En hög genomströmning, hög-innehåll, vätskebaserade C. elegans Pathosystem

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Här beskriver vi ett protokoll som är en anpassningsbar, hela värd, hög-innehåll screeningverktyg som kan utnyttjas för att studera värd-patogen interaktioner och användas för läkemedelsutveckling.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Anderson, Q. L., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem. J. Vis. Exp. (137), e58068, doi:10.3791/58068 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Antalet nya läkemedel som identifierats av traditionella, in vitro- skärmar har avtagit, minska framgången av detta tillvägagångssätt i sökandet efter nya vapen att bekämpa flera läkemedelsresistens. Detta har lett till slutsatsen att forskare inte bara behovet av att hitta nya läkemedel, men också behöver utveckla nya sätt att hitta dem. Bland de mest lovande kandidaten metoder är hel-organismen, in-vivo -analyser att använda hög genomströmning, fenotypiska utläsningar och värd som spänner från Caenorhabditis elegans till Danio rerio. Dessa värdar har flera starka fördelar, inklusive dramatiska minskningar falska positiva träffar, som föreningar som är giftiga för de mottagande och/eller biounavailable släpps normalt i den första skärmen, före kostsamma följa upp.

Här visar vi hur vår analys har använts för att förhöra värd variation i den väldokumenterade C. elegansPseudomonas aeruginosa flytande döda pathosystem. Vi visar också flera förlängningar av denna väl fungerade ut teknik. Exempelvis kan vi utföra hög genomströmning genetiska skärmar med hjälp av RNAi i 24 - eller 96-bra platta format till fråga värd faktorer i denna värd-patogen interaktion. Med denna analys, kan hela genomet skärmar fyllas i bara några månader, som dramatiskt förenklar uppgiften att identifiera läkemedelsmål, potentiellt utan behov av mödosamma biokemisk rening metoder.

Vi rapporterar också här en variant av vår metod som ersätter grampositiva bakterien Enterococcus faecalis för gramnegativ patogen P. aeruginosa. Mycket som är fallet för P. aeruginosa, är dödandet av E. faecalis tidsberoende. Till skillnad från tidigare C. elegansE. faecalis analyser, vår analys för E. faecalis inte kräver preinfection, förbättra dess säkerhetsprofil och minska risken för kontamination med vätska-hanteringsutrustning. Analysen är mycket robust, visar ~ 95% dödstalen 96 h post infektion.

Introduction

Identifiering och utveckling av effektiva, brett spektrum antibiotika, nu nästan ett sekel sedan, ledde till en vattendelare ögonblick i folkhälsa där det fanns en utbredd tro att smittsam sjukdom skulle vara ett gissel av förflutnan. Inom några korta decennier började denna optimism avta, som patogen efter patogen framkallade resistensmekanismer som begränsade dessa en gång mirakulösa behandlingar. För en tid verkade kapprustningen mellan drug discovery ansträngningar och patogenerna balanserad. Missbruk av antimikrobiella medel har dock nyligen kulminerade i uppkomsten av pan-resistenta stammar av Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumanii, Serratia marcescensoch P. aeruginosa1, 2,3,4.

P. aeruginosa är en opportunistisk, gram negativ, multi-värd patogen som är ett allvarligt hot mot patienter med svåra brännskador, dem som är immunsupprimerade, eller har cystisk fibros. Det är också alltmer identifierad som en orsakande agens i allvarliga nosokomiala infektioner, särskilt på grund av dess pågående förvärv av antimikrobiell resistens. Till att börja med att ta itu med detta hot har vi använt den väldokumenterade C. elegans-P. aeruginosa infektion system5. Vårt labb har leveraged detta system för att utveckla en vätskebaserade, hög kapacitet, hög-innehåll screening plattform för att identifiera nya föreningar som begränsar sjukdomsalstrande förmåga att döda den värd6. Dessa föreningar verkar spännande, tillhör minst tre allmänna kategorier, inklusive antimikrobiella medel7 och virulens hämmare8. Andra high-innehåll drug discovery analyser i C. elegans har rapporterats för Mycobacterium tuberculosum, Chlamydia trachomatis, Yersinia pestis, Listeria monocytogenes, Francisella tularensis, Staphylococcus aureus, Candida albicans, och Enterococcus faecalis, bland annat9,10,11,12,13,14,15,16. Dessa typer av analyser har flera välkända fördelar, till exempel begränsa falska positiva träffar som kan vara giftigt för både värd och patogen, ökad sannolikhet för biotillgänglighet jämfört med en kemisk skärm och förmågan att identifiera träffar utanför helt enkelt begränsa mikrobiell tillväxt, såsom anti-virulents, immun stimulerande molekyler eller föreningar som annars lutar balansen i värd-patogen interaktionen till förmån för den tidigare. De föreningar som upptäcktes i dessa skärmar är dessutom ofta effektiva i däggdjur värdar.

