Einzellige Transkriptomischen Analysen der Maus endokrinen Zellen der Bauchspeicheldrüse

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Developmental Biology

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Summary

Wir beschreiben eine Methode zur Isolierung von endokrinen Zellen aus embryonalen, Neugeborenen- und postnatale Bauchspeicheldrüsen gefolgt von einzelligen RNA Sequenzierung. Diese Methode ermöglicht Analysen der pankreatischen endokrinen Linie Entwicklung, Zell-Heterogenität und transkriptomischen Dynamik.

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Li, L. C., Yu, X. X., Zhang, Y. W., Feng, Y., Qiu, W. L., Xu, C. R. Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells. J. Vis. Exp. (139), e58000, doi:10.3791/58000 (2018).

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Abstract

Pankreatische endokrine Zellen, die in Inseln gruppiert sind, Regeln Blut-Glukose-Stabilität und Energiestoffwechsel. Die unterschiedlichen Zelltypen in Inseln, einschließlich Insulin-sezernierenden β-Zellen werden von gemeinsamen endokrine Vorfahren während der embryonalen Phase unterschieden. Unreife endokrine Zellen über Zellproliferation zu erweitern und einen lange postnatale Entwicklung Zeitraum Reifen. Allerdings sind die Mechanismen, die diese Prozesse nicht klar definiert. Einzelne Zelle RNA-Sequenzierung ist ein vielversprechender Ansatz für die Charakterisierung von unterschiedlichen Zellpopulationen und Ablaufverfolgung Zelle Abstammung Differenzierung Wege. Hier beschreiben wir eine Methode für die einzelne Zelle RNA-Sequenzierung der isolierte Pankreatische β-Zellen aus embryonalen, Neugeborenen- und postnatale Bauchspeicheldrüsen.

Introduction

Die Bauchspeicheldrüse ist eine wichtige Stoffwechselorgan bei Säugetieren. Die Bauchspeicheldrüse besteht aus endokrinen und exokrinen Fächer. Endokrine Zellen der Bauchspeicheldrüse, Insulin produzierenden β-Zellen und Glukagon produzierenden α Zellen, einschließlich cluster gemeinsam in den Langerhans-Inseln und koordinativ systemische Glukose Homöostase zu regulieren. Dysfunktion der endokrinen Zellen führt zu Diabetes Mellitus, die eine wichtige gesundheitspolitische Frage weltweit geworden ist.

Endokrine Zellen der Bauchspeicheldrüse stammen aus Ngn3+ Vorfahren während der Embryogenese1. Später, während der Perinatalperiode die endokrinen Zellen vermehren sich zu Form unreifen kleinen Inseln. Diese unreifen Zellen weiter zu entwickeln und allmählich reifer Inselchen, die reich durchblutet werden, um Blut-Glukose-Homöostase in Erwachsene2zu regulieren.

Obwohl eine Gruppe von transcriptional Faktoren, die β-Zell-Differenzierung zu regulieren identifiziert worden, ist die präzise Reifung Weg der β-Zellen noch unklar. Darüber hinaus beinhaltet der β-Zelle-Reifung auch die Regulierung der Zelle Nummer Erweiterung3,4 und die Generierung von zellulären Heterogenität5,6. Die Regulierungsmechanismen dieser Prozesse sind jedoch nicht gut untersucht worden.

Einzelne Zelle RNA-Sequenzierung ist ein leistungsfähiger Ansatz, der Zelle Subpopulationen Profil und Zelle Abstammung Entwicklungsbiologie Bahnen7verfolgen kann. Nutzen diese Technologie, die Schlüssel, die Ereignisse, die während der Entwicklung von Bauchspeicheldrüsenkrebs Inselchen auftreten bei den einzelligen Ebene8entziffert werden können. Unter den einzelligen RNA-Sequenzierung Protokolle ermöglicht Smart-seq2 die Erzeugung von in voller Länge cDNA mit verbesserte Empfindlichkeit und Genauigkeit und die Verwendung von standard Reagenzien bei niedrigeren Kosten9. Smart-seq2 dauert ungefähr zwei Tage, eine cDNA-Bibliothek für Sequenzierung10zu konstruieren.

Hier schlagen wir eine Methode zur Isolierung von Fluoreszenz-markierten β-Zellen aus den Bauchspeicheldrüsen von fetalen Erwachsenen Ins1-RFP Transgene Mäuse11, mit Fluoreszenz-aktivierte Zelle Sortieren (FACS) und die Leistung des transkriptomischen analysiert, bei der einzellige Ebene, mit Smart-seq2 Technologie (Abbildung 1). Dieses Protokoll kann erweitert werden, um das Transkriptom alle pankreatischen endokrinen Zelltypen in normalen und pathologischen Altern Staaten zu analysieren.

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Protocol

Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) der Peking-Universität genehmigt.

