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Transmissão sexual de tripanosomas americanas de machos e fêmeas para companheiros de ingênua

Immunology and Infection

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Summary

O Trypanosoma cruzi agente da doença de Chagas produz duradouro infecções assintomáticas que se desenvolvem abruptamente em patologia clinicamente reconhecida. O protocolo de pesquisa a seguir descreve um curto prazo baseada na família epidemiológico estudo para desvendar a T. cruzi infecção transmitida sexualmente da mãe à progênie.

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Almeida, A. B., Araújo, P. F., Bernal, F. M., Rosa, A. d., Valente, S. A., Teixeira, A. R. Sexual Transmission of American Trypanosomes from Males and Females to Naive Mates. J. Vis. Exp. (143), e57985, doi:10.3791/57985 (2019).

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Abstract

Tripanossomíase americana é transmitida aos seres humanos por insetos triatomíneos através da ingestão de alimentos contaminados, por transfusão de sangue ou acidentalmente em hospitais e laboratórios de pesquisa. Além disso, a infecção Trypanosoma cruzi é transmitida congenitamente de uma mãe chagásica, a sua prole, mas contribuição do parceiro masculino de contaminação no útero é desconhecida. Os achados de ninhos e aglomerados de amastigotes e de trypomastigotes nas células do ovário theca, no goniablasts e no lúmen dos túbulos seminíferos sugerem que infecções de T. cruzi são transmitidas sexualmente. O protocolo de pesquisa neste documento apresenta os resultados de uma população de estudo família mostrando parasita DNA nuclear, as células mononucleares do sangue diploide e os gametas haploides de assuntos humanos. Assim, três amostras biológicas independentes coletadas um ano separados confirmaram que T. cruzi infecções sexualmente foram transmitidas à descendência. Curiosamente, o específico do anticorpo de T. cruzi foi ausente na maioria de descendência familiar que gerou tolerância imunológica para o antígeno do parasita. Tolerância imunológica foi demonstrada em frango refratário para T. cruzi após a primeira semana de crescimento embrionário e pintos nascidos de ovos flagellate-inoculados foram incapazes de produzir o anticorpo específico. Além disso, a instilação do sêmen humano ejacula intraperitonealmente ou na vagina de ratos ingênuos rendido amastigotes de T. cruzi no epidídimo, tubo seminífero, ducto deferente e tuba uterina, com ausência de inflamação reações nos órgãos imunes privilegiados de reprodução. A criação do T. cruzi-infectados de ratos masculinos e femininos com companheiros de ingênua resultaram na aquisição das infecções, que mais tarde foram transmitidas aos descendentes. Portanto, um programa robusto de educação, informação e comunicação que envolve a população e organizações sociais é considerado necessário para prevenir a doença de Chagas.

Introduction

O protozoário parasita Trypanosoma cruzi pertencentes à família t sofre trypomastigote e amastigotas estágios do ciclo de vida em hospedeiros mamíferos e existe como avaliação do inseto-vetor (Reduviid: Triatominae) intestino e em cultura axénica. Nas últimas décadas, vários estudos têm demonstrado a presença da doença de Chagas em países em quatro continentes consideradas alóctones bug livre1,2,3,4,5, 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. o; a dispersão de tripanosomas americanas foi inicialmente atribuída aos imigrantes latino-americanos para o hemisfério norte, mas a possibilidade de que alguns são casos autóctones da doença de Chagas já não pode ser negada3,4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14. somente reconhecível endógena fonte de T. cruzi transmissão tenha sido atribuída a transferência da mãe chagásica do parasita para a prole em aproximadamente 10% das gestações15; contribuição do parceiro masculino para infecções no útero através de ejacula sêmen manteve-se não reconhecida.

Mais de um século atrás, os investigadores16,17 observadas intracelular de T. cruzi amastigotes nas células do ovário theca e no germe linha células dos testículos de casos agudos da doença de Chagas. Os ninhos e grupos de T. cruzi trypomastigotes e amastigotes em células theca do ovário, no goniablasts e no lúmen dos túbulos seminíferos (Figura 1) de casos de doença de Chagas agudos mortais desenvolvem imune privilégio nos órgãos de reprodução na ausência de inflamatório infiltra18,19. Nas últimas décadas, alguns estudos experimentais demonstraram ninhos das formas amastigotas redondo de T. cruzi no tubo seminífero, epidídimo e ducto deferente , bem como no útero, ovário e tubos células theca de ratos infectados agudamente 1,20,21,22. Além disso, no decurso de estudos familiares para documentar a transferência de DNA mitocondrial de pacientes de Chagas dos pais para seus descendentes, T. cruzi DNA nuclear (nDNA) verificou-se em humano haploide germe de células linha23, de protozoários e estágios de ciclo de vida do parasita foram observados a ejacula de chagásicos ratos24. Esses achados estão de acordo com relatórios sobre a tolerância imunológica alcançado pela progenitura de T. cruzi -infectados hosts na ausência de anticorpos específicos1,25,26. Além disso, relatórios epidemiológicos que sugeriram a propagação endêmica da doença de Chagas para outros continentes,3,4,5,6,7,8 ,9,10,11,12,13 são suportados por estudos experimentais, mostrando que a doença de Chagas pode ser transmitida sexualmente1 . A presente investigação apresenta um protocolo de estudo epidemiológico de família e mostra que a infecção do T. cruzi se propaga por relações sexuais.

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Protocol

O ser humano e as comissões de pesquisa Animal da faculdade de medicina da Universidade de Brasília aprovaram todos os procedimentos com seres humanos e animais de laboratório, respectivamente, em protocolos de pesquisa 2500.167567 e 10411/2011. O Comitê de ética do público Fundação Hospital Gaspar Vianna (protocolo n. º 054/2009 e 2009/11163 CONEP) aprovou os formulários de consentimento livre para o estudo de campo, com extensão para o Ministério da saúde Comissão Nacional de investigação humana (CONEP 2585/04). O protocolo foi ajustado para avaliar o T. cruzi DNA em células mononucleares de sangue diploides e em gametas haploides de ejacula sêmen. Os animais de laboratório receberam atendimento humano; os ratos, submetidos a punção do coração antes do sacrifício, estavam sob anestesia.

