Seringue-injectable maillage électronique pour l’électrophysiologie rongeur chronique Stable

Bioengineering
 

Summary

Maillage électronique sondes parfaitement intègrent et fournissent le niveau stable, à long terme, single-neurone d’enregistrement dans le cerveau. Ce protocole utilise un maillage électronique pour des expériences in vivo , impliquant la fabrication de l’électronique de maille, chargement en aiguilles, injection stéréotaxique, interface d’entrée/sortie, enregistrement des expériences et histologie du tissu contenant maille les sondes.

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Schuhmann Jr., T. G., Zhou, T., Hong, G., Lee, J. M., Fu, T. M., Park, H. G., Lieber, C. M. Syringe-injectable Mesh Electronics for Stable Chronic Rodent Electrophysiology. J. Vis. Exp. (137), e58003, doi:10.3791/58003 (2018).

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Abstract

Sondes d’électrophysiologie cérébrale implantables sont des outils précieux en neurosciences en raison de leur capacité à enregistrer activité neurale avec haute résolution spatio-temporelle de régions cérébrales superficielles et profondes. Leur utilisation a été entravée, toutefois, de mécaniques et structurelles des incompatibilités entre les sondes et le cerveau tissu entraîner que communément micromotion et gliose avec résultant du signal l’instabilité chronique enregistrement des expériences. En revanche, après l’implantation de maille ultra-flexible électronique par injection de la seringue, le maillage des sondes forme une interface transparente et gliose-libre avec les tissus environnants de cerveau qui permet le suivi stable de neurones individuels au moins un an échelle de temps. Ce Détails du protocole les étapes clés dans une expérience d’enregistrement neuronaux typique souris à l’aide de la seringue-injectable maillage électronique, y compris la fabrication de l’électronique de maille dans un standard photolithographie processus possible dans de nombreuses universités, chargement maillage électronique en aiguilles capillaires standards, injection stéréotaxiques in vivo, connexion du maillage d’entrée/sortie aux interfaces de l’instrumentation standard, freinés ou se déplaçant librement des sessions d’enregistrement et histologique sectionnement du cerveau contenant du tissu mesh électronique. Représentant enregistrements neurones et les données histologiques sont présentées. Enquêteurs familiers avec ce protocole auront les connaissances nécessaires pour intégrer le maillage électronique dans leurs propres expériences et tirer parti des opportunités uniques offertes en créant une interface neurale stable à long terme, telles que les études du vieillissement processus, le développement du cerveau et la pathogenèse de la maladie du cerveau.

Introduction

Le développement d’outils capables de cartographier le cerveau avec une résolution unique-neuron est d’une importance cruciale pour les neurosciences et la neurologie. Technologies non invasives pour les études neurales comme électroencéphalographie (EEG), magnétoencéphalographie (MEG) et imagerie de résonance magnétique fonctionnelle (IRMf) se sont avérés utiles pour corréler l’activité cérébrale avec comportement chez les humains1, 2, mais ils n’ont pas la résolution spatio-temporelle nécessaire pour étudier la structure et la dynamique des réseaux neuronaux à leurs fondamentaux micromètre et millisecond balances, respectivement3,4. Certaine expression (ECoG) des sondes et des méthodes d’imagerie optiques à l’aide de colorants sensibles au voltage ont réussi à enregistrer unitaires fortification activité in vivo5,6, mais ils sont généralement efficaces que près de la surface du cerveau, limite l’application à l’étude des régions cérébrales superficielles. En revanche, les sondes électriques implantables peuvent mesurer électrophysiologie single-neurone en se déplaçant librement animaux de pratiquement n’importe quelle région du cerveau sans besoin de marquage fluorescent, ce qui les rend indispensables aux neurosciences au niveau des systèmes, en particulier comme les techniques de microfabrication de l’industrie des semi-conducteurs ont poussé canal compte dans les centaines de milliers3,7,8,9. En vertu de ces capacités, implantables sondes électriques ont fait de nombreuses et importantes contributions aux neurosciences et neurologie, y compris des études fondamentales de traitement dans le système visuel10, le traitement de neurologique de l’information troubles comme la maladie de Parkinson,11et la démonstration des interfaces cerveau-machine (IMC) pour prothèses avancé12,13.

Néanmoins, l’instabilité à long terme que qui se manifeste comme diminution des amplitudes de spike et signaux instables sur des échelles de temps des semaines aux mois14,15 a limité l’applicabilité des sondes implantables à l’étude de relativement courte durée phénomènes, laissant des questions telles que le développement et le vieillissement cérébral dans une large mesure sans réponse. Les limitations dans l’instabilité à long terme sont le résultat d’un déséquilibre entre les sondes classiques et tissu cérébral dans la taille, la mécanique et topologie14,15,16,17,18. En termes de taille, alors que les synapses neuronales et les corps cellulaires sont environ une dizaines de nanomètres à quelques dizaines de micromètres de diamètre19, respectivement, les sondes traditionnelles sont souvent nettement plus grandes, dans le cas des matrices de microélectrodes silicium > 4 fois la taille d’un seul neurone corps cellulaire7,8. La taille relativement importante de ces sondes peut-être perturber la structure naturelle et la connectivité du dense tissu neural, contribuant ainsi à système immunitaire chronique et perturber les circuits neuronaux à l’étude. En termes de propriétés mécaniques, les sondes traditionnelles sont considérablement plus rigides que le tissu neural extrêmement doux, dans lequel ils sont implantés ; sondes même « flexibles » de 10 à 20 µm feuilles épaisses de polyimide sont au moins 100.000 fois plus rigides que le tissu de cerveau20,21. Ce décalage dans la rigidité de flexion provoque motion relative au cisaillement entre les tissus sonde et le cerveau, conduisant à unitaires non fiable de suivi durant les enregistrements étendus et induisant une gliose chronique sur le site d’implantation. Enfin, la structure topologique de sondes cérébrales conventionnelle exclut nécessairement un volume solide du tissu. Tel décalage dans la topologie perturbe la connectivité des circuits neuraux, s’oppose à la distribution des neurones, cellules gliales et les vaisseaux sanguins dans le cerveau tissu22interpenetrated (3D) naturelle en trois dimensions et entrave le transport 3D de signalisation des molécules23. Ensemble, ces lacunes des sondes classiques ont fait la compatibilité à long terme recherchée pour des applications cliniques et des études de neurosciences longitudinale au niveau de single-neurone en deçà.

Pour pallier ces insuffisances, nous avons cherché à brouiller la ligne entre les systèmes neurones et électroniques en mettant au point un nouveau paradigme de sondes neuronales « tissus-like » appelé maillage électronique16,21,24. Maillage électronique aborde les questions correspondantes ci-dessus dans la taille, la mécanique et topologie en incorporant des caractéristiques (1) structurales de la même nanomètre à l’échelle du micromètre taille du tissu neural, propriétés (2) mécaniques similaires à celles du tissu cérébral et (3) un 3D topologie de macroporeux qui est > 90 % open space et accueille ainsi l’interpénétration de neurones et de la diffusion des molécules à travers l’environnement extracellulaire. Maillage électronique sondes peuvent être livrés avec précision à certaines régions du cerveau grâce à une seringue et une aiguille, causant des dommages aigus minimal tout en implanter même dans les régions de cerveau profond21,25. Axones et soma neuronale montrent s’interpénètrent la structure ouverte de maillage 3D électronique sonde après l’injection semaines, créant ainsi une interface homogène et exempt de gliose entre enregistrement électronique et qui entourent le cerveau tissu21 , 26 , 27. ces particularités ont permis à maillage électronique sondes suivre stablement fortification de l’activité de neurones individuels mêmes pendant au moins une année calendrier27. En outre, la fabrication de l’électronique de maillage issu de photolithographie (PL) offre évolutivité élevée du nombre d’électrodes qui peuvent être incorporés, avec canal démontrée compte jusqu'à 128 électrodes par sonde à l’aide de la lithographie par simple contact masque 28 et une conception plug-and-play d’entrée/sortie (e/s) permet une connexion électrique rapide périphériques électroniques sans équipement spécialisé29.