1. die Bauchspeicheldrüse Isolation

  1. Für E17.5 (embryonale Tag 17,5) Embryonen:
    1. Embryonalen Tag 0,5 Basierend auf dem Zeitpunkt erscheint der vaginal Plug zu schätzen.
    2. Die schwangere Mäuse durch CO2 Verwaltung zu opfern. Sprühen Sie das Bauch-Fell mit 70 % Alkohol.
    3. Machen Sie einen v-förmigen Schnitt mit der Schere aus dem Genitalbereich Erweiterung an den Rippen. Dieser Prozess wird komplett im Bauchraum geöffnet.
    4. Sezieren Sie die Gebärmutter aus der Bauchhöhle zu und legen Sie sie in einer 10 cm Petrischale mit kaltem PBS.
    5. Zerlegen Sie die Embryonen aus der Gebärmutter mit dünnen Spitzen Pinzette unter einem Stereomikroskop, andere Gewebe wie die Plazenta und die Nabelschnur zu entfernen. Legen Sie alle Embryonen in einem 10 cm-Schüssel mit kaltem PBS.
    6. Reißen Sie die Embryonen Bauchhöhle und Graben der viszeralen Gewebes mit Ellenbogen Pinzette. Übertragen Sie die viszerale Gewebe in eine 6 cm-schwarz-unten-Schale mit kaltem PBS.
    7. Die Bauchspeicheldrüse befindet sich in der oberen linken Teil des Bauches und legt auf die Milz, Magen und Zwölffingerdarm (gelbe gestrichelte Linie in Abbildung 2A)12. Lösen der Bauchspeicheldrüsen aus dem viszeralen Gewebe mit Pinzette und bündeln das Pankreasgewebe zusammen in ein 20 mL-Fläschchen mit 5 mL 0,5 mg/mL kalte Kollagenase Lösung: 0,5 mg/mL Kollagenase P in Isolation Puffer (HBSS mit 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2 5 mM Glucose, pH 7.4).
  2. Für Mäuse P0-P15 (postnatale Tag 0-15):
    1. Opfern und die Maus durch die Einhaltung der Gliedmaßen, ein Stück der Benchtop-Protector mit Klebeband fixieren. Sprühen Sie das Bauch-Fell mit 70 % Alkohol.
    2. Vollständig öffnen der Bauchhöhle, wie in Schritt 1.1.3 beschrieben. Ziehen Sie den Darm, und auf der linken Seite der Maus. Dieses Verfahren wird der Zwölffingerdarm, Magen und Milz Lappen der Bauchspeicheldrüse aussetzen. Sorgfältig sezieren Sie alle Lappen der Bauchspeicheldrüse (Abb. 2 b)12 und bündeln Sie das Pankreasgewebe zusammen in ein 20 mL-Fläschchen mit 5 mL 0,5 mg/mL kalte Kollagenase-Lösung.
  3. Für Mäuse P18-P60 (postnatale Tag 18-60):
    1. Bereiten Sie die Kollagenase-Lösung. Auf Eis bis zur Verwendung aufbewahren.
    2. Opfern Sie die Maus zu und öffnen Sie die Bauchhöhle zu, wie bereits erwähnt (Schritt 1.1.2 und 1.1.3).
      Hinweis: Die Leber nicht zu verletzen, jede Wunde, die Leber wird der Fließdruck in den Gallengang verringern und die Perfusion Effizienz der folgende Schritt.
    3. Entfernen Sie die Xiphoid. Ziehen Sie den Darm, und auf der rechten Seite der Maus, und drücken Sie die linken und rechts medialen Lappen der Leber auf jeder Seite der Gallenblase (weißer Pfeil in Abbildung 2) und der hauptgallengang auszusetzen.
    4. Klemmen Sie den Zwölffingerdarm mit ein paar kleinen Schiff Klemmen an der oberen und unteren Position, flankieren die Website, wo der Gallengang tritt in den Zwölffingerdarm (Abb. 2D).
      Hinweis: Die Magen oder Milz Lappen der Bauchspeicheldrüse nicht einspannen. Die Kollagenase-Lösung fließen nicht in den Magen und Milz Lappen der Bauchspeicheldrüse im nächsten Schritt wenn geklemmt.
    5. Füllen Sie eine Spritze mit 5 mL 0,5 mg/mL kalte Kollagenase Lösung und 30 G Nadel in der Gallenblase. Manipulieren Sie sorgfältig und gleichmäßig, die Nadel durch den Gallengang.
    6. Durchspülen der Bauchspeicheldrüsenkrebs durch die Injektion von 1 – 5 mL 0,5 mg/mL kalte Kollagenase Lösung, abhängig von der Größe der Maus. Die Injektion sollte langsam und konstant zu verhindern, dass die Nadel aus dem Rohr rutscht und zu verhindern, dass der Darm platzen unter Hochdruck flüssig sein. Die Injektion ist abgeschlossen, wenn die Bauchspeicheldrüse voll ausgebildet ist.
    7. Die Bauchspeicheldrüse (das gelbe gestrichelte Linie in Abb. 2D) aus der Bauchhöhle mit Pinzette unmittelbar nach der Perfusion zu sezieren. Legen Sie das Gewebe in eine 20 mL-Fläschchen mit 5 mL 0,5 mg/mL kalte Kollagenase-Lösung. Wenn mehrere Mäuse gleichzeitig bearbeiten, durchspülen Sie die Mäuse eins nach dem anderen und bündeln Sie das Gewebe in kalten Kollagenase-Lösung in ein 20 mL Fläschchen zu, bis alle Mäuse seziert worden.

(2) Collagenase Verdauung und Inselchen Isolation

  1. Legen Sie die 20 mL-Fläschchen mit der Bauchspeicheldrüsen-Gewebe in ein Wasserbad von 37 ° C und 3 min auf die Temperatur equilibrate inkubieren.
  2. Schütteln Sie das Rohr für weitere 3 bis 5 Minuten. Wenn die Bauchspeicheldrüse-Gewebe vollständig aufgeblasen ist, wird es nach und nach in kleinen Gewebe Stücke distanzieren, bis es schließlich gleichmäßig verteilt ist. Die Verdauung Zeit hängt von der Bauchspeicheldrüse-Größe und die Perfusion Effizienz.
  3. Filtern Sie das verdaute Produkt durch ein 0,25 mm Nylon Sieb in eine neue 50 mL Zentrifugenröhrchen. Das Sieb mit einer 20 mL Spritze mit eiskaltem PBS gründlich zu waschen.
  4. Überspringen Sie für E17.5-P15 Bauchspeicheldrüsen Schritt 3.1.
  5. Für P18-P60 Bauchspeicheldrüsen 200 X g für 1 min zentrifugieren und den überstand verwerfen. Wieder aussetzen des Gewebes mit kaltem PBS.
  6. Gießen Sie 5 mL der Suspension Gewebe in einer 6 cm schwarz-unten Schüssel. Die pankreatischen kleinen Inseln sind klein, kompakt, milchig weißen Strukturen und acinar Gewebe ist locker und durchscheinend weiß. Wählen Sie Inselchen mit einer 200 μl Pipette aus und übertragen Sie sie in ein 1,5 mL Röhrchen mit einer kleinen Menge an kaltem PBS.