1. o recrutamento dos participantes humanos

  1. Certifique-se de que a equipe de pesquisa participa de um programa de doença de Chagas sistema de saúde para fornecer cuidados de saúde para pacientes de Chagas.
  2. Recrute participantes humanos de famílias inscritas no programa, mostrando pelo menos um caso com febre, mal-estar, dor de cabeça, taquicardia e edema, os principais sintomas clínicos do de doença de Chagas aguda14.
  3. Dar cuidados de saúde ao povo nas famílias estudo por um período de cinco anos.
  4. Obter 15 mL de sangue venoso de participantes do estudo em três ocasiões um ano separados, dividir a amostra em três alíquotas de 5 mL e armazená-los na geladeira a 4 ° C.
  5. Coletar 2 mL de ejacula o sémen adultos voluntários dos membros da família e prossiga conforme descrito no passo 3.3.

2. crescimento de parasitas

  1. Usando a alíquota da etapa 1.4, misturar o sangue com 5 unidades de anticoagulante heparina de sódio; fazer uma cultura de inclinação, a inoculação do sangue da família participantes com diagnóstico de doença de Chagas aguda.
    1. Inocular 5ml de sangue humano coagulado em uma inclinação de ágar-sangue 50 mL tampa de rosca tubo mais 5 mL de meio de infusão-tryptose fígado (LIT) e incubar a amostra em uma coqueteleira a 27 ° C durante 3 meses.
    2. Coloque 100 µ l do sobrenadante meio em cima de lâminas de vidro, cobrir com deslizamentos e busca de sangue T. cruzi avaliação sob o microscópio, a cada quatro semanas.
    3. Colher os epimastigote isolados no sobrenadante de LIT axênico a 27 ° C; lavar as células em pH de PBS 7.4, centrifugar a 1.000 x g por 10 min; Dilua a avaliação na pelota em 5 mL de meio essencial modificado do Dulbecco (DMEM).
    4. Inocular os confluentes frascos de cultura de células de músculo L6 com 1 x 106 ECI1-para-ECI21 epimastigote de T. cruzi isolados.
    5. Cresce o T. cruzi ECI1-para-ECI21 e o trypomastigotes do arquétipo de Berenice em culturas de células de músculo L6 em frascos de cultura de 75 mL.
    6. Alimente as células com 15 mL de DMEM em pH 7,4, suplementado com 5% de soro fetal bovino, penicilina 100 UI/mL, 100 estreptomicina µ g/mL, 250 nM L-glutamina e 5% CO2 a 37 ° C1.
    7. Use o controle positivo trypomastigotes do T. cruzi Berenice para fenótipo ECI1-para-ECI21 isolados de cultura de tecidos, conforme descrito na etapa 5.2.
    8. Crescer o controle negativo de Leishmania braziliensis27 em DMEM suplementado com 20% soro bovino fetal apenas e usar as promastigotas parasita como controlo negativo.
    9. Use 1 x 106trypomastigotes ECI1-para-ECI21 deT. cruzi no sobrenadante de cultura de pilha para infectar camundongos. 
    10. Pesquisar trypomastigotes do T. cruzi no sangue cauda após a primeira semana da infecção.
    11. Procure os ninhos dos amastigotes em hematoxilina-eosina manchado seções do coração, músculo esquelético e órgãos reprodutivos de ratos infectados, um mês depois disso.

3. análises PCR e extração de DNA

  1. Coloque 5 mL de sangue (etapa 1.4) alíquota em um tubo estéril de EDTA e realizar a centrifugação gradiente de densidade de 45 min a 3.000 x g. Use uma pipeta para colher as células mononucleares da fase esbranquiçada acima os eritrócitos, lavar as células brancas, duas vezes em 5 mL de PBS, pH 7,4, por centrifugação por 10min a 1.500 x g em um tubo de 15ml diferentes e usar as células para a extração de DNA.
  2. Extrair o DNA do CSE-1 a CSE-21 T. cruzi, de controlo positivo Berenice T. cruzi, do controle negativo de L. braziliensis (etapa 2.1.8) e de células mononucleares de sangue o teste da família humana 109 estudar assuntos1 , 27 , 28.
  3. Diluir 2 mL das amostras de esperma obtido na etapa 1.5 em DMEM (1:4, v/v); Incubar durante 45 min a 5% de CO2 e 37 ° C, recuperar espermatozoides do líquido sobrenadante após centrifugação por 5 min a 13.000 x ge extrair o ADN haploide23.
  4. Coloque 1 mL de células no buffer de extração (10 µM 1% de NaCl, 20 µM EDTA, SDS, 0,04% protease-K e 1% ditiotreitol) e misture as soluções por inversão e a tremer.
    1. Centrifugar as soluções durante 10 minutos a 13.000 x g e 25 ° C e transferir o sobrenadante viscoso para uma coluna de rotação.
    2. Centrifugue a coluna de volta por 1 min a 10.000 x g e descartar o eluato; Adicionar tampão de ligação 500 µ l para a coluna de rotação (Tabela de materiais), centrifugá-lo durante 1 min a 12.000 x ge descartar o eluato.
    3. Adicionar o tampão de lavagem 600 µ l para a coluna de rotação, centrifugue-lo por 1 min a 12.000 x ge descartar o eluato.
    4. Repita essa etapa duas vezes e transferir a coluna de rotação para um tubo de centrífuga micro estéril 1,5 mL.
    5. Adicione 100 µ l de tampão TE, incubar o tubo em temperatura ambiente por 2 min e centrifugar o tubo por 1 min a 12.000 x g. O buffer no tubo microcentrifuga contém o DNA.
    6. Medir as concentrações de DNA executando alíquotas em um gel de agarose 0,8% e pela leitura da absorvância a 260 nm com um espectrofotômetro. Armazene as amostras a-20 º C até o uso na análise do PCR.
  5. Primers de T. cruzi Tcz1/2 uso recozidos à sequência específica 188-nt específico telômero sonda29 e executar o PCR com DNA de sangue e esperma dos sujeitos do estudo familiar, de controlo positivo Berenice T. cruzi e do L. braziliensis controlo negativo.
    1. Prepare a mistura PCR com 10 modelo ng DNA, 0,4 µM de cada par de primers, 2 U de Taq DNA polimerase, 0,2 µM dNTPs e 15 µM MgCl2 em um volume de final 25 µ l.
    2. Iniciar o programa de amplificação de DNA a 94 ° C por 30 s para desnaturar o modelo e arrefecer as amostras a 55 ° C por 30 s. Em seguida, incubar as amostras a 94 ° C por 90 s para estender os primers recozidos. Retornar a temperatura de 94 ° C por 30 s para iniciar o próximo ciclo e incubar as amostras um adicional 3 min a 72 ° C. No final do ciclo de 32nd , arrefecer as amostras durante 10 minutos à temperatura ambiente e armazená-los na geladeira a 4 ° C29.
    3. Amplifica uma sequência de repetição de telômero do DNA de T. cruzi recozida para os primers Tcz1/2 em ambas as extremidades.
    4. Analisar os produtos de amplificação em um gel de agarose de 1,3% e observar as bandas de DNA de 188-nt um UV-iluminador.