Un large éventail d’études peut-être bénéficier de maillage électronique intégrant de protocoles de mesure. Plupart enregistrement intracortical expériences pourraient bénéficier de la procédure d’implantation minimalement invasive maillage électronique par injection seringue, la réponse immunitaire réduite considérablement après l’implantation, et la possibilité de quitter maillage électronique en la tissu au cours d’histologie ultérieur et immunostaining pour une analyse précise de l’environnement biologique entourant chaque site d’enregistrement. Expériences d’enregistrement chronique dérivent en particulier valeur de la capacité unique de maillage électronique pour suivre un grand nombre de neurones individuels pendant des mois aux années. Cette fonctionnalité offre des possibilités d’études avec une résolution de single-neurone qui étaient précédemment irréaliste, par exemple, des études longitudinales de vieillissement des circuits neuraux, enquêtes du cerveau en développement et des enquêtes sur la pathogenèse de transmissibles16.

Dans le présent protocole, les auteurs décrivent toutes les principales étapes d’une expérience d’enregistrement neuronaux typique de souris à l’aide de la seringue-injectable maillage électronique (voir Figure 1). Étapes décrites comprennent la fabrication de l’électronique de maille dans un éventuel processus axés sur les PL standard dans de nombreuses universités, chargeant le maillage électronique dans aiguilles capillaires standards, injection stéréotaxique du maillage électronique en vivo, connexion de la Mesh I/O pour instrumentation standard interfaces, sessions d’enregistrement restreints ou librement mobiles et les coupes histologiques du tissu cérébral contenant le maillage électronique. Certains chercheurs utilisant le maillage électronique uniquement pour les études d’histologie ne peuvent exiger qu’interface électrique et un enregistrement, auquel cas ils peuvent ignorer ces étapes. Après en se familiarisant avec ce protocole, les enquêteurs devraient avoir toutes les connaissances nécessaires pour utiliser le maillage électronique dans leurs propres expériences.

Protocol

Toutes les interventions sur les sujets animaux vertébrés ont été approuvées par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de l’Université Harvard.

1. fabrication de l’électronique de maille

Remarque : La procédure décrite dans cette section est conçue pour utilisation à l’intérieur d’une installation de salle blanche standard de l’Université, comme le Centre pour les systèmes nanométriques (CNS) à l’Université Harvard. Cette installation ainsi que des installations similaires sont accessibles aux utilisateurs extérieurs autour des Etats-Unis, par exemple, dans le cadre de la National Nanotechnology Infrastructure réseau (NNIN) pris en charge par la National Science Foundation (NSF). Ces installations, beaucoup d’outils, équipements et matériaux décrits dans cette section sont fournis ainsi que l’accès à l’installation de salle blanche et n’exigerait pas d’achat séparé.

ATTENTION : Beaucoup de produits chimiques utilisés dans la fabrication de l’électronique de la maille sont dangereux, y compris résiste, CD-26, remover PG, SU-8 développeur et Ni solution de gravure. Consulter les fiches de données de sécurité des matériaux (MSDS) pour ces produits chimiques avant de l’utiliser et mettre en œuvre et suivre les mesures de sécurité appropriées à tout moment.

  1. Thermiquement évaporer 100 nm de nickel sur une plaquette de Si propre.
    Remarque : Les paramètres de dépôts typiques sont base pression de 5 x 10-7 T et la fréquence de 1 à 2 Å/s. La mince couche de nickel agit comme une couche sacrificielle qui sera plus tard dissoute pour libérer le maillage électronique de la plaquette.
  2. Le premier masque de PL (PL masque-1) permet de définir le fond passivation couche de maillage électronique avec SU-8 photosensible négative (Figure 2 a).
    NOTE : PL est une technique de microfabrication standard dans lequel la lumière ultraviolette (UV) est a brillé sur un masque qui s’est tenu sur un substrat photosensible. Lumière soit rend insoluble (résiste négatif) ou soluble (résiste positif) les zones exposées sur le substrat. Les masques sont dessinés dans le logiciel de conception (CAO) assistée par ordinateur et puis généralement commandés auprès d’un fournisseur. Un aligneur de masque est utilisé pour aligner des masques à motifs existants sur un substrat et de les exposer à la lumière UV. Fabrication de maillage électronique nécessite quatre différents masques (masque de PL-1 à PL masque-4). Nos modèles de masque sont disponibles sur demande ou sur le site de ressource, meshelectronics.org.
    1. Spin-manteau SU-8 2000.5 photosensible négative sur la plaquette à 4 000 tr/min pour une épaisseur approximative de SU-8 de 400 – 500 nm.
    2. Cuire au four doux les tranches sur une plaque de cuisson pendant 1 min à 65 ° C suivie de 1 min à 95 ° C.
    3. Charger la plaquette dans un aligneur de masque pour exposer le SU-8 PL masque-1 correspondant à la couche de maille SU-8 bas. Exposer à une dose de i-line (longueur d’onde de 365 nm) de 100 mJ/cm2.
    4. Post, faites cuire la galette sur une plaque de cuisson pendant 1 min à 65 ° C, suivie de 1 min à 95 ° C.
    5. Immerger la plaquette dans un plateau de SU-8 développeur. Agiter délicatement la solution pendant 2 min jusqu'à ce que le motif maillé dans le SU-8 a été entièrement développé. Rincez dans un plateau de l’alcool isopropylique pour 1 min et séchage à l’air.
    6. Dur de faire cuire la galette sur une plaque de cuisson à 180 ° C pendant 1 h.
      NOTE : SU-8 est normalement difficile au four entre 150 ° C et 250 ° C après développement. La cuisson dure recuits des craquelures de surface qui peuvent se former lors du développement et de nouvelles liaisons transversales du SU-8 afin d’assurer la stabilité mécanique. Dur allant au four à 180 ° C pour la couche de fond SU-8 et 190 ° C pour le top SU-8 couche donne de bons résultats pour l’électronique de la maille.
  3. Utilisation PL masque-2 pour définir le métal des interconnexions et tampons I/O (Figure 2 b).
    1. LOR3A spin-manteau sur la plaquette à 4000 tr/min pour une épaisseur approximative de 300 nm.
      Remarque : LOR3A est basée sur une polydimethylglutarimide résister qui accélère sous-cotation des prix durant la procédure ultérieure de métallisation.
    2. Faire cuire la galette sur une plaque de cuisson à 180 ° C pendant 5 min.
    3. Spin-manteau S1805 photosensible positive à 4000 tr/min pour une épaisseur approximative de 500 nm.
    4. Faire cuire la galette sur une plaque chauffante à 115 ° C pendant 1 min.
    5. Charger la plaquette dans un aligneur de masque pour exposer le S1805 avec PL masque-2 correspondant au métal d’interconnexions et de tapis de I/O. Exposer à une dose de h-ligne (onde de 405 nm) de 40 mJ/cm2.
    6. Immerger la plaquette dans un plateau de CD-26 photorésine développeur. Agiter délicatement la solution pendant 1 min, jusqu'à ce que le métal des interconnexions modèle a été entièrement mis au point. Rincez dans un bac d’eau désionisée (DI) pendant 1 min et séchage à l’air.
    7. Thermiquement évaporer 3 nm de Cr suivi de 80 nm d’UA.
      NOTE : Une pression de base d’au plus 5 x 10-7 T et la vitesse de déposition de 1 Å/s donnent généralement la meilleure qualité de film.
    8. Immerger la plaquette dans un bécher de plat de dissolvant PG pendant environ 3 h jusqu'à ce que le métal a entièrement sont inférieurs, laissant le métal que dans l’interconnexion désirée et régions pad I/O de maillage électronique. Rincer dans de l’alcool isopropylique et séchage à l’air.
  4. PL masque-3 permet de définir des électrodes Pt (Figure 2).
    1. Répétez les étapes 1.3.1 par 1.3.4.
    2. Charger la plaquette dans l’aligneur de masque pour exposer le S1805 avec PL masque-3 correspondant aux électrodes Pt. Exposer à une dose de h-line de 40 mJ/cm2.
    3. Immerger la plaquette dans un plateau de CD-26 photorésine développeur. Agiter délicatement la solution pendant 1 minute jusqu'à ce que le modèle d’électrodes Pt a été entièrement développé. Rincez dans un plateau de DI pour 1 min et séchage à l’air.
    4. Utiliser un évaporateur de faisceau d’électrons dépôt 3 nm de Cr suivi de 50 nm du Pt.
      NOTE : Les paramètres de dépôts typiques sont une pression de 5 x 10-7 T de base et taux de 2 Å / s.
    5. Immerger la plaquette dans un bécher de plat de dissolvant PG pendant environ 3 h jusqu'à ce que le métal a entièrement sont inférieurs, laissant Pt uniquement sur les sites de l’électrode souhaitée de maillage électronique. Rincer dans de l’alcool isopropylique et séchage à l’air.
  5. Masque de PL-4 permet de définir le haut passivation couche de maillage électronique avec SU-8 photosensible négative (Figure 2D).
    1. Répétez les étapes 1.2.1 à 1.2.5,, excepté exposant avec PL masque-4 correspondant à la couche passivante de maille de SU-8.
    2. Dur de faire cuire la galette sur une plaque de cuisson à 190 ° C pendant 1 h.
      Remarque : Cette température est de 10 ° C plus élevée que celle pour la cuisson dure du fond SU-8 (étape 1.2.6). Cette température élevée déplacement légèrement le bas SU-8, faisant fusionner avec la couche supérieure de SU-8 et forment ainsi une structure unique et continue de SU-8.
  6. Maillage électronique sont maintenant terminé (Figure 2E et Figure 3) ; libérer de la plaquette Si en dissolvant la couche sacrificielle de Ni.
    1. Traiter la plaquette avec le plasma d’oxygène à 50 W pendant 1 min. Cela s’oxyde à la surface SU-8, rend hydrophile et permettant le maillage ne s’appliquera pas facilement en solution aqueuse.
    2. Dans un bécher de plat, combiner l’acide chlorhydrique et du chlorure ferrique DI à un rapport volumétrique de 1:1:20, respectivement, à préparer une solution de Ni gel de mordançage.
    3. Immerger la plaquette dans un bécher de plat de la solution de gel de mordançage Ni pendant environ 3 h jusqu'à ce que l’électronique de maille est complètement sortis de la plaquette Si.
    4. Utiliser une pipette Pasteur pour transférer la maille version électronique sondes d’etchant Ni dans un bécher de 100 mL de DI. Transférer l’électronique de maille dans un becher frais de DI au moins 3 fois pour assurer le rinçage.
    5. Utiliser une pipette Pasteur pour transférer le maillage électronique à une solution eau/éthanol 70 % / 30 % pour la désinfection, puis utilisez la pipette pour transférer le maillage électronique à l’eau stérile pour rinçage.
      Remarque : Après la stérilisation, l’électronique de maillage peut être transférées à d’autres solutions pour la fonctionnalisation. Par exemple, pour promouvoir l’adhésion cellulaire, l’électronique de maillage peut être transférés à une solution aqueuse de poly-D-lysine (1 mg/mL) pendant 24 h.
    6. Utiliser une pipette Pasteur pour transférer le maillage électronique sondes dans un bécher de 100 mL de phosphate stérile 1 x solution saline tamponnée (PBS) avant l’injection in vivo.

