Высокой пропускной способностью, высоким содержанием, на основе жидкости C. elegans Pathosystem

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Здесь мы описываем протокол, который является адаптируемой, весь узел, высоким содержанием скрининга инструмент, который может быть использован для изучения взаимодействия хост возбудителя и использоваться для обнаружения наркотиков.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Anderson, Q. L., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem. J. Vis. Exp. (137), e58068, doi:10.3791/58068 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Количество выявленных новых препаратов, традиционных, в пробирке экраны waned, уменьшения успех такого подхода в поисках новых видов оружия для борьбы с несколькими лекарственной устойчивости. Это привело к выводу, что исследователи не только необходимость поиска новых лекарств, но также должны разработать новые способы их обнаружения. Среди наиболее перспективных кандидатов методов всего организма, в естественных условиях assays что использование высокой пропускной способностью, фенотипические отсчетов и находится в диапазоне от Caenorhabditis elegans до данио рерио. Эти узлы имеют несколько мощных преимуществ, включая резкое сокращение в ложных положительных хитов, как соединения, которые являются токсичными для пребывания и/или biounavailable обычно переносятся в начальный экран, до дорогостоящих последующей вверх.

Здесь мы покажем, как нашего анализа была использована допросить хост вариации в документально C. elegansPseudomonas aeruginosa жидкого убийства pathosystem. Мы также продемонстрировать несколько расширений этой хорошо отработанные методики. Например мы в состоянии осуществлять генетические экраны высокой пропускной способности с помощью РНК-интерференции в 24 - или 96-луночных пластины форматы запросов хоста факторов в этом взаимодействии хост патогена. Используя этот assay, весь геном экранов может быть завершена только через несколько месяцев, которые могут значительно упростить задачу выявления лекарственных препаратов, потенциально без необходимости кропотливого биохимической очистки подходов.

Мы также приводим здесь вариант нашего метода, который заменяет грамположительные бактерии Enterococcus faecalis для грамотрицательных патогенов P. aeruginosa. Много, как это предусмотрено для P. aeruginosa, убийство E. faecalis зависит от времени. В отличие от предыдущих C. elegansE. faecalis анализов, наши пробирного для E. faecalis не требует preinfection, повышение его безопасности профиля и уменьшая шансы заражения жидкость разгрузочное оборудование. Assay является очень надежной, показаны ~ 95% смертности 96 h пост инфекции.

Introduction

Выявление и развитие эффективных, широкого спектра действия антибиотиков, теперь почти столетие назад, привели к переломным моментом в области общественного здравоохранения где существует широкое распространение убеждение, что инфекционные болезни будет бедствием прошлого. В течение нескольких десятилетий короткие этот оптимизм начал ослабевать, как возбудитель после возбудителя механизмы сопротивления, которые ограничивают эти однажды чудесных лечения. На некоторое время гонка вооружений между усилиями обнаружения наркотиков и возбудители казалось сбалансированным. Однако неправомерное использование противомикробных препаратов недавно стало появление Пан лекарственной устойчивостью штаммов Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter заболеваний, Serratia marcescensи P. aeruginosa1, 2,3,4.

P. aeruginosa является оппортунистических, грам отрицательные, мульти хост возбудителя, является серьезной угрозой для больных с ожогами, те, кто с ослабленным иммунитетом или кистозный фиброз. Он также все чаще определяется как возбудитель в тяжелых нозокомиальных инфекций, особенно из-за его постоянной приобретения устойчивости к противомикробным препаратам. Чтобы приступить к решению этой угрозы, мы использовали документально C. elegans-P. aeruginosa инфекции системы5. Наша лаборатория использовала эту систему для разработки платформы на основе жидкости, высокой пропускной способности, высоким содержанием скрининг для выявления новых соединений, которые ограничивают способность возбудителя убить пребывания6. Интригующе эти соединения, как представляется, принадлежат по крайней мере три общие категории, включая антимикробные7 и вирулентности ингибиторы8. Другие анализы обнаружения наркотиков высоким содержанием в C. elegans были зарегистрированы для tuberculosum микобактерии, Chlamydia trachomatis, Yersinia pestis, Listeria monocytogenes, Francisella tularensis, золотистый стафилококк, Candida albicans, и Enterococcus faecalis, среди других9,10,11,12,13,14,,1516. Эти типы анализов есть несколько хорошо признанных преимуществ, таких как ограничение ложных положительных хитов, которые могут быть токсичными для принимающей страны и возбудителя, увеличение вероятности биодоступность, по сравнению с химической экрана и возможность выявления хитов за пределами просто, ограничивая рост микроорганизмов, таких как анти virulents, иммунных стимулирующих молекул или соединения, которые в противном случае смещение баланса в хост возбудитель взаимодействия пользу бывшей. Кроме того соединения, обнаружил в эти экраны часто эффективны в млекопитающих хостов.

Стоит отметить, что по крайней мере два других анализов17,18 доступны для выполнения высокопроизводительных экраны в C. elegans в жидкости. Однако, каждый из этих анализов представляет собой модификацию, который позволяет прототипом assay кишечных колонизации, известный как медленно убийства, чтобы выполняться в жидкости, увеличивая пропускную способность и позволяет соединения для более легко проверяться. Тщательно характеристика убедительно продемонстрировал, что механизмы вирулентности бактерий отличаются между этих анализов и жидкости на основе экрана7. Поскольку оба типа вирулентности наблюдаются в системах млекопитающих, важно рассмотреть, какие детерминант вирулентности является наиболее актуальной для экспериментатора интересы до отбора пробы.

Здесь мы показываем, оптимизированной версии на основе жидкости C. elegans-P. aeruginosa assay. Мы также доклад адаптации нашего Пробирной жидкости на основе метода для размещения грамположительных бактерий возбудителя Enterococcus faecalis. Как P. aeruginosa E. faecalis во все большей степени определяется как угроза серьезного нозокомиальных с растущей вооружение антибиотикорезистентности пути1. Хотя предыдущий метод для высокопроизводительного скрининга E. faecalis существует14, он требует preinfection с возбудителя, который усложняет процедуру и повышает вероятность заражения оборудования как COPAS FlowSort. Наш протокол устраняет необходимость предварительной инфекции, улучшение профиль безопасности. Наконец мы сообщаем средств, по которому любой из этих анализов могут быть объединены с кормления интерференции, позволяя пользователю для поиска узла факторов, которые играют определенную роль в создании, или устойчивость к инфекции.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Предупреждение: P. aeruginosa и E. faecalis патогенов биологической безопасности уровня 2, и надлежащие меры предосторожности должны быть приняты для предотвращения случайного заражения и свести к минимуму загрязнение поверхностей. Все средства массовой информации и материалы, которые вступают в контакт с патогенами должны стерилизовать или удалены. Дополнительные руководящие принципы доступны из CDC публикации биобезопасности в микробиологические и биомедицинских лабораториях (BMBL), 5-е издание.