3. Trypsin-Verdauung von Bauchspeicheldrüsen-Gewebe oder Inseln

  1. Zentrifugieren Sie die Röhrchen mit Bauchspeicheldrüsen-Gewebe oder Inseln 200 X g für 1 min bei 4 ° C und verwerfen Sie den überstand, ohne zu stören das Pellet.
  2. Das Pellet mit 0,25 % Trypsin-EDTA wieder auszusetzen und im Wasserbad 37 ° C inkubieren. Aspirieren Sie nach 4 min Inkubation sanft und gelegentlich (Pipette) für 1 min mit 200 μL Spitzen.
    Hinweis: Für E17.5-P3 Bauchspeicheldrüsen, fügen Sie 1 mL Trypsin-EDTA. Fügen Sie für P4-P15 Bauchspeicheldrüsen 3 mL Trypsin-EDTA hinzu. Fügen Sie für 100-300 Inseln 1 mL Trypsin-EDTA. Stellen Sie die Lautstärke von Trypsin-EDTA entsprechend der Menge des Gewebes.
  3. Die Verdauung durch Hinzufügen von 0,4 X Volumen der kalten fetalen bovine Serum (FBS) zu stoppen und durch sanfte Wirbel mischen.
  4. Zentrifuge bei 250 X g für 3 min bei 4 ° C. Den überstand ohne zu stören das Pellet zu verwerfen.
  5. Wieder auszusetzen, die Zellen mit 200 μL kalt FACS Puffer (HBSS mit 1 % FBS, pH 7.4). Übertragen Sie Zellen auf einem 5 mL FACS-Rohr.
  6. Schnell Drehen der FACS-Röhre um die Zellsuspension durch den Filter, unverdaute große Gewebe Ablagerungen zu entfernen gehen zu ermöglichen. Die einzigen Zellsuspension in der Röhre ist nun bereit für die Sortierung von FACS.

4. Single-Zell-Lyse

  1. Bereiten Sie Zelle Lysis Puffer.
    Hinweis: Führen Sie alle Experimente unter einer UV-entkeimt Kapuze mit Laminar-Flow. Alle Rohre, Platten und Pipettenspitzen sollte RNase- / DNase-free. Die Motorhaube und Pipetten mit RNase Weg Lösung vor Gebrauch zu dekontaminieren.
    1. Die Reagenzien auf Eis Auftauen: dNTP (10 mM), Oligo-dT Grundierung (10 μM) und ERCC Lager Lösung (01:20).
    2. Verdünnen Sie das ERCC bis 1:5 x 105 mit Nuklease-freies Wasser.
    3. Berechnen Sie das Volumen der Zelle Lysis Puffer benötigt. Fügen Sie 0,1 μl RNase-Inhibitor (40 U/μl), 1.9 μL von 0,2 % (Vol/Vol) Triton x-100, 1 μl dNTP, 1 μL Oligo-dT Grundierung und 0,05 μL der verdünnten ERCC zu einem Endvolumen von 4,05 μL für jede Zelle.
    4. Aliquot der Zelle Lysis Puffer in 0,2 mL Dünnwand-8-Streifen PCR Schläuche oder 96-Well Platten. Zentrifugieren Sie die Rohre oder Platten für 30 s bei 4 ° C.
      Hinweis: Zentrifugieren Sie 0,2 mL Dünnwand-8-Streifen PCR Schläuche auf 7500 x g und 96-Well-Platten bei 800 X g in den folgenden Schritten.
  2. Einzellige Kommissionierung und Lyse.
    1. Manuell wählen FACS Ins1-RFP+ einzelne Zellen im FACS Puffer in 8 Streifen PCR-Röhrchen mit einer 30-40 µm Kapillare Pipette sortiert, oder direkt sortieren Einzelzellen Ins1-RFP+ in 96-Well-Platten. Das Volume mit einer einzelnen Zelle gilt als weniger als 0,3 μL.
      Hinweis: Verwendung forward Scatter Höhe (FSC-H) Vs vorwärts Scatter Bereich (FSC-A) gating Strategie für Wams Diskriminierung, FSC-H Vs side Scatter-Bereich (SSC-A) für Schutt und Fluoreszenz gating für Ins1-RFP+ Zellsortierung (Abbildung 3A-3C). Sortieren Sie für die entnahmemethode die Zielzellen in eine 1,5 mL Röhrchen mit 300 μL FACS Puffer. Die entsprechenden Endkonzentration wird 5 – 10 Zellen/μL. Das Puffervolumen entsprechend anpassen. Sortieren Sie für die Platte Erfassungsmethode eine einzelne Zelle in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte nach dem Handbuch des Instruments. 7 , 13
    2. Wirbel der Rohre oder Platten zur lyse der Zellen und lassen Sie die RNA. Zentrifugieren Sie die Rohre oder Platten für 30 s bei 4 ° C und sofort auf Eis legen.
      Hinweis: Die Zellen können bei-80 ° C eine Woche aufbewahrt werden.