2. chargement de maillage électronique en aiguilles

  1. Le titulaire de la pipette comme acheté est ouvert s’écouler aux deux extrémités. Sceller l’extrémité opposée de l’attache de vis circulaire avec de l’époxy, donc il n’y a pas de fuite au cours de l’injection (Figure 4 a). Durcir l’époxy avant de procéder.
  2. Insérer une aiguille capillaire de verre dans le support de la pipette. Fixez-le à l’aide de la vis de serrage circulaire et la rondelle conique (Figure 4 b). Une aiguille capillaire 400 µm de diamètre intérieur (650 µm de diamètre extérieur) verre a été utilisé pour ce protocole. Autres matériaux d’aiguille capillaire (e.g., métal) et diamètres peuvent être utilisées, mais peuvent nécessiter des modifications apportées à la conception de l’électronique de maille pour assurer injectabilité.
    NOTE : Les aiguilles capillaire allant de 150 µm à 1,17 mm de diamètre intérieur (250 µm à 1,5 mm de diamètre extérieur) ont été utilisés dans notre laboratoire. Injection à travers de petites aiguilles peut être promue en rendant l’angle d’intersection entre les éléments du maillage à SU-8 transverses et longitudinaux plus aiguës, diminuant la largeur des éléments maille SU-8, à l’aide de diluant SU-8 et en utilisant une plus grossière (i.e., plus grande maille) structure de maille. Masques pour les maillages conçus pour les plus petits capillaires aiguilles sont disponibles sur demande ou sur le site de ressource, meshelectronics.org. Aiguilles capillaires de verre avec un diamètre intérieur de 400 µm et un diamètre extérieur de 550 µm sont également disponibles dans le commerce. Ceux-ci réduisent les dommages de tissu aiguë provoqué par injection tout en conservant la compatibilité avec des maillages nécessitant un 400 µm de diamètre intérieur, mais ils n’étaient pas utilisés pour les études décrites ici.
  3. Fixer une seringue de 1 mL à la sortie du côté du porte-pipette en utilisant une longueur de 2 à 4 cm de tube capillaire.
  4. Insérez l’aiguille capillaire de verre dans le bécher de 100 mL de PBS contenant l’électronique de la maille. Positionner l’extrémité de l’aiguille près des touches I/O d’un maillage électronique sonde et escamoter la seringue pour dessiner une sonde électronique de maille sur l’aiguille (Figure 5 et supplémentaire vidéo 1).
    Remarque : Les touches I/O, tige d’interconnexion région et région de dispositif de maillage sont facilement identifiables par l’oeil nu lorsque les sondes électroniques de maille sont suspendus dans une solution. Cela permet un chargement sans ambiguïté de maillage électronique dans les aiguilles avec la bonne orientation.
  5. Pousser/tirer le piston de la seringue toujours immergés dans une solution saline pour régler la position de maillage électronique au sein de l’aiguille.
    NOTE : Le positionnement idéal est avec la région de dispositif de maillage ultra-flexible comme près de l’extrémité de l’aiguille que possible. Cette configuration réduit le volume de fluide qui est injecté dans le cerveau tout en garantissant que la région périphérique est injectée tout d’abord et les touches I/O dernière.
  6. Soigneusement détacher le tube capillaire de la prise du côté du porte-pipette. Retirez-le lentement pour éviter de créer une force d’aspiration qui pourrait modifier la position de l’électronique de maille de l’aiguille.

3. stéréotaxique Injection de maillage électronique dans le cerveau de souris vivante

NOTE : Les souris ont été anesthésiés par injection intrapéritonéale d’un mélange de 75 mg/kg dexdomitor de kétamine et 1 mg/kg. Le degré d’anesthésie a été vérifié avec la méthode de pincement orteil avant de commencer la chirurgie. Température corporelle a été maintenue en plaçant la souris sur une couverture homéothermes de 37 ° C sous anesthésie. Une technique stérile adaptée a été mis en place pour la chirurgie, y compris mais non limité à l’autoclavage, tous les instruments chirurgicaux métalliques pour 1 h avant son utilisation, à l’aide de gants stérilisés, utiliser un stérilisateur de boudin chaud tout au long de la chirurgie, le maintien d’un champ stérile autour du site chirurgical, la désinfection des instruments en plastique avec l’éthanol à 70 % et le cuir chevelu épilée, peau a été préparée avec iodophore avant l’incision. Pour les chirurgies de survie, à l’issue de la chirurgie, pommade antibiotiques a été appliqué autour de la plaie, et la souris a été renvoyée à une cage équipée d’un 37 ° C coussin chauffant. Souris pas ont été laissés sans surveillance jusqu'à ce qu’ils avaient repris conscience suffisante pour maintenir le décubitus sternal. Les souris ont reçu buprénorphine analgésie par injection intrapéritonéale à une dose de 0,05 mg/kg de poids corporel toutes les 12 h pendant 72 h après la chirurgie. Souris ont été isolés des autres animaux suivant la chirurgie. Souris ont été euthanasiés par une injection intrapéritonéale de pentobarbital à une dose de 270 mg/kg de poids corporel ou par perfusion de transcardial (Voir l’étape 6.1). Les enquêteurs peuvent se référer à Geiger, et al. 30, Kirby, et al. 31et Gage, et al. 32 pour plus de détails sur la chirurgie stéréotaxique de rongeur.