1. Подготовка и поддержание P. aeruginosa

  1. P. aeruginosa полоска из замороженных запасов на пластину агар фунтов (Lysogeny бульон). Инкубировать 16-24 ч при 37 ° C
    Примечание: Выполните эксперименты P. aeruginosa внутри BSL-2 биологической безопасности кабинета для обеспечения стерильности. Используйте соответствующие меры предосторожности, чтобы свести к минимуму вероятность патогенной инфекции или контаминации.
  2. Передача этой пластины до 4 ° C. Эта пластинка может сохранить на 4 ° C и используется для инокуляции культур на срок до одной недели. После одной недели обеззараживания и отбросить пластину и сделать новую пластину полоска фунтов.
    Примечание: P. aeruginosa вирулентности уменьшается после длительного хранения.
  3. Два дня до создания пробирного пластины, прививать 3-5 мл стерильной LB отвара с одной колонии P. aeruginosa от пластины в 1.1. Инкубируйте при 37 ° C 12 до 16 часов.
    Примечание: Не больше, чем 16 ч инкубации. В богатых жидких культур P. aeruginosa PA14 начинает лизируют.
  4. Подготовить стерильные 10 см пластины с медленно убивать СМИ (3 г NaCl, 3.5 g Пептон, CaCl 1 мм2, 1 мм MgSO4, 25 мл фосфатного буфера (сумма за литр: 132 мл K2HPO4 (1 М) и 868 мл х2PO4 (1 М)) и 18 g агар/Л).
    Примечание: Подготовьте пластины впереди времени. Они могут храниться до 3 недель в герметичном контейнере на 4 ° C.
  5. Семя пластины, медленно убивают каждый 10 см (SK пластины) с 350 мкл P. aeruginosa свежие ночи LB культуры. С помощью стерильных бактериальных разбрасыватель, распространение бактерий равномерно по всей поверхности средств массовой информации и дать высохнуть в BSL-2 биологической безопасности кабинета.
  6. Инкубируйте пластины при 37 ° C в течение 24 ч.

2. Подготовка RNAi бактерий

  1. Полоса, или ПИН передача требуемой штаммов бактерий, интерферирующих РНК содержащих, на плиты агара LB, содержащие соответствующие антибиотики (carbenicillin на 100 мкг/мл) и тетрациклинов на 15 мкг/мл для библиотек Ahringer и Видал из замороженных запасов.
    Примечание: При работе с непатогенных бактерий, используйте либо BSL-2 A / B биологической безопасности кабинета или ламинарного потока BSL-1 капот для обеспечения стерильности культур и свести к минимуму вероятность загрязнения библиотеки.
  2. Инкубировать пластины для 24 ч при 37 ° C.
  3. Храните пластины на 4 ° C на срок до двух недель.
    1. После двух недель отменить пластины и заменить их с свежезаваренным сделал пластинами.
  4. Проверьте несколько штаммов RNAi параллельно, индивидуально прививки единую колонию от каждого клона в 4 мл carbenicillin дополнить фунтов в сингл хорошо пластины 24 deep скважины или в стерильную пробирку.
    Примечание: Тетрациклин как сообщается, снижают эффективность RNAi. Не использовать его в это средства массовой информации.
  5. Поместите пластины для 24-ну погруженный в тряску инкубатор, оптимизированный для multiwell пластины и инкубировать и при 37 ° C для 16 h при встряхивании в 950 об/мин.
    Примечание: Это трудно получить равномерное рост бактерий в multiwell пластины, с использованием обычных пожимая инкубатора. Покачивая инкубатор необходимо иметь возможность пожать как минимум 750 об/мин в порядке для культур расти должным образом. В отсутствие специализированных шейкер можно вырастить каждой культуры в отдельных труб. Культур могут быть перенесены в 24-ну пластина для центрифугирования, при желании.
  6. Собирайте бактерий центрифугированием на 5 минут в 2000 x g.
  7. Декант супернатант инвертирование пластину и энергично встряхивая. Ресуспензируйте RNAi бактерий в 100 мкл базальной S (5.85 г NaCl, 1 g K2HPO4, 6 g KH2PO4 растворяют в 1 Л ультрачистая вода и стерилизации в автоклаве).
  8. Пипетка ресуспензированы бактерий в соответствующее количество скважин multiwell плиты NGM (нематоды роста СМИ, 3 g NaCl, 2.5 g Пептон, CaCl 1 мм2, 1 мм MgSO4, 25 мл фосфатного буфера (сумма за литр: 132 мл K2HPO4 (1 M) и 868 мл х2PO4 (1 М)) и 18 g агар на литр воды) с IPTG (1 mM концентрации выпускных экзаменов) и carbenicillin (конечная концентрация 100 мкг/мл).
    1. Используйте 3,5 мл NGM СМИ за хорошо 6-ну пластины, 1 мл на хорошо 24-ну плиты или 150 мкл на хорошо 96-луночных пластины.
    2. Использовать 100 мкл/ну бактерий для 6-ну плиты; 50 мкл/колодец для 24-хорошо; или 20 мкл/96-луночных пластины. Дайте высохнуть.
      Примечание: Сушка обычно производится в стерильных потока капот для содействия быструю и равномерную сушку. Очень важно равномерное высыхание. Избегайте чрезмерного высыхания, как трещины в агар поощрять рыться червей. Это приводит к червь потерь и потенциальных засорение систем жидкость обработки.
  9. Сразу использовать подготовленные пластины или хранить их при температуре 4 ° C на срок до двух недель для последующего использования.
    Примечание: Для предотвращения высыхания плиты, их можно герметичные пластиковые парафин пленкой или помещены в контейнер плотно закрытыми с влажной салфетки.

