्री की मेज) ३७ डिग्री सेल्सियस पर ९० मिनट के लिए ।
    7. PBST के साथ तीन बार प्लेट धोने, सब्सट्रेट पी नाइट्रो फिनाइल फॉस्फेट जोड़ें, और रंग के विकास के लिए प्रतीक्षा करें ।
    8. एक बहुपद्वति प्लेट रीडर में ६३० एनएम पर ODs पढ़ें ।
    9. अध्ययन आबादी से परीक्षण सीरम के तपसिल कमजोर पड़ने भागो और ODs के लिए विशिष्ट टी. cruzi एंटीबॉडी titers की पहचान की साजिश ।

6. प्रतिरक्षा सहिष्णुता का आकलन

नोट: एक चिकन मॉडल प्रणाली भ्रूण विकास के पहले सप्ताह के बाद टी cruzi संक्रमणों का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था ।

  1. Inoculate चिकन उपजाऊ अंडे के साथ 100/10 µ एल टी cruzi trypomastigotes ऊतक संस्कृति माध्यम से काटा; inoculate 10 cruzi trypomastigotes प्रति µ एल संस्कृति माध्यम के साथ नकली नियंत्रण अंडे । टेप के साथ छेद सील ।
  2. 20 टी cruzi-संक्रमित अंडे और ३७ डिग्री सेल्सियस पर नकली नियंत्रण उपजाऊ अंडे की एक बराबर संख्या और 21 दिनों के लिए ६५% आर्द्रता ।
  3. लड़कियों कि 24 घंटे के लिए मशीन में हैच रखो और उसके बाद, तीन सप्ताह के लिए तापमान नियंत्रण के साथ डाकू में ३२ डिग्री सेल्सियस पर ।
  4. cruzi से रचा लड़कियों -inoculated अंडे और नकली नियंत्रण अंडे से 24 डिग्री सेल्सियस में एक सकारात्मक हवा के दबाव कमरे में वयस्क चरण के लिए, अलग गलियारों में रखा व्यक्तिगत पिंजरों में बढ़ो ।
  5. सभी वयस्क लड़कियों को चुनौती 107 formalin-मारे गए trypomastigotes के साथ उंर के छह महीने में तीन बार चमड़े का इंजेक्शन, साप्ताहिक, वीडियो में योजना के अनुसार ।
  6. cruzi-inoculated अंडे से रची मुर्गियों के एक पंख नस से और नकली नियंत्रण से पिछले प्रतिरक्षण के बाद सीरम प्राप्त करने के लिए चार सप्ताह से आकर्षित रक्त ।
  7. के रूप में प्रोटोकॉल के चरण 5 में वर्णित IIF और एलिसा द्वारा विशिष्ट टी. cruzi एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए चिकन सीरम का उपयोग करें ।

7. Chagas मरीजों के वीर्य बोल पड़ना से cruzi के साथ चूहों का संक्रमण

  1. एक वयस्क पीसीआर + Chagas रोग रोगी (चरण १.५) से और एक वयस्क पीसीआर-Chagas से मुक्त व्यक्ति से वीर्य बोल पड़ना का उपयोग करें ।
  2. १२ १ महीने पुराने बालब/सी भोली चूहों के दो समूहों का प्रयोग करें 24 डिग्री सेल्सियस और फेड खाद्य विज्ञापन libitumमें सकारात्मक हवा के दबाव के तहत डाकू में रखा ।
  3. मानव Chagas-सकारात्मक वीर्य aliquots (१०० µ एल) को योनि में और बराबर मात्रा में समूह-एक चूहों के रूप में पैदा करते हैं ।
  4. नियंत्रण Chagas-मुक्त वीर्य aliquots (१०० µ एल) और एक बराबर मात्रा में समूह-बी चूहों की योनि में ।
  5. hematoxylin के साथ धुंधला करने के लिए संज्ञाहरण के तहत प्रयोगात्मक चूहों पांच सप्ताह के वीर्य जगाकर और विषय ऊतक वर्गों बलिदान ।
  6. दिल, कंकाल की मांसपेशी, और चूहों के समूहों में प्रजनन अंगों में cruzi trypomastigotes और amastigotes के लिए खोज करने के लिए माइक्रोस्कोपी का प्रयोग करें ।

8. समागम द्वारा टी. cruzi संक्रमण का संचरण

  1. प्रयोगों में 10 नर और मादा छह सप् ताह पुरानी बालब/सी चूहों का प्रयोग करें ।
  2. टिशू कल्चर से Inoculate पांच नर और पांच मादा चूहे intraperitoneally 1 x 105 टी के साथ cruzi trypomastigotes ।
  3. उम्र के तीन महीने तक चूहों को नस्ल: समूह मैं पांच टी. cruzi-संक्रमित मादा चूहों और पांच नियंत्रण संक्रमित पुरुष साथियों द्वारा गठित किया जाएगा; ग्रुप द्वितीय में पांच टी. cruzi-संक्रमित पुरुष तथा पांच नियंत्रण संक्रमित महिला साथियों का गठन किया जाएगा । ग्रुप III में पांच पुरुष और पांच महिला कंट्रोल भोले अनसंक्रमित साथियों का गठन किया जाएगा ।
  4. घर एक पिंजरे में एक 5 मिमी ग्रिड और ताला के साथ एक सुरक्षित बॉक्स के अंदर रखा के लिए भागने को रोकने के लिए प्रजनन जोड़ी ।
  5. चूहे चाउ और पानी विज्ञापन libitum फ़ीड । समूह द्वितीय में ७० प्रातः और मैं के लिए कुल बढ़ा छह सप्ताह के लिए ।
  6. संज्ञाहरण के तहत माता पिता (फो) और संतति (F1) चूहों से दिल पंचर द्वारा रक्त ड्रा, चूहों बलिदान, और दिल के वर्गों प्रस्तुत, कंकाल की मांसपेशी, और रोग विश्लेषण के लिए प्रजनन अंगों.