  1. Anesthésier la souris et le fixer dans un cadre stéréotaxique.
  2. Appliquer du lubrifiant oculaire aux yeux de la souris pour prévenir le dessèchement tandis que sous anesthésie.
  3. Utilisez une fraise dentaire et le cadre stéréotaxique pour ouvrir une craniotomie coordonnées souhaitée sur le crâne. Ouvrir une deuxième craniotomie loin du site d’injection pour l’insertion d’une vis en acier inoxydable mise à la terre ou le fil.
  4. Fixer un support de serrage sur le crâne avec ciment dentaire. Couper un écart d’environ 1 mm dans le substrat pour améliorer la fiabilité de l’étape de pliage plus tard dans la procédure.
    Remarque : Un câble plat souple (FFC) coupé à un « L » forme efficace (Figure 7 a), bien que de nombreux matériaux pourrait fonctionner tant qu’ils sont de l’épaisseur appropriée pour le 32-canal zéro connecteur de force (ZIF) insertion (conçu pour 0,18 câbles épais de ± 0,05 mm).
  5. Fixer le support de la pipette avec l’aiguille contenant le maillage électronique sur le cadre stéréotaxique à l’aide d’une pince à angle droit fin (Figure 4 et Figure 6 a).
  6. Fixer la prise du côté du porte-pipette à une seringue de 5 mL attachée dans une seringue pompe (Figure 6) utilisant un environ 0,5 à 1 m de longueur du tube capillaire.
    Remarque : Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles dans le tube capillaire avant de le raccorder à la titulaire de la pipette. Bulles peuvent interrompre le flux pendant l’injection et empêcher une livraison lisse, contrôlée de l’électronique de la maille.
  7. Utilisez le cadre stéréotaxique pour positionner la pointe de l’aiguille à l’endroit de départ souhaitée dans le cerveau.
    Remarque : Les sondes d’électronique maille utilisées ici sont conçus avec enregistrement des électrodes réparties sur une longueur d’environ 2 mm et avec la première électrode située env. 0,5 mm de l’extrémité de départ de l’électronique de maille (bord le plus à gauche dans la Figure 3 a). Pour cette raison, les coordonnées stéréotaxiques doivent être sélectionnées, tel que l’emplacement de départ est plus profond que la région du cerveau d’intérêt de 0,5 mm. La propagation et l’emplacement des électrodes enregistrement au sein de maillage électronique programmable librement pendant le processus de conception de masque et doivent être sélectionnés pour les électrodes d’enregistrement couvrent les régions cérébrales d’intérêt car elles sont injectées le long de leurs stéréotaxiques trajectoire.
  8. Positionnez la caméra (Figure 6 b) pour afficher la partie supérieure de la sonde électronique de maillage au sein de l’aiguille de verre. Un logiciel permet à l’utilisateur de tirer un trait sur l’écran pour marquer la position originale de l’électronique de la maille.
  9. Ouvrir le flux en affectant le pousse-seringue à basse vitesse en appuyant sur Start. 10 mL/h est un débit départ typique d’une aiguille capillaire du 400 µm de diamètre intérieur. Augmentez progressivement la vitesse d’écoulement si la sonde électronique de maille ne se déplace pas dans l’aiguille.
    Remarque : Il est important de minimiser le volume de liquide injecté dans le cerveau, car cela pourrait endommager le tissu qui entoure le point d’injection. Les meilleurs résultats sont obtenus avec des volumes d’injection moins de 25 µL par 1 mm de longueur de maille injectée. Les valeurs idéales sont moins de la moitié de ce volume ; dans notre laboratoire, nous injectons typiquement 10 à 50 µL par une longueur de maille de 4 mm injecté.
  10. Comme la sonde électronique de maillage commence à circuler à l’intérieur de l’aiguille, utilisez le cadre stéréotaxique pour rétracter l’aiguille à la même vitesse avec laquelle la sonde électronique de maille en train d’injecter, à l’aide de la position originale marquée de maillage électronique comme un guide.
    Remarque : Cette procédure, appelée le champ de vision (FoV) injection méthode25, permet pour la livraison précise de maillage électronique à une région du cerveau ciblées sans froisser ou luxation. Souvent, le débit peut être réduit une fois la maillage électronique sonde commence se déplaçant dans l’aiguille. Dans notre laboratoire, débits de 20 à 30 mL/h sont souvent obligés de surmonter le frottement statique entre la maille et les murs de l’aiguille capillaire, mais le taux puis peut être réduit à 10 mL/h, une fois que le processus d’injection a été lancé. Les débits et volumes d’injection sont généralement plus petits pour les plus petites aiguilles capillaire de diamètre.
  11. Continuer coulant saline et rétraction de l’aiguille jusqu'à ce que l’aiguille a quitté le crâne. Arrêter le débit de la pompe de seringue.

4. entrée/sortie d’interface

Remarque : À ce stade, la sonde électronique de maille a été injectée depuis le point de départ souhaité dans le cerveau, le long de la trajectoire choisie. L’aiguille a été rétractée et est juste au-dessus de la craniotomie avec le maillage électronique d’interconnexions qui s’étend de cerveau à l’aiguille et les entrées/sorties tampons encore à l’intérieur de l’aiguille (Figure 7 b). Cette section utilise une carte de circuit imprimé (PCB ; Figure 7, Figure 8) pour s’interfacer à la sonde électronique de maille. Le PCB connecte à un connecteur ZIF à un connecteur 32 voies amplificateur standard grâce à un substrat isolant qui devient la tête-scène pour enregistrement neuronaux expériences. Le PCB est personnalisable pour s’adapter à diverses configurations de tête-scène. Nos fichiers de conception sont disponibles sur demande ou depuis le site Web de ressources, meshelectronics.org et peut être utilisée pour acheter les BPC économiquement provenant de fournisseurs de services de fabrication et de montage PCB.