3. техническое обслуживание и подготовка C. elegans

Примечание: Прежде чем начинать эксперименты, следующим создайте синхронизированные населения беременных, взрослые черви гермафродиты.

  1. Вымойте беременных взрослых (т.е., с несколько эмбрионов, видимый в пределах Гонада) из 4-6 10-см NGM плит в 15 мл Конические трубки путем добавления 4 мл S Базальные пластины, закрученной мягко и затем вливаются в 15 мл Конические трубки.
  2. Пелле червей через центрифугирования в 1000 x g за 30 секунд.
  3. Супернатант аспирата, стараясь не нарушить червь Пелле.
  4. Добавить 3,5 мл раствора отбеливатель червь (конечная концентрация 0,5 М NaOH, гипохлорит натрия 1%, в стерильной воде) червь Пелле, и микс от переворачивать за 1 минуту.
  5. Кратко вихря и центрифуги на 1000 x g за 30 секунд.
  6. Аспирационная или сцеживаться супернатанта, стараясь не нарушить червь Пелле.
  7. Добавьте 3,5 мл свежего червь раствор отбеливателя в Пелле червя.
  8. Энергично перемешивают червей в раствор отбеливателя. Периодически (примерно каждые десять секунд) осмотрите червей под микроскопом рассечения. Следите за червь кутикулы сломать, выпуская яйца. После того как большинство взрослых червей были растворенного (~ 95%), разбавленных отбеливатель для 15 мл с базальной S чтобы остановить пищеварение.
    Примечание: Яичная скорлупа являются более устойчивыми к отбеливать чем взрослых тканях, но они могут быть распущены в период длительного воздействия. Чтобы избежать распада яйцо, не подвергайте яйца червь раствор отбеливателя для более чем 7 минут. Если повреждены чрезмерно яичную скорлупу, эмбрионы будут умирать.
  9. Пелле эмбрионов в 1000 x g 30 секунд и аспирационная или сцеживаться супернатант без удаления Пелле эмбрионов.
  10. Ресуспензируйте червей в S базальной окончательный объемом 15 мл для разбавления оставшийся раствор отбеливателя.
  11. Повторите шаги стиральная (3,9-3.10) три раза для в общей сложности 4 последовательных моет.
  12. После четвертого вымыть удалить супернатант и добавить до 5 или 6 мл стерильного базальной S в 15 мл Конические трубки. Цель заключается в Ресуспензируйте эмбрионов для концентрации ~ 50 червей за мкл.
    Примечание: Количество S базальной зависит от размера гранул яйцо; чем больше Пелле, больше базальных S является необходимым.
  13. Инкубировать Конические трубки ночь на столешницы ротатор при комнатной температуре или 48 ч при 15 ° C. Личинки вылупятся, но развития личинок будет арестовать на стадии L1 (L1 диапауза) вследствие лишения питательных веществ.
  14. Изучения под микроскопом рассечения, чтобы убедиться, что большинство из них вылупился и арестованы на L1 стадии развития эмбриона.
  15. Определите количество червя, приняв 20 мкл червь подготовительной и разбавления с 80 мкл базальной S. Пипетка 10 мкл разбавленного червь раствора непосредственно на пустую тарелку NGM. Повторите 2 раза.
    1. Граф личинок в каждом месте и определить среднее число. Разделите этот средний 2 получить приблизительное количество червей за мкл в червь prep. Парфюмерные Червь затем может использоваться для распространения пластин или экспериментов.
      Примечание: После 4-5 дней, голодали личинки начнут умирать; на данный момент отменить prep.
  16. Для размножения напряжение, соответствующее количество L1 червей (5000-6000 человек) на 3-4 10-см NGM пластин пятнистый с пипеткой сосредоточены ОР50 E. coli – «супер-пупер» (E. coli ОР50 заметили на 25 X концентрации (т.е., 1 Л из ночи ОР50 культуры, выращенные в LB дает 40 мл 25 X OP50 супер-пупер); 2 мл этой концентрации бактериальных подвеска запятнаны на каждой пластинке NGM 10 см).
  17. Подготовить пластины для экспериментов, выполните одно из следующих действий (для установки использовать 3.17.1 «Основной протокол», для «RNAi экран, расположенный на» использование шаги 3.17.2 - 3.17.4 в соответствующих случаях):
    1. Пипетка ~ 5000 червей/10 см пластины семенами с супер-пупер RNAi или ОР50.
    2. Пипетка ~ 500 червей/хорошо в пластине 6-ну семенами с RNAi.
    3. Пипетка ~ 300 червей/хорошо в пластине 24-ну семенами с RNAi.
    4. Пипетка ~ 100 червей/хорошо в плиту 96-луночных семенами с RNAi.
      Примечание: Для инструкций на как был посеян RNAi пожалуйста обратитесь к шагам 2,7-2,9 в подготовке RNAi бактерий.
  18. Если используется плодородные штамм червей, Инкубируйте червей при 25 ° C для ~ 44-48 ч. Использование этих червей как можно быстрее после того, как населения достиг соответствующего возраста. Это минимизирует влияние Яйца инкубационные в пределах червей в assay.
  19. Если используется штамм является температура стерильные (например, fer-15(b26); FEM-1(hc17) или glp-4(bn2)), инкубировать червей на 15 ° C ~ 16 h, а затем передавать на 25 ° C для 44 h завершить разработку и предотвратить эмбриогенеза.

4. жидкость убийство Assay установки (основной протокол)

Примечание: Это протокол для одного бактериальный штамм и один источник червей.