9. प्रतिरक्षा विशेषाधिकार का मूल्यांकन

  1. cruziसे ऊतकों को प्राप्त संक्रमित और भोली नियंत्रण चूहों (चरण ८.६), और 4 µm मोटी वर्गों में तेल-एंबेडेड नमूनों में कटौती ।
  2. आयल निकालें और xylene के कई परिवर्तनों के साथ कांच स्लाइड पर वर्गों निर्जलीकरण और १००% से ७०% इथेनॉल के साथ वर्गीकृत बहाकर, 1 मिनट के लिए प्रत्येक ।
  3. ०.०५% saponin एक बार के साथ ऊतक वर्गों की मशीन, कमरे के तापमान पर तीन आसुत पानी बहाकर द्वारा पीछा किया ।
  4. 5% नोनफेट पाउडर दूध के साथ ऊतक वर्गों ब्लॉक ४५ मिनट के लिए ०.१ मीटर PBST में स्लाइड धो और Chagas माउस विरोधीcruzi सीरम के साथ या नियंत्रण संक्रमित माउस सीरम के साथ वर्गों के लिए एक 1:20 कमजोर पड़ने पर 2 एच ।
  5. PBST में 5 मिनट और सूखी एक 1 के साथ मशीनीकरण से पहले कमरे के तापमान पर सूखे के लिए तीन बार स्लाइड धो-क्षारीय फॉस्फेट के 1000 कमजोर पड़ने-संयुग्मित खरगोश विरोधी माउस आईजीजी ।
  6. PBST में स्लाइड कुल्ला और 3 के १०० µ एल जोड़ें, एक 5 मिनट की मशीन के लिए 3 ' diaminobenzidine, PBST और counterstaining के साथ तीन बहाकर द्वारा पीछा किया 30 एस के लिए हैरिस hematoxylin के साथ ।
  7. 5 मिनट के लिए आसुत जल में स्लाइड धो, उंहें ७०%, ८०%, ९०%, और 1 मिनट के लिए १००% इथेनॉल में निर्जलीकरण, और उंहें बफर ग्लिसरीन में माउंट ।
  8. एक उज्ज्वल क्षेत्र प्रकाश माइक्रोस्कोप के साथ स्लाइड की जांच करें, और सॉफ्टवेयर और एक विश्लेषक कार्यक्रम के साथ एक microcamera के साथ फोटो छवियों पर कब्जा ।
  9. प्रजनन अंगों में भड़काऊ प्रतिक्रियाओं के अभाव में परजीवी के प्रतिरक्षा विशेषाधिकार दस्तावेज़ ।

10. सांख्यिकीय विश्लेषण

  1. अनुक्रम विश्लेषण के लिए जैव चिकित्सा संपादन का उपयोग करें, विस्फोट के साथ संरेखण प्रदर्शन, और ई-मान सांख्यिकीय महत्व (p < ०.०५) का निर्धारण ।
  2. एक-तरफ़ा विश्लेषण प्रसरण (ANOVA) और Tukey परीक्षण के लिए तुलना करने के लिए ओडी का अर्थ है प्लस या शून्य मानक विचलन ।

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Representative Results

इस अनुसंधान, प्रोटोकॉल के अनुसार आयोजित, नैदानिक और parasitological परीक्षा द्वारा Chagas रोग के तीव्र मामलों का पता लगाने के उद्देश्य से । शिरापरक रक्त के नमूनों प्रत्यक्ष सूक्ष्म परीक्षा और इन विट्रो संस्कृति में परजीवी विकास के लिए अधीन थे । Chagas रोग के इक्कीस गंभीर मामलों में रक्त में cruzi टी दिखाई दी । अनुसंधान प्रोटोकॉल cruzi ECI1 के अलगाव को सुरक्षित-तीव्र Chagas रोग से ECI21 करने के लिए, और डीएनए नमूने अध्ययन जनसंख्या के शेष में सकारात्मक डीएनए पदचिह्नों का प्रदर्शन: nDNA-पीसीआर परख ठेठ telomere दोहराने अनुक्रम झुकेंगे साथ १८८-nt बैंड वर्तमान के रूप में के रूप में अच्छी तरह से cruzi Berenice आदर्श1। Chagas मामलों और उनके परिवार के सदस्यों को जो अध्ययन में भाग लेने के लिए स्वेच्छा से चार परिवारों में बांटा गया1

इस परिवार के अध्ययन में, टी cruzi nDNA 21 तीव्र Chagas रोग के मामलों में से प्रत्येक से विशिष्ट telomere अनुक्रम को प्राइमर सेट1,23 annealed के साथ परिवर्धित पीसीआर था । इन T. cruzi nDNA amplicons विशिष्ट radiolabeled अनुक्रम जांच (चित्रा 2) के साथ संकर; क्लोनिंग और sequencing amplicons cruzi १८८-nt telomere दोहराने आकृति शामिल है कि पता चला । इन संकरण प्रक्रियाओं की विशिष्टता एल braziliensis promastigotes के साथ प्रदर्शन नकारात्मक नियंत्रण में दिखाया गया था । विकृति विश्लेषण पुष्टि की है कि तीव्र Chagas रोग रोगियों में hemoflagellates सही मायने में विषमय टी cruzi थे । हम निष्कर्ष है कि टी cruzi nDNA (१८८-बीपी) बैंड 21 एक्यूट Chagas मामलों में पाया (चित्रा 2) लगातार संक्रमण का एक सीधा प्रदर्शन है ।

मनुष्यों में Trypanosoma cruzi का यौन संचरण

cruzi संक्रमण के अनुपात का मूल्यांकन करने के लिए, हम परिवार के अध्ययन जनसंख्या1में परजीवी पदचिह्नों के उच्च संवेदनशीलता का पता लगाने के लिए न्यूक्लिक एसिड परीक्षण लागू किया । इन पीसीआर परख में, प्रवर्धन उत्पादों है कि विशिष्ट radiolabeled १८८-nt जांच के साथ संकर परीक्षण नमूनों की ७६.१% (83/109) में nDNA बैंड का गठन; विशिष्ट १८८-nt radiolabeled जांच के साथ nDNA-पीसीआर प्रवर्धन उत्पादों के दक्षिणी संकरण के परिणाम चित्रा 3में दिखाए गए हैं । इसके अलावा, hybridizations स्वयंसेवक परिवार के सदस्यों (चित्रा 4) के रोगाणु कोशिका लाइन में परजीवी डीएनए दिखाया ।

IIF में cruzi के trypomastigotes प्रदर्शन के साथ एक आईजीजी रोग सीरम बैंक के नमूने से मानव सीरम Chagas के साथ ECI21 T. parasitological प्रोटोजोआ करने के लिए ECI1 को phenotype करने के लिए नियोजित किया गया था, और एक fluorescein संयुग्मित विरोधी मानव आईजीजी इस्तेमाल किया गया था . T. cruzi Berenice Chagas एंटीबॉडी के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण था, और नकारात्मक नियंत्रण अपने परिवार के रिश्तेदार एल promastigoteके braziliensis था । चित्रा 5 से पता चलता है कि Berenice मूलरूप के सकारात्मक सेब-हरी सिल्हूट जंगली प्रकार cruzi वीडियो में दिखाया लिफाफा के साथ संबद्ध ।

एलिसा और IIF विशिष्ट टी cruzi एंटीबॉडी1,२८.४% में28 (31/109) परीक्षण के नमूनों का पता चला । एलिसा और IIF के परिणामों के साथ ही nDNA-पीसीआर amplicon और दक्षिणी hybridizations से उन लोगों के रूप में, चित्रा 6में रची गई हैं । nDNA के परिणामों के बीच विसंगति-पीसीआर पैरों के निशान और विशिष्ट एंटीबॉडी परख से उन heredograms में चित्रित कर रहे है (चित्रा 7), परिवार के एक, चार विषयों था सकारात्मक nDNA और विरोधीटी cruzi एंटीबॉडी, और 11 था केवल सकारात्मक nDNA; पाँच नर वीर्य बोल पड़ना में cruzi था. ४४ लोगों के साथ परिवार बी में, 11 विशिष्ट टी. cruzi एंटीबॉडी था, और 23 दोनों विशिष्ट एंटीबॉडी और परजीवी nDNA था; सात व्यक्तियों के वीर्य बोल पड़ना में cruzi था. परिवार के सी 29 सदस्यों के साथ एंटीबॉडी और पांच व्यक्तियों में टी cruzi nDNA था, और 17 अकेले परजीवी nDNA था; चार नर वीर्य बोल पड़ना में nDNA-पीसीआर पॉजिटिव था । परिवार डी में, 21 विषयों के अलावा, 11 विशिष्ट विरोधीcruzi एंटीबॉडी और nDNA पदचिह्न था, और नौ सकारात्मक nDNA-पीसीआर अकेले था । चित्रा 3, चित्रा 6 और चित्रा 7 परिणाम के बीच व्यापक विसंगतियों को दर्शाती है, लगातार, जैविक नमूनों में परिवार के विषयों से प्राप्त तीन स्वतंत्र प्रयोगों में एक वर्ष के अलावा चलाते हैं ।

तालिका 1 मानव अध्ययन परिवारों से नमूनों में IIF, एलिसा, और nDNA-पीसीआर परख के बीच मात्रात्मक अंतर दिखाता है A-to-D । एंटीबॉडी परख के अनुपात के बीच विसंगतियों (२८.४%) और सकारात्मक न्यूक्लिक एसिड परख (७६.१%) के उन सांख्यिकीय महत्वपूर्ण है (पी < ०.००५) । इन परिवारों में, cruzi के समूहों के बीच मतभेद -संक्रमित लोगों (III और IV) जनसंख्या के ६२.६% (52/83) के लिए खाते, एक सकारात्मक न्यूक्लिक एसिड अकेले परीक्षण दिखा । सकारात्मक nDNA पैरों के निशान और विशिष्ट cruzi एंटीबॉडी के उन के अनुपात के बीच व्यापक विसंगतियों चिकन मॉडल प्रणाली में किए गए प्रयोगों द्वारा समझाया गया ।

प्रतिरक्षा सहिष्णुता

-मुर्गियों के समूहों में आयोजित प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन अलग से भोले नियंत्रण मुर्गियों युक्त गलियारों में व्यक्तिगत पिंजरों में वयस्क मंच के लिए उठाया (ए); नकली नियंत्रण मुर्गियों से रची अंडे inoculated संस्कृति माध्यम के साथ (ख); और मुर्गे ने टी. cruzi trypomastigotes से रची-inoculated अंडे (C)26. समूह बी और सी में वयस्क मुर्गियों formalin-मारे गए टी cruzi trypomastigote प्रतिजन, साप्ताहिक, के रूप में वीडियो में दिखाया गया के साथ तीन बार चुनौती दी थी । एलिसा और IIF परख समूह ए, बी और सी मुर्गियों एक महीने के चैलेंज के बाद से एकत्र सीरम के साथ चला रहे थे । चित्रा 8 समूह ए और सी मुर्गियों, जो cruzi प्रतिजन के साथ समूह बी प्रतिरक्षित में विशिष्ट एंटीबॉडी उत्पादन के साथ तेजी से विषम में विशिष्ट एंटीबॉडी की अनुपस्थिति से पता चलता है । परिणाम स्पष्ट रूप से टी. cruzi-inoculated अंडे से रचा समूह सी में प्रतिरक्षा सहिष्णुता दिखाया ।

का यौन संचरण प्रयास करें एक माउस मॉडल प्रणाली में panosoma cruzi

इसके अलावा, एक Chagas रोगी के बोल पड़ना से cruzi के infectivity, जो पीसीआर में सकारात्मक परीक्षण किया और विशिष्ट एंटीबॉडी का अभाव है , पुरुष चूहों की µ गुहा में वीर्य के १०० पेरिटोनियल एल के जगाती के माध्यम से प्रदर्शन और एक के माध्यम से था वीर्य की बराबर मात्रा योनि में जगाकर. पांच सप्ताह बाद, cruzi amastigote घोंसले दिल और कंकाल की मांसपेशियों में पाया गया, और अंतर परजीवी के झुरमुट वॉज deferens और गर्भाशय ट्यूब के लुमेन में मौजूद थे. दिलचस्प है, विनाशकारी भड़काऊ प्रतिक्रियाओं cruzi amastigotes (चित्रा 9) के घोंसले और झुरमुट के चारों ओर नहीं था ।

cruzi संक्रमण के यौन संचरण का आकलन आगे चूहों inoculated intraperitoneally के दो समूहों में आयोजित किया गया था 1 एक्स 105 टी के साथ . cruzi Berenice trypomastigotes प्रपत्र1,30, 31. प्रयोगात्मक समूह में मैं, 10 cruzi-संक्रमित नर 10 भोली नियंत्रण महिला चूहों के साथ मेट । प्रयोगात्मक समूह द्वितीय में, 10 cruzi-संक्रमित महिलाओं 10 भोली नियंत्रण पुरुषों के साथ मेट । चित्रा 10 से पता चलता है कि टी. cruzi-संक्रमित नर चूहे (ए-टू-ई) और टी. cruzi-संक्रमित मादा चूहे (F-to G) झुकेंगे १८८-बीपी nDNA बैंड्स (विषम संख्या) । प्रजनन के बाद, भोली साथियों (यहां तक कि संख्या) आसानी से एक chagasic मेट के साथ एक अनूठा यौन मुठभेड़ के बाद cruzi का अधिग्रहण किया । इसी तरह दोहराने के प्रयोगों के तहत किया समान शर्तों की पुष्टि की है कि प्रत्येक भोली महिला या पुरुष माउस है कि यौन एक टी. cruziके साथ साथी-संक्रमित पुरुष या महिला flagellate संक्रमण हासिल की । ये nDNA-पॉजिटिव फाउंड्री (F0) संतति उत्पन्न करते हैं जिन्हें उन्होंने छह सप्ताह की आयु तक उठाया. फिर, परीक्षण और नियंत्रण संक्रमित चूहों दिल पंचर के माध्यम से खून की लगभग ०.५ मिलीलीटर इकट्ठा करने के लिए लहूलुहान थे । nDNA-पीसीआर परख पता चला है कि संस्थापकों ' (F0) यौन अधिग्रहण संक्रमण F1 संतान को प्रेषित किया गया, के रूप में १८८-बीपी nDNA बैंड (11 अंक) द्वारा दिखाया गया है । F1 संतति थे nDNA-पॉजिटिव के ४१ में ७० (५८.६%) नमूनों की जांच की । nDNA के साथ इन चूहों के ऊर्ध्वाधर अधिग्रहण संक्रमण के विचारोत्तेजक बैंड, के रूप में कुछ के रूप में ४१ के 9 (22%) cruzi एंटीबॉडी था ।

F1 संतान चूहों संज्ञाहरण के तहत बलिदान किया गया था, और शरीर के ऊतकों रोग और प्रतिरक्षा peroxidase-धुंधला विश्लेषण के अधीन थे । इन प्रयोगों के परिणाम चित्रा १२में दर्शाए गए हैं. T. cruzi amastigotes के लिए परिणाम अधिवृषण के मध्यवर्ती कक्षों में और goniablasts में दर्ज़ किए गए थे; trypomastigotes में अंतर amastigotes भड़काऊ प्रतिक्रियाओं के अभाव में सेमिनीफेरस नलिकाओं के लुमेन में मौजूद थे ।

Figure 1
चित्रा 1 . Trypanosoma cruzi एक्यूट Chagas रोग से मरने वाले एक लड़के की सेमिनीफेरस tubule में इंफेक्शन . Microphotograph से डॉक्टर Teixeira की फाइल, १९७०18. cruzi रूपों goniablasts में हैं, और amastigotes और मुक्त trypomastigotes (तीर) के झुरमुट में मौजूद हैं सेमिनीफेरस tubule के लुमेन में भड़काऊ घुसपैठ के अभाव में1. Hematoxylin-eosin दाग । बार, 20 µएम प्रकाशक और1,19लेखकों से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित ।

Figure 2
चित्रा 2 . एक्यूट Chagas रोग से Trypanosoma cruzi के पदचिह्न. cruzi nDNA-पीसीआर प्रवर्धन उत्पादों का गठन १८८ एक विशिष्ट radiolabeled १८८-nt जांच के साथ nt बैंड । टीसी, टी. cruzi; नेकां, नकारात्मक नियंत्रण । प्रकाशक और लेखक1से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 . मानव अध्ययन परिवारों के विषयों में Trypanosoma cruzi संक्रमणों का दक्षिणी सोख्ता विश्लेषण । परिवार A-सभी 15 विषयों विशिष्ट nDNA-पीसीआर १८८-nt बैंड दिखाया । परिवार बी में, ४३ विषयों में से ३५ की कुल (८१.४%) विशिष्ट nDNA बैंड का गठन किया । परिवार के सी में, 29 सदस्यों के बीच, 22 (७५.८%) nDNA बैंड का गठन किया । परिवार डी में, 21 विषयों में से 11 (५२.४%) nDNA बैंड था । टी. cruzi-विशिष्ट nDNA बैंड क्लोनिंग और अनुक्रमण द्वारा पुष्टि की गई । प्रकाशक और लेखक1से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 . को सक्रिय Trypanosoma cruzi वीर्य में संक्रमण अध्ययन परिवार के स्वयंसेवकों से बोल पड़ना. Chagas रोगियों ' बोल पड़ना में संक्रमण nDNA-पीसीआर १८८-बीपी बैंड की पहचान की । टीसी, cruzi सकारात्मक नियंत्रण । नेकां, एल braziliensis नकारात्मक नियंत्रण । प्रकाशक और लेखक1से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5 . के phenotype को Trypanosoma cruzi Chagas रोग रोगियों के सीरम एंटीबॉडी के साथ । cruzi Chagas सीरम आईजीजी एंटीबॉडी के साथ की पहचान की है कि एक trypomastigote-लेबल FITC एबी विरोधी मानव मोनोक्लोनल के साथ इलाज आईजीजी परजीवी पहचानता है । विरोधीटी. cruzi एबी को Leishmania braziliensis promastigotes नहीं पहचानता । प्रीसेट नकारात्मक नियंत्रण दिखाते हैं । सलाखों, 20 µm. प्रकाशक और लेखक1से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए । 

Figure 6
चित्रा 6 . एलिसा और nDNA के ग्राफिक प्रतिनिधित्व-परिवार के अध्ययन की आबादी में पीसीआर परख । समूह I (n = 10) और समूह II (n = 20) नकारात्मक नियंत्रण और सकारात्मक नियंत्रण सीरा, क्रमशः cruzi से parasitological प्रदर्शन के साथ संक्रमण थे । समूह III (n = 31) १८८-बीपी nDNA बैंड और cruziके लिए विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ परिवार के विषयों से नमूने शामिल हैं । समूह IV (n = 52) विशिष्ट एंटीबॉडी के अभाव में nDNA-पीसीआर १८८-nt amplicons द्वारा पता लगाए गए T. cruzi संक्रमण के साथ विषयों से नमूना शामिल । समूह V (n = 26) नकारात्मक परीक्षण परिवार के अध्ययन में संक्रमण से मुक्त लोगों को शामिल नमूने थे । प्रकाशक और लेखक1से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्र 7 . heredograms और मैपिंग Trypanosoma cruzi- संक्रमित परिवार की आबादी । यह आंकड़ा एंटीcruzi एंटीबॉडी और nDNA-पीसीआर की उन परख के अनुपात के बीच विसंगतियों को दर्शाता है । खुला वर्ग और चक्र, नकारात्मक पुरुष और महिला । लाल चौकों और हलकों, सकारात्मक विरोधीटी cruzi एंटीबॉडी और nDNA-पीसीआर । काले चौकों और हलकों, सकारात्मक nDNA-अकेले पीसीआर । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए । 

Figure 8
चित्र 8 . मुर्गियों में प्रतिरक्षा सहिष्णुता से रची Trypanosoma cruzi- inoculated अंडे । एक) नकली नियंत्रण मुर्गियों में प्रतिरक्षा एंटीबॉडी प्रोफ़ाइल (एन = 10). ख) cruzi प्रतिजन (एन = 20) के साथ चुनौती दी भोली नियंत्रण मुर्गियों में विशिष्ट एंटीबॉडी प्रतिक्रिया । ग) टी. cruzi प्रतिजन (एन = 20) के साथ चुनौती के बाद cruzi-inoculated अंडे से रची मुर्गियों में एक विशिष्ट प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के अभाव । एक और सी के बीच ऑप्टिकल घनत्व अंतर (024 ± ०.१७) बी की ओर (०.८५ ± ०.६) सांख्यिकीय महत्वपूर्ण है (p < 0.05). यह आंकड़ा संदर्भ26 से संशोधित किया गया है और प्रकाशक और लेखक की अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित है ।

Figure 9
चित्र 9 . मानव बोल पड़ना में संक्रामक Trypanosoma cruzi एक सक्रिय murine संक्रमण में तब्दील हो जाती है । Chagas रोगी बोल पड़ना के Aliquots पेरिटोनियल गुहा में या चूहों की योनि में जगाकर थे । चूहों को जगाकर तीन सप्ताह बाद बलि दी गई. शीर्ष लेन, cruzi amastigotes दिल में घोंसले (बाएं) और कंकाल की मांसपेशी में (सही) । नीचे लेन, cruzi amastigote वॉज deferens में घोंसले (बाएं) और गर्भाशय ट्यूब (सही) में । सम्मिलित करें एक विभाजन amastigote (वृत्त) दिखाता है । ऊतक वर्गों में भड़काऊ घुसपैठ के अभाव की सूचना । Hematoxylin-eosin दाग । सलाखों: ऊपर और नीचे बाएं, 20 µm; नीचे दाईं ओर, 10 µm. प्रकाशक और लेखक1से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 10
चित्र 10 . के यौन संचरण Trypanosoma cruzi संभोग द्वारा माउस मॉडल प्रणाली में संक्रमण । chagasic से भोले साथियों के लिए cruzi संक्रमण के संचरण विशिष्ट nDNA १८८-बीपी बैंड दक्षिणी hybridizations में पता चला द्वारा प्रदर्शन किया । Top लेन) cruzi-संक्रमित चूहों और भोले चूहों के पीसीआर प्रवर्धन उत्पादों के रिश् तों की प्रोफाइल । विषम संख्या T. cruzi-संक्रमित पुरुष A-to-E और महिला एफ-टू-I माउस नमूने इंगित करता है । सम संख्या में भोली मादा (2-से-10) और पुरुष (12-से-20) चूहे हैं । नीचे लेन, प्रजनन के बाद, प्रोफाइल बताते है कि यहां तक कि 2 चूहों-20 cruzi संक्रमण का अधिग्रहण किया । प्रकाशक और1,30लेखक से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 11
चित्र 11 . Trypanosoma cruzi संक्रमण खड़ी F1 संतान चूहों के लिए F0 chagasic माता पिता से स्थानांतरित कर रहा है । chagasic जनक एक एकल प्रजनन मुठभेड़ द्वारा टी cruzi संक्रमण संचारित । t. cruzi-संक्रमित महिलाओं को भोली नर एक-ई के लिए, और भोली महिलाओं के लिए साथी थे cruzi-संक्रमित नर F-J । ब्रीडिंग के बाद सभी फाउंड्री (F0) को पॉजिटिव प्रोटोजोआ nDNA-पीसीआर १८८-बीपी बैंड दिखाया । दक्षिणी सोख्ता F1 कूड़े के बहुमत में radiolabeled १८८-nt जांच के साथ संकरण के बाद विशिष्ट nDNA बैंड से पता चला । नेकां, एल braziliensis नकारात्मक नियंत्रण; टीसी, cruzi सकारात्मक नियंत्रण । प्रकाशक और1,31लेखक से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 12
चित्र 12 . histopathology प्रलेखित Trypanosoma cruzi यौन एक भड़काऊ प्रतिक्रिया के अभाव में F1 संतति और प्रतिरक्षा सहिष्णुता के लिए F0 से संचारित । वर्गों अधिवृषण, goniablasts और F1 चूहों के सेमिनीफेरस नलिकाओं में टी. cruzi रूपों की वृद्धि दिखा । चूहों संज्ञाहरण के तहत बलिदान किया गया था, और प्रतिरक्षा peroxidase-सना हुआ वर्गों एक खुर्दबीन के नीचे की जांच की गई । photomicrographs के मध्य में भूरे प्रतिरक्षा peroxidase-सना हुआ T. cruzi amastigotes दिखाने के अधिवृषण () और amastigotes के लुमेन में trypomastigotes में अंतर के झुरमुट सेमिनीफेरस tubule (B, C, and F). amastigote घोंसला एक goniablast (डी) में देखा । पॉजिटिव कंट्रोल माउस की सेमिनीफेरस tubule नॉर्मल प्रोटोकॉल () है । Chagas परजीवी का भार दिखा F1 चूहों के परीक्षण में भड़काऊ घुसपैठ के अभाव की सूचना. Giemsa का दाग । पट्टियां: A, B, C और E, 20 µm; डी एण्ड एफ, १० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें

तालिका 1. सकारात्मक IIF और एलिसा परीक्षा और nDNA के उन के अनुपात के बीच विसंगतियों-मानव अध्ययन परिवारों से एकत्र नमूनों में पीसीआर परख-के लिए डी *

समूह * * एलिसा: सीरम विरोधीटी. cruzi एबी (%) T. cruzi nDNA-पीसीआर (%)
मैं-कंट्रोल एबी-पीसीआर-(n = 10) 10/10 १०० 10/10 १००
द्वितीय-नियंत्रण Ab + पीसीआर + 20/20 १०० 20/20 १००
(n = 20)
III-Chagas Ab + पीसीआर + ᵟ 31/109 २८.४ 31/109 २८.४
(n = 31)
IV-Chagas Ab-पीसीआर + ᵟ - - 83/109 ७६.१
(n = ५२)
वी-Chagas-फ्री एबी-पीसीआर- 26/109 २३.९ 26/109 २३.९
(n = 26)
* तीन स्वतंत्र एलिसा और nDNA-पीसीआर परख के परिणाम 1, 2, और 3 वर्षों में तीन विभिंन अवसरों में एकत्र नमूनों में चलाते हैं । [1]. १८८ के प्रवर्धन-nt cruzi डीएनए दोहराया क्लोनिंग और अनुक्रमण द्वारा की पुष्टि की ।
* * नकारात्मक (समूहों मैं और वी) और सकारात्मक विषयों (समूहों III और IV) के बीच मतभेद सांख्यिकीय महत्वपूर्ण है (पी < ०.०५) ।
ᵟ III और IV के बीच विसंगतियों cruzi एंटीबॉडी के अभाव में प्रतिरक्षा सहिष्णुता द्वारा समझाया पीसीआर सकारात्मक विषयों की ६२.६% (52/83) में प्राप्त की है ।

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Discussion

इस के साथ साथ, हम एक परिवार आधारित अनुसंधान प्रोटोकॉल है कि क्या मानव Chagas रोग यौन संचारित intraspecies T. cruzi संक्रमण से उपजी के सवाल का जवाब चर्चा । प्रारंभिक अध्ययन टी cruzi संक्रमण के यौन संचरण के सबूत प्रदान नहीं कर सकता है, शायद क्योंकि उपलब्ध डेटा और Chagas रोग पर जानकारी अलग से प्राप्त किया गया3,4, 5,6,7,8,9,10,11,12,13। एक लड़के के सेमिनीफेरस tubule में टी. cruzi की खोज (चित्रा 1) चिंगारी है कि प्रेरित नैदानिक और महामारी विज्ञान जांच था । कई दशकों के बाद, गर्भ धारण जब परिवार के अध्ययन के दृष्टिकोण और प्रौद्योगिकियों इस अनुसंधान प्रोटोकॉल में वर्णित उपलब्ध थे, cruzi जीवन चक्र चरणों मानव बोल पड़ना1,19में दिखाई दिया ।

21 तीव्र Chagas रोग मामलों में प्रोटोजोआ के प्रत्यक्ष parasitological प्रदर्शन nDNA-पीसीआर प्रवर्धन उत्पादों को मान्य करने के लिए महत्वपूर्ण था, जो तीव्र रूप से टी. cruziसे संक्रमित सभी विषयों से नमूनों में विशिष्ट बैंड का गठन किया. इस बिंदु की देखभाल प्रयोगशाला मार्कर प्रतिरक्षा और न्यूक्लिक एसिड परख के परिणामों का मूल्यांकन किया । मौलिक लंबे समय से चलाने Chagas रोग परिवार के अध्ययन, इसलिए, प्रयोगशाला पशुओं के समूहों में प्राप्त लोगों के साथ मनुष्यों में निष्कर्षों को जोड़ती है । प्रोटोकॉल के अनुसार किए गए शोध में पहली बार पता चला है कि cruzi संक्रमण यौन1मनुष्यों में फैलता है ।

परजीवी विशिष्ट एंटीबॉडी परख और न्यूक्लिक एसिड परीक्षण से उन के अनुपात के बीच व्यापक अंतर यह इंगित करता है कि nDNA पैरों के निशान के बहुमत विशिष्ट विरोधी cruzi के अभाव में यौन संचारित मामलों से हुई एंटीबॉडी. इस प्रकार, विशिष्ट आईजीजी एंटीबॉडी के अभाव में सकारात्मक nDNA का प्रदर्शन करने वाले परिवार के सदस्यों में cruzi का यौन संचरण प्रतिरक्षा सहिष्णुता के कारण हुआ.