  1. Utilisez le cadre stéréotaxique pour guider soigneusement l’aiguille à la FFC, substrat de serrage et à travers l’écart, s’écoulant de la solution avec le pousse-seringue pour générer de mou dans l’électronique de maille d’interconnexions (Figure 7).
  2. Une fois l’aiguille au-dessus du soubassement de serrage et à travers l’écart, reprendre le flux à un rythme rapide pour éjecter l’électronique mesh pads I/O sur le substrat de serrage (Figure 7).
  3. À l’aide de pinces à épiler et une pipette de DI, plier les touches I/O pour ca. angle de 90° comme à proximité de la première touche de I/O que possible.
    Remarque : La flexion est nécessaire pour permettre les plaquettes à insérer dans le connecteur ZIF sur un PCB dans une étape ultérieure. Le connecteur ZIF est exactement la même largeur que les 32 coussinets de I/O la sonde électronique de maille, les plier un imparfait 90° ou un coude ne pas survenant juste avant la première touche de I/O, seront traduira par devoir couper les pads de I/O (les pads de plus à gauche dans la Figure 7E).
  4. Une fois les plaquettes de I/O sont alignés, déplié et à un angle de 90° à la tige mesh, sec eux en place avec coulant doucement l’air comprimé.
    NOTE : Maillage électronique sondes avec moins de 32 canaux peut être interfacé à avec la même carte interface 32 canaux. Par exemple, notre laboratoire utilise couramment 16 canaux maillage électronique sondes avec canal 32 BPC. Ceci fournit un espace supplémentaire au sein du connecteur ZIF, faciliter l’interfaçage, et les canaux non contacté supplémentaires sont facilement reconnaissables comme un circuit ouvert à impédance stable au cours de sessions d’enregistrement.
  5. Couper le substrat serrage à un bord droit environ 0,5 à 1 mm du bord des plaquettes I/O. Également de couper les parties superflues du substrat serrage qui entravera l’insertion dans le connecteur ZIF 32 voies monté sur PCB (Figure 7F).
  6. Insérer les coussinets de I/O dans le connecteur ZIF sur le circuit imprimé et fermez le loquet (Figure 7). Interfaçage d’utilisation électronique de mesure pour mesurer l’impédance entre les canaux et la vis de terre pour confirmer le succès. Si les valeurs d’impédance sont trop élevés, déverrouiller le connecteur ZIF, régler l’insertion et refaites le test jusqu'à ce que la connexion réussie est confirmée.
  7. Couvercle du connecteur ZIF et exposés maillage électronique d’interconnexions avec un ciment dentaire pour la protection. Retourner le PCB à l’écart dans le substrat et fixer le circuit imprimé avec du ciment sur le crâne de souris (Figure 7 H).
    Remarque : La FFC à l’écart de flexion réduit la tension mécanique qui peut parfois briser le maillage électronique d’interconnexions.
  8. Laisser le ciment à durcir, transformant le PCB en un stade tête robuste et compact pour l’interfaçage au cours de sessions d’enregistrement suivantes (Figure 7I).

5. neural enregistrement expériences

  1. Placez votre souris dans un tailveiner ou autre drisse33. Insérez le préamplificateur PCB dans le connecteur standard amplificateur sur le circuit imprimé de tête-scène. Utilisez un câble séparé pour fonder la vis de référence.
  2. Pour les enregistrements sobres, laisser la souris dans la drisse. Enregistrer les données en utilisant le système d’acquisition de données pour la période désirée (Figure 8 a).
  3. Pour les enregistrements se déplaçant librement, relâchez la souris de la drisse après l’insertion du préamplificateur PCB et mise à la terre de la vis de référence. Enregistrement pour la durée désirée en utilisant le système d’acquisition de données, tandis que la souris se comporte librement (Figure 8 b).
  4. À la fin de la séance d’enregistrement, remettre la souris dans la drisse, si nécessaire. Enlever le fil de terre et le préamplificateur, puis relâchez le bouton de la souris à sa cage et renvoyez-le à l’animalerie jusqu'à la prochaine session d’enregistrement.

6. histologique de sectionnement, la coloration et l’imagerie

  1. Attendez que la post-injection durée souhaitée, puis anesthésier la souris et transcardially perfuse avec le formaldéhyde. Supprimer, gel et cryosection le cerveau en tranches épaisses de 10 µm. Un protocole détaillé sur l’immunohistochimie et cryosectioning du tissu cérébral rongeurs se trouvent dans Evilsizor, et al. 34.
    Remarque : Les tissus cérébraux contenant le maillage électronique peuvent être fixe et sectionné normalement, même si le système de surveillance électronique est laissés à l’intérieur. Il s’agit d’une fonctionnalité unique par rapport aux sondes neurones classiques, qui doivent être enlevées avant découpe et par conséquent modifier le tissu ou rendent difficile d’analyser l’interface de sonde-tissu.
  2. Rincer les coupes de tissus congelés cerveau 3 fois en 1 x PBS.
  3. Bloquer les sections dans une solution de 0,3 % Triton X-100 et 5 % de sérum de chèvre dans du PBS 1 x. Laisser reposer à température ambiante pendant 1 h.
  4. Incuber les sections avec la solution d’anticorps primaires. Les solutions d’anticorps primaire utilisées ici étaient de lapin anti-NeuN (dilution 1 : 200), anti-neurofilaments souris (dilution 1 : 400) et rat anti-GFAP (dilution 1/500) avec le sérum du Triton 0,3 % X-100 et 3 % de chèvre. Incuber une nuit à 4 ° C.
  5. Rincer les sections 9 fois pour un total de 40 min avec du PBS 1 x.
  6. Incuber les sections du cerveau avec la solution d’anticorps secondaires. Les solutions d’anticorps secondaire utilisées ici étaient Alexa Fluor 488 chèvre anti-lapin (dilution 1 : 200), Alexa Fluor 568 chèvre anti-souris (dilution 1 : 200) et Alexa Fluor 647 anti-rat de chèvre (dilution 1 : 200). Incuber les sections pendant 1 h à température ambiante.
  7. Rincer les sections 9 fois pour un total de 30 min avec du PBS 1 x.
  8. Monter les sections sur les lames de verre avec lamelles couvre-objet à l’aide de mountant antifade. Laissez les lames dans l’obscurité pendant au moins 24 h avant l’imagerie.
  9. Les diapositives d’images avec un microscope confocal à l’aide de 488 nm, 561 nm et 633 nm lasers comme la source d’excitation pour Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 568 et Alexa Fluor 647, respectivement. Utilisez contraste interférentiel différentiel (DIC) à l’image de l’électronique de maille sur le microscope même pour le recouvrement ultérieur des images et analyse.

Representative Results

Résultats variera selon l’espèce animale à l’étude, la région du cerveau ciblées, le temps écoulé depuis l’injection, le montant des dommages aigus subis pendant l’injection et le succès de l’i/o interface de procédure, parmi d’autres facteurs. Activité de fortification unitaires peut-être ne pas apparaître jusqu’au jour 1 (dans le cas des aiguilles de diamètre intérieur 150 µm) et 1 semaine après que les amplitudes injection et spike peuvent varier jusqu'à 4 à 6 semaines. La figure 9 présente des données électrophysiologiques représentatives d’une sonde électronique de 32 voies maille injectée dans l’hippocampe et le cortex somatosensoriel primaire d’une souris mâle adulte de C57BL/6J. Environ 300-µV amplitude potentiels de champs locaux (LFPs) ont été enregistrées sur les 32 voies et activité de fortification unitaires a été enregistrée le 26 chaînes. Les LFPs et les pointes isolées restent similaires entre 2 et 4 mois, ce qui suggère une interface hautement stable entre l’enregistrement électronique et neurones au cours de cette période de temps prolongée. La figure 10 montre des résultats représentatifs de coupes histologiques et immuno-coloration du tissu cérébral contenant le maillage électronique 1 an après l’injection. Coloration pour NeuN, un marqueur des corps cellulaires neurones et neurofilaments, un marqueur des axones neurones, ne révèle peu ou aucun perte de densité des tissus au point d’injection, ce qui implique d’interfaçage sans couture entre le tissu de maille électronique et le cerveau. Coloration pour GFAP (un marqueur pour les astrocytes) plus révèle près-fond des astrocytes autour de maillage électronique, indiquant que sa présence suscite peu chronique réponse immunitaire.