  1. С помощью скребка ячейки, удалить P. aeruginosa из СК пластины и Ресуспензируйте в ~ 5 мл базальной S. Масштабирование при необходимости. Измерение оптической плотности бактериальных подвеска, используя спектрофотометр (600OD)
  2. Подготовка 24 мл разбавленной акций P. aeruginosa в базальной S в ОД ≈600 0,09 (3 X конечная концентрация). Смотрите 4.6.2 для окончательного содержания на хорошо и соответственно масштабировать объем бактериальных разрежения.
  3. Добавьте 21 мл жидких сред медленно убивать (3 g NaCl, 3.5 g Пептон/л, дополненная CaCl2 и4 MgSO до конечной концентрации 1 мм). С помощью многоканальных дозаторов, передачи 45 мкл бактерий и средств массовой информации в каждой скважине 384-ну плиты.
  4. Моют червей от их источника (т.е., шаг 3.17.1) в 50 мл Конические трубки и позволяют червей селиться под гравитационных сил. Аспирационная супернатанта по 5 мл. Ресуспензируйте в общей сложности 50 мл S базальной.
  5. Повторите шаг 4.4 дважды.
  6. С помощью сортировщика червь, сортировать приблизительно 22 червей в каждой скважине 384-ну пластины.
    Примечание: Установка падает каждый червь в мкл ~1.1 жидкости. 22 червей составит 25 мкл, достигло 70 мкл/хорошо общего анализа тома.
    1. Окончательный состав каждой скважины состоит из 70 мкл. 45 мкл этого тома добавляется как Бактериальное средство (0,03 ОД600 бактерий в 24 мкл S базальной и 21 мкл SK дополнена CaCl2 и4MgSO). Другие 25 мкл добавляется с 22 червей.
    2. Если используется сортировщик здесь (см. Таблицу материалы) недоступна, черви могут быть ослаблены в конечной концентрации 1 червь/мкл в базальной S и накапаны 25 мкл/колодец с помощью многоканальных дозаторов. Однако результаты могут демонстрировать повышение изменчивости. Кроме того это можно использовать перистальтические жидкого мыла, как описано в19Леунг и коллеги.
  7. После того, как черви были отсортированы в пластину 384-Ну, печать плита с газовой полупроницаемых и инкубировать пластин при 25 ° C в течение 24-48 ч.
  8. В нужное время используйте микропланшетов мыть 384-ну пластины с базальной S в общей сложности 5 раз.
    1. После второго вымыть, удалить большую часть средств массовой информации, оставив ~ 20 мкл. энергично встряхнуть пластины Гонав Вортекс для по крайней мере 30 секунд чтобы ослабить любой мусор в нижней части скважины).
  9. После того, как окончательный мыть, аспирационная супернатант вплоть до 20 мкл. Добавьте 50 мкл 0,98 мкм нуклеиновых кислот пятна (см. Таблицу материалы) / хорошо 384-ну плита, для окончательного концентрации 0,7 мкм.
  10. Инкубации при комнатной температуре на 12-16 ч. Эта краска будет только пятно мертвых червей. После желаемого инкубационного периода мыть тарелки, удалить излишки с помощью микропланшетов пятно (минимум 3 стирок).
  11. Для сбора данных используйте спектрофотометр или автоматизированных микроскоп для изображения пропускаемого света и флуоресценции (531 Нм возбуждения и 593 выбросов).
    1. Используйте малое увеличение цель разрешить изображение всего хорошо быть захвачен.
    2. Кроме того использование потока vermimetry. Этот метод использует большой объект проточный цитометр как червь fluorimeter, измерение размера и флуоресценции всего организма (т.е., C. elegans) в моде, которая сильно похож на проточной цитометрии.
  12. Использовать программное обеспечение для анализа автоматизированных изображения (например, CellProfiler, студия анализ бесплатный изображений на основе MatLab http://cellprofiler.org/) для расчета области флуоресцентные и общая червь в колодец на беспристрастной основе.
    Примечание: Коэффициент этих чисел представляет смерть дроби для каждой скважины. Если один хорошо были 7 окрашенных червей из 20 всего, то смерть фракция состоит из 0.35 или 35%.
    1. Перед первым использованием автоматизации обработки изображения трубопровода должны быть проверены, ручная биговка. Это делается путем сравнения результатов от автоматизированный конвейер баллы, полученные путем визуального осмотра изображения и записи фракций мертвых червей для каждого из них. Процесс проверки гарантирует, что параметры для автоматической обработки изображений являются точными и представляют данные правильно.

5. Адаптация для отбора нескольких C. elegans штаммов или нокдаунов (RNAi экран Setup)

Примечание: Это RNAi экран, описанной для установки 24-ну пластины.

  1. Добавить 1 мл базальной S на хорошо 24-ну плиты (см. шаг 3.17.3). Осторожно агитировать червей путем встряхивания пластины, а затем передать пустой, стерильные 24 штанхглубинных плиты червей. Разрешить червей урегулировать гравитационно (~ 5 минут).
  2. Супернатант аспирата, оставив примерно 1 мл. Добавление 7 мл базальной S для каждой скважины.
  3. Повторите шаги 5.1-5.2 минимум 2 еще раз. После окончательной стирки аспирационная супернатанта, оставив примерно 400 мкл.
  4. Используя функцию ухудшенной червь сортировщик, сортировать 22 червей от 24-ну пластины червь подвеска в каждой скважине 384-ну плиты (каждый хорошо 24-ну лунках урожайность 8-12 384-ну плиты).
    1. Чтобы избежать голода, Пипетка бактерий в 384-ну пластины (штамм, который служит исключительно в качестве пищи, таких как ОР50, или патогенный штамм) до сортировки.
      Примечание: Патогены могут быть добавлены следующие шаги 2.3-2.5 или 6,4-6,5, и источник пищи бактерии могут быть разведен и добавил, следуя той же схеме, как P. aeruginosa.
  5. После того, как черви были отсортированы в пластину 384-хорошо, добавьте малых молекул или другие материалы, специфичные для эксперимента.

6. Адаптация для E. faecalis

Примечание: Только отличия от P. aeruginosa пробирного описаны.

  1. Подготовьте свежий источник E. faecalis мелирование бактерий из замороженных запасов на тарелку агар BHI (мозг сердца инфузии) и инкубации для 16-24 ч при 37 ° C.
    Примечание: Выполните эксперименты E. faecalis внутри BSL-2 биологической безопасности кабинета для обеспечения стерильности. Используйте соответствующие меры предосторожности, чтобы свести к минимуму вероятность патогенной инфекции или контаминации.
  2. Плиты могут храниться при температуре 4 ° C до одной недели. После этого периода замените свежим пластины.
  3. В ночь перед сортировки червей, прививать 3-5 мл стерильной BHI с одной колонии E. faecalis. Инкубируйте 12-16 ч при 37 ° C с перемешиванием.
  4. Добавьте бактерий к скважинам для P. aeruginosa (3 x бактерий в S базальной, ОД600≈0.09).
    Примечание: Для E. faecalis, это окончательный состав хорошо: E. faecalis (OD600≈0.03), BHI = 10% v/v, с оставшийся объем состоит из S базальной. Помните, что 25 мкл S базальной будет поставляться с червей.
    Примечание: E. faecalis производит густой биопленки, которые поглощают флуоресцентные пятна, вызывая нечеткость изображения. Обширные Стиральная может быть недостаточно, чтобы удалить этот биопленки. В этом случае черви могут передаваться пустой пластину, используя многоканальные пипетки. Для облегчения передачи, анимации 20 могут добавляться к базальной S до конечной концентрации 0,1% (v/v) 20 анимации в базальной S. Это помогает в устранении червей от биопленки.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Важные параметры для анализа производительности