प्रतिरक्षा सहिष्णुता एक चिकन मॉडल प्रणाली दुर्दम्य में भ्रूण विकास के पहले सप्ताह के बाद cruzi संक्रमण का प्रदर्शन किया गया1,25,26,३२,३३, ३४. इसके बाद, अपरिपक्व प्रतिरक्षा प्रणाली के शरीर के एक विदेशी घटक के रूप में परजीवी पहचान अक्षमता टी cruzi की ओर चिकन देर से परिपक्व प्रतिरक्षा प्रणाली सहिष्णुता संकेत दिया । इन परिणामों को ध्यान में रखते हुए, सहिष्णुता एक प्राकृतिक घटना है1 प्रतिरक्षा प्रणाली की आत्म मान्यता और शारीरिक शर्तों के तहत अपने स्वयं के शरीर के घटकों के रखरखाव के परिणामस्वरूप25,26, ३२ , ३३ , ३४. प्रतिरक्षा सहिष्णुता के राज्य से स्व-प्रतिरक्षित Chagas हृदय रोग के लिए बदलाव इसलिए प्रभाव सेल टी cruzi kinetoplast (kDNA) मेजबान के जीनोम1 में उत्परिवर्तनों से जिसके परिणामस्वरूप संशोधनों के साथ संबद्ध किया जा सकता है ,2,14,23,25,26

अनुसंधान प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम मुख्य तकनीक संशोधन और समस्या निवारण का वर्णन करने के लिए यौन संचारित Chagasपरजीवी1,14,23,25का खुलासा करने के लिए, 26: i) एक्यूट Chagas रोग के मामलों के साथ अध्ययन परिवारों का चयन३५,३६; ii) तीव्र मामलों के रक्त से वाइल्ड-टाइप टी. cruzi को अलग करना; iii) ' परिवारों प्रतिभागियों रक्त flagellates से डीएनए नमूने प्राप्त करने, Berenice टी cruzi मूलरूप से, सकारात्मक पहचान बैंक डीएनए नमूनों से, और नकारात्मक नियंत्रण से braziliensis एल; iv) साफ तकनीकी प्रक्रियाओं प्रदर्शन करने के लिए प्रदर्शन है कि प्रतिभागियों ' flagellates nDNA पदचिह्न Berenice टी cruzi आदर्श और उन सकारात्मक बैंक डीएनए नमूनों की है कि समान है; v) एक वर्ष के अलावा तीन अवसरों पर परिवार के सदस्यों में टी. cruzi संक्रमण का प्रदर्शन करने के लिए स्वतंत्र तपसिल nDNA पदचिह्न चल रहा है; vi) सुनिश्चित करना है कि nDNA-पीसीआर तकनीक देखभाल पैदावार परिणामों के बिंदु पर आयोजित की क्लोनिंग और अनुक्रमण सभी amplicons annealed विशिष्ट प्राइमर सेट करने के लिए, इस प्रकार लगातार दिखा टी. cruzi १८८-nt अनुक्रम द्वारा की पुष्टि 1,25,28,29,30; vii) उच्च गुणवत्ता वाले ट्रेडमार्क रिएजेंट का उपयोग करके एंटीबॉडी titers को पुन: उत्पंन करने के लिए तीन अलग समय बिंदुओं पर एकत्र सीरम नमूने में अभी भी; viii) परिवार के अध्ययन प्रोटोकॉल cruzi nDNA के प्रदर्शन पर रोगाणु लाइन कोशिकाओं में मौजूदा रहते संक्रमण से पता चला वीर्य में विशिष्ट सीरम एंटीबॉडी के अभाव में Chagas परजीवी से एकत्र बोल पड़ना-संक्रमित व्यक्तियों1; ix) परिप्रेक्ष्य यह है कि अनुसंधान के लिए यौन संचारित टी cruzi संक्रमण को खंडित करने के लिए डिजाइन प्रोटोकॉल पांच महाद्वीपों पर autochthonous Chagas रोग का खुलासा करना चाहिए; x) nDNA और kDNA पदचिह्नों मनुष्यों में जीर्ण स्पर्शोन्मुख Chagas रोग के निदान को सुरक्षित1,2; xi) nDNA के अभाव में,टी cruzi kDNA अनुक्रम1,2,23,25,26 अकेले के उत्परिवर्तन के लिए एक प्रयोगशाला मार्कर है अज्ञातहेतुक फैली cardiomyopathies23,25,३७,३८,३९से विभेदक निदान को प्राप्त करने ।

इसके अतिरिक्त, विषमय T. cruzi Chagas रोगी बोल पड़ना में प्रलेखित के लिए माउस योनि में जगाकर पर व्यापक संक्रमण की शुरुआत करने में सक्षम थे और अपनी पेरिटोनियल गुहा में । पैथोलॉजी स्टडी ने cruzi amastigote नेस्ट को दिल और कंकाल की मांसपेशियों के साथ-साथ वॉज deferens और गर्भाशय ट्यूब में दिखाया । दिलचस्प है, परजीवी घोंसले भड़काऊ प्रतिक्रियाओं कि महत्वपूर्ण प्रजनन कार्यों में बाधा पैदा नहीं भड़काया था । भड़काऊ प्रतिक्रियाओं के अभाव महत्वपूर्ण कार्यात्मक शरीर संरचनाओं में प्रतिरक्षा विशेषाधिकार renders४०,४१,४२,४३,४४,४५ और इसलिए प्रजनन अंगों में cruzi की रोक वृद्धि को स्पष्ट करता है ।