Figure 1
Figure 1 : étapes dans un seringue-injectable maillage électronique expérience. Ce protocole décrit toutes les étapes clés dans une expérience d’enregistrement neuronaux rongeur typique utilisant le maillage électronique. Expériences entraînent habituellement, par ordre de mise en œuvre, (1) fabrication de maillage électronique, (2) chargement de maillage électronique en aiguilles capillaires, injection (3) stéréotaxique de maillage électronique dans le cerveau, I/O (4) électrique interfaçage maillés électronique, enregistrements de restreints ou librement mobiles (5) et (6) maille/tissu de sectionnement et de coloration pour l’histologie. Dans certaines études, seules les données histologiques peuvent désirer, auquel cas les étapes (4) et (5) peut être ignorée. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : schéma illustrant la procédure de fabrication pour l’électronique de maille plug-and-play dans la région périphérique ultra-flexible (première rangée), tige d’interconnexions (rangée du milieu) et I/O (rangée du bas). (A) SU-8 photosensible négative (rouge) s’inspire avec masque de PL-1 pour définir le fond passivation couche de chaque sonde électronique de maille plug-and-play. (B) structuration avec masque-2 PL, l’évaporation thermique et déjaugeage métal définir Au interconnexions et plaquettes de I/O (or). (C) structuration avec masque-3 PL, évaporation par faisceau d’électrons et métal déjaugeage définir Pt électrodes (bleu). (D) SU-8 photosensible négative (rouge) s’inspire avec PL masque-4 définir la couche de passivation. Ouvertures dans le SU-8 sont laissés à chaque électrode Pt et coussin I/O. (E) A terminé mesh sonde électronique avec des boîtes en pointillés indiquant les emplacements agrandis dans le haut, au milieu et lignes de fond. Photomasque fichiers de conception sont disponibles sur demande auprès des auteurs ou depuis le site de ressource, meshelectronics.org. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : photographies et images de microscope optique de plug-and-play maillage électronique. (A) en mosaïque d’images de microscope optique d’une sonde électronique de seringue-injectable maille avec e/s plug-and-play. La sonde a été photographiée après que l’achèvement de la fabrication les étapes dans la Figure 2 , mais avant la publication du substrat Ni enduit. Les zones en pointillés correspondent de gauche à droite pour les sections de la région périphérique ultra-flexible, la tige et la région I/O amplifiés dans C, D et E, respectivement. Echelle = 1 mm. (B) photographie d’une plaquette de TR 3 pouces contenant 20 terminé mesh sondes électroniques. Echelle = image microscope optique 20 mm. (C) de 20 µm de diamètre Pt enregistrement des électrodes dans la région périphérique ultra-flexible. Echelle = 100 µm. (D) image par microscope optique de haute densité Au interconnexions dans la région de la tige. Chaque interconnexion UA est isolée électriquement et connecte à une seule électrode Pt sur un coussinet de I/O unique. Echelle = 100 µm. (E) optique image microscopique des plaquettes I/O. Chaque tampon se compose d’une région réductible maille et une région minces continue sur la tige. Conducteurs non SU-8 rubans connecter les portions de maillage des plaquettes ensemble pour aider à maintenir l’alignement. Echelle = 200 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : montage des appareils pour la tenue des aiguilles capillaires pendant l’injection de. Photographie (A) des composants de l’appareil. Les composants incluent (1) une aiguille capillaire de verre, (2) le titulaire de la pipette, (3) une attache de vis circulaire pour le titulaire de la pipette et (4) une rondelle conique pour le titulaire de la pipette. Points (2) à (4) sont inclus avec l’achat d’un détenteur de la pipette. La flèche indique la sortie du titulaire de la pipette, qui doit être collé fermé avec de l’époxy. (B) photo du titulaire pipette après montage et insertion d’une aiguille capillaire de verre. L’époxy ajouté est visible à la sortie en haut du porte-pipette (indiquée par la flèche) et tube capillaire connecte le titulaire de la pipette sur une seringue (non illustrée). (C) photo du titulaire de la pipette et l’aiguille capillaire après la fixation au cadre stéréotaxique avec une pince à angle droit fin. Barreaux de l’échelle est 1 cm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : chargement de maillage électronique en verre aiguilles. (A) illustration schématique de la procédure de chargement pour l’électronique de maille plug-and-play. Une aiguille de verre est positionnée près de l’extrémité de la I/O d’une sonde électronique de maille, alors qu’il est suspendu dans une solution. Le piston de la seringue est alors manuellement rétracté pour dessiner dans la sonde électronique de maille. Positionnement idéal, c’est avec la région périphérique ultra-flexible juste à l’intérieur de l’extrémité de l’aiguille. Photographies (B) correspondant à (A) d’une sonde électronique de maille chargée dans une aiguille de verre. Barreaux de l’échelle = 2 mm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : schéma de la station de chirurgie stéréotaxique. Un cadre stéréotaxique motorisé (A) avec porte-pipette jointe sert à positionner l’aiguille dans la région du cerveau désirée. La position de l’aiguille et chargé de maillage électronique sont surveillées avec un objectif et fixé la caméra (B) et affichés sur un ordinateur (C). Un pousse-seringue (D) volumes précis d’une solution saline, traverse de l’aiguille, permettant une injection précise et contrôlée de maillage électronique dans la région du cerveau désiré. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : Plug-and-play I/O interfaçage procédure. (A) An FFC substrat de serrage est sécurisée avec un ciment dentaire adjacent à la craniotomie. (B) Plug-and-play maillage électronique est stereotaxically injecté dans la région du cerveau désirée à l’aide de la méthode de champ de vision. (C), l’aiguille, avec les pads I/O du maillage électronique sonde toujours à l’intérieur, est repositionné au-dessus de la FFC, substrat de serrage. Débit (D) est repris par l’aiguille pour éjecter les coussinets de I/O sur la FFC substrat de serrage. (E) les plaquettes de I/O sont pliées à 90 ° par rapport à la tige, s’est déroulée avec le côté conducteur vers le haut et séché en place. Substrat (F), la FFC est garnie de ciseaux à un linéaire environ 0,5 mm entre le bord des plaquettes I/O. Substrat excès est coupé pour permettre l’insertion dans un connecteur ZIF de 32 voies. Tampons (G), les entrées/sorties sont insérés dans un connecteur ZIF de 32 voies monté sur un circuit imprimé personnalisé. Le connecteur ZIF est verrouillé fermée pour faire contact avec les plaquettes I/O. (H), le verrou est cimenté fermé, le PCB est renversé sur le crâne et le PCB est maintenu en place avec du ciment dentaire. (I) The PCB forme un préamplificateur compact doté d’un connecteur standard amplificateur pour l’interfaçage facile au cours de sessions d’enregistrement. Barreaux de l’échelle = 1 cm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 8
Figure 8 : enregistrements sobres et émouvant librement. (A) photographie d’une souris C57BL/6J mâle dans une drisse pendant une session d’enregistrement. Un préamplificateur de 32 canaux de PCB a été inséré dans le connecteur standard amplificateur. Photographie (B) de la même souris avec 32 canaux préampli PCB au cours d’une expérience d’enregistrement librement mobiles. Barreaux de l’échelle = 1 cm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 9
Figure 9 : inscription neural représentatif des résultats. (A) représentant LFP cartes de chaleur de 32 canaux de maille sondes électroniques injectés dans la souris hippocampe et le cortex somatosensoriel. Les données ont été enregistrées tandis que la souris explorer librement sa cage à 2 mois (en haut) et après l’injection 4 mois (en bas). Amplitude de la LFP est codé par couleur selon la barre de couleur à droite. Passe-haut filtrés traces (noir) montrant l’activité de fortification sont superposées sur le spectrogramme pour chacun des 32 canaux. (B) pointes isolées après que le tri des données tracées dans (A). Activité de fortification unitaires a été détectée sur 26 de la 32 canaux les deux 2 mois après injection (en haut) et de 4 mois après (en bas). Les nombres au-dessus de chaque cluster de pointes correspondent aux numéros canal (a). Ce chiffre a été modifié par Fu, et al. 28. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 10
Figure 10 : résultats histologiques représentatif. (A) schéma illustrant l’orientation de maillage électronique au sein de l’horizontale (panneau central) et sagittales tranches de cerveau (panneau inférieur). (B) image microscope de Fluorescence d’une tranche de cerveau cortical épais de 10 µm un an après l’injection d’une sonde électronique de maille 16 canaux. La tranche a été immunomarquées pour NeuN (vert). (C) la même tranche de cerveau immunomarquage des neurofilaments (rouge). (D) le même cerveau tranche immunomarquage pour GFAP (cyan). (E), une image composite de (B) à (D) montrant le maillage électronique/tissu s’interfacer avec marqué NeuN (vert), neurofilaments (rouge), GFAP (cyan) et maillage électronique (bleu). Barreaux de l’échelle = 100 µm. Ce chiffre a été modifié par Fu et al. 27. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Supplémentaire vidéo 1 : répété le chargement et l’injection de maillage électronique dans la solution. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Toutes les étapes de la fabrication et l’utilisation de l’électronique de la maille sont importants, mais quelques-uns sont particulièrement critiques. Avant de relâcher l’électronique de maille de leur plaquette, il est essentiel d’oxyder la surface pour faire les mailles facilement suspendus dans une solution aqueuse (étape 1.6.1). Si cette étape est ignorée, les mailles généralement flottant à la surface de l’eau, ce qui les rend difficiles à charger dans les aiguilles, et si ils peuvent être chargés, ils collent souvent aux côtés des aiguilles verre, nécessitant de grands volumes (> 100 µL) pour l’injection. Échec d’oxyder la surface avant la libération, par conséquent, en général signifie que les mailles ne peuvent être utilisés et la fabrication doivent être re-joués depuis le début. Une autre étape critique est la flexion le maillage électronique « tige » à ~ 90° pendant les e/s interface (étape 4.3). Si l’angle est inférieur à 90°, puis tous les pads de I/O 32 ne tiendra pas dans le connecteur ZIF ; certains devront être couper l’extrémité pour permettre l’insertion, en réduisant le nombre d’électrodes connectées. Le processus doit aussi faire doucement pour prévenir la tige de se casser.