Правильное понимание биологии, лежащие в основе этого анализа необходим для устранения неполадок и оптимизации assay. С этой целью, мы сначала коснуться нескольких ключевых документов, изучение механизмов патогенеза P. aeruginosa-опосредованной, убийство в жидком7,20. Условии, что выполнены шаги, описанные выше (см. Рисунок 1 для схема протокол assay) время зависимых убийство C. elegans будет соблюдаться только в присутствии возбудителя (рисунок 2A). Напротив в отсутствие основных пищевых добавок (например, если Пептон исключены из средств массовой информации, и только базальной S добавляется), практически не убийство будет наблюдаться (Рисунок 2Б). Интересно двухступенчатый инкубации P. aeruginosa (за 24 ч при 37 ° C, затем 24 ч при 25 ° C), которая имеет решающее значение для обычных анализов медленно убийство и первоначально был реализован в жидком убийство21, располагаемый в этот assay ( Рисунок 2 c). Хотя это можно добавить P. aeruginosa прямо от ночи LB культуры, таким образом значительно изменяет летальность кинетики и не рекомендуется.

Понимание биологии пробирного позволяет также упрощение assay, если целесообразно и желательно. Например наиболее важным водитель хоста, убийство в этот assay siderophore pyoverdine, и токсичность хост, вызванные pyoverdine зависит от его способности связать железа7. Таким образом можно упростить assay, заменив pyoverdine богатые фильтрата, очищенный pyoverdine или даже некоторые синтетического хелатными железа химических веществ (например, 1,10-фенантролиновый) для живых бактерий, как транскрипционный анализ реакции C. elegans эти методы лечения является очень похожи (рис. 3)22.

Несколько различных видов доказательств говорить надежность экспериментальной установки. Во-первых программа установки переносит широкий спектр начальной концентрации бактериальных. Концентрации, как низко как OD600 = 0,0025 (приблизительно 10 раз ниже, чем рекомендуется) по-прежнему выставку и концентрации зависящие от времени убийства, хотя сроки перехода (рис. 4A). Во-вторых, воспроизводимость assay такова, что как мало как 4 скважины является часто достаточно получить статистически значимые данные (рис. 4B).

Есть несколько изменений, которые не рекомендуется. Например используя первоначальный бактерии инокуляты с концентрациями намного выше, чем те, которые перечислены в протоколе; делать так приводит в густой, биопленки как материал, который трудно или невозможно эффективно смыть, которая осложняет скоринга летальность. Кроме того высокие концентрации бактериальных инокуляты также может конкурировать для кислорода и вызвать неспецифические хост убийства7.

Еще одно важное замечание — ограничить период времени между остановка анализа и визуализации мертвых червей. Обратите внимание, что этот срок должен включать окрашивание, поэтому очень важно, чтобы быть эффективным. После смерти биологический материал в пределах червей начинает выдавливать или потребляться бактерий. В течение 24-32 h остается только кутикулы. Кутикула пятна очень плохо и очень легкий, что делает его легко потерять во время мойки. Важно отметить, что штаммы или деформации/RNAi условий с очень разные кинетики убийства может быть осложнено это явление (т.е., которую некоторые черви все еще могут быть живы, в то время как другие уже потеряли их содержание и не поддаются изображение). Рисунок 4A показывает это явление, как черви на левой стороне пластины, привиты с очень низкой концентрации первоначальный бактериальных, живы до сих пор во многом во время червей на правой стороне пластины, которые были подвержены гораздо более высокие концентрации бактерии, были смыты.

Очень важным фактором, определяющим успех пробирного является метод, используемый для сбора и анализа данных. В нашей лаборатории, мы использовали по крайней мере три метода для сбора данных от этих анализов: спектрофотометрии, автоматизированных микроскопии и vermimetry потока (т.е. адаптация технологий цитометрии потока в C. elegans; буквально, измерение червей в пропуская раствор). Первый из этих методов используется spectophotometer для чтения флуоресцентной краски или репортер червей в вопросе. Этот метод имеет преимущество использования довольно повсеместно кусок оборудования (стандартная спектрофотометр с Считыватель микропланшетов) и быстрый метод для получения данных. Однако ей не хватает Информационное содержимое, доступное из автоматизированных микроскопии и статистической мощности потока vermimetry.

Автоматизированный микроскопии является еще одним жизнеспособным вариантом. Ряд Гонав тепловизионных систем в настоящее время на рынке, начиная в ценах, которые являются доступными для одного следователя (например, био-тек Cytation5) для более крупных, более дорогой и более высокого качества машины, которые чаще встречаются в ядре Услуги (например, микроскопом ImageXpress молекулярных устройств). На практике большинство из этих решений подходит для большинства экранов и анализов. Наиболее автоматизированной обработки изображений платформы также может быть связан к течению программного обеспечения для обработки (например, Метаморф, ImageJ, Gene5 или ячейки профилировщик) для дальнейшего выхода информации изображений. Рисунок 5 и Рисунок 6показаны примеры полезности обработки. Когда соотношение сигнал шум является высокой (как показано на рис. 5), анализ прост и дискриминацию между положительных и отрицательных условий тривиальна. В этих случаях можно легко определить даже слабые хитов. Многие анализов, однако, имеют слабые соотношение сигнал шум. Например лечение глистов PINK-1::GFP22 (с учредительного mCherry выражение в их фарингит) с 1,10-phenathroline увеличивает уровень PINK-1::GFP. Для анализа данных индуцибельной репортер GFP нормируется учредительного mCherry сигнал (рис. 6). В этом случае репортер слабее выражения и/или не активирован в большинстве червей. Таким образом реализация дополнительной обработки изображений инструменты, как Profiler клетки, которые могут уменьшить фон и усилить сигнал может быть выгодным.