इसके अलावा, chagasic चूहों में प्रयोगात्मक अध्ययन है कि भोली साथियों के साथ नस्ल और मानव में cruzi संक्रमण के यौन संचरण की व्याख्या की । संक्रमित महिलाओं और पुरुषों को संभोग के दौरान संक्रमित भोली साथियों को टी cruzi संक्रमण संचारित, और उनके कूड़े के बहुमत cruzi ऊर्ध्व माता पिता से संतति के लिए स्थानांतरित कर लिया । इन प्रयोगों में, प्रारंभिक चरण ट्यूब में और गर्भाशय में cruzi के विकास के लिए भेजा, साथ ही सेमिनीफेरस tubule और वॉज deferens, जहां प्रतिरक्षा विशेषाधिकार जगह ले लिया । फिर, यौन संचरण वीर्य में परजीवी चरणों या योनि में गर्भाशय स्राव में के माध्यम से हुई । प्रतिरक्षा विशेषाधिकार४०,४१,४२,४३,४४,४५ एक घटना है कि कुछ अंगों (प्रजनन प्रणाली, आंखें, और मस्तिष्क) downregulate करने की अनुमति देता है भड़काऊ प्रतिक्रियाओं और महत्वपूर्ण, संवेदनशील और विशिष्ट कार्यों४०को नुकसान से बचें । हार्मोन४१ और कई प्रतिरक्षा कारकों downregulate मैक्रोफेज४१,४२,४३, प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं४१, टी लिम्फोसाइटों, और टी-विनियामक (Treg) कोशिकाओं, इस प्रकार के उद्घोष भड़काऊ साइटोकिंस और प्रतिरक्षा विशेषाधिकार के एक नंबर के निषेध४०,४१,४२,४३,४४,४५ट्रिगर ।

पुरुषों और महिलाओं से भोले भागीदारों के लिए cruzi संक्रमण के यौन संचरण इंगित करता है कि Chagas रोग के नियंत्रण अंतरराष्ट्रीय एकजुटता की आवश्यकता है । परिणामों पर चर्चा के साथ साथ सुझाव है कि और अधिक रचनात्मक अनुसंधान की जरूरत है । निंनलिखित तत्काल लक्ष्यों को प्राप्त कर रहे हैं: i) एक सटीक निदान तक पहुंचने के लिए विशिष्ट और अति संवेदनशील न्यूक्लिक एसिड परीक्षण के लिए उच्च प्रवाह प्लेटफार्मों विकसित करने के लिए, संभोग द्वारा प्रेषित संक्रमण की रोकथाम के लिए लक्ष्य, रक्त आधान और अंग प्रत्यारोपण के रूप में अच्छी तरह से नैदानिक और epidemiologic पूछताछ की सुविधा के निदान और Chagas रोग की व्यापकता का निर्धारण करने के लिए; ii) cruzi संक्रमण के उन्मूलन के लिए नई औषधों को प्राप्त करने के लिए एक multicenter औषध विकास कार्यक्रम को बढ़ावा देना; और iii) Chagas रोग के प्रसार को रोकने के लिए एक उपयुक्त शिक्षा, सूचना और संचार कार्यक्रम को कार्यान्वित करना जिसमें स्कूलों, चर्चों, सामाजिक संगठनों और स्वास्थ्य संस्थाओं की भागीदारी शामिल है.

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Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

हम प्रयोगशाला सुविधाओं और Izabela Dourado, कार्ला Araujo, और चालाक गोम्स और ब्रूनो Dalago और राफेल Andrade की तकनीकी सहायता की महत्वपूर्ण टिप्पणी स्वीकार करते हैं । हम विज्ञान की उंनति (FAPDF), राष्ट्रीय अनुसंधान परिषद, विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय (CNPq/MCT), और मानव संसाधन, शिक्षा मंत्रालय (CAPES/ME), ब्राजील, के लिए एजेंसी के समर्थन के लिए फाउंडेशन के लिए ऋणी है ये जांच.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BCIP and NBT redox system Sigma-Aldrich 681 451 001
Blood DNA Purification columns Amersham Biosciences 27-9603-01
d-ATP, [α-32P], 250 µCi.   Perkin Elmer   BLU012H
DNA, Solution Salt Fish Sperm AMRESCO 064-10G
dNTP Set, 100 mM Solutions GE Healthcare 28-4065-51
Eco RI Invitrogen 15202-021
Goat anti-human IgG- alkaline phosphatase conjugated Southern Biotech        2040-04
Goat anti-human IgG- FITC conjugated Biocompare MB5198020
Hybond – N+ nylon membrane GE Healthcare RPN303B
Hybridization oven Thomas Scientific 95-0031-02
Micro imaging software cell Sens software Olympus, Japan
Molecular probes labeling System Invitrogen 700-0030
Nsi I Sigma-Aldrich R5584 1KU
Plasmid Prep Mini Spin Kit GE Healthcare 28-9042-70
Plate reader  Bio-Tek GmBH 2015
Rabbit anti-chicken IgG-alkaline phosphatase conjugated Sigma-Aldrich A9171
Rabbit anti-chicken IgG-FITC conjugated Sigma-Aldrich F8888
Rabbit anti-mouse IgG- alkaline phosphatase conjugated Sigma Aldrich A2418 
Rabbit anti-mouse IgG-FITC conjugated Biorad MCA5787
Spin Columns for radio labeled DNA purification, Sephadex G-25, fine Sigma-Aldrich G25DNA-RO 
Taq DNA Polymerase Recombinant Invitrogen 11615-010
Thermal cycler system Biorad, USA 1709703
Vector Systems Promega A1380