La conception de maillage électronique peut être personnalisée pour diverses applications en modifiant les masques et en utilisant le même procédé de fabrication décrit dans la Figure 2. Par exemple, alors que les sondes de maillage électronique utilisés pour enregistrer les données dans la Figure 9 ont été conçus pour avoir 32 électrodes d’enregistrement couvrent la souris hippocampe et le cortex somatosensoriel primaire, l’emplacement des électrodes dans le maillage ultra-flexible peut être sélectionné pour cibler n’importe quel cerveau région (s) ou plus grandes électrodes pour la stimulation peuvent être constituée de27. La même procédure de structure et de la fabrication de maille de base sont conservées, mais le placement des électrodes et la conception sont ajustées pour répondre aux besoins de l’étude. Enquêteurs devraient faire preuve de prudence, cependant et toujours tester que dessins modifiés peuvent être injectés facilement à travers les aiguilles prévues. Petits changements à la déformation mécanique de maillage électronique peut avoir des effets substantiels sur l’injectabilité. Un tel exemple est qu’un angle de 45° entre transversales et longitudinales SU-8 rubans donne une sonde électronique de maille qui peut être injectée simpliste mais qui se froisse et obstrue les aiguilles21entraîne un angle de 90°.

Mesurer l’impédance des électrodes enregistrement est utile pour le dépannage. Une électrode de Pt 20 µm de diamètre circulaire devrait avoir une magnitude de l’impédance près 1 MΩ lorsqu’il est mesuré à une fréquence de 1 kHz en vivo ou en 1 x PBS29. Une impédance sensiblement plus grande que cela implique que l’électrode est pas exposé, comme peut se produire si elle est contaminée par des résidus de résine photosensible ou pas électriquement connecté. Ce dernier peut se produire si, par exemple, poussière sur le masque photo pendant les PL qui interconnecte les conduit à un décalage dans l’UA, ou si une des touches I/O maille n’est pas contactée par les broches du connecteur ZIF au cours de l’interfaçage de I/O. Une magnitude de l’impédance à peu près la moitié de la valeur attendue suggère que le canal peut être court-circuités à celle adjacente, créer un circuit de deux impédances électrode parallèlement les uns aux autres. Les valeurs d’impédance mesurée servent de guide pendant le dépannage ; combiné avec la microscopie optique des sondes électroniques maille, la source du problème peut généralement être identifiée et corrigée en conséquence dans la prochaine fabrication exécuter ou la tentative d’interfaçage de I/O.

L’utilisation de seringue-injectable maillage électronique pour les études de toxicité aiguë est limitée à cet activité fortification unitaires n’est pas habituellement observée jusqu'à 1 semaine post injection27, bien que des travaux récents (non publiée) montrent que ce problème est facilement vaincu. Des facteurs déterminants du temps requis pour voir l’activité de fortification sont la maille design, le volume du liquide injecté dans le cerveau ainsi que de l’électronique de la maille et le diamètre de l’aiguille utilisée pour l’injection, comme ceux-ci affectent le degré des lésions tissulaires au cours de la l’injection et le taux de guérison. Volumes d’injection grande peuvent être requis si l’électronique de maille n’est pas traités avec le plasma d’oxygène avant la publication dans Ni etchant ; autrement dit, si le maillage n’est pas hydrophile, il peut adhérer à l’aiguille de verre. Parfois, les mailles ont des défauts qui mènent à la flexion mécanique qui les rendent difficiles à injecter. Lors du chargement de l’électronique de la maille, il est important de vérifier que des maillages sont déplacent facilement et en douceur au sein de l’aiguille (comme sur la vidéo supplémentaire 1). Si ce n’est pas le cas, une sonde électronique de maillage différent doit être utilisée. Meilleurs résultats pour interfacer les neurones sans soudure seront atteint avec l’idéal injecter des volumes de 10 à 50 µL par 4 mm de longueur de maille injectée. Des résultats plus récents avec des sondes d’électronique plus fines maille injectée et/ou petites AIG capillaire de diamètre (aussi petit que le diamètre intérieur de 150 µm, 250 µm de diamètre extérieur) montrent que seule unité de dopage peut être observée de peu de temps après l’injection (mesures aiguës) Grâce à des temps plus longs. Fichiers de conception du masque pour ces structures fines de la maille sont disponibles sur demande ou sur le site de ressource, meshelectronics.org. Nous estimons que le rendement global de notre en vivo maille injection procédures avec 400 µm de diamètre intérieur (650 µm de diamètre extérieur) aiguilles à environ 70 %, même si le rendement est plus proche de 80 à 90 % pour nos travaux plus récents avec 150 µm de diamètre intérieur (250 µm diamètre extérieur de ) aiguilles. Les raisons les plus fréquentes de l’échec sont (1) que le maillage injecte-t-il pas sans à-coup, entraînant œdème cérébral des volumes important d’injection dans le cerveau, rupture de maille (2) au cours de la manipulation manuelle requise dans les entrées/sorties, interface de procédure et (3) saignement d’endommager un vaisseau sanguin pendant l’injection. Endommager un vaisseau sanguin au cours de l’injection est rare (la cause de moins de 10 % d’échecs) et pourrait être réduite davantage en utilisant la chirurgie guidée par l’image. Notons aussi que les dommages des vaisseaux sanguins sont une limite commune de toutes les procédures impliquant la pénétration du tissu cérébral, y compris l’injection de particules virales pour la transfection, l’implantation des sondes cérébrales rigide et l’injection de l’électronique de la maille.

Maillage électronique sondes sont capables de stablement enregistrer et suivre les mêmes neurones individuels au moins les mois aux échelles de temps de l’année et n’évoquent presque aucune réponse immunitaire chronique, comme le montre la Figure 9 et Figure 10, respectivement. Cela représente un avantage significatif par rapport aux électrodes de profondeur de convention, qui souffrent souvent de diminution des amplitudes de spike, signaux instables et une inflammation chronique au cours de la longue durée d’enregistrement des expériences14, 15. en outre, l’électronique de maille ont l’avantage qu’ils peuvent être laissés dans le tissu lors de coupes histologiques, la coloration, et d’imagerie, contrairement aux sondes classiques, qui sont trop rigides et doivent donc être enlevés avant l’histologie analyses. Par conséquent, maillage électronique permettre la capacité unique d’analyse immunohistochimique permet d’étudier précisément l’environnement cellulaire entourant chaque site d’enregistrement.