Наконец если COPAS FlowPilot доступен, он может использоваться для получения данных через поток vermimetry. Гораздо как более знакомое понятие проточной цитометрии, этот инструмент может использоваться для измерения флуоресценции C. elegans в по крайней мере два или три канала одновременно. Этот метод очень подходит для приобретения данных с высокой статистической значимости, но пропускная способность очень сильно уменьшается по сравнению с автоматизированной микроскопии. Наиболее важным преимуществом потока vermimetry находится в способность анализировать весь червь населения как единая группа репликации, а не разделить их на несколько скважин и анализа в среднем скважин. Анализ больших групп в этой моде кардинально улучшает статистической мощности и позволяет обнаружить даже небольшие эффекты.

Модификации Пробирной жидкости убийство

Недавние события assay расширил свою полезность, включая опробование активации флуоресцентные журналистов (рис. 6), с использованием методов РНК-интерференции средне высок объём (рис. 3) и даже замена оригинального патогена.

Наиболее очевидная причина для использования РНК-интерференции создана состоит в проверке на пути узла обороны против P. aeruginosa (или других патогенов). На рисунке 3приведены примеры RNAi нокдаун генов для выживания в assay. В соответствии с ранее замечания20,23,24,25, daf-2(RNAi) расширение C. elegans выживания во время воздействия P. aeruginosa, а (daf-16 RNAi), zip-2(RNAi) и cebp-1(RNAi) сократить его. Как уже отмечалось, RNAi наиболее просто входит в assay Выращивание червей на multiwell плит, где каждый хорошо содержит другой клон RNAi. Благодаря высокой вязкости агар и малых объемов связанных трудно добиться единообразного, пузырей заполнения 96-луночных плит без специального оборудования. Кроме того сушки бактериальных штаммов, перевозящих RNAi также может быть проблемой, как внешние скважин сухой быстрее, чем внутренний скважин, приводит к неравномерности и значительный потенциал для агар трещин. Как отмечалось выше, это поощряет червей в нору, сократить количество животных, доступных для скрининга и риски, засорение жидкость-погрузочно-разгрузочное оборудование. Для обоих из этих причин 24-ну пластины проще работать с чем 96-луночных пластины. Хотя это уменьшает пропускную способность пробирного, это повышает надежность и предлагается, особенно для начального экрана.

Наконец assay был изменен assay заменить P. aeruginosa E. faecalis. (В принципе замещения с другими бактериальными видами не должны предоставлять неоправданных трудностей, при том условии, что соответствующие культивирования и условий воздействия определяются.) Наиболее важным фактором для рассмотрения является СМИ требования возбудителя, как для роста и развития, так и для индукции вирулентности. К примеру грамм позитивные, оппортунистических патогенов E. faecalis требует питательн-богатые люди СМИ (как BHI) и инкубации при более высоких температурах по сравнению с P. aeruginosa14,26. С учетом этих факторов, адаптация assay использовать E. faecalis была проста. Как отмечалось на P. aeruginosa, мы видели, зависящих от времени убийства (рис. 7). Интересно, что сроки смерти был похож на ранее опубликованных анализов, использовавшиеся до заражения агар пластины26, несмотря на отсутствие этого шага, который может предложить, что механизмы, участвующие в патогенезе различаются.

Figure 1
Рисунок 1: схема для основе жидких C. elegans P. aeruginosa инфекции пробирного. Шаги с участием нематоды распространения и подготовки находятся на левой стороне, бактериальные подготовка справа. Шаги, как выравнивается по центру. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: Убийство C. elegans , P. aeruginosa специфичен и требует правильного питания бактериальных. Смерти (A) C. elegans присутствии E. coli и P. aeruginosa. (B) C. elegans смерти в присутствии P. aeruginosa с (справа) и без (слева) медленно убивать СМИ, добавил в смесь (т.е. S только базальную). Базальная S является минимальным СМИ и не содержат питательные вещества, необходимые для роста бактерий и исключает производство pyoverdine. (C) C. elegans смерть присутствии по-разному подготовленных P. aeruginosa. p < 0.01, основанный на студента t-теста. Планки погрешностей представляют S.E.M. 10 скважин были использованы за биологических реплицировать в условие. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: C. elegans сопротивление P. aeruginosa зависит от иммунной пути узла. Группа выбранных RNAi нокдаунов лечили P. aeruginosa (A) или 1,10-фенантролиновый (химическая хелатором, что имитирует воздействие P. aeruginosa в жидкости) (B). p < 0.01, #p < 0,05, основанный на студента t-теста. Планки погрешностей представляют S.E.M. 10 скважин были использованы за биологических реплицировать в условие. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: C. elegans убийство P. aeruginosa является надежной и зависит от бактериальных концентратов. (A-B) представитель изображения (A) и количественной оценки (B) C. elegans смерти после воздействия различной концентрации P. aeruginosa за 72 ч. р-значения рассчитывались на основе студента t -тест. Линейки в (A) — 1 мм. 16 скважин были использованы в биологических реплицировать на состояние. BF: Яркие области, FL: флуоресценции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5: приобретение и изображения обработки данных assay с сильным сигналом. (A) представитель изображения живых (отрицательный контроль) и мертвых (положительный контроль) C. elegans. (B) статистический анализ отрицательных и положительных элементов управления на основе метода сбора данных, режим обработки и количество скважин проанализированы. (C) флуоресценции была проанализирована для червей из четырех отдельных скважин 96-луночных плиты (два положительных и две отрицательный контроль скважины). Каждый хорошо содержал ~ 100 червей. Каждая точка на графике представляет одного червя, показывая время прохождения (которая коррелирует с, но, из-за скручивания жизни червей, несовершенно представляет размер) и измеренных флуоресценции для червей, которые будут окрашены с оранжевым Sytox. Положительный контроль червей предварительно были убиты теплового воздействия. Из-за изменения напряженности и форма мертвых червей (как можно увидеть в (A), мертвых червей появляются больше стержня как и имеют несколько изгибов тела) по сравнению с их коллегами-живой, мертвой червей имеют больше TOF. p-значения рассчитывались на основании студенческой t-теста. Линейки в (A). 1 мм пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 6
Рисунок 6: приобретение и изображения обработки данных assay с умеренной сигнала. (A) представитель изображения C. elegans индуцибельной репортер PINK-1::GFP и маркер учредительного mCherry (нормализовать экспрессии генов из нехромосомной массива). C. elegans действию ДМСО (отрицательный контроль) или 1,10-фенантролиновый (положительный контроль). (B) статистический анализ отрицательных и положительных элементов управления на основе метода сбора данных, режим обработки и количество скважин проанализированы. (C) четыре отдельных скважин 96-луночных плиты (два положительных и две отрицательный контроль скважины) были проанализированы с помощью потока vermimetry. p-значения рассчитывались на основании студенческой t-теста. Линейки в (A). 1 мм пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 7
Рисунок 7: C. elegans убийство E. faecalis зависит от времени и надежные. (A-B) представитель изображения (A) и количественной оценки (B) C. elegans смерти после воздействия E. faecalis. p < 0.01, основанный на студента t-теста. 10 скважин были использованы за биологических реплицировать в условие. Планки погрешностей представляют S.E.M. линейки в (A) 1 мм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Этот assay (или аналогичных анализов, где другие патогены подставляются P. aeruginosa или E. faecalis) является полезным для целого ряда целей, в том числе лекарственных препаратов. Это также полезно для решения фундаментальных биологических вопросов, такие факторы вирулентности, выяснение принимающей обороны путей, выявление и определение механизма регулирования участвующих в хост возбудитель взаимодействия.