(5) einzellige cDNA Amplification

  1. Reversen Transkription (RT).
    1. Die RT-Reagenzien (Tabelle 1) auf dem Eis Auftauen.
    2. Die Proben bei 72 ° C für 3 min inkubieren und sofort setzen die Rohre oder Platten auf Eis für mindestens 1 min. kurz Zentrifugieren die Rohre oder Platten für 30 s bei 4 ° C.
      Hinweis: Verwenden ein Thermocycler mit 105 ° C erhitzt, Deckel für alle Inkubationen.
    3. Bereiten Sie die RT-Mischung für alle Reaktionen, wie in Tabelle 1beschrieben.
    4. 5.7 μl RT-Mix für jede Probe insgesamt 10 μL Volumen zu verzichten. Sanft die Mischung Vortex und Zentrifuge für 30 s bei 4 ° C.
    5. Legen Sie die Proben in einem Thermocycler und starten Sie das RT-Programm wie folgt: 42 ° C für 90 min, 10 Zyklen (50 ° C für 2 min, 42 ° C für 2 min), 70 ° C für 15 min und Halt bei 4 ° C.
  2. PCR-Vorverstärkung.
    1. Die PCR Reagenzien (Tabelle 2) auf dem Eis Auftauen.
    2. Vorbereiten des PCR-Mixes für alle Reaktionen, wie in Tabelle 2beschrieben.
    3. 15 μl des PCR-Mixes zu jeder Probe, enthält die erste Strang Reaktionen zu verzichten. Sanft die Mischung Vortex und Zentrifuge für 30 s bei 4 ° C.
    4. Legen Sie die Proben in einem Thermocycler und starten Sie das folgende PCR-Programm: 98 ° C für 3 min, 18 Zyklen (98 ° C für 20 s, 67 ° C für 15 s, 72 ° C für 6 min.), 72 ° C für 5 min und Halt bei 4 ° C.
      Hinweis: Das PCR-Produkt kann bei 4 ° C für weniger als eine Woche oder bei-20 ° C/-80 ° C für bis zu 6 Monate gespeichert werden.
  3. PCR-Reinigung.
    1. Jede Probe 25 μL neu suspendierten DNA Reinigung Perlen (1 X) aus dem vorherigen Schritt und die Mischung gut durch Wirbel hinzufügen. Dann schnell Drehen des Rohres oder Platten bei Raumtemperatur zu sammeln die Flüssigkeit aber vermeiden die Ansiedlung von Perlen.
      Hinweis: Equilibrate DNA Reinigung Perlen auf Raumtemperatur für 15 min und Vortex gründlich vor der Anwendung.
    2. 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
    3. Ort der Röhre oder Platte auf eine entsprechende magnetische stehen, bis die Lösung klar ist, dann sorgfältig entfernen und entsorgen den überstand.
    4. Fügen Sie 200 μL von frisch zubereiteten 80 % Ethanol, waschen Sie die Perlen in die Magnetstativ, inkubieren Sie für 30 s, dann vorsichtig entfernen und entsorgen Sie die Ethanol-Lösung.
      Hinweis: Die 80 % (Vol/Vol) Ethanol-Lösung sollte frisch jedes Mal vorbereitet werden.
    5. Wiederholen Sie Schritt 5.3.4 für eine Gesamtmenge von zwei Wäschen.
    6. Sorgfältig entfernen und entsorgen Sie die restlichen Ethanol-Lösung und Luft trocknen die Perlen und die Röhre oder Platte ist auf dem magnetischen Stand.
      Hinweis: Vermeiden Sie übermäßig trocknen die Kugeln, um die maximale Elution Effizienz zu gewährleisten.
    7. Fügen Sie 11 μL der Nuklease-freies Wasser zu eluieren DNA Ziel von Perlen und mischen Sie gut durch Wirbel. Dann schnell drehen Sie des Rohres oder Teller und legen Sie es auf einem Magnetstativ, bis die Lösung klar ist. Übertragen Sie 10 μl der Probe auf eine neue PCR-Rohr.
      Hinweis: Nach der Reinigung, Verteilung Formaterkennung cDNA anhand einer einzigen Runde gäbe es Dimere reinigen Sie wieder um die dimere vollständig zu entfernen. Die dimere können die cDNA Ertragsberechnung beeinflussen, wenn erlaubt, in die Stichprobe zu bleiben.
  4. Qualitäts-Check der cDNA.
    1. Wählen Sie nach dem Zufallsprinzip Proben, die cDNA Gesamtausbeute mit einem Fluorometer zu erkennen.
    2. Bewerten Sie die Marker-Gen Ausdruck Niveaus durch Echtzeit-PCR (qPCR) (Abb. 4E). 1 μl der Probe zu verdünnen 40mal und 384-Well-Platte mit qPCR durchführen zu entfernen. Bereiten Sie den qPCR-Mix, wie in Tabelle 3beschrieben. Radsport-Bedingungen: 95 ° C für 10 min, 45 Zyklen (95 ° C für 10 s, 60 ° C für 15 s, 72 ° C für 15 s).
    3. Wählen Sie nach dem Zufallsprinzip Proben, die Größenverteilung mit einem parallelen Kapillarelektrophorese Instrument zu erkennen.

(6) cDNA Bibliotheksbau

  1. Tagmentation Reaktion von Tn5 Transposase.
    1. Die cDNA Gesamtausbeute qPCR-ausgewählte Zellen aus Schritt mit einem Fluorometer 5.4.2 zu erkennen. Verwenden Sie 2 ng cDNA als Ausgangsmaterial.
    2. Die Tagmentation Reaktion Reagenzien (Tabelle 4) auf dem Eis Auftauen.
    3. Bereiten Sie die Tagmentation Reaktion in einem 0,2 mL Dünnwand-8-Streifen PCR-Röhrchen, wie in Tabelle 4, beschrieben und durch Wirbel vermengen Sie vorsichtig. Dann schnell spin-down der Lösung bei Raumtemperatur.
    4. Die Proben bei 55 ° C für 10 min inkubieren und bei 4 ° c zu halten
    5. Fügen Sie 2 μL 5 X TS sofort jede Probe mit der Tagmented DNA, um die Reaktion zu stoppen hinzu. Durch Wirbel vorsichtig umrühren und dann schnell spin-down der Lösung bei Raumtemperatur.
    6. Inkubieren Sie die Mischung für 5 min bei Raumtemperatur. Die DNA sollte für die endgültige Bereicherung PCR sofort verarbeitet werden.
  2. Verstärkung der Adapter ligiert Fragmente.
    1. Die PCR Reagenzien (Tabelle 5) auf dem Eis Auftauen.
    2. Bereiten Sie die Anreicherung PCR Mischung, wie in Tabelle 5, beschrieben zu und mischen Sie sorgfältig durch Wirbel. Dann schnell spin-down der Lösung bei Raumtemperatur.
    3. Die PCR mit das folgende Programm ausführen: 72 ° C für 10 min, 98 ° C für 30 s, 8 Zyklen (98 ° C für 15 s, 60 ° C für 30 s, 72 ° C für 3 min), 72 ° C für 5 min und Halt bei 4 ° C.
      Hinweis: Die Anzahl der Zyklen richtet sich nach der erwarteten Bibliothek DNA-Menge.
  3. PCR-Reinigung mit Größenauswahl.
    1. Jede Probe 14 μL neu suspendierten DNA Reinigung Perlen (0,7 X) aus dem vorherigen Schritt und die Mischung gut durch Wirbel hinzufügen. Dann drehen Sie schnell das Rohr bei Raumtemperatur zu sammeln die Flüssigkeit aber vermeiden die Ansiedlung von Perlen.
      Hinweis: Equilibrate DNA Reinigung Perlen auf Raumtemperatur für 15 min und Vortex gründlich vor der Anwendung.
    2. 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
    3. Legen Sie das Rohr auf eine entsprechende Magnetstativ, bis die Lösung klar ist, sorgfältig übertragen des Überstands zu einem neuen Schlauch Streifen und entsorgen den vorherigen Röhre Streifen.
    4. Fügen Sie 3 μL neu suspendierten DNA Reinigung Perlen (0,15 X) zu jeder Probe in der Röhre Streifen und die Mischung gut durch Wirbel. Dann drehen Sie schnell das Rohr bei Raumtemperatur.
    5. 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
    6. Ort der Röhre oder Platte auf eine entsprechende magnetische stehen, bis die Lösung klar ist, dann sorgfältig entfernen und entsorgen den überstand.
    7. Fügen Sie 200 μL von frisch zubereiteten 80 % Ethanol, waschen Sie die Perlen in die Magnetstativ, inkubieren Sie für 30 s, dann vorsichtig entfernen und entsorgen Sie die Ethanol-Lösung.
      Hinweis: Die 80 % (Vol/Vol) Ethanol-Lösung sollte frisch jedes Mal vorbereitet werden.
    8. Wiederholen Sie Schritt 6.3.7 für eine Gesamtmenge von zwei Wäschen.
    9. Sorgfältig entfernen und entsorgen Sie die restlichen Ethanol-Lösung und Luft trocknen die Perlen und die Röhre oder Platte ist auf dem magnetischen Stand.
      Hinweis: Vermeiden Sie übermäßig trocknen die Kugeln, um die maximale Elution Effizienz zu gewährleisten.
    10. Fügen Sie 11 μL der Nuklease-freies Wasser zu eluieren DNA Ziel von Perlen und mischen Sie gut durch Wirbel. Dann schnell drehen Sie des Rohres oder Teller und legen Sie es auf einem Magnetstativ, bis die Lösung klar ist. Übertragen Sie 10 μl der Probe auf einem neuen Schlauch Streifen.
  4. Qualitäts-Check der endgültigen cDNA-Bibliothek.
    1. Messen Sie die Konzentration von jeder Bibliothek mit einem Fluorometer und prüfen Sie die Größenverteilung mit einem parallelen Kapillarelektrophorese-Instrument.
      Hinweis: Die DNA-Ausbeute ist in der Regel zwischen 15 – 25 ng für jede Bibliothek. Die Fragmente von 250 bp auf 450 bp beobachtet werden. Wenn Dimere nach der Reinigung, bleiben wie die Verteilung Überprüfung bestätigt, mit 1 x DNA Reinigung Perlen noch einmal zu reinigen.
  5. Pooling-Bibliothek
    1. Basierend auf die ungefähre Fragmentgröße Pool gleiche Mengen von DNA von jeder Probe, um sicherzustellen, dass keiner von ihnen die gleichen Kombinationen von N6XX und N8XX-Adapter enthalten.

(7) DNA-Sequenzierung

  1. Fachbibliotheken Barcode zu 51 bp Einend-Sequenzierung mit einem Hochdurchsatz-Sequenzierung System. Führen Sie die Sequenzierung nach der Hersteller-Protokolls. Die Sequenzierung Tiefe jeder Zelle beträgt etwa 1 Million im Durchschnitt8, liest mindestens 0,5 Millionen pro Zelle14liest.

(8) Bioinformatik-Analysen

  1. Sequenzierung Qualitätsbewertung und Ausrichtung.
    1. Bewertung der Qualität der sequenzielle Lesevorgänge mit FastQC (v0.11.3)15 mit den folgenden Parametern: "Fastqc - Extrakt -o Output_dir Input_fastq".
    2. Zusammenführen der Maus Genom mit dem ERCC-Sequenzen mit dem Befehl "cat mm10.fa ERCC.fa > mm10_ERCC.fa".
    3. Bowtie2 zu bauen (v2.2.5)16 Index mit den folgenden Parametern: "bowtie2-Build mm10_ERCC.fa mm10_ERCC".
    4. Richten Sie liest mit tophat2 (v2.1.0)17 mit den folgenden Parametern: "tophat2 -o Output_dir -G gene.gtf--Transkriptom-Index Trans_index mm10_ERCC Input_fastq".
  2. Gen Ausdruck Niveaus zu quantifizieren.
    1. Graf abgebildet liest für jedes Gen mit HTSeq (V 0.6.0)18 mit den folgenden Parametern: '' Htseq-Count - f Bam - R pos -s keine - ein 30 accepted_hits.bam gene.gtf > read_count.txt''.
    2. Normalisieren Sie die Gen Ausdruck Ebenen Transkripte pro million (TPM)19.
  3. Qualitätskontrolle der Zellen.
    1. Zellen mit weniger als 0,5 Millionen zugeordneten liest oder weniger als 4.000 Gene auszuschließen (TPM > 1).
      Hinweis: das Kriterium der Ausgrenzung richtet sich nach der Zelltypen und Sequenz Tiefe.
    2. Behalten Sie mit dem Ausdruck endokrine Marker (z. B. Ins1 für β-Zellen, Gcg für α-Zellen) Zellen und schließen Sie Zellen mit dem Ausdruck nicht endokrine Marker (z. B. Spi1 für Leukozyten aus).
  4. Hauptkomponentenanalyse (PCA)
    1. Hochvariablen Gene nach ERCC Spike-ins, wie zuvor beschrieben20zu identifizieren.
    2. Führen Sie mithilfe der Funktion "PCA" in der R FactoMineR (v1.31.4)21, Paket mit PCA log2(TPM + 0.1) hochvariablen Gene.
    3. Visualisieren der PCA-Ergebnisse mit ggplot2 (v2.0.0)22.
  5. Hierarchische Cluster.
    1. Identifizieren Sie mit den höchsten Hauptkomponente (PC) Belastungen, die mit der Funktion "Dimdesc" FactoMineR (v1.31.4)21Gene.
    2. Führen Sie hierarchische Cluster mithilfe der Funktion "heatmap.2" in der R-Paket Gplots (v3.0.1)23, mit log2 (TPM + 1) relative Werte des hohen PC laden Gene.

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Representative Results

Bauchspeicheldrüsen von embryonalen, Neugeborenen- und postnatale Mäusen seziert wurden (Abbildung 2A und 2 b). Für Mäuse älter als postnatale 18.Tag hängt die verdauungsfördernde Wirkung vom Grad der Durchblutung; die Injektion ist daher der wichtigste Schritt zur Insel Isolierung (Abbildung 2-2E und Tabelle 6). Wie viel Kollagenase injiziert wurde, da die Bauchspeicheldrüse bei diesem Schritt füllen konnte. Die völlig überhöhte Bauchspeicheldrüse ist in Abb. 2Ddargestellt. Wenn die Durchblutung nicht erfolgreich (Abb. 2E ist), aber die Probe kostbar ist, kann die Bauchspeicheldrüse in kleine Stücke für eine ausreichende Verdauung später abgerissen werden.

Nach Perfusion war der Bauchspeicheldrüse-Gewebe in kleine Stücke freizugebende Inselchen (Abb. 2F) verdaut. Um die Sortierung FACS-Zeit zu verkürzen, angereichert wir die endokrinen Zellen durch Abnehmen der Inselchen im voraus. Die Größe der Inseln variieren je nach der Maus Alter und die Intensität der Verdauung. Gelegentlich sind die Inseln nicht rund. Inselchen sollte je nach Farbe und kompakten Zustand (Abbildung 2 und Tabelle 6) gewählt werden. Wenn die transgenen Maus-Sorte ein Reportergen wie GFP oder RFP für endokrine Zellen hat, könnte die Inseln auch unter dem Fluoreszenzmikroskop entnommen werden.

Ins1-RFP+ Zellen wurden durch FACS sortieren (Abb. 3A-3 C) gereinigt wurden, und dann einzelne Zellen mit einer Kapillare Pipette für einzellige RNA-Seq (Abbildung 3D). Erfolgreich verstärkte cDNA hätte einen in vollen Länge über 500 bp und von 1,5 kb auf 2 kb angereichert werden. Darüber hinaus gibt es in der Regel eine 500-600 bp Bereicherung der cDNA beobachtet in den Ins1-RFP+ -Zellen, die Insulin-Transkripte (Abb. 4A) darstellen können. Allerdings gab es einige Ausnahmesituationen beobachteten10 (Tabelle 6). Zum Beispiel die cDNA-Fragmente in der Nähe von 100 bp sind Grundierung Dimere (Abbildung 4 b), die in der Regel durch die übermäßige Primer verursacht werden, die durch Wiederholung den DNA Reinigungsschritt entfernt werden müssen. Die Existenz der Grundierung Dimere beeinflussen die Berechnungen der gesamten cDNA Erträge, die für die folgenden Bibliotheksbau verwendet werden. Die cDNA-Fragmente zwischen 100 bp und 500 bp in der Regel Stellen abgebaut cDNA (Abbildung 4), verursacht durch schlechte Zelle Status oder Reagenz Probleme wie RNase Kontamination. Unter dieser Bedingung sollten wir die Ursache des DNA-Abbau und die Störung ausschließen. Zum Beispiel, um gute Zelle Stand zu gewährleisten, sollten Gewebe verdaut werden Zellen sortiert werden sollen, schnell und schonend und Operationen sollten vorsichtig ausgeführt werden, um jede Art von Schadstoffen zu vermeiden.

Nach der Reinigung der cDNA-Bibliotheken für die Sequenzierung erhielten wir cDNA Fragmente unterschiedlicher Größe anhand der Anweisungen für das Hinzufügen von verschiedenen Übersetzungen von DNA Reinigung Perlen auf die Probe. Zum Beispiel erhalten wir cDNA von 250 bp 450 bp durch Hinzufügen von 0,7 x und 0,15 x DNA Reinigung Perlen zum ersten und zweiten runden der Läuterung, bzw. (Abbildung 4). Dieser Schritt hat eine hohe Erfolgsquote. Allerdings gibt es Fragmente von etwa 100 bp, es empfiehlt sich, um die Bibliotheken wieder mit 1 x DNA Reinigung Perlen entfernen Dimere (Tabelle 6) zu reinigen. Gesehen Dimere werden die DNA-Quantifizierung schief und die Probe Bündelung der Ergebnisse, die Ergebnisse in die unebene Datenerfassung von jeder Probe beeinflussen werden.

Wir analysieren die Sequenzierungsdaten mit Bioinformatik Ansätze (Abb. 5A). Die Sequenzierung Qualitätsfaktoren sollte größer als 30 sein, während der Sequenzierung Qualitätsbewertung (Abb. 5 b). Nach dem ausrichten werden 80-90 % der Lesevorgänge voraussichtlich das Referenz-Genom zugeordnet werden. Um qualitativ hochwertige Zellen für nachgelagerte Analysen zu erhalten, wir Zellen mit weniger als 0,5 Millionen zugeordneten liest ausgeschlossen oder mit weniger als 4.000 Gene (Abbildung 5 und 5D) erkannt. Nach PCA und hierarchischen clustering Wir zeichnen sich verschiedene Gruppen von Zellen und die Gene, die in verschiedenen Gruppen8heterogen geäußert wurden.

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Übersicht für einzellige RNA-Seq des endokrinen Pankreas Mauszellen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Bauchspeicheldrüse Dissektion, Perfusion und Inselchen Kommissionierung. (A) Dissektion der embryonalen Bauchspeicheldrüsen-Gewebe aus einem E17.5 Embryo (oben) (unten). Die gelb gepunktete Linie abgrenzt Bauchspeicheldrüse-Gewebe. Maßstabsleiste = 1.000 µm. (B) Dissektion der postnatalen Bauchspeicheldrüsen-Gewebe aus einer P10-Maus (links) (rechts). Maßstabsleiste = 1.000 µm. (C-D) das Pankreasgewebe Mausklick P60 vor (C) und nach (D) Perfusion. Die gelb gepunktete Linie abgrenzt Bauchspeicheldrüse-Gewebe. Weißen Pfeil zeigt die Gallenblase. (E) die teilweise PERFUNDIERTEN Pankreasgewebe Mausklick P60. Roter Pfeil zeigt den gut PERFUNDIERTEN Bereich der Bauchspeicheldrüse. Blaue Pfeile zeigt die schlecht PERFUNDIERTEN Bereiche der Bauchspeicheldrüse. (F) der Bauchspeicheldrüsen-Gewebe vor (oben) und nach (unten) Kollagenase Verdauung. (G) Pfeile zeigen auf die Inseln, die von Kollagenase verdaut Pankreasgewebe veröffentlicht wurden. Maßstabsleiste = 200 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: manuell Kommissionierung Zellen mit einer 30-40 µm Kapillare Pipette unter einem Mikroskop. (A-C) Schrittweise FACS gating für die Sortierung Ins1-RFP+ Zellen. (D) die hellen Kreise zeigen die Zellen und das Rohr ist eine Kapillare Pipette. Wählen Sie die Zellen mit besseren Morphologie (Pfeil) und ignorieren Sie die gruppierten Zellen (Pfeilspitze). Maßstabsleiste = 200 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: Qualität Erkennung der cDNA und Bibliothek Größenverteilung der Ins1-RFP+ Zellen durch eine parallele Kapillarelektrophorese Instrument. (A) der Vertreter Ergebnis erfolgreich vorverstärkt cDNA. Normalerweise sollte das cDNA-Profil über 500 bp mit einem ~1.5–2 kb Peak. (B) das repräsentative Ergebnis vorverstärkt cDNA mit einer Grundierung Dimer Spitze. Die Grundierung Dimer Spitze ist ca. 100 BP. (C) das Profil des vorverstärkt cDNA Fragmente zwischen 100 bp und 500 bp zeigt die Möglichkeit der cDNA-Abbau. (D) die Größenverteilung der cDNA Bibliothek zwischen 250 bp und 450 bp nach der Reinigungsschritte in diesem Protokoll erwähnt. (E) der Ausdruck Niveaus des Ins2 in cDNA-Bibliotheken von qPCR (links) und Relative Sequenzierungsdaten (rechts). Die x-Achsen repräsentieren unterschiedliche 8 einzelne Zellenproben. Die y-Achse (links) steht für normalisierten ΔCt relativ Gapdh (CtGapdh- CtIns2 + 6) und die y-Achse (rechts) für normalisierte Ausdruck Ebene des Ins2 im Vergleich zu Gapdh (Log2(TPM Ins2 / TPMGapdh)). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5: Bioinformatik-Analysen von einzelligen Transkriptom Daten. (A) Pipeline Bioinformatik Analysen. (B) Sequenzierung Qualitätskennzahlen über alle Basen der mal gelesen. (C) Verteilung der zugeordneten lesen Sie Graf. (D) Verteilung der gefundenen gen zählen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Komponente Volumen (µL)
Reverse Transkriptase (200 U/µL) 0,5
RNase-inhibitor 0,25
Erste-Strang Puffer (5 X) 2
DVB-t (100 mM) 0,5
Betain (5 M) 2
MgCl2 (1 M) 0,06
TSO (100 ΜM) 0.1
Nuklease-freies Wasser 0.29
Insgesamt 5.7

Tabelle 1: RT Reagenz mischen Komponenten in einer 5,7 µL Reaktion für jede Probe.

Komponente Volumen (µL)
Erste Strangreaktion 10
DNA-Polymerase (2 X ReadyMix) 12.5
IST PCR Primer (10 µM) 0,25
Nuklease-freies Wasser 2.25
Insgesamt 25

Tabelle 2: PCR Vorverstärkung Reagenz mischen Komponenten in einer 25 µL Reaktion für jede Probe

Komponente Volumen (µL)
SYBR Green Master Mix 5
Primer (5 µM) 0,5
Nuklease-freies Wasser 2.5
cDNA 2
Insgesamt 10

Tabelle 3: qPCR Reagenz mischen Komponenten in einer 10 µL-Reaktion mit einer standard-384-Well-Platte.

Komponente Volumen (µL)
5 X TTBL 1.6
2 ng cDNA Variable
DdH2O Variable
TTE Mix V5 2
Insgesamt 8

Tabelle 4: Tagmentation Reagenz mischen Komponenten in einer 8 µL Reaktion für jede Probe.

Komponente Volumen (µL)
DdH2O 1.6
Produkt der vorherigen Schritt 10
5 x TAB 4
N6XX 2
N8XX 2
TAE 0,4
Insgesamt 20

Tabelle 5: Bereicherung PCR Reagenz Mischung Komponenten in einer 20 µL Reaktion für jede Probe.

Schritt Problem Möglichkeit Lösung
1.3.4 Verrutschen der Klemmen Die äußere Oberfläche des Darms ist nass, verursacht durch das Vorhandensein von der geringen Höhe der interstitiellen Flüssigkeit und Collegenase leakness Sanft zu tauschen, der Zwölffingerdarm-Wand und andere Organ Wände in die Bauchhöhle mit Wattestäbchen
1.3.6 Darm platzen Flüssigkeitsdruck ist zu hoch in den Darm Verlangsamen Sie die Einspritzgeschwindigkeit
2.6 Inselchen halten Sie sich an exokrinen Gewebe bei der Kommissionierung Inselchen Unzureichende Verdauung Verlängern Sie die Dauer der Verdauung und schütteln Stärke
5.3 Die cDNA-Ausbeute ist gering nach PCR Verstärkung Die Zellen sind in schlechtem Zustand Zellen zu halten, frisch und in gutem Zustand
5.4 oder 6.4 Primer-Dimere können gesehen werden Übermäßige Primer Reinigen der cDNA noch einmal mit DNA Reinigung Perlen (0.8:1 oder Verhältnis 1:1)
5.4 Degradierten cDNA nach PCR Verstärkung Schlechte Qualität der Zellen oder kontaminierten Reagenzien Zellen in gutem Zustand halten oder Reagenzien zu ändern
6.3 Die Menge an DNA ist nach Bibliotheksbau gering Zu wenige PCR-Zyklen oder die Qualität der cDNA ist nicht gut Erhöhen Sie die Anzahl der Zyklen oder cDNA Qualitätssicherung vor Bibliotheksbau

Tabelle 6: Fehlerbehebung.

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Discussion

In diesem Protokoll haben wir eine effektive und einfach zu bedienende Methode zur Untersuchung der einzelligen expressionsprofile von pankreatischer β-Zellen gezeigt. Mit dieser Methode konnte, endokrine Zellen aus embryonalen, Neugeborenen- und postnatale Bauchspeicheldrüsen zu isolieren und einzellige transkriptomischen Analysen durchzuführen.

Die wichtigste Schritt ist die Isolierung der einzelnen β-Zellen in gutem Zustand. Voll PERFUNDIERTEN Bauchspeicheldrüsen reagieren besser auf nachfolgenden Verdauung. Unzureichende Durchblutung, was in der Regel in den dorsalen Pankreas, führt zu einer niedrigen Inselchen Ausbeute. Nach Perfusion erfordern die Dauer der Verdauung und schütteln Intensität besondere Aufmerksamkeit. Über Verdauung, aus langen Inkubationszeiten und kräftige kann Zittern, die kleinen Inseln in Stücke brechen. Unzureichende Verdauung wird nicht völlig die Inseln von angrenzenden Gewebe zu trennen. Nach der Verdauung der Bauchspeicheldrüse wurden die Inseln durch Handlese und nicht durch Dichte-Gradienten-Zentrifugierung gereinigt. Obwohl die Dichte-Gradienten-Zentrifugierung Inselchen bereichern kann, sind viele kleine Inseln und Inselchen mit acinar Gewebe verbunden irrtümlich verworfen. Versuchen Sie zu vermeiden acinar Gewebe, das kann dazu führen, dass ineffiziente Trypsin-Verdauung und reduzieren die Reinheit der β-Zellen.