Le protocole présenté ici s’ouvre-up excitant de nouvelles opportunités en neurosciences. La méthode mini-invasive de la livraison et l’intégration transparente de maillage électronique avec tissu cérébral réduit au minimum la perturbation de circuits neuronaux et évite la réponse immunitaire chronique, pouvant être bénéfique pour la plupart des types d’expériences d’enregistrement neuronaux chronique. La capacité de maillage électronique pour enregistrer et suivre les mêmes neurones seul pour de longues périodes sera particulièrement intéressant pour les chercheurs qui cherchent à établir une corrélation entre activité de fortification à l’échelle de la milliseconde par mois à l’année longue des processus comme le vieillissement, la pathogénie de la maladie du cerveau, ou cerveau développement16,18. En outre, il existe des opportunités importantes pour étendre et personnaliser ce protocole, telles que l’ajout de composants électroniques actifs sur la scène-tête de PCB pour implémenter des fonctionnalités comme numérique, multiplexage8,35, sans fil communication de36,35,37et35, conjointement par injection de cellules souches ou des polymères avec l’électronique de maille pour faciliter tissue regeneration18,38, de traitement du signal 39et incorporant des nanofils effet transistors de champ (NW-FETs) en maillage électronique pour très localisée et cerveau multifonctionnel sondes24,29,40,41 ,,42.

Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgements

C.M.L. reconnaît la prise en charge de ce travail par l’Air Force Office of Scientific Research (FA9550-14-1-0136), un prix Harvard Université des Sciences physiques et ingénierie accélérateur et un instituts nationaux de santé directeur de Pioneer Award) 1DP1EB025835-01). T.G.S. reconnaît la prise en charge par le Department of Defense (DoD) à travers le Programme National Defense Science & Engineering Graduate Fellowship (NDSEG). G.H. reconnaît la prise en charge de bourse de l’American Heart Association (16POST27250219) et la voie à l’indépendance Award (Parent K99/R00) de l’Institut National sur le vieillissement de la National Institutes of Health. Cette œuvre était jouée en partie au Centre universitaire de Harvard pour le systèmes nanométriques (CNS), un membre de la National Nanotechnology coordonnée Infrastructure réseau (NNCI), qui est soutenu par la National Science Foundation sous NSF ECCS prix n 1541959.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Motorized stereotaxic frame World Precision Instruments MTM-3 For mouse stereotaxic surgery
512-channel recording controller Intan Technologies C3004 A component of the neural recording system
RHD2132 amplifier board Intan Technologies C3314 A component of the neural recording system
RHD2000 3 feet ultra thin SPI interface cable Intan Technologies C3213 A component of the neural recording system
Mouse restrainer Braintree Scientific TV-150 STD Standard 1.25 inch inner diameter; used to restrain the mouse during restrained recording sessions.
Si wafers Nova Electronic Materials 3" P <100> .001-.005 ohm-cm 356-406 μm Thick
Prime Grade SSP Si wafers w/2 Semi-Std. Flats &
6,000 A°±5% Wet Thermal Oxide on both sides.
Photomasks (chrome on soda lime glass) Advance Reproductions Advance Reproductions and other vendors manufacture photomasks from provided design files. Our photomask design files are available by request or from the resource website, meshelectronics.org. Alternatively, some university clean rooms have mask writers for making photomasks on site.
AutoCAD software Autodesk Inc. Design software for drawing photomasks. A free alternative is LayoutEditor. Our photomask design files are available by request or from the resource website, meshelectronics.org.
Thermal evaporator Sharon Vacuum Used to evaporate Ni, Cr, and Au onto mesh electronics during fabrication. Many university clean rooms have this or a similar tool.
SU-8 2000.5 negative photoresist MicroChem Corp. Negative photoresist used to define the bottom and top passivating layers of mesh electronics.
MA6 mask aligner Karl Suss Microtec AG Used to align each photomask to the pattern on the wafer and expose the wafer to UV light. Most university clean rooms have this or a similar tool.
SU-8 developer MicroChem Corp. Used to develop SU-8 negative photoresist following exposure to UV light.
LOR3A lift-off resist MicroChem Corp. Used with Shipley 1805 photoresist to promote undercutting during metal lift-off processes
Shipley 1805 positive photoresist Microposit, The Dow Chemical Company Positive photoresist used to define metal interconnects and Pt electrodes in mesh electronics
MF-CD-26 positive photoresist developer Microposit, The Dow Chemical Company To develop S1805 positive photoresist after exposure in a mask aligner. Many university clean rooms stock this chemical.
Spin coater Reynolds Tech For coating wafers with positive and negative resists. Most university clean rooms have spin coaters.
PJ plasma surface treatment system AST Products, Inc. Used to oxidize the surface of mesh electronics prior to release into aqueous solution. Most university clean rooms have this or a similar tool.
Electron beam evaporator Denton Vacuum For evaporating Cr and Pt during fabrication of mesh electronics. Many university clean rooms have this or a similar tool.
Remover PG MicroChem Corp. Used to dissolve LOR3A and Shipley S1805 resists during metal lift-off
Ferric chloride solution MG Chemicals 415-1L A component of Ni etching solution
36% hydrochloric acid solution Kanto Corp. A component of Ni etching solution
Glass capillary needles Drummond Scientific Co. Inner diameter 0.40 mm, outer diameter 0.65 mm. Other diameters are available.
Micropipette holder U-type Molecular Devices, LLC 1-HL-U Used to hold the glass capillary needles during stereotaxic injection
1 mL syringe NORM-JECT®, Henke Sass Wolf Used for manual loading of mesh electronics into capillary needles
Polyethylene intrademic catheter tubing Becton Dickinson and Company Inner diameter 1.19 mm, outer diameter 1.70 mm
5 mL syringe Becton Dickinson and Company Used in the syringe pump for injection of mesh electronics in vivo
Eyepiece camera Thorlabs Inc. DCC1240C Used to view mesh electronics within capillary needles during injection
ThorCam uc480 image acquisition software for USB cameras Thorlabs Inc. Used to view mesh electronics within capillary needles during injection
Syringe pump Harvard Apparatus PHD 2000 Used to flow precise volumes of solution through capillary needles during injection of mesh electronics
EXL-M40 dental drill Osada 3144-830 For drilling the craniotomy
0.9 mm drill burr Fine Science Tools 19007-09 For drilling the craniotomy
Hot bead sterilizer 14 cm Fine Science Tools 18000-50 Used to sterlize surgical instruments
CM1950 cryosectioning instrument Leica Microsystems Used to slice frozen tissue into sections. Many universities have this or a similar tool available in a shared facility.
0.3% Triton x-100 Life Technologies Used for histology
5% goat serum Life Technologies Used for histology
3% goat serum Life Technologies Used for histology
Rabbit anti-NeuN Abcam ab177487 Used for histology
Mouse anti-Neurofilament Abcam ab8135 Used for histology
Rat anti-GFAP Thermo Fisher Scientific Inc. PA516291 Used for histology
ProLong Gold Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific Inc. P36930 Used for histology
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich Corp. P6407-5MG Molecular weight = 70-150 kDA
Right-angle end clamp Thorlabs Inc. RA180/M Used to attach the pipette holder to the stereotaxic frame
Printed circuit board (PCB) Advanced Circuits Used to interface between mesh electronics and peripheral measurement electronics such as the Intan recording system. Advanced Circuits and other vendors manufacture and assemble PCBs based on provided design files. Our PCB design files are available by request or at the resource site meshelectronics.org
32-channel standard amplifier connector Omnetics Connector Corp. A79024-001 Component assembled onto the PCB
32-channel flat flexible cable (FFC) Molex, LLC 152660339 Used as a clamping substrate when interfacing to mesh electronics I/O pads with the PCB-mounted ZIF connector
32-channel zero insertion force (ZIF) connector Hirose Electric Co., LTD FH12A-32S-0.5SH(55) Component assembled onto the PCB

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References

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