Хотя надежные Пробирной жидкости убийство P. aeruginosa , есть несколько точек, где пристальное внимание следует уделять свести к минимуму вероятность отказа. Во-первых, как уже отмечалось бактериальной источник пластина для P. aeruginosa прививки должны оставаться свежий, дабы бактерии теряют вирулентности, несмотря на ночь рост фунта. Во-вторых это ключ, чтобы убедиться, что кальция и магния добавляются P. aeruginosa убийство анализов. Без него будет значительно снижена вирулентности. Наконец, стоит отметить, что глисты, воспитанных на HT115 (для РНК-интерференции на основе анализов) умрет значительно позже, чем червей воспитанных на ОР50 (с. Кириенко, личное сообщение). По этой причине, если переход на систему РНК-интерференции на основе исследования важно чтобы эмпирически определить лучший момент для assay.

За убийство анализов с P. aeruginosa или E. faecalis, важно обеспечить достаточное питание для развития червей от этапа L1, пока они не готовы для использования в assay. Голод, даже в краткосрочной перспективе, как известно активировать количество принимающей обороны путей, таких как инсулин DAF-2/DAF-16/IGF сигнализации сети27. Наши данные показывают, что уже слегка DAF-16/FOXO активируется культивировали в жидком20, и дальнейшей активизации сильно нежелательно, так как DAF-16/FOXO способствует широкого спектра патогенных сопротивления23.

Наконец крайне важно использовать полностью стерильным червей в assay, которая опирается на смертность как индикация. Если черви являются плодородные, находясь в жидкости вызывает трудности в кладке яиц. В результате некоторые из эмбрионов люк в родительском элементе, в конечном итоге причиной его смерти. По этой причине мы обычно используем генетических поражения, такие как glp-4(bn2)28, , демонстрирующий полностью капиллярный стерильные фенотип для этих анализов. Следует избегать использования химических веществ, которые не допустить эмбрионального развития, но по-прежнему позволяют яиц, например 5-fluorodeoxyuridine (FUdR), поскольку они также могут мешать бактериального роста и развития.

В целом мы нашли его очень полезно планировать несколько моментов времени для анализа. Хотя assay является надежной и сроки в целом отвечает, стохастические и незаметные изменения могут перенести сроки смерти в assay в течение 2-4 часов. При необходимости устранения неполадок часто бывает полезно рассмотреть сначала простых ответов; т.е., подготовить свежие СМИ, отбросить последние бактериальных культур и повторно испещрять бактериальных штаммов из замороженных запасов, и т.д. , только очень редко эти меры не восстанавливайте assay функциональность.

Благодаря относительной простоте метода можно легко выполнить широкий спектр модификаций. Изменение червей от единой glp-4(bn2) фон для высокой пропускной способности RNAi экранов, такие как те мы описываем здесь, полезно для идентификации узла ответ пути для широкого круга ксенобиотиков и токсичных химических веществ. Например путем добавления одной и той же химической или токсина в каждой скважине RNAi пластин (например, Cry5B токсин, фенантролиновый и т.д.), пути, которые изменяют чувствительности этих токсинов можно легко определить. Эти типы экранов может также использоваться для выявления сетей обороны против любого из Арсенал патогенов, которые заражают C. elegans.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что они имеют без конфликта интересов раскрыть.