Unabhängige biologische Wiederholungen sind notwendig für die Unterscheidung der biologischen Variabilität und Batch-Effekte. Wenn zwei biologische repliziert haben ein ähnliches Muster in PCA und ähnliche Untergruppen beim clustering Ergebnisse beinhalten, diese Proben zuverlässig biologischen Variabilität offenbaren könnten. Andernfalls sind zusätzliche biologische Wiederholungen erforderlich, um die Ergebnisse zu bestätigen. Für ein Stoffwechselorgan wie der Bauchspeicheldrüse kann der Zellstatus verbunden mit der circadianen Uhr24 Batch Unterschiede ausmachen. Um dieses Problem zu lösen, empfiehlt es sich, alle Probenahmen zur gleichen Zeit des Tages.

Die Einschränkung dieses Ansatzes ist niedriger Durchsatz, denn wir haben eine Bibliothek für jede Zelle zu konstruieren. Aufgrund der übermäßigen Primer in der Reaktion sollte die cDNA vor und nach der Bibliotheksbau in der Regel gereinigt werden, zweimal, um die Zündkapsel-Dimere vollständig zu entfernen. Diese Prozesse sind zeitaufwendig. Vor kurzem wurde ein modifiziertes Protokoll25 berichtet, dass dieses Problem in gewissem Maße lösen könnte. In diesem Protokoll Etiketten die zellspezifische Barcode cDNA Fragmente während der reversen Transkription Schritt. Daher die cDNA jeder Zelle können gebündelt und dann gereinigt werden, gefolgt von Bibliotheksbau. Diese Änderung erhöht den Durchsatz der Bibliotheksbau. Aber diese modifizierte Methode ist weniger empfindlich und weniger Gene pro Zelle erkennt. Darüber hinaus ist diese Methode eine 3' Zählweise mit reduzierten lesen Sie Abdeckung. Daher ist die Smart-seq2 noch die am besten geeignete Methode für Pankreatische Entwicklung.

Die Bauchspeicheldrüse Vorbereitung von anderen Arten kann unterschiedlich sein. Für menschlichen Pankreas absperrbar die Inseln nach vorherigen Protokolle26,27. Dann die isolierten Inseln können in einzelnen Zellen28 getrennt werden und einzellige Analysen mit dieser Methode. Diese Methode kann zur Erforschung der Säugetier-Pankreatische Entwicklung, Krankheiten und Regeneration weit angewendet werden.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgements

Wir danken die National Center für Protein Sciences, Beijing (Peking-Universität) und dem Peking-Tsinghua-Center für die Life Science-Computing-Plattform. Diese Arbeit wurde unterstützt durch das Ministerium für Wissenschaft und Technology of China (2015CB942800), der National Natural Science Foundation of China (31521004, 31471358 und 31522036) und Finanzierung von Peking-Tsinghua Zentrum für Life Sciences, C.-R.X.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagenase P Roche 11213873001
Trypsin-EDTA (0.25 %), phenol red Thermo Fisher Scientific 25200114
Fetal bovine serum (FBS) Hyclone SH30071.03
Dumont #4 Forceps Roboz RS-4904
Dumont #5 Forceps Roboz RS-5058
30 G BD Needle 1/2" Length BD 305106
Stereo Microscope Zeiss Stemi DV4
Stereo Fluorescence microscope Zeiss Stereo Lumar V12
Centrifuge Eppendorf 5810R
Centrifuge Eppendorf 5424R
Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap BD-Falcon 352235
96-Well PCR Microplate Axygen PCR-96-C
Silicone Sealing Mat Axygen AM-96-PCR-RD
Thin Well PCR Tube Extragene P-02X8-CF
Cell sorter BD Biosciences BD FACSAria
Capillary pipette Sutter B100-58-10
RNaseZap Ambion AM9780
ERCC RNA Spike-In Mix Life Technologies 4456740
Distilled water Gibco 10977
Triton X-100 Sigma-Aldrich T9284
dNTP mix New England Biolabs N0447
Recombinant RNase Inhibitor Takara 2313
Superscript II reverse transcriptase Invitrogen 18064-014
First-strand buffer (5x) Invitrogen 18064-014
DTT Invitrogen 18064-014
Betaine Sigma-Aldrich 107-43-7
MgCl2 Sigma-Aldrich 7786-30-3
Nuclease-free water Invitrogen AM9932
KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2x) KAPA Biosystems KK2601
VAHTS DNA Clean Beads XP beads Vazyme N411-03
Qubit dsDNA HS Assay Kit Invitrogen Q32854
AceQ qPCR SYBR Green Master Mix Vazyme Q121-02
TruePrep DNA Library Prep Kit V2 for Illumina Vazyme TD502 Include 5x TTBL, 5x TTE, 5x TS, 5x TAB, TAE
TruePrep Index Kit V3 for Illumina Vazyme TD203 Include 16 N6XX and 24 N8XX
High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit Advanced Analytical Technologies DNF-474
1x HBSS without Ca2+ and Mg2+ 138 mM NaCl; 5.34 mM KCl
4.17 mM NaHCO3; 0.34 mM Na2HPO4
0.44 mM KH2PO4
Isolation buffer 1 × HBSS containing 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 5 mM Glucose, pH 7.4
FACS buffer 1 × HBSS containing 15 mM HEPES, 5.6 mM Glucose, 1% FBS, pH 7.4
NaCl Sigma-Aldrich S5886
KCl Sigma-Aldrich P9541
NaHCO3 Sigma-Aldrich S6297
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S5136
KH2PO4 Sigma-Aldrich P5655
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G5767
HEPES Sigma-Aldrich H4034
MgCl2 Sigma-Aldrich M2393
Oligo-dT30VN primer 5'-AAGCAGTGGTATCAA
CGCAGAGTACT30VN-3'
TSO 5'-AAGCAGTGGTATCAAC
GCAGAGTACATrGrG+G-3'
ISPCR primers 5'-AAGCAGTGGTAT
CAACGCAGAGT-3'
Gapdh Forward primer 5'-ATGGTGAAGGTC
GGTGTGAAC-3'
Gapdh Reverse primer 5'-GCCTTGACT
GTGCCGTTGAAT-3'
Ins2 Forward primer 5'-TGGCTTCTTC
TACACACCCA-3'
Ins2 Reverse primer 5'-TCTAGTTGCA
GTAGTTCTCCA-3'

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References

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