4. hibridação do Sul

Nota: Hibridação do Sul foi usada para descartar a maioria do falso positivo PCR amplicons no gel do agarose.

  1. Submeta os produtos de amplificação do PCR de controles não infectados, de Chagas casos controlos positivos, de 109 amostras de teste de DNA diploide e haploides DNA de estudo 21 participantes familiar para hibridação do Sul .
  2. Empregar a T. cruzi 188-nt DNA específico telômero sequência sonda recozida para os primers Tcz1/2 mostrados; rotular a sonda com [α -32P] 2'-Desoxiadenosina trifosfato (dATP) usando um primer aleatório rotulagem kit e analisar os produtos de amplificação em um gel de agarose de 1,3% em 60 V durante a noite a 4 ° C.
  3. Transferi o gel para uma membrana de nylon positivamente carregado usando o método capilar durante a noite.
  4. Cruzar as bandas de DNA transferidas para a membrana de nylon com a prova radiolabeled 188-nt, que vincula o digere EcoR1 do DNA genômico em 25 µ l de buffer enzima específica por períodos variáveis.
  5. Lave a membrana duas vezes por 15 min a 65 ° C com 2 x SSC e 0,1% SDS.
  6. Expor as películas de raio x para a membrana de nylon e autoradiograph as bandas na membrana por uma semana.
  7. Crescem os clones selecionados de PCR e Southern hibridização com os produtos de amplificação do PCR do T. cruzi , que são cruzadas com a prova de DNA específica radiolabeled.
  8. Comercialmente Sequencie os clones usando os primers Tcz1/2 conjunto recozidos para o T. cruzi -telômero específico pegada2,23.

5. imunológicos ensaios

Nota: A sensibilidade e especificidade da imunofluorescência indireta (IIF) e o ensaio imunoenzimático (ELISA) foram avaliados no soro de seis pacientes de Chagas, com parasitemia demonstrável e de seis Chagas-livre, deidentified soro banco de samples. Os ensaios realizados com as diluições do soro duplo em PBS, pH 7,4, reveladas que o IIF em diluições de 1: 100 e as ELISA densidades ópticas (ODs) em 0.150 e acima separaram o lado positivo dos resultados negativos.

  1. Usar 5 mL de sangue coagulado alíquota (etapa 1.4) mantido em temperatura ambiente durante 1 h e centrifugue a 1.500 x g durante 30 min separar o soro no sobrenadante.
  2. Executar o IIF e ELISA em diluições de soro de 1: 100 triplicado para detectar os antígenos de T. cruzi e L. braziliensis , conforme descrito anteriormente28.
  3. IIF
    1. Realizar o ensaio IIF em diluições do soro triplicado de amostras dos assuntos 109 estudo obtidas em três ocasiões um ano separados.
    2. Coloque 5 suspensões µ l de formalina a 1% - tratamento avaliação de T. cruzi ou promastigotas de L. braziliensis em lâminas de vidro; Deixe-a parasitas secar durante a noite em uma capa à temperatura ambiente e armazenar as lâminas de vidro a-20 ° C até o uso.
    3. Lugar de 20 µ l de diluições do soro dos pacientes em cima de lâminas de vidro revestido com 5 µ l da avaliação de T. cruzi de formalina-matou (10 parasitas / µ l) ou L. braziliensis promastigotas.
    4. Incube a lâmina de vidro coberta com um deslize por 1h em uma câmara úmida a 37 ° C e lavar três vezes com PBS.
    5. Incubar a lâmina de vidro secas ao ar com uma diluição de 1:1,000 de um anticorpo de coelho rotulado de fluoresceína (Tabela de materiais) para IgG humana durante 1 h a 37 ° C; Lave e seque o slide.
    6. Montar o slide com uma lamínula e examiná-la sob um microscópio de luz UV.
      Nota: Um exame positivo é um verde-maçã silhueta epimastigote de T. cruzi , mostrada no vídeo.
  4. ELISA
    1. Execute um ELISA para detectar o T. cruzi e os antígenos solúveis de L. braziliensis (1 µ g/100 μl de tampão de carbonato de 0,1 M, pH 9,6) em poços da microplaca revestida.
    2. Incube as diluições do soro de 1: 100 em triplicado Poços revestidos por 2h, à temperatura ambiente.
    3. Lavar as placas três vezes com PBST (PBS contendo 0.5% Tween-20), pH 7,4, solução antes da secagem.
    4. Incubar as placas com 50 µ l de uma diluição de 1:1,000 de anticorpos IgG anti-humano de coelho para 90 min a 37 ° C.
    5. Lavar as placas três vezes com solução PBST e deixe-os secar à temperatura ambiente.
    6. Incubar as placas com 100 µ l de 1:1,000 diluições de caprinos conjugados a fosfatase alcalina anti-IgG de coelho (Tabela de materiais) para 90 min a 37 ° C.
    7. Lavar as placas três vezes com PBST, adicionar o fosfato de fenil substrato p-nitro e esperar pelo desenvolvimento de cor.
    8. Leia os ODs em 630 nm em um leitor de placa multimodo.
    9. Executar as triplicado diluições do soro teste da população estudada e plotar os ODs para identificar o específico do T. cruzi anticorpos.

6. as avaliações de tolerância imunológica

Nota: Um modelo de sistema de frango foi usado para testar o T. cruzi infecções após a primeira semana do desenvolvimento embrionário.

  1. Inocular ovos férteis de galinha com 10/100 µ l T. cruzi trypomastigotes colhidos em meio de cultura de tecidos; inocule ovos controle simulado com 10 trypomastigotes do T. cruzi por µ l de meio de cultura. Sele o furo com fita adesiva.
  2. Incube 20 T. cruzi -infectadas ovos e um número igual de ovos férteis de controle simulado a 37 ° C e 65% de umidade durante 21 dias.
  3. Manter os filhotes a escotilha na incubadora durante 24 h e, posteriormente, a 32 ° C, na versão com controle de temperatura por três semanas.
  4. Crescem os pintos nascidos de ovos T. cruzi -inoculadas e de ovos de simulação de controle para a fase adulta em um quarto de pressão de ar positiva a 24 ° C, em gaiolas individuais colocadas nos corredores separados.
  5. Desafio todos os filhotes adultos três vezes em seis meses de idade com 107 formalina-matou trypomastigotes injetadas por via subcutânea, semanalmente, de acordo com o esquema no vídeo.
  6. Tirar sangue de uma veia de asa de galinhas que eclodiram a partir os ovos de T. cruzi -inoculadas e dos controles simulados de quatro semanas após a última imunização para obter o soro.
  7. Usar o soro de frango para detectar o específico do anticorpo de T. cruzi por IIF e ELISA, conforme descrito na etapa 5 do protocolo.