Acknowledgments

Это исследование было поддержано путем профилактики рака и исследовательский институт штата Техас (CPRIT) награда RR150044, Грант C исследовательский фонд Уэлч-1930 и национальных институтов из здравоохранения K22 AI110552 присуждена НВК. Спонсоры имел никакой роли в дизайн исследования, сбор данных и анализ, решение опубликовать или подготовка рукописи.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
COPAS FP BioSorter Union Biometrica Large object flow cytometer/worm sorter
Cytation 5 BioTek
EL406 Washer Dispenser BioTek
Multitron Pro Infors HT
24 Deep-Well RB Block Thermo Fisher Scientific CS15124
384-Well plate Greiner Bio-One MPG-781091
Nematode Growth Media (NGM) Amount per liter: 18 grams agar, 3 grams NaCl, 2.5 grams Peptone, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Phospate buffer, and 973 mL of milli-Q water
Slow Killing (SK) plates Amount per liter: 18 grams agar, 3 grams NaCl, 3.5 grams Peptone, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Phospate buffer, and 973 mL of milli-Q water
Slow Killing (SK) media Amount per liter:  3 grams NaCl, 3.5 grams Peptone, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Phosphate buffer, and 973 mL of milli-Q water
Lysogeny Broth (LB) USBiological Life Sciences L1520
Brian Heart Infusion broth (BHI) Research Products International Corp 50-488-526
Worm Bleach Solution Amount per 100 mL: 10 mL of 5 M NaOH solution, 20 mL of 5% Sodium Hypochlorite Solution, and 70 mL of sterile water
S Basal Amount per liter: 5.85 grams NaCl, 6 grams KH2PO4, 1 gram K2HPO4, and 1 Liter of milli-Q water
Agar USBiological Life Sciences A0930
NaCl USBiological Life Sciences S5000
Peptone USBiological Life Sciences P3300
CaCl2 USBiological Life Sciences
MgSO4 Fisher Scientific M63-500
Phospate buffer amount per liter: 132 mL of K2HPO4 (1M) and 868 mL of KH2PO4 (1M)
KH2PO4 Acros Organics 7778-77-0
K2HPO4 USBiological Life Sciences P5100
5% Sodium Hypochlorite Solution BICCA 7495.5-32
NaOH solution Fisher Scientific SS255-1
Breathe-easy Diversified Biotech BEM-1
SYTOX Orange Nucleic Acid Stain Fisher Scientific S11368
Bacterial Strains
P. aeruginosa (PA14)
E. faecalis(OG1RF)
E. coli superfood (OP50)
E. coli RNAi expressing bacteria (HT115)
Worm Strains
glp-4(bn2) (Beanan and Strome, 1992, PMID: 1289064)
PINK-1::GFP reporter (Kang et al., 2018, PMID: 29532717)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Falagas, M. E., et al. Pandrug-resistant Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii infections: Characteristics and outcome in a series of 28 patients. International Journal of Antimicrobial Agents. 32, (5), 450-454 (2008).
  2. Hsueh, P. R., et al. Pandrug-resistant Acinetobacter baumannii causing nosocomial infections in a university hospital, Taiwan. Emerging Infectious Diseases. 8, (8), 827-832 (2002).
  3. Wang, C. Y., et al. Pandrug-resistant Pseudomonas aeruginosa among hospitalised patients: clinical features, risk-factors and outcomes. Clinical Microbiology and Infection. 12, (1), 63-68 (2006).
  4. Yao, Y., et al. Draft genome sequences of pandrug-resistant Serratia marcescens clinical isolates harboring blaNDM-1. Genome Announcements. 5, (3), (2017).
  5. Utari, P. D., Quax, W. J. Caenorhabditis elegans reveals novel Pseudomonas aeruginosa virulence mechanism. Trends in Microbiology. 21, (7), 315-316 (2013).
  6. Conery, A. L., Larkins-Ford, J., Ausubel, F. M., Kirienko, N. V. High-throughput screening for novel anti-infectives using a C. elegans pathogenesis model. Current Protocols in Chemical Biology. 6, (1), 25-37 (2014).
  7. Kirienko, N. V., et al. Pseudomonas aeruginosa disrupts Caenorhabditis elegans iron homeostasis, causing a hypoxic response and death. Cell Host & Microbe. 13, (4), 406-416 (2013).
  8. Kirienko, D. R., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. A high-content, phenotypic screen identifies fluorouridine as an inhibitor of pyoverdine biosynthesis and pseudomonas aeruginosa virulence. mSphere. 1, (4), (2016).
  9. Manning, A. J., et al. A high content microscopy assay to determine drug activity against intracellular Mycobacterium tuberculosis. Methods. 127, 3-11 (2017).
  10. Marwaha, S., et al. N-acylated derivatives of sulfamethoxazole and sulfafurazole inhibit intracellular growth of Chlamydia trachomatis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58, (5), 2968-2971 (2014).
  11. Kota, K. P., et al. Integrating high-content imaging and chemical genetics to probe host cellular pathways critical for Yersinia pestis infection. PLoS One. 8, (1), e55167 (2013).
  12. Arif, M., et al. Quantification of cell infection caused by Listeria monocytogenes invasion. Journal of Biotechnology. 154, (1), 76-83 (2011).
  13. Jayamani, E., et al. Characterization of a Francisella tularensis-Caenorhabditis elegans pathosystem for the evaluation of therapeutic compounds. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61, (9), (2017).
  14. Moy, T. I., et al. High-throughput screen for novel antimicrobials using a whole animal infection model. ACS Chemical Biology. 4, (7), 527-533 (2009).
  15. Rajamuthiah, R., et al. Whole animal automated platform for drug discovery against multi-drug resistant Staphylococcus aureus. PLoS One. 9, (2), e89189 (2014).
  16. Breger, J., et al. Antifungal chemical compounds identified using a C. elegans pathogenicity assay. PLoS Pathogens. 3, (2), e18 (2007).
  17. Garvis, S., et al. Caenorhabditis elegans semi-automated liquid screen reveals a specialized role for the chemotaxis gene cheB2 in Pseudomonas aeruginosa virulence. PLoS Pathogens. 5, (8), e1000540 (2009).
  18. Zhou, Y. M., et al. An efficient and novel screening model for assessing the bioactivity of extracts against multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa using Caenorhabditis elegans. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 75, (9), 1746-1751 (2011).
  19. Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains. Journal of Visual Experiments. (51), (2011).
  20. Kirienko, N. V., Ausubel, F. M., Ruvkun, G. Mitophagy confers resistance to siderophore-mediated killing by Pseudomonas aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, (6), 1821-1826 (2015).
  21. Kirienko, N. V., Cezairliyan, B. O., Ausubel, F. M., Powell, J. R. Pseudomonas aeruginosa PA14 pathogenesis in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 1149, 653-669 (2014).
  22. Kang, D., Kirienko, D. R., Webster, P., Fisher, A. L., Kirienko, N. V. Pyoverdine, a siderophore from Pseudomonas aeruginosa, translocates into C. elegans, removes iron, and activates a distinct host response. Virulence. 1-41 (2018).
  23. Garsin, D. A., et al. Long-lived C. elegans daf-2 mutants are resistant to bacterial pathogens. Science. 300, (5627), 1921 (2003).
  24. Estes, K. A., Dunbar, T. L., Powell, J. R., Ausubel, F. M., Troemel, E. R. bZIP transcription factor zip-2 mediates an early response to Pseudomonas aeruginosa infection in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, (5), 2153-2158 (2010).
  25. Tjahjono, E., Kirienko, N. V. A conserved mitochondrial surveillance pathway is required for defense against Pseudomonas aeruginosa. PLoS Genetics. 13, (6), e1006876 (2017).
  26. Moy, T. I., et al. Identification of novel antimicrobials using a live-animal infection model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, (27), 10414-10419 (2006).
  27. Henderson, S. T., Bonafe, M., Johnson, T. E. daf-16 protects the nematode Caenorhabditis elegans during food deprivation. The Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 61, (5), 444-460 (2006).
  28. Beanan, M. J., Strome, S. Characterization of a germ-line proliferation mutation in C. elegans. Development. 116, (3), 755-766 (1992).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics