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美国锥虫从男性和女性到天真的命运的性传播

Immunology and Infection

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Summary

加斯病的锥虫瘤壳体产生长期的无症状感染, 突然发展成为临床公认的病理。下面的研究协议描述了一项以家庭为基础的短期流行病学研究, 以揭示从父母到后代性传播的t. cruzi感染。

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Almeida, A. B., Araújo, P. F., Bernal, F. M., Rosa, A. d., Valente, S. A., Teixeira, A. R. Sexual Transmission of American Trypanosomes from Males and Females to Naive Mates. J. Vis. Exp. (143), e57985, doi:10.3791/57985 (2019).

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Abstract

美国锥虫病是通过摄入受污染的食物、输血或在医院和研究实验室意外传播给人类的。此外, 克鲁兹锥虫病感染是由长崎母亲自然传播给后代的, 但男性伴侣在子宫污染方面的贡献尚不清楚。在卵巢的细胞、性腺和精原管腔内发现的阿玛菌和色母细胞的巢穴和团块表明, t .克鲁兹感染是性传播的。本文的研究方案介绍了一个家庭研究群体的结果, 该群体在人体二倍体血单个核细胞和单倍体配子中显示了寄生虫核 dna。因此, 时隔一年收集的三个独立生物样本证实, t. cruzi感染是通过性传播到后代的。有趣的是, 大多数对寄生虫抗原具有免疫耐受能力的家族后代中都存在特异性 t. cruzi 抗体。在胚胎生长的第一周后, 鸡的难熔对t. cruzi 的免疫耐受性得到了证实, 而从鞭毛接种的卵中孵化出来的小鸡则不能产生特定的抗体。此外, 人精液射精射精射精腹腔内或阴道中的天真小鼠产生 t. cruzi amastigotes 在附属物, 精原体小管, 输精管和子宫管没有炎症 反应在免疫特权器官再生产。受 t. cruzi感染的雄性和雌性老鼠与天真的配偶的繁殖导致了感染的获取, 这些感染后来被传播到后代身上。因此, 有民众和社会组织参与的强有力的教育、信息和通信方案被认为是预防查加斯病的必要条件。

Introduction

原生动物寄生虫三叶草属植物在哺乳动物寄主中经历了锥虫和三甲草的生命周期阶段, 并作为异位体存在于昆虫媒介的肠道和无菌培养。近几十年来, 几项研究表明, 在被认为三胺素无菌的四大洲国家, 有查加斯病的存在, 有 123、4、5 ,6,7.,8,9,10,11,12,13;美国锥虫体的分散最初归因于拉丁美洲移民到北半球, 但有些是本土的恰加斯病的可能性不能再被否认 3,4,5,6,7.,8,9,10,11,12,13,14. 唯一可识别的内源 t. cruzi传播的原因是, 在大约10% 的怀孕中, 长崎母亲将寄生虫转移到后代身上,15男性伴侣对精液射精在子宫内感染的贡献仍未得到承认。

一个多世纪前, 研究人员卵巢的卵细胞和急性恰加斯病患者睾丸的生殖细胞中观察到细胞内的 t . cruzi。在致命急性恰加斯病病例的卵巢癌细胞、性腺和精原管腔 (图 1) 中, t. cruzi 色样体和阿玛菌的巢穴和团块在卵巢的器官中产生免疫特权。繁殖在没有炎症渗透 18,19。近几十年来, 一些实验研究表明, 在急性感染 小鼠的精子管、附属物、输便于和子宫、管和卵巢细胞中, 出现了圆形的 "1,20,21,22。此外, 在记录父母查加斯患者原生动物线粒体 dna 转移到后代的家庭研究过程中, t. cruzi核 dna (ndna) 在人类单倍体生殖细胞23中得到了验证,在马达加斯加小鼠24的射精中观察到寄生虫的生命周期阶段.这些发现与关于受 t . cruzi-感染的宿主在没有特定抗体12526的情况下获得免疫耐受的报告一致。此外, 表明恰加斯病流行向其他大陆蔓延的流行病报告3、45678 9101112、13现在得到实验研究的支持, 这些实验研究表明, 恰加斯病可以通过性行为传播.本研究提出了一个流行病学的家庭研究程序 , 并表明t . cruzi感染是通过传播的。

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Protocol

巴西利亚大学医学院人类和动物研究委员会分别在 2011年2500.167567 和 1041111/研究议定书中批准了与人体和实验动物有关的所有程序。公共基金会医院 gaspar vianna (2009年和 conep 1116ne2009 号议定书) 的道德委员会批准了实地研究的自由同意书, 并扩大到卫生部国家人类研究委员会 (conep 2585/04)。对该程序进行了调整, 以评估二倍体血液单个核细胞和精液单倍体配子中的t. cruzi dna 。实验动物得到了人道的照顾;老鼠, 在牺牲前接受心脏穿刺, 在麻醉下。

1. 招募人的参与者

  1. 确保研究小组参与卫生系统查加斯疾病计划, 为查加斯患者提供保健服务。
  2. 从参加该计划的家庭招募人参与者, 显示至少有一例发烧、不适、头痛、心动过速和水肿, 是急性恰加斯病的主要临床症状14.
  3. 为研究家庭的人提供为期五年的医疗服务。
  4. 每隔一年从研究参与者处三次获得15毫升的静脉血液, 将样本分成三个5毫升的等价物, 并将其存放在4°c 的冰箱中。
  5. 收集2毫升的精液从成人志愿者家庭成员射精, 并按照步骤3.3 中所述进行。

2. 寄生虫的生长

  1. 使用步骤1.4 中的脂肪, 将血液与5个单位的抗凝血肝素钠混合;通过接种家庭参与者的血液进行坡度培养, 诊断急性恰加斯病。
    1. 将未凝血的5毫升注射到50毫升的螺帽管中, 再加上5毫升的肝脏注入色氨酸培养基 (lit), 并在27°c 的振动台中孵育样品3个月。
    2. 每四周将上清液培养基的100μl 放在玻璃幻灯片上, 用滑块覆盖, 并在显微镜下寻找血液t. cruzi上黄体。
    3. 在27°c 时在无菌 lit 培养基上清液中采集上清体;在 pbs ph 7.4 中清洗细胞, 离心机在 1, 000 x下清洗 10分钟;在5毫升的杜尔贝科改性必需介质 (dmem) 中稀释颗粒中的 episimallgte。
    4. 接种融合的 l6 肌肉细胞培养瓶与 1 x10 6 eci1 至 eci21 t. cruzi epastigote 分离株.
    5. 在75毫升培养瓶中, l6 肌肉细胞培养中生长 t . cruzi eci1 至 eci21 和贝伦ice 原型色板。
    6. ph 7.4 下 dmem 15 毫升的饲料细胞补充了5% 的胎牛血清、100种 iuml 青霉素、100μgml 链霉素、250 nm l-谷氨酰胺和 37°c 1 时5% 的 co2.
    7. 如步骤5.2 所述,使用阳性对照 t. cruzi berenice 色眼类动物对从组织培养中分离出的 ei1 至至至至至至 eci21 的表型。
    8. 在 dmem 中增加阴性对照, 仅补充20% 的胎儿牛血清,并以寄生虫促进者为阴性对照。
    9. 在细胞培养的上清液中使用 1 x10-克鲁齐eci1 至 eci21 色原体感染小鼠。 
    10. 在感染的第一周后, 在尾血中寻找t. cruzi 色样体。
    11. 在受感染小鼠的心脏、骨骼肌和生殖器官的血红素染色部分中, 搜索血丝素染色部分的阿玛菌巢穴。

3. dna 提取和 pcr 分析

  1. 将血液中的5毫升 (步骤 1.4) 放在无菌 edta 管中, 并在 3, 000 x g处进行45分钟的密度梯度离心。使用移液器从红细胞上方的白色相中采集单个核细胞, 在 pbs 5 毫升中两次清洗白色细胞, ph 7.4, 在不同的15毫升管中离心 10分钟, 1, 500 x克,并使用这些细胞进行 dna 提取。
  2. 从 eci-1 提取到 eci-21 t .cruzi, 从阳性对照 berenice t.cruzi, 从阴性对照l. braziliensis (步骤 2.1.8), 以及从109个人类家庭研究对象的血单个核细胞测试1,27,28岁
  3. 稀释 dmem (1: 4, v2) 中步骤1.5 中获得的精子样本的2毫升;在 5% co 2 和37°c 孵育 45分钟, 在 13, 000 x g 离心5分钟后从上清液中回收精子, 并提取单倍体dna 23.
  4. 将1毫升的细胞放入萃取缓冲液中 (10μm 氯化钠、20μm edta、1% sds、0.04% 蛋白酶-k 和1% 二硫醇), 并通过倒置和晃动混合溶液。
    1. 在 13, 000x g和25°c 的温度下将溶液离心 10分钟, 并将粘性上清液转移到自旋柱上。
    2. 以 10, 000 x g的速度离心旋转柱 1分钟, 并丢弃洗脱液;在自旋柱 (材料表) 中加入500μl 结合缓冲液, 以 12, 000 x 克的速度离心 1分钟, 并丢弃洗脱液。
    3. 在旋转柱中加入600μl 洗涤缓冲液, 以 12, 000 x 克的速度离心 1分钟, 并丢弃洗脱液。
    4. 重复此步骤两次, 并将自旋柱转移到无菌 1.5 ml 微型离心管。
    5. 加入 100μl te 缓冲液, 在室温下孵育管 2分钟, 然后在 12, 000 x g处离心管1分钟。微离心管中的缓冲液包含 dna。
    6. 通过在0.8% 琼脂糖凝胶上运行等价物和用分光光度计读取260纳米的吸收率来测量 dna 浓度。将 dna 样本储存在-20°c, 直到在 pcr 分析中使用。
  5. 使用t. cruzi Tcz1/2 退火到特定的188-nt 特粒序列探针29 , 并运行 pcr 与 dna 从家庭研究对象的血液和精子, 从 berenice t. cruzi 阳性对照和从l. braziliensis阴性对照。
    1. 用10μn 模板 dna、每一对引物0.4 微米、taq dna 聚合酶 2 u、0.2μm dntp 和 15μm mgcl2以25μl 最终体积制备 pcr 混合物。
    2. 在94°c 下启动 dna 扩增程序 30秒, 使模板变变性, 并将样品冷却到 55°c 30秒。然后, 在94°c 下孵育样品 90度, 以延长退火引物。将温度恢复到 94°c, 30秒, 启动下一个周期, 并在72°c 下再孵育样品3分钟。在32循环结束时 , 在室温下冷却样品 10分钟, 并在4°c 至29点将样品存放在冰箱中。
    3. 在两个肢体上将t. cruzi dna 端粒重复序列扩增到 tcz半引物上。
    4. 分析1.3% 琼脂糖凝胶上的扩增产物, 观察紫外线照明器上 188-nt dna 带。

4.南方杂交

注:南方杂交被用来丢弃琼脂糖凝胶中的大多数假阳性 pcr 放大器。

  1. 研究 pcr 扩增产物, 从未感染的对照, 从查加斯病例阳性对照, 从109个二倍体 dna 测试样本和单倍体 dna 的21个研究家庭参与者到南方杂交。
  2. 采用t. cruzi 188-nt dna 特异性端粒序列探针退火到所显示的 tcz半引物;用 [α-32p] 2'-脱氧腺苷三磷酸酯 (datp) 使用随机引物标记试剂盒标记探针, 并在4°c 过夜时, 在 60 v 时分析1.3% 琼脂糖凝胶上的扩增产物。
  3. 使用毛细管法将凝胶转移到带正电荷的尼龙膜过夜。
  4. 用放射性标记188nt 探针杂交转移到尼龙膜的 dna 带, 该探针将基因组 dna 的ecor1 消化结合在酶特异性缓冲液的25μl 中, 在可变时期内。
  5. 用 2x ssc 和 0.1% sds 在65°c 下清洗膜两次, 时间为15分钟。
  6. 将 x 射线胶片暴露在尼龙膜上, 并对膜上的带进行一个星期的签名。
  7. t. cruzi pcr 扩增产物共同培养从 pcr 和南方杂交中选择的克隆体, 并与特定的放射性标记 dna 探针杂交。
  8. 商业测序克隆使用 tcz半引物设置退火 t . cruzi-特定端粒足迹2,23

5. 免疫学检测

注: 在6例查加斯明显寄生虫血症患者的血清中, 对间接免疫荧光 (iif) 和酶联免疫吸附法 (elisa) 的敏感性和特异性进行了评估。银行样本。用 ph 7.4 ppbs 中的双血清稀释剂进行的检测显示, iif 在1:100 稀释时和 elisa 光学密度 (od) 在0.150 及以上时, 将阳性与阴性结果分离。

  1. 使用5毫升的未凝血物 (步骤 1.4) 保持在室温下 1小时, 并在 1, 500 x离心 30分钟, 以分离上清液中的血清。
  2. 进行 iif 和 elisa 三文三文三文三文多的血清稀释剂, 以检测 t . cruzi 和l. braziliensis抗原, 如前28.
  3. Iif
    1. 对109个研究对象的样本进行综合投资框架检测, 每间隔一年三次获得。
    2. 将福尔沙林的5μl 悬浮液, 用1% 处理的t. cruzi epastigotes 或l. braziliensis放在玻璃滑梯上;让寄生虫在室温下在引擎盖里过夜, 并将玻璃滑梯存放在-20°c, 直到使用。
    3. 将患者血清稀释液放入涂覆5μl 的玻璃滑块上, 涂有5μl 的福尔沙林 (10 种寄生虫-μl) t. cruzi epimastigotes 或l. braziliensis prom白皮书。
    4. 在37°c 的潮湿室内用滑块将玻璃滑块孵化 1小时, 并用 pbs 三次清洗。
    5. 在37°c 条件下, 用1:1000 稀释荧光素标记的兔抗体 (材料表) 将风干玻璃滑块体体体体对人体 igg 进行1小时的稀释;清洗和擦干滑梯。
    6. 用盖板滑块安装幻灯片, 并在紫外线显微镜下进行检查。
      注: 考试呈阳性的是照片绿色 t. cruzi epastigote 的剪影, 显示在视频中。
  4. Elisa
    1. 运行 elisa 检测涂层微板井上的t. cruzi 和巴西可溶性抗原 (0.1 m 碳酸盐缓冲液中的 1μg/100μl, ph 9.6)。
    2. 在室温下将 1: 100 层涂布井中的血清稀释剂培养2小时。
    3. 干燥前, 用 pbst (含有 0.5% tween-20 的 pbs)、ph 7.4、溶液将板材洗三次。
    4. 在37°c 条件下, 用 1:1-1000 稀释兔抗人 igg 抗体50μl 对板材进行90分钟的研版。
    5. 用 pbst 溶液将板材洗三次, 并使其在室温下干燥。
    6. 在37°c 条件下, 用100μl 的1:1000 稀释碱性磷酸酶共轭山羊抗兔 igg (材料表) 90分钟。
    7. 用 pbst 三次清洗板材, 加入基材对硝基磷酸苯酯, 等待颜色的发展。
    8. 在多模板读取器中读取 630 nm 的 od。
    9. 运行研究人群中检测血清的三分一次稀释, 绘制 od, 以确定特异性 t. cruzi 抗体滴度。

6. 免疫耐受评估

注: 在胚胎发育的第一周后, 采用鸡模型系统对t. cruzi感染进行检测。

  1. 用从组织培养基中提取的100微米-l. cruzi 色原体接种鸡的繁殖卵;每μl 培养基用 10 t. cruzi 色形动物接种模拟控制蛋。用胶带封住这个洞。
  2. 在37°c 和65% 的湿度下孵育20个受克鲁基感染的鸡蛋和同等数量的模拟控制生育期鸡蛋21天。
  3. 将在孵化器中孵化的雏鸡保持 24小时, 然后在32°c 的情况下, 在温度控制下的头套中保持三周。
  4. 24°c 的正气压室中, 在单独的笼子里, 从 t. 壳接种的卵和模拟控制卵中孵化出的小鸡进入成人阶段。
  5. 挑战所有的成年小鸡三次在6个月大与 10 7 福尔沙林杀死色样体注射皮下注射, 每周, 根据方案在视频中.
  6. 在最后一次免疫接种四周后, 从接种 t.壳的卵和模拟控制中提取鸡的翅膀静脉中的血液, 以获得血清。
  7. 如协议第5步所述, 用 iif 和 elisa 检测鸡血清的特异性 t. cruzi 抗体。

7. 查加斯患者精液射精小鼠 t . cruzi 感染

  1. 使用成人 pcr + 查加斯病患者 (步骤 1.5) 和成人 pcr-茶长崎无个体的精液射精。
  2. 使用两组12个月大的 balb1 天真的小鼠在24°c 的正气压下保持在头套中, 并喂养食物和脂肪.
  3. 将人的 chagac 阳性精液精华 (100μl) 注入腹膜, 并将等量输入 a 组小鼠的阴道。
  4. 将对照组无切渣精液的精液 (100μl) 注入腹膜, 并将等量的量输入团体 b 小鼠的阴道。
  5. 在精液注入并使组织切片用血红素-eosin 染色5周后, 在麻醉下牺牲实验小鼠。
  6. 用显微镜观察小鼠组心脏、骨骼肌和生殖器官中的t. cruzi色样体和血清素体。

8 . 通过 传播 t . cruzi感染

  1. 在实验中使用10只男性和女性6周大的 balb1 小鼠。
  2. 用 1 x 10 5 t. cruzi 色氨酸从组织培养中取出 5只雄性和雌性小鼠腹腔内的菌核。 
  3. 培育小鼠至3个月大: 第一组将由5只受 t. cruzi感染的雌性小鼠和5只对照的未感染雄性配偶组成;第二组将由 5名受 t. 克鲁兹感染的雄性和5名对照的未感染雌性配偶组成。第三组将由5名男性和5名女性控制的天真的未感染伴侣组成。
  4. 将每对繁殖组合放在一个笼子里, 放在一个保险箱里, 里面有一个5毫米的网格和锁门, 以防止逃跑。
  5. 喂老鼠吃东西, 给它浇水。在第二和 i 组中, 总共培养70个断奶后代, 时间至少为6周。
  6. 在麻醉下, 用心脏穿刺从亲本 (fo) 和后代 (f1) 小鼠身上抽血, 牺牲小鼠, 并提交心脏、骨骼肌和生殖器官的部分进行病理分析。

9. 免疫特权评估

  1. t. cruzi感染和天真的对照小鼠 (步骤 8.6) 中获取组织, 并将石蜡嵌入的样品切割成4微米厚的部分。
  2. 取出石蜡, 用几块二甲苯的变化将部分脱水到玻璃滑梯上, 并用100% 至70% 乙醇分级清洗, 每次1分钟。
  3. 用0.05% 的皂甙对组织切片进行一次培养, 然后在室温下进行三次蒸馏水清洗。
  4. 用5% 脱脂奶粉阻断组织切片 45分钟, 用 0.1 m pbst 清洗切片, 用查加斯小鼠抗t. cruzi 血清或与对照组对照的未感染小鼠血清在 1:20 稀释2小时时孵育切片。
  5. 用1:1000 稀释碱性磷脂结合兔抗小鼠 igg, 在 pbst 下三次清洗幻灯片, 在室温下干燥。
  6. 在 pbst 中冲洗幻灯片, 加入100μl 的 3, 3 ' 二胺苯并在5分钟的孵育中, 然后用 pbst 冲洗 3次, 用哈里斯血红素进行30分钟的反染色。
  7. 将幻灯片在蒸馏水中清洗 5分钟, 在70%、80%、90% 和100% 乙醇中脱水 1分钟, 然后将其安装在缓冲甘油中。
  8. 使用明亮的光显微镜检查幻灯片, 并使用带有软件和分析仪程序的微型摄像机拍摄照片图像。
  9. 记录在生殖器官没有炎症反应的情况下寄生虫的免疫特权。

10. 统计分析

  1. 使用生物医学编辑进行序列分析, 使用 blast 进行对齐, 并确定 e 值统计意义 (p < 0.05)。
  2. 执行方差单向分析 (anova) 和 tukey 测试, 以比较 od 均值正负标准偏差。

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Representative Results

这项根据协议进行的研究, 旨在通过临床和寄生虫学检查检测急性恰加斯病病例。对静脉血液样本进行了直接显微镜检查和体外培养, 以促进寄生虫的生长。21例急性恰加斯病在血液中显示t. 克鲁齐。研究协议确保了 t. cruzi eci1-至 eci21 与急性恰加斯病的分离, dna 样本在其余研究人群中显示出阳性 dna 足迹: dna-pcr 检测产生了典型的端粒重复序列与188nt 乐队存在, 以及t.克鲁齐贝雷尼斯原型1。chagas 案及其自愿参与研究的家庭成员被分为四个家庭1

在本家族研究中,引物1,23退火21例急性查加斯病患者的特异性端粒序列, 对 t. cruzi ndna 进行 pcr 扩增。这些t. cruzi ndna 放大器与特定的放射性标记序列探针杂交 (图 2);克隆和测序显示, 扩音器由t. cruzi 188-nt 端粒重复母题组成。这些杂交过程的特异性表现在用的负对照中。病理分析证实, 急性恰加氏病患者的血红素是真正的毒性t. cruzi。我们的结论是, 在21个急性恰加斯病例 (图 2) 中发现的t. cruzi ndna (188-bp) 带是持续性感染的直接表现。

板皮虫在人身上的性传播

为了评价t. cruzi感染的比例, 我们应用核酸试验对群体研究人群中寄生虫足迹高灵敏度检测1。在这些 pcr 检测中, 与特定放射性标记188nt 探针杂交的扩增产物在 761% (8 109) 的测试样本中形成了 ndna 带;ndna-pcr 扩增产物与特定188-nt 放射性标记探针的南方杂交结果如图 3所示. 此外, 杂交显示了志愿者家庭成员生殖细胞系中的寄生虫 dna (图 4)。

采用 iif 表型从查加斯病血清样本中的人血清 igg 对 eci1 进行了 eci1 到 eci21-曲子色体的表型, 并对血液中的原生动物进行了寄生虫学演示, 并采用了荧光素共轭反人类 igg.t. cruzi berenice 是对恰加斯抗体的阳性对照, 阴性对照是其家族亲属巴西氏杆菌的阳性对照。图 5显示了贝伦尼斯原型的正苹果绿色轮廓与视频中显示的野生类型t. cruzi 包络相关。

elisa 和 iif 在测试样本中发现了明确的t. cruzi抗体1 , 28., 占测试样本的 28.4% (31/109)。elisa 和 iif 的结果, 以及 ndna-pcr 放大器和南方杂交的结果, 如图 6所示。在遗传图谱 (图 7)、a 家族、4名受试者的 ndna 阳性和抗 t-曲奇抗体中描述了 ndna-pcr 足迹的结果与特定抗体检测结果之间的差异, 11个受试者只有阳性 ndna;五名男性在精液中射精。在44人的 b 家族中, 11 人具有特异性 t. cruzi抗体, 23 人同时具有特异性抗体和寄生虫 ndna;七个人在精液中射精。家庭 c 与29成员有抗体和t. cruzi ndna 在5个体, 17 仅有寄生虫 ndna;四个男性在精液射精中的 ndna-pcr 呈阳性。在 dafs 中, 在21名受试者中, 有11例具有特异性抗 t. cruzi抗体和 ndna 足迹, 仅 ndna-pcr 就有9例阳性。图 3图 6图 7 描述了在三个独立实验中从家庭研究对象获得的生物样本中, 结果之间的广泛差异。

表 1显示了人类研究家族 a 至 d 样本中 iif、elisa 和 ndna-pcr 检测方法之间的数量差异。抗体检测 (28.4%) 与阳性核酸检测 (766.1%) 的比率差异有统计学意义 (p < 0.005)。在这些家庭中, t. cruki 感染者(iii 和 iv 组) 之间的差异占人口的 62.6 (52/83 人), 仅核酸检测呈阳性。通过在鸡模型系统中进行的实验, 解释了阳性 ndna 足迹与特异性 t. cruzi 抗体的比例之间的巨大差异。

免疫耐受

评估在含有天真控制鸡的单独通道内的单独笼子中饲养到成虫阶段的鸡群的免疫反应 (a);用培养基接种的蛋孵化的模拟控制鸡 (b);和鸡孵化从t. cruzi 色虫接种的蛋 (c)26。如视频所示, b 组和 c 组的成年鸡每周三次接受福尔林杀灭t. cruzi 色氨酸抗原的挑战。elisa 和 iif 检测是在挑战一个月后使用从 a、b 和 c 组鸡收集的血清进行的。图 8显示了 a 组和 c 组鸡缺乏特异性抗体, 这与用 t. cruzi抗原免疫的 b 组的特异性抗体产生形成鲜明对比。结果清楚地显示了从t. cruzi接种的卵中孵化的 c 组的免疫耐受性。

性传播试试小鼠模型系统中的盘状瘤

此外, 通过将100μl 精液注入雄性小鼠的腹腔和 同样数量的精液注入阴道。五个星期后, 在心脏和骨骼肌中发现了t. cruzi amastigote 巢, 并在输孔和子宫管的腔内发现了分化寄生虫的团块。有趣的是, 破坏性的炎症反应并没有围绕着 t. cruzi的巢穴和团块 (图 9)。

对 t. cruzi 感染的性传播进行了进一步的评估, 在两组接种的小鼠腹腔内接种 1 x 10 5 t. cruzi berenice 色板形成 1,30, 31岁在实验组 i 中, 10 例受 t. 克鲁兹拉感染的雄性与10只天真控制的雌性小鼠交配。在实验组 ii 中 , 10 t . 地壳感染的雌性与10 名天真的对照雄配。图 10显示,受 t. cruzi感染的雄性小鼠 (a-to e) 和受 t.cruzi 感染的雌性小鼠 (f-to-g) 产生 188千 bp ndna 带 (奇数)。繁殖后, 天真的配偶 (偶数) 在与长崎伴侣发生独特的性关系后, 很容易获得t. cruzi. 在相同条件下进行的类似重复实验证实 , 每只与t . cruzi感染的男性或女性发生配的天真的雌性或雄性老鼠都感染了鞭毛。这些 ndna 阳性创始人 (f0) 产生了后代, 他们一直抚养到6周大。然后,通过心脏穿刺对未感染的小鼠进行检测和对照, 收集约0.5 毫升的血液。ndna-pcr 检测显示, 创始人的性感染 (f0) 传播到 f1 后代, 如 188-bp ndna 带 (图 11) 所示。在所检查的70个样本中, 有 41个 (50.6%) 的 f1 后代呈 nna 阳性。在这些有 ndna 带提示垂直感染的小鼠中, 只有41头中的9头 (22%) 有t. cruzi抗体。

麻醉条件下牺牲 f1 后代小鼠, 对机体组织进行病理和免疫过氧化物染色分析。这些实验的结果如图 12所示。在附属物间质细胞和性腺间质细胞中记录了t. cruzi amastigotes 的结果;在没有炎症反应的情况下, 精管腔内存在分化为色原体的瘤。

Figure 1
图 1.克鲁子锥那龙死于急性恰加斯病的男孩在精子管中的感染.1970年18年特谢拉医生档案中的缩微照片t. cruzi形式是在性腺, 和团块的羊毛衫和自由色针 (箭头) 是存在于腔腔的精原体小管在没有炎症浸润1.血红素-eosin 污渍。酒吧, 20μm. 经出版商和作者的许可转载1,19.

Figure 2
图 2.急性恰加斯的壳皮虫的足迹。t. cruzi ndna-pcr 扩增产物形成188-nt 带, 具有特定的放射性标记188nt 探针。tc, t. cruzi;nc, 负控制。经出版商和作者许可转载1请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3. 人类研究家庭研究对象的锥虫病感染南方印迹分析。家庭 a-所有15名受试者都显示出特定的 dna-pcr 188nt 带。在 b 家族中, 43名受试者中共有35人 (81.4) 形成了特定的 ndna 带。在家庭 c 中, 在29名成员中, 22 人 (合 0.58%) 形成了 ndna 带。在 d 家庭中, 21名受试者中有11人 (52.4) 有 ndna 带。通过克隆和测序证实了t. cruzi特异性 ndna 带。经出版商和作者许可转载1请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4.活动的克鲁子锥那龙在精液中的感染射精从研究家庭志愿者.查加斯患者射精中的感染由 ndna-pcr 188-bp 波段鉴定。tc, t. cruzi 阳性控制。nc, l. braziliensis阴性对照。经出版商和作者许可转载1请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 5
图 5. 表型克鲁子锥那龙与恰加斯病患者的血清抗体.t. cruzi 用chagas 血清 igg 抗体鉴定, 该抗体识别用 fit 标记的单克隆 ab 抗人 igg 治疗的锥虫寄生虫。抗t. cruzi ab 不承认利什曼病的促销动物。输入显示负控件。酒吧, 20μm. 经出版商和作者许可转载1。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 6
图 6.家庭研究群体中 elisa 和 dna-pcr 检测的图形表示。i 组 (ncx10) 和 ii 组 (nc:20) 分别是对t. cruzi感染和寄生虫学演示的负对照和阳性对照血清。第三组 (ncs31) 包括来自家庭受试者的样本, 其 rdna 带为188 bp, 并具有 t. cruzi的特异性抗体。第四组 (ncs52) 包括在没有特定抗体的情况下, 由 ndna-pcr 188-nt 幅值检测到的 t . cruzi 感染受试者的样本。第五组 (ncs26) 是由家庭研究中无感染人群组成的阴性检测样本。经出版商和作者许可转载1请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 7
图 7. 遗传图和映射锥虫病受感染的家庭人口.该图显示了抗 t. cruzi抗体与 ndna-pcr 检测的比率之间的差异。开放的正方形和圆形, 负男性和女性。红色方块和圆圈, 阳性抗 t-克鲁子抗体和 dna-pcr。黑色方块和圆圈, 仅 ndna-pcr 阳性。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 8
图 8.鸡的免疫耐受孵化锥虫病接种鸡蛋.a) 模拟控制鸡的免疫前抗体谱 (n = 10)。b) 单纯的控制鸡的特异性抗体反应受到 t . cruzi抗原 (n = 20) 的挑战。c) 在接受t. cruzi 抗原 (n = 20) 挑战后, 从t. cruzi 接种的卵中孵化出来的鸡没有特定的免疫反应。a 和 c (024±0.17) 对 b (0.85±0.6) 的光学密度差异具有统计学意义 (p<0.05)。这一数字已从参考26中修改, 并在出版商和作者允许的情况下重新打印。

Figure 9
图 9.人类射精中的感染性锥虫病转化为活跃的小鼠感染.恰加斯病人射精的液体被注入腹腔或小鼠的阴道。这些老鼠在注入三个星期后被牺牲了。顶部车道, t. cruzi巢在心脏 (左) 和骨骼肌 (右)。底部车道, t. cruzi amastigote 巢在输行(左) 和子宫管 (右)。插入显示一个划分的护身符 (圆圈)。注意组织切片中没有炎性浸润。血红素-eosin 污渍。酒吧: 左上角和下角, 20μm;右下角, 10μm. 经出版商和作者许可转载1。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 10
图 10.性传播克鲁子锥那龙感染在小鼠模型系统通过 .t. cruzi感染从长崎传播到天真的配偶, 表现为在南方杂交中揭示的特定 ndna 188-bp 带。(顶车道) 受t.cruzi-的小鼠和天真的小鼠的 pcr 扩增产物的繁殖前剖面。奇数表明, 受 t . cruzi感染的雄性 a 对 e 和雌性 fto-i 小鼠样本。偶数是天真的雌性 (2 至 10) 和雄性 (12 至 20) 小鼠。底部车道, 繁殖后的轮廓显示, 即使是小鼠2至 20获得 t.克鲁兹感染。经出版商和作者 1,30的许可转载。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 11
图 11.曲子锥虫病感染从 f0 长加崎母细胞垂直转移到 f1 后代小鼠.查加崎父母通过一次繁殖遭遇传播了 t. cruzi 感染。受 t. 克鲁子感染的雌性与天真的雄性 a-e 交配, 而天真的雌性则与受 t. 克鲁兹感染的雄性 f-j 交配。育种后, 所有创始人 (f0) 均呈阳性原生动物 ndna-pcr 188-bp 带。南方的印迹揭示了特定的 ndna 带杂交后与放射性标记188而 t 探针在大多数 f1 垃圾。nc, l. braziliensis阴性对照;tc, t. cruzi 阳性控制。经出版商和作者 1,31的许可转载。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 12
图 12.组织病理学记录了没有炎症反应的情况下, 从 f0 到 f1 后代和免疫耐受的性传播。各部分显示 f1 小鼠的附属物、性腺和精子管中的 t . cruzi 形态的生长。在麻醉下对小鼠进行了牺牲, 并在显微镜下对免疫过氧化物染色切片进行了检查。显微显示棕色免疫过氧化物染色 t . cruzi amastigotes 在附属物(a) 的间质和菌丝分化为锥虫流的精子腔中管 (b、cf)。在性腺中看到的阿玛菌窝 (d)。积极控制小鼠的精子管正常组织学 (e)。注意 f1 小鼠睾丸中没有炎症浸润, 显示大量的恰加斯寄生虫。吉姆萨的污渍酒吧: a、b、c 和 e, 20μm;d 和 f, 10μm. 请点击这里查看这个数字的更大版本.

表1。从人类研究家庭 a-d 收集的样本中, 阳性 iif 和 elisa 检测与 ndna-pcr 检测的比率之间的差异 *

团体 * * elisa: 血清抗 ~~ 残酷 a ( %) t. cruzi nDNA-(%)
i-控制非 pcr-(n=10) 10 100元 10 100元
二、控制 ab + pcr + 20/20 100元 20/20 100元
(n = 20)
iii-chagas ab + pcr + 31/109 28。4 31/109 28。4
(n = 31)
iv-查加斯 abr + - - 8 109 76。1
(n = 52)
无氯恰斯非 pcr- 26/109 23。9 26/109 23。9
(n = 26)
* 在第1、第2和第3年的三次不同场合采集的样本中进行三次独立 elisa 和 ndna-pcr 检测的结果。[1]. 通过克隆和测序证实 1888-nt t . cruzi dna 重复的扩增。
* * 消极 (第一组和第五组) 与阳性对象 (第三组和第四组) 之间的差异有统计学意义 (< 0.05 页)。
在 62.6 (52/2 _ 83) 的 pcr 阳性受试者中, iii 组和 iv 组之间的差异是在没有 t . cruzi 抗体的情况下免疫耐受的原因。

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Discussion

在此, 我们讨论了一个基于家庭的研究协议, 该协议回答了人类恰加病是否源于性传播种内感染的问题。早期的研究无法提供t. cruzi感染的性传播证据, 可能是因为关于查加斯病的现有数据和信息是与个人3,4分开获得的, 5,6,7,8, 9,10, 11,12,13。在男孩的生精小管中发现t. cruzi ( 图 1) 是促进临床和流行病学调查的火花。几十年后, 可以想象, 当家庭研究方法和本研究方案中描述的技术可用时, t. cruzi生命周期阶段出现在人类射精1,19

在21例急性恰加斯病病例中, 原生动物的直接寄生虫学演示对于验证 ndna-pcr 扩增产物至关重要, 该产品在所有急性感染 t. cruzi 的受试者的样本中形成了特定的带.这个护理点实验室标记对免疫和核酸检测的结果进行了评估。因此, 基本的长期查加斯病家族研究将人类的发现与在实验动物群体中获得的结果结合起来。根据该协议进行的研究首次揭示了t. cruzi感染是在人类传播的1。

寄生虫特异性抗体检测与核酸检测的比率差别很大, 这表明大多数 ndna 足迹是在没有特定抗 t . cruzi 的情况下由性传播病例造成的抗体。因此, 在没有特定 igg 抗体的情况下, t. cruzi 在表现出阳性 ndna 的家庭成员中的性传播是由于免疫耐受。

免疫耐受被证明在鸡模型系统难熔 t. cruzi 感染后的胚胎生长第一周, 25,26,32,33 , 34岁此后, 未成熟的免疫系统无法识别寄生虫作为身体的外来成分, 这表明鸡的免疫系统对t 克鲁齐的免疫系统耐受性较晚。鉴于这些结果, 耐受是一种自然现象, 1是由于免疫系统在生理条件下自我识别和维护自身身体成分而产生的,25,26,32,33,34. 因此, 从免疫耐受状态向自身免疫性恰加斯心脏病的转变可能与宿主基因组1中 t . cruzi kinetoplast (kdna) 突变引起的效应细胞修饰有关,2,14,23,25,26