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References

  1. Araujo, P. F., et al. Sexual transmission of American trypanosomiasis in humans: a new potential pandemic route for Chagas parasites. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 112, (6), 437-446 (2017).
  2. Teixeira, A. R. L., Nitz, N., Bernal, F. M., Hetch, M. M. Parasite Induced Genetically Driven Autoimmune Chagas Heart Disease in the Chicken Model. Journal of Visualized Experiments. (65), 3716 (2012).
  3. Kalil-Filho, R. Globalization of Chagas Disease Burden and New Treatment Perspectives. Journal of the American College of Cardiology. 66, (10), 1190-1192 (2015).
  4. Nunes, M. C. P., Dones, W., Morillo, A., Encina, J. J., Ribeiro, A. L. Chagas Disease: An Overview of Clinical and Epidemiological Aspects. Journal of the American College of Cardiology. 62, (9), 767-776 (2013).
  5. Pinazo, M. J., Gascon, J. Chagas disease: from Latin America to the world. Reports in Parasitology. 2015, (4), 7-14 (2015).
  6. Kessler, D. A., Shi, P. A., Avecilla, S. T., Shaz, B. H. Results of lookback for Chagas disease since the inception of donor screening at New York Blood Center. Transfusion. 53, (5), 1083-1087 (2013).
  7. Klein, N., Hurwitz, I. R. Globalization of Chagas Disease: A Growing Concern in Nonendemic Countries. Epidemiology Research International. (2012).
  8. Pérez-Molina, J. A., Norman, F., López-Vélez, R. Chagas disease in non-endemic countries: epidemiology, clinical presentation and treatment. Current Infectious Diseases Report. 14, (3), 263-274 (2012).
  9. Hotez, P. J., et al. Chagas disease: "the new HIV/AIDS of the Americas". PLoS Neglected Tropical Diseases. 6, e1498 (2012).
  10. Schmunis, G. A., Yadon, Z. E. Chagas disease: a Latin American health problem becoming a world health problem. Acta Tropica. 115, (1-2), 14-21 (2010).
  11. Franco-Paredes, C., Bottazzi, M. E., Hotez, P. J. The Unfinished Public Health Agenda of Chagas Disease in the Era of Globalization. PLoS Neglected Tropical Diseases. 3, (7), e470 (2009).
  12. Teixeira, A. R. L., Vinaud, M., Castro, A. M. Emerging Chagas Disease. In: Chagas Disease: - A Global Health Problem. 3, Bentham Science Publishers. New York. Chapter 3 18-39 (2009).
  13. Lee, B. Y., Bacon, K. M., Bottazzi, M. E., Hotez, P. J. Global economic burden of Chagas disease: a computational simulation model. Lancet Infectious Diseases. 13, (4), 342-348 (2013).
  14. Teixeira, A. R. L., Hecht, M. M., Guimaro, M. C., Sousa, A. O., Nitz, N. Pathogenesis of Chagas Disease: Parasite Persistence and Autoimmunity. Clinical Microbiology Review. 24, (3), 592-630 (2011).
  15. Murcia, L., et al. Risk factors and primary prevention of congenital Chagas disease in a nonendemic country. Clinical Infectious Diseases. 56, (4), 496-502 (2013).
  16. Chagas, C. New human trypanosomiasis. Morphology and lifecycle of Schizotrypanum cruzi, the cause of a new human disease. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 1, 159 (1909).
  17. Vianna, G. Contribution to the study of the Pathology of Chagas disease. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 3, 276 (1911).
  18. Teixeira, A. R. L., Roters, F., Mott, K. E. Acute Chagas disease. Gazeta Médica da Bahia. 3, 176-186 (1970).
  19. Teixeira, A. R. L., et al. Prevention and Control of Chagas Disease – An Overview. International STD Research, Reviews. 7, (2), 1-15 (2018).
  20. Rios, A., et al. Can sexual transmission support the enzootic cycle of Trypanosoma cruzi? Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 113, (1), 3-8 (2018).
  21. Lenzi, H. L., et al. Trypanosoma cruzi: compromise of reproductive system in acute murine infection. Acta Tropica. 71, (2), 117-129 (1998).
  22. Carvalho, L. O. P., et al. Trypanosoma cruzi and myoid cells from seminiferous tubules: Interaction and relation with fibrous components of extra cellular matrix in experimental Chagas’ disease. International Journal of Experimental Pathology. 90, (1), 52-57 (2009).
  23. Hecht, M. M., et al. Inheritance of DNA transferred from American trypanosomes to human hosts. PLoS One. 12, e9181 (2010).
  24. Alarcon, M., et al. Presencia de epimastigotes de Trypanosoma cruzi en el plasma seminal de ratones con infección aguda. Boletín Malariología y Salud Ambiental. 51, 237 (2011).
  25. Teixeira, A. R. L., et al. Trypanosoma cruzi in the Chicken Model: Chagas-Like Heart Disease in the Absence of Parasitism. PLoS Neglected Tropical Diseases. 5, (3), e1000 (2011).
  26. Guimaro, M. C., et al. Inhibition of Autoimmune Chagas-Like Heart Disease by Bone Marrow Transplantation. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8, (12), e3384 (2014).
  27. Oliveira, C. I., et al. Leishmania braziliensis isolates differing at the genome level display distinctive features in BALB/c mice. Microbes and Infection. 6, (11), 977-984 (2004).
  28. Mendes, D. G., et al. Exposure to mixed asymptomatic infections with Trypanosoma cruzi, Leishmania braziliensis and Leishmania chagasi in the human population of the greater Amazon. Tropical Medicine, International Health. 12, 629 (2007).
  29. Moser, D. R., Kirchhoff, L. V., Donelson, J. E. Detection of Trypanosoma cruzi by DNA amplification using the polymerase chain reaction. Journal of Clinical Microbiology. 27, (7), 1477-1482 (1989).
  30. Da Silva, A. R. Sexual transmission of Trypanosoma cruzi in mus musculus [MsD thesis]. University of Brasília. Brasília. Available from http://repositório.unb.br/handle/10482/14829 (2013).
  31. Ribeiro, M., et al. Can sexual transmission support the enzootic cycle of Trypanosoma cruzi? Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 113, (1), 3-8 (2018).
  32. Billingham, R. E., Brent, L., Medawar, P. B. Actively acquired tolerance of foreign cells. Nature. 172, (4379), 603-606 (1953).
  33. Burnet, F., Fenner, F. The production of Antibodies. MacMillan. Melbourne, Australia. (1949).
  34. Hasek, M. Parabiosis of birds during their embryonic development. Chekhoslovatskaia Biology. 2, (1), 29-31 (1953).
  35. Coura, J. R., Junqueira, A. C. V., Fernades, O., Valente, S. A., Miles, M. A. Emerging Chagas Disease in Amazonian Brazil. Trends Parasitology. Trends Parasitology. 18, (4), 171-176 (2002).
  36. Teixeira, A. R. L., et al. Emerging Chagas disease: Trophic network and cycle of transmission of Trypanosoma cruzi from palm trees in the Amazon. Emerging Infectious Diseases. 7, (1), 100112 (2001).
  37. Hazebroek, M., Dennert, R., Heymans, S. Idiopathic dilated cardiomyopathy: possible triggers and treatment strategies. Netherland Heart Journal. 20, (7-8), 332-335 (2012).
  38. Arimura, T., Hayashi, T., Kimura, A. Molecular etiology of idiopathic cardiomyopathy. Acta Myologica. 26, (3), 153-158 (2007).
  39. Dec, W. G., Fuster, V. Idiopathic Dilated Cardiomyopathy. New England Journal of Medicine. 33, 1564-1575 (1994).
  40. Niederkorn, J. Y. See no evil, hear no evil, do no evil: the lessons of immune privilege. Nature Immunology. 7, (4), 354-359 (2006).
  41. Smith, B. E., Braun, R. E. Germ cell migration across Sertoli cell tight junctions. Science. 338, (6118), 798-802 (2012).
  42. Garth, A., Wilbanks, J., Streilein, W. Fluids from immune privileged sites endow macrophages with the capacity to induce antigen-specific immune deviation via a mechanism involving transforming growth factor-β. European Journal of Immunology. 22, (4), 1031-1036 (1992).
  43. Meng, J., Anne, R., Greenlee, C., Taub, J., Braun, R. E. Sertoli Cell-Specific Deletion of the Androgen Receptor Compromises Testicular Immune Privilege in Mice. Biology of Reproduction. 85, (2), 254-260 (2011).
  44. Fujisaki, J., et al. In vivo imaging of Treg cells providing immune privilege to the haematopoietic stem-cell niche. Nature. 474, (7350), 216-219 (2011).
  45. Wood, K. J., Sakaguchi, S. Regulatory T cells in transplantation tolerance. Nature Review Immunology. 3, (3), 199-210 (2003).

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