7. infecção de ratos com T. cruzi de sêmen dos pacientes de Chagas ejacula

  1. Use a ejacula sêmen de um paciente de doença de Chagas PCR + adulto (passo 1.5) e de um indivíduo adulto PCR - Chagas-livre.
  2. Use dois grupos de 12 um mês de idade BALB/c ingênuo os ratos mantidos em capas sob pressão de ar positiva a 24 ° C e alimentados com comida ad libitum.
  3. Instile as alíquotas de sêmen humanas do Chagas-positivo (100 µ l) no peritônio e quantidades iguais na vagina de ratos do grupo-A.
  4. Instile as alíquotas de sémen de controle livre de Chagas (100 µ l) em peritônio e uma quantidade igual de ratos do grupo B na vagina.
  5. Sacrificar os ratos experimentais sob anestesia cinco semanas após os instillations de sêmen e sujeita as secções de tecido de coloração com hematoxilina-eosina.
  6. Utilização de microscopia para procurar trypomastigotes do T. cruzi e amastigotes no coração, músculo esquelético e órgãos reprodutivos em grupos de ratos.

8. transmissão do a infecção do T. cruzi por relação sexual

  1. Use 10 ratos BALB/c de seis semanas de masculino e femininos nos experimentos.
  2. Inocule cinco machos e cinco ratos fêmeas intraperitonealmente com 1 x 105 T. cruzi trypomastigotes da cultura do tecido.
  3. Os ratos se reproduzem até três meses de idade: grupo que será formado por cinco T. cruzi-ratos fêmeas infectados e cinco controla companheiros masculinos infectados; Grupo II será formado por cinco T. cruzi -infectados masculino e cinco controlar companheiros femininos infectados. Grupo III será formado por cinco machos e cinco fêmeas controle ingênuo não infectado companheiros.
  4. Casa cada casal em uma gaiola colocada dentro de um cofre com uma porta de grade e bloquear em 5 mm para evitar a fuga de reprodutor.
  5. Alimente os ratos chow e água ad libitum. Levante um total de 70 desmame progênies em grupos II e eu pelo menos seis semanas.
  6. Tirar o sangue por punção do coração do parental (FO) e ratos de descendentes (F1) sob anestesia, sacrificar os ratos e apresentar seções do coração, músculo esquelético e órgãos reprodutivos para análise patológica.

9. avaliação de privilégio imune

  1. Obter tecidos do T. cruzi-infectados e ingênuo controlar ratos (etapa 8,6) e cortar as amostras de parafina 4 µm seções espessas.
  2. Remover a parafina e desidratar as seções sobre lâminas de vidro com várias mudanças de xileno e classificadas lavagens com etanol 100% para 70%, durante 1 min cada.
  3. Incube as seções de tecido com saponina 0,05% uma vez, seguido por três lavagens de água destilada à temperatura ambiente.
  4. Bloquear as seções de tecido com 5% de leite em pó desnatado de 45 min. lavar as lâminas em 0,1 M PBST e incubar as secções com Chagas do mouse antisoro deT. cruzi ou com o soro de rato de controlo não infectado em um 01:20 diluição por 2 h.
  5. Lave as lâminas três vezes por 5 min em PBST e seco à temperatura ambiente antes de incubação com uma diluição de 1:1,000 de anti-rato de coelho conjugados a fosfatase alcalina IgG.
  6. Lavar as lâminas em PBST e adicionar 100 µ l de 3,3' diaminobenzidina para uma incubação de 5 min, seguida de três lavagens com PBST e counterstaining com hematoxilina de Harris por 30 s.
  7. Lavar as lâminas em água destilada por 5 min, desidrata-los em 70%, 80%, 90% e 100% de etanol por 1 min e montá-los em glicerina tamponada.
  8. Examinar as lâminas com um microscópio de campo claro e capturar imagens de foto com um micro com o software e um programa do analisador.
  9. Documente o privilégio imune do parasita na ausência de reações inflamatórias em órgãos reprodutivos.

10. estatísticas análises

  1. Use editar biomédica para análise de sequências, realizar alinhamentos com explosão e determinar a significância estatística E-value (p < 0,05).
  2. Executar um unidirecional análise de variância (ANOVA) e o teste de Tukey para comparar o OD significa mais ou menos desvios-padrão.

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Representative Results

Esta pesquisa, conduzida de acordo com o protocolo, teve como objetivo detectar casos agudos da doença de Chagas por exames clínicos e parasitológicos. Amostras de sangue venoso foram submetidas a exame microscópico direto e cultura in vitro para o crescimento do parasita. Vinte e um casos agudos da doença de Chagas mostraram T. cruzi no sangue. O protocolo de pesquisa garantiu o isolamento do T. cruzi ECI1-ECI21 da doença de Chagas aguda, e o DNA amostras expostas pegadas de DNA positivas no restante da população de estudo: ensaios de PCR-DNAn renderam a sequência de repetição típica telômero com as bandas de 188-nt presentes assim como o T. cruzi Berenice arquétipo1. Os casos de Chagas e seus familiares que se voluntariaram para participar do estudo foram agrupados em quatro famílias1.

Neste estudo familiar, o T. cruzi DNAn foi PCR amplificado com primer define1,23 , recozido a sequência específica dos telômeros de cada um dos 21 casos de doença de Chagas agudos. Estes T. cruzi DNAn amplicons hibridizado com a sonda sequência radiolabeled específica (Figura 2); a clonagem e sequenciamento revelaram que os amplicons compreendia o motivo de repetição de 188-nt telômero de T. cruzi . A especificidade destes procedimentos de hibridização foi mostrada no controle negativo realizado com promastigotas de L. braziliensis . A análise de patologia validado que a hemoflagellates nos pacientes de doença de Chagas agudos foram verdadeiramente virulentos T. cruzi. Podemos concluir que o T. cruzi nDNA (188-bp) banda encontrou o 21 aguda Chagas casos (Figura 2) é uma manifestação direta de infecções persistentes.