研究协议中的关键步骤描述了主要的技术修改和故障排除, 以揭示性传播的恰加斯寄生虫1,14,23,25, 26 : i)选择患有急性恰加斯病的研究家庭3536;(ii) 将野生 t. cruzi急性病例的血液隔离;(iii) 从家属的血液鞭毛虫、berenice t. cruzi 原型、阳性被鉴定的银行 dna 样本和阴性对照 l. braziliensis 中获得 dna 样本;(四) 执行整洁的技术程序, 以证明参与者的鞭毛 ndna 足迹与 berenice t. cruzi原型和那些阳性的库 dna 样本相同;v) 连续一年运行独立的三式 ndna 足迹, 以证明家庭成员中的t. cruzi感染病例三次;(vi) 确保在护理点进行的 ndna-pcr 技术产生通过克隆和测序确定的所有放大器退火到特定引物集的结果, 从而持续显示 t . cruzi 188-nt 序列125282930;) 使用优质商标试剂在三个不同时间点复制血清样本中仍然存在的抗体滴度;) 家庭研究规程显示, 在从查加斯寄生虫感染中采集精液中没有特定血清抗体的情况下, 在胚系细胞中存在活感染个人1;) 前景是, 旨在破除性传播t. cruzi感染的研究方案应揭示五大洲的本土恰加斯病;x) ndna 和 kdna 足迹确保了人类1,2慢性无症状恰加病的诊断;没有 ndna 的情况下,t. cruzi kdna 序列12232526的突变本身就是获得特发性扩张型心肌病 23,25,37,38,39的鉴别诊断。

此外, 在恰加斯患者射精中记录的毒t. 克鲁齐能够在注入小鼠阴道和腹腔时引发广泛的感染。病理研究显示,心脏和骨骼肌以及输孔和子宫管中都有胚。有趣的是, 寄生虫巢不会引起炎症反应, 这会妨碍重要的生殖功能。没有炎症反应使免疫特权在重要的功能结构40,41,42,43, 44, 45,因此解释了在生殖器官中 t . cruzi的未抑制生长。

此外, 对与天真的配偶繁殖的长崎小鼠进行的实验研究进一步解释了 t . cruzi感染在人类中的性传播。受感染的雌性和雄性在过程中将t . cruzi感染传染给了未感染的天真的配偶 , 他们的大部分垃圾都是从父母垂直转移到后代的. 在这些实验中, 初始阶段指的是 t. cruzi 在管内和子宫中的生长, 以及在产生免疫特权的精子管和输孔中的生长。然后, 性传播发生通过寄生阶段的精液或子宫分泌物进入阴道。免疫特权404142434445 是一种允许某些器官 (生殖系统、眼睛和大脑) 向下调节的现象炎症反应, 避免对重要的、敏感的和特定的功能造成损害 40。激素41和几个免疫因子降低调节巨噬细胞41,42,43, 自然杀伤细胞 41, t 淋巴细胞,和 t 调控 (treg) 细胞, 从而协调抑制一些促炎细胞因子和免疫特权触发40,41,42,43, 44,45.

t. cruzi 感染从男性和女性传播到天真的伴侣, 这表明控制查加斯病需要国际团结。本文讨论的结果表明, 需要更有创意的研究。以下近期目标是可以实现的 : ( 一 )为特定和高度敏感的核酸检测开发高通量平台 , 以获得准确的诊断 , 旨在预防传播的感染 ,输血和器官移植, 以及促进临床和流行病学调查, 以确定查加斯病的诊断和流行情况;(二) 促进多中心药物开发方案, 以获得根除t. cruzi 感染的新药;(三)实施适当的教育、信息和通信方案, 让学校、教会、社会组织和保健机构参与, 防止查加斯病的传播。

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Disclosures

提交人声明, 他们没有相互竞争的经济利益。

Acknowledgments

我们感谢伊扎贝拉·杜拉多、卡拉·阿劳霍和聪明的戈梅斯的实验室设施和批评意见, 以及布鲁诺·达拉戈和拉斐尔·安德拉德的技术援助。我们感谢科学促进基金会、国家研究理事会、科技部和巴西教育部人力资源培训机构对这些机构的支持。调查。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BCIP and NBT redox system Sigma-Aldrich 681 451 001
Blood DNA Purification columns Amersham Biosciences 27-9603-01
d-ATP, [α-32P], 250 µCi.   Perkin Elmer   BLU012H
DNA, Solution Salt Fish Sperm AMRESCO 064-10G
dNTP Set, 100 mM Solutions GE Healthcare 28-4065-51
Eco RI Invitrogen 15202-021
Goat anti-human IgG- alkaline phosphatase conjugated Southern Biotech        2040-04
Goat anti-human IgG- FITC conjugated Biocompare MB5198020
Hybond – N+ nylon membrane GE Healthcare RPN303B
Hybridization oven Thomas Scientific 95-0031-02
Micro imaging software cell Sens software Olympus, Japan
Molecular probes labeling System Invitrogen 700-0030
Nsi I Sigma-Aldrich R5584 1KU
Plasmid Prep Mini Spin Kit GE Healthcare 28-9042-70
Plate reader  Bio-Tek GmBH 2015
Rabbit anti-chicken IgG-alkaline phosphatase conjugated Sigma-Aldrich A9171
Rabbit anti-chicken IgG-FITC conjugated Sigma-Aldrich F8888
Rabbit anti-mouse IgG- alkaline phosphatase conjugated Sigma Aldrich A2418 
Rabbit anti-mouse IgG-FITC conjugated Biorad MCA5787
Spin Columns for radio labeled DNA purification, Sephadex G-25, fine Sigma-Aldrich G25DNA-RO 
Taq DNA Polymerase Recombinant Invitrogen 11615-010
Thermal cycler system Biorad, USA 1709703
Vector Systems Promega A1380

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