Transmissão sexual do Trypanosoma cruzi em humanos

Para avaliar as razões das infecções de T. cruzi , aplicamos o teste de ácido nucleico para detecção de alta sensibilidade das pegadas de parasita na população estudo familiar1. Nestes ensaios PCR, os produtos de amplificação que hibridizado com a sonda de 188-nt específica radiolabeled formaram bandas DNAn em 76,1% (83/109) das amostras de teste; os resultados da hibridação do Sul dos produtos DNAn-PCR amplificação com o específico de prova radiolabeled 188-nt são mostrados na Figura 3. Além disso, a hibridação mostrou o DNA do parasita na linha de células germinativas dos membros da família de voluntários (Figura 4).

IIF foi contratado para o fenótipo a ECI1 para trypomastigotes ECI21 T. cruzi com o soro humano IgG de uma amostra de banco de soro do doença de Chagas com parasitológico demonstração do protozoário no sangue, e uma fluoresceína conjugado anti-humano que IgG foi usado . T. cruzi Berenice era um controlo positivo para os anticorpos Chagas, e o controlo negativo foi o amazonensis de sua família relativo L. braziliensis. A Figura 5 mostra que a silhueta de maçã-verde positiva do arquétipo Berenice correlaciona-se com o selvagem-tipo envelope de T. cruzi , mostrado no vídeo.

A ELISA e IIF revelaram o específico do T. cruzi anticorpos1,28 em 28,4% (31/109) das amostras de ensaio. Os resultados do método ELISA e IIF, bem como aqueles do nDNA-PCR amplicons e hibridação do Sul , são plotados na Figura 6. As discrepâncias entre os resultados das pegadas DNAn-PCR e do anticorpo específico ensaios são descritos em heredograms (Figura 7), A família, quatro indivíduos tinham positivo DNAn e anticorpo antit. cruzi e 11 tinha apenas o DNAn positivo; cinco machos tinham T. cruzi na ejaculação do sêmen. Família B com 44 pessoas, 11 tinham o específico anticorpo de T. cruzi e 23 tiveram tanto o anticorpo específico e o DNAn parasita; sete indivíduos tinham T. cruzi na ejaculação do sêmen. Família C com 29 deputados tinha o anticorpo e o T. cruzi DNAn em cinco indivíduos e 17 tinham o parasita DNAn sozinho; Quatro machos tinham o DNAn-PCR positivo na ejaculação do sêmen. Na família D, entre 21 temas, 11 tinha anticorpo específico antit. cruzi e a pegada DNAn, e nove tinha DNAn-PCR positivo sozinho. Figura 3, Figura 6 e Figura 7 retratam as grandes discrepâncias entre os resultados, consistentemente, nas amostras biológicas obtidas em assuntos familiares em três experimentos independentes, executados um ano separados.

A tabela 1 mostra as diferenças quantitativas entre o IIF, o ELISA e os ensaios de PCR-DNAn nas amostras das famílias estudo humano A-a-i. As discrepâncias entre os rácios dos ensaios de anticorpo (28,4%) e dos ensaios positivos de ácidos nucleicos (76,1%) são estatisticamente significantes (p < 0.005). Estas famílias, as diferenças entre grupos de T. cruzi -infectado pessoas (III e IV) contabilizados 62,6% (52/83) da população, mostrando um teste positivo de ácidos nucleicos sozinho. As grandes discrepâncias entre os rácios de pegadas DNAn positivos e aqueles a específicas de T. cruzi anticorpos foram explicados pelos experimentos conduzidos no sistema modelo de frango.

Tolerância imunológica

A avaliação das respostas imune realizada em grupos de galinhas elevados à fase adulta em gaiolas individuais nos corredores separados contendo galinhas de controle ingênuo (A); simulado de controle galinhas nasceram de ovos inoculados com meio de cultura (B); e galinhas eclodiram entre o T. cruzi ovos inoculados trypomastigotes (C)26. O adulto galinhas nos grupos B e C foram desafiados três vezes com a formalina-matou o antígeno de T. cruzi trypomastigote, semanal, como mostrado no vídeo. O ELISA e os IIF ensaios foram executados com o soro coletado do grupo A, B e C galinhas um mês após o desafio. A Figura 8 mostra a ausência de anticorpo específico em frangos de grupo A e C, que contrastava fortemente com a produção de anticorpos específicos no grupo B imunizada com o antígeno de T. cruzi . Os resultados mostraram claramente o imunológico tolerância no grupo C, nascidas do T. cruzi-inoculados com ovos.

Transmissão sexual do Tente panosoma cruzi em um sistema de modelo de Mouse

Além disso, a infectividade do T. cruzi de ejacular Chagas do paciente, que testou positivo em PCR e faltava o anticorpo específico, demonstrou-se através de instillations de 100 µ l de sêmen na cavidade peritoneal de camundongos machos e passar um igual quantidade de sêmen que incutiu na vagina. Cinco semanas depois, os ninhos de amastigotas de T. cruzi foram detectados no coração e músculos esqueléticos, e aglomerados de diferenciar os parasitas estavam presentes no lúmen do canal deferente e tuba uterina. Curiosamente, as reações inflamatórias destrutivas não cercar os ninhos e aglomerados de amastigotes o T. cruzi (Figura 9).

Ainda mais, a avaliação da transmissão sexual das infecções de T. cruzi foi conduzida em dois grupos de camundongos inoculados intraperitonealmente com 1 x 105 T. cruzi Berenice trypomastigotes formulários1,30, 31. No grupo experimental que, 10 T. cruzi -infectado machos acasalados com 10 ratos fêmeas controle de ingênuo. No grupo experimental II, 10 T. cruzi -infectados fêmeas acasaladas com 10 machos de controle de ingênuo. A Figura 10 mostra que o T. cruzi-infectados de ratos masculinos (A-a-E) e o T. cruzi -infectados de ratos fêmeas (F-g) produziu bandas DNAn 188-bp (números ímpares). Após a reprodução, os companheiros de ingênua (números pares) prontamente adquiriram o T. cruzi após um único encontro sexual com um companheiro chagásica. Experimentos semelhantes de repetição executados sob condições idênticas confirmaram que cada rato masculino ou feminino de ingênuo que sexualmente acasalado com um T. cruzi-infectado do sexo masculino ou feminino adquiriu a infecção flagelada. Estes fundadores DNAn-positivo (F0) gerado descendência que criaram até a idade de seis semanas. Então, o teste e o controle não infectados ratos eram sangrados através de punção de coração para coletar aproximadamente 0,5 mL de sangue. Os ensaios de DNAn-PCR mostraram que as infecções dos fundadores (F0) sexualmente adquiridas foram transmitidas para a progênie F1, conforme mostrado pelas bandas DNAn 188-bp (Figura 11). A progênie F1 eram DNAn-positivo em 41 das 70 (58,6%) amostras examinadas. Estes ratos com bandas DNAn sugestivas de infecções adquiridas na vertical, como poucos como 9 de 41 (22%) tinha anticorpos de T. cruzi .

Os ratos de progênie F1 foram sacrificados sob anestesia, e os tecidos do corpo foram submetidos a análises de peroxidase de coloração patológicas e imunes. Os resultados destes experimentos são mostrados na Figura 12. Os resultados para o amastigotes de T. cruzi foram documentados nas células intersticiais do epidídimo e em goniablasts; amastigotes diferenciar em trypomastigotes estavam presentes no lúmen dos túbulos seminíferos, na ausência de reações inflamatórias.

Figure 1
Figura 1 . Trypanosoma cruzi infecção no túbulo seminífero de um menino que morreu de doença de Chagas aguda . Microfotografia de arquivo médico Teixeira, 197018. As formas de T. cruzi estão em goniablasts, e aglomerados de amastigotes e trypomastigotes livre (setas) estão presentes no lúmen do túbulo seminífero, na ausência de infiltrados inflamatórios1. Manchas de hematoxilina-eosina. Bar, 20 µm. reproduzido com permissão do editor e os autores1,19.

Figure 2
Figura 2 . A pegada do Trypanosoma cruzi da doença de Chagas aguda. Os produtos de amplificação do T. cruzi DNAn-PCR formaram bandas de 188-nt com uma específico de prova radiolabeled 188-nt. TC, T. cruzi; NC, controle negativo. Reproduzido com permissão da editora e o autor1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3 . Sul da mancha análise de Trypanosoma cruzi infecções em indivíduos de famílias do estudo humano. A família - todos os 15 sujeitos mostraram o DNAn-PCR específico bandas 188-nt. Em família B, um total de 35 43 disciplinas (81,4%) formou as bandas DNAn específico. Em família C, entre 29 deputados, 22 (75,8%) formaram as bandas DNAn. Na família D, 11 dos 21 sujeitos (52,4%) tinha as bandas DNAn. O T. cruzi-bandas DNAn específica foram confirmados por clonagem e sequenciamento. Reproduzido com permissão da editora e o autor1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4 . O ativo Trypanosoma cruzi infecções no sêmen ejaculam de estudo família voluntários. As infecções em ejacula Chagas dos pacientes identificadas pelas bandas 188-bp DNAn-PCR. TC, controlo positivo de T. cruzi . NC, L. braziliensis controlo negativo. Reproduzido com permissão da editora e o autor1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5 . O fenótipo de Trypanosoma cruzi anticorpos do soro dos pacientes de doença de Chagas. T. cruzi , identificado com o anticorpo de IgG soro Chagas que reconhece o parasita trypomastigote tratados com um rótulo FITC monoclonal Ab IgG anti-humano. O antit. cruzi Ab não reconhece promastigotas de Leishmania braziliensis . As inserções mostram os controles negativos. Bares, 20 µm. reproduzido com permissão do editor e o autor1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 

Figure 6
Figura 6 . Representação gráfica da Elisa e ensaios DNAn-PCR da família estudar a população. Grupo I (n = 10) e grupo II (n = 20) foram o controle negativo e os soros de controlo positivo, respectivamente, de T. cruzi infecções com parasitológico demonstração. Grupo III (n = 31) incluiu amostras de assuntos familiares com as bandas DNAn 188-bp e anticorpos específicos para T. cruzi. Grupo IV (n = 52) composta por amostra de indivíduos com infecções de T. cruzi detectadas pelo DNAn-PCR amplicons de 188-nt na ausência de anticorpo específico. Grupo V (n = 26) foram amostras de teste negativo, compreendendo o povo livre de infecção no estudo familiar. Reproduzido com permissão da editora e o autor1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7 . o heredograms e o mapeamento da Trypanosoma cruzi- infectado população família. A figura mostra as discrepâncias entre os rácios de antit. cruzi anticorpos e aqueles dos ensaios DNAn-PCR. Praça e círculo, negativo macho e fêmea. Quadrados vermelhos e círculos, positivo, antit. cruzi anticorpos e nDNA-PCR. Quadrados pretos e círculos, DNAn-PCR positivo sozinho. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 

Figure 8
Figura 8 . A tolerância imunológica em frangos provenientes de Trypanosoma cruzi- inoculadas ovos. A) perfil de anticorpos preimmune nas galinhas de simulação de controle (n = 10). Galinhas de B) a resposta imunitária específica no controle ingênuo desafiadas com o antígeno de T. cruzi (n = 20). C) a ausência de uma resposta imune específica em galinhas nascidas do T. cruzi-inoculadas ovos após desafio com o antígeno de T. cruzi (n = 20). A diferença de densidade óptica entre A e C (024 ± 0,17) para B (0,85 ± 0,6) é estatisticamente significativa (p < 0,05). Esta figura foi modificada de referência26 e é reproduzida com permissão da editora e o autor.

Figure 9
Figura 9 . A infecciosa Trypanosoma cruzi em ejacula humana se traduz em uma infecção activa murino. Alíquotas do paciente ejacula Chagas foram instiladas dentro da cavidade peritoneal ou na vagina de ratos. Os ratos foram sacrificados três semanas após a instilação. Top lane, ninhos de amastigotes de T. cruzi no coração (à esquerda) e no músculo esquelético (à direita). Pista de fundo, ninhos de amastigotas de T. cruzi no canal deferente (à esquerda) e no tubo uterino (à direita). A inserção mostra uma divisória amastigotas (círculo). Note a ausência de infiltrados inflamatórios nas seções de tecido. Manchas de hematoxilina-eosina. Bares: superior e inferior esquerdo, 20 µm; canto inferior direito, 10 µm. reproduzido com permissão do editor e o autor1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 10
Figura 10 . A transmissão sexual de Trypanosoma cruzi infecções no mouse modelo sistema por intercurso. A transmissão das infecções T. cruzi de chagásicos para companheiros de ingênua, demonstrados pelas bandas específicas DNAn 188-bp reveladas na hibridação do Sul . Perfis de Prebreeding de faixa superior) dos produtos do PCR amplificação dos ratos T. cruzi -infectados e dos ratos ingênuos. Os números ímpares indicam o T. cruzi-infectados masculino A-a-E e F-a-eu feminino rato amostras. Os números pares são ingênuos fêmea (2 a 10) e os ratos do sexo masculino (12-a-20). Pista de fundo, após a reprodução, o show de perfis que mesmo infecções de T. cruzi de ratos 2-a-20 adquiridos. Reproduzido com permissão da editora e o autor1,30. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 11
Figura 11 . O Trypanosoma cruzi infecção verticalmente é transferida da F0 chagásica parental para os ratos de progênie F1. O pai de chagásicos transmissíveis o T. cruzi por um encontro único de reprodução. O T. cruzi-fêmeas infectadas foram acopladas a ingênua machos A-E, e as fêmeas ingênuo foram acopladas para os T. cruzi -infectados machos F-J. Após a reprodução, todos os fundadores (F0) mostraram a banda de 188-pressão positiva DNAn protozoário-PCR. Mancha do Sul revelou a banda DNAn específico após a hibridização com a prova radiolabeled 188-nt na maioria das ninhadas da F1. NC, L. braziliensis controle negativo; TC, controlo positivo de T. cruzi . Reproduzido com permissão da editora e o autor1,31. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 12
Figura 12 . A histopatologia documentada Trypanosoma cruzi doenças sexualmente transmissíveis de F0 F1 progeny e imunológico tolerância na ausência de reação inflamatória. As seções mostram crescimento das formas de T. cruzi em epidídimo, goniablasts e túbulos seminíferos dos ratos F1. Os ratos foram sacrificados sob anestesia, e as seções manchadas de peroxidase imunes foram examinadas sob um microscópio. As fotomicrografias mostram acastanhado imune manchadas de peroxidase de T. cruzi amastigotes no intersticial do epidídimo (A) e aglomerados de amastigotes diferenciar em trypomastigotes galpão no lúmen do seminíferos túbulo (B, C e e F). O ninho de amastigotas visto em um goniablast (D). Histologia normal de tubo seminífero do mouse controle positivo duplo (E). Note a ausência de infiltrados inflamatórios nos testículos dos ratos F1 mostrando cargas dos parasitas Chagas. Coloração de Giemsa. Grades: A, B, C e E, 20 µm; D e F, 10 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1. As discrepâncias entre os rácios de exames IIF e ELISA positivos e dos ensaios de PCR-DNAn nas amostras coletadas as famílias do estudo humano A-a-D *

Grupos * * ELISA: soro anti-Ab deT. cruzi (%) T. cruzi DNAn-PCR (%)
-Controle Ab - PCR - (n = 10) 10/10 100 10/10 100
II - controle Ab + PCR + 20/20 100 20/20 100
(n = 20)
III - Chagas Ab + PCR + ᵟ 31/109 28,4 31/109 28,4
(n = 31)
IV - Chagas Ab - PCR + ᵟ - - 83/109 76,1
(n = 52)
V - Chagas-free Ab - PCR- 26/109 23,9 26/109 23,9
(n = 26)
* Resultados de três independente ELISA e PCR-DNAn ensaios executados em amostras coletadas em três ocasiões diferentes em anos 1, 2 e 3. [1]. a amplificação do 188-nt T. cruzi DNA repetir confirmado por clonagem e sequenciamento.
* * As diferenças entre os indivíduos positivos (grupos III e IV) e negativos (grupos I e V) são estatisticamente significativas (p < 0,05).
ᵟ as discrepâncias entre os grupos III e IV, explicado pela tolerância imunológica na ausência do anticorpo de T. cruzi atingidas em 62,6% (52/83) dos sujeitos PCR positivos.

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Discussion

Aqui, vamos discutir um protocolo de investigação baseada na família que respondeu à pergunta de se a doença de Chagas humana decorre de doenças sexualmente transmissíveis intraspecies T. cruzi infecções. Estudos iniciais não poderiam fornecer evidências da transmissão sexual das infecções de T. cruzi , provavelmente porque os dados e informações disponíveis sobre a doença de Chagas foram obtidas separadamente o individual3,4, 5,6,7,8,9,10,11,12,13. O achado de T. cruzi no túbulo seminífero de um menino (Figura 1) foi a faísca que estimulou a investigação clínica e epidemiológica. Após várias décadas, é concebível quando família estudar abordagens e as tecnologias descritas no presente protocolo de pesquisa estavam disponíveis, estágios do ciclo de vida de T. cruzi apareceram na ejaculação humana1,19.

A demonstração parasitológico direta do protozoário em 21 casos de doença de Chagas agudos foi crucial para validar os produtos de amplificação DNAn-PCR, que formaram bandas específicas em amostras de todos os indivíduos agudamente infectados com T. cruzi. Este marcador de point-of-care laboratório avaliado os resultados dos ensaios imunológicos e ácidos nucleicos. O fundamental longo prazo Chagas doença familiar estudo, portanto, combina os achados em seres humanos com os obtidos em grupos de animais de laboratório. A pesquisa realizada de acordo com o protocolo revelado pela primeira vez o T. cruzi infecções são transmitidas sexualmente em seres humanos1.

A vasta diferença entre os rácios de ensaios os anticorpos específicos do parasita e aqueles dos testes de ácidos nucleicos indica que a maioria das pegadas DNAn resultou de casos de doenças sexualmente transmissíveis na ausência de específica anti T. cruzi anticorpos. Assim, a transmissão sexual de T. cruzi em membros da família, exibindo DNAn positivo na ausência de anticorpo IgG específico foi devido à tolerância imunológica.

Tolerância imunológica foi demonstrada em um sistema de modelo galinha refratário para T. cruzi infecções após a primeira semana do embrião crescimento1,25,26,32,33, 34. Posteriormente, do sistema imunológico imaturo incapacidade de reconhecer o parasita como uma componente externa do corpo indicado tarde tolerância de sistema imunológico maduro do frango a cruzi T. Tendo em conta estes resultados, a tolerância é um fenômeno natural1 resultantes de auto-reconhecimento do sistema imunológico e a manutenção de seus próprios componentes do corpo sob condições fisiológicas25,26, 32 , 33 , 34. a mudança de estado de tolerância imunológica para doença auto-imune Chagas, portanto, pode ser associada com modificações de células efetoras resultantes de mutações de cinetoplasto (kDNA) de T. cruzi em de genoma do hospedeiro1 ,2,14,23,25,26.

As etapas críticas do protocolo de pesquisa descrevem a modificação técnica principal e solução de problemas a fim de divulgar as doenças sexualmente transmissíveis Chagas parasitas1,14,23,25, 26: eu) selecionando o estudo de famílias com casos de aguda Chagas doença35,36; ii) isolando do selvagem-tipo T. cruzi do sangue dos casos agudos; iii) obter amostras de DNA de flagelados de sangue das famílias participantes, partir do arquétipo de Berenice T. cruzi , de amostras de DNA de banco deidentified positivo e do negativo controlam L. braziliensis; iv) realizando procedimentos técnicos arrumados para demonstrar que a pegada de DNAn flagelados dos participantes é idêntica do arquétipo Berenice T. cruzi e dessas amostras de DNA de banco positiva; footprinting do nDNA triplicado independente de v) para demonstrar as infecções de T. cruzi em membros da família em três ocasiões um ano separados; vi) garantir que a técnica de PCR-DNAn realizada no ponto de cuidado produz resultados confirmados por clonagem e sequenciamento de todos os amplicons recozidos para o primer específico define, assim consistentemente mostrando a sequência de 188-nt de T. cruzi 1,25,28,29,30; vii) usando reagentes de marca de alta qualidade para reproduzir os anticorpos em amostras de soro coletadas em três pontos diferentes do tempo; viii) o protocolo de estudo de família revelou a infecção ao vivo existente nas células germinativas linha mediante a demonstração do T. cruzi DNAn na ausência de anticorpos do soro específico em ejacula sêmen coletados de Chagas parasita infectados indivíduos1; ix) a perspectiva é que o protocolo de pesquisa projetado para desvendar as doenças sexualmente transmissíveis infecções de T. cruzi devem divulgar a doença de Chagas autóctone nos cinco continentes; x) o DNAn e as pegadas de kDNA seguro o diagnóstico da doença de Chagas crônica assintomática em seres humanos1,2; xi) na ausência do DNAn, a mutaçãodo T. cruzi kDNA sequência1,2,23,25,26 sozinho é um marcador de laboratório para realizar o diagnóstico diferencial de cardiomiopatias dilatada idiopática23,25,37,38,39.

Além disso, o virulento T. cruzi documentado no paciente ejacula Chagas foram capaz de iniciar infecções generalizadas após a instilação na vagina do mouse e em sua cavidade peritoneal. O estudo de patologia mostrou ninhos de amastigotas de T. cruzi no coração e músculos esqueléticos, bem como dos vasos deferentes e tuba uterina. Curiosamente, os ninhos de parasita não provocou reações inflamatórias que dificultariam vitais funções reprodutivas. A ausência de reações inflamatórias processa o privilégio imunológico no corpo funcional vital estruturas40,41,42,,43,44,45 e, portanto, explica o crescimento uncurbed de T. cruzi em órgãos reprodutivos.

Além disso, os estudos experimentais em camundongos chagásicos que criados com companheiros de ingênua explicaram ainda a transmissão sexual das infecções de T. cruzi em humanos. As fêmeas infectadas e machos transmissíveis o T. cruzi para os companheiros de ingênua não infectados durante a relação sexual, e a maioria de suas ninhadas adquiriu o T. cruzi verticalmente transferidos de pai para a descendência. Nesses experimentos, a fase inicial refere-se ao crescimento do T. cruzi no tubo e no útero, bem como no túbulo seminífero e canal deferente, onde ocorreu o privilégio imune. Então, a transmissão sexual ocorreu através das fases parasitárias no sêmen ou as secreções uterinas na vagina. Privilégio de imune40,41,42,,43,44,45 é um fenômeno que permite que alguns órgãos (sistema reprodutivo, olhos e cérebro) para downregulate reações inflamatórias e evitar danos importantes, sensíveis e específicas funções40. Hormônios41 e vários fatores imunes downregulate macrófagos41,42,43, células assassinas naturais41, linfócitos T e células T reguladoras (Treg), assim a orquestrar a inibição de um número de cytokines proinflammatory e disparadores de privilégio imunológico40,41,42,,43,44,45.

A transmissão sexual das infecções de T. cruzi de machos e fêmeas para parceiros ingênuo indica que o controle da doença de Chagas exige solidariedade internacional. Os resultados discutidos neste documento sugerem que é necessária uma investigação mais criativa. Os seguintes objetivos imediatos são realizáveis: eu) para desenvolver plataformas de alto rendimento para específicas e altamente sensível do ácido nucleico testes para chegar a um diagnóstico preciso, visando a prevenção de infecções transmitidas por relações sexuais, transfusões de sangue e transplantação de órgãos, bem como facilitar a inquéritos epidemiológicos e clínicos para determinar o diagnóstico e a prevalência da doença de Chagas; ii) promover um programa de desenvolvimento de drogas multicêntrico para obter novas drogas para a erradicação do T. cruzi infecções; e iii) implementar uma educação adequada, o programa de informação e comunicação que inclui a participação de escolas, igrejas, organizações sociais e instituições de saúde para evitar a propagação da doença de Chagas.

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Disclosures

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Acknowledgments

Reconhecemos que as instalações de laboratório e os comentários críticos de Izabela Dourado, Carla Araujo e inteligente Gomes e a assistência técnica de Bruno Dalago e Rafael Andrade. Estamos em dívida para com a Fundação para o avanço da ciência (FAPDF), o Conselho de pesquisa nacional, Ministério da ciência e tecnologia (CNPq/MCT) e a Agência para a formação de recursos humanos, Ministério da educação (CAPES / ME), Brasil, para apoiar estas investigações.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BCIP and NBT redox system Sigma-Aldrich 681 451 001
Blood DNA Purification columns Amersham Biosciences 27-9603-01
d-ATP, [α-32P], 250 µCi.   Perkin Elmer   BLU012H
DNA, Solution Salt Fish Sperm AMRESCO 064-10G
dNTP Set, 100 mM Solutions GE Healthcare 28-4065-51
Eco RI Invitrogen 15202-021
Goat anti-human IgG- alkaline phosphatase conjugated Southern Biotech        2040-04
Goat anti-human IgG- FITC conjugated Biocompare MB5198020
Hybond – N+ nylon membrane GE Healthcare RPN303B
Hybridization oven Thomas Scientific 95-0031-02
Micro imaging software cell Sens software Olympus, Japan
Molecular probes labeling System Invitrogen 700-0030
Nsi I Sigma-Aldrich R5584 1KU
Plasmid Prep Mini Spin Kit GE Healthcare 28-9042-70
Plate reader  Bio-Tek GmBH 2015
Rabbit anti-chicken IgG-alkaline phosphatase conjugated Sigma-Aldrich A9171
Rabbit anti-chicken IgG-FITC conjugated Sigma-Aldrich F8888
Rabbit anti-mouse IgG- alkaline phosphatase conjugated Sigma Aldrich A2418 
Rabbit anti-mouse IgG-FITC conjugated Biorad MCA5787
Spin Columns for radio labeled DNA purification, Sephadex G-25, fine Sigma-Aldrich G25DNA-RO 
Taq DNA Polymerase Recombinant Invitrogen 11615-010
Thermal cycler system Biorad, USA 1709703
Vector Systems Promega A1380

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