Det är värt att notera att det finns minst två andra analyser17,18 att utföra hög genomströmning skärmar i C. elegans i vätska. Dock var och en av dessa analyser är en ändring som tillåter prototypiska intestinal-colonization analysen, känd som långsam-dödande, ska utföras i flytande öka genomströmningen och låta föreningar elektronikkedjan lättare. Noggrann karakterisering har slutgiltigt visat att bakteriell virulens mekanismer är olika mellan dessa analyser och vår vätskebaserade skärmen7. Eftersom båda typerna av virulens observeras i däggdjur system, är det viktigt att överväga vilka virulens avgörande är mest relevanta för de experimenter's intressen före assay urval.

Här visar vi en optimerad version av de vätskebaserade C. elegans-P. aeruginosa assay. Vi rapporterar också anpassningen av vår vätskebaserade analys metod att rymma grampositiva bakterie patogenen Enterococcus faecalis. Som P. aeruginosaidentifieras E. faecalis alltmer som ett allvarliga nosokomiala hot med en växande rustningen av antimikrobiell resistens vägar1. Även om det finns14en föregående metod för high-throughput screening av E. faecalis , kräver det preinfection med patogener, vilket försvårar förfarandet och ökar risken för kontamination med utrustning som de COPAS FlowSort. Våra protokoll eliminerar behovet av före infektion, förbättra säkerhetsprofilen. Slutligen, Vi rapporterar ett medel genom vilket antingen av dessa analyser kan kombineras med utfodring RNAi, tillåt förbrukaren till söka för värd faktorer som spelar en roll i etableringen av, eller motstånd mot, infektion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Försiktighet: P. aeruginosa och E. faecalis är biosäkerhetsnivå 2 patogener, och korrekta säkerhetsåtgärder vidtas för att förhindra oavsiktlig infektion och för att minimera kontaminering av ytor. Alla media och material som kommer i kontakt med patogener måste vara steriliserade eller kasseras. Ytterligare riktlinjer finns tillgängliga från CDC publikationen biosäkerhet i Microbiological och biomedicinska laboratorier (BMBL), 5: e upplagan.

1. förberedelser och underhåll av P. aeruginosa

  1. Strimma P. aeruginosa från en fryst lager på en LB (Lysogeny buljong) agarplatta. Inkubera 16 till 24 timmar vid 37 ° C
    Obs: Utföra P. aeruginosa experiment inne i BSL-2 biologiska säkerhetsdragskåp att säkerställa steriliteten. Använd lämpliga säkerhetsåtgärder för att minimera risken för patogena infektion eller förorening.
  2. Överföra denna platta till 4 ° C. Denna platta kan lagras vid 4 ° C och används för att Inokulera kulturer för upp till en vecka. Efter en vecka, sanera och kassera plattan och göra en ny LB strimma plåt.
    Obs: P. aeruginosa virulens minskar efter långvarig lagring.
  3. Två dagar före inrättandet av assay plattor, Inokulera 3-5 mL steril LB buljong med en enda koloni av P. aeruginosa från plattan i 1.1. Inkubera vid 37 ° C i 12 till 16 h.
    Obs: Inte Inkubera längre än 16 h. I rika flytande kulturer börjar P. aeruginosa PA14 lysera.
  4. Förbereda sterila 10 cm plattor med långsam döda media (3 g NaCl, 3.5 g pepton, 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 25 mL fosfatbuffert (belopp per liter: 132 mL K2HPO4 (1 M) och 868 mL av KH2PO4 (1 M)) och 18 agar HB).
    Obs: Förbered plattor före tid. De kan lagras i upp till 3 veckor i en lufttät behållare vid 4 ° C.
  5. Utsäde varje 10 cm långsam döda platta (SK plattan) med 350 μL av P. aeruginosa från färska övernattning LB kultur. Med hjälp av en steril bakteriell spridare, bakterier jämnt fördelade över ytan av media och låt torka i biologiska säkerhetsdragskåp med BSL-2.
  6. Inkubera plattorna vid 37 ° C under 24 h.

2. beredning av RNAi bakterier

  1. Strimma ut eller pin-överföring önskad stammar av RNAi-innehållande bakterier på LB agarplattor som innehåller lämpliga antibiotika (carbenicillin på 100 µg/mL) och tetracyklin på 15 µg/mL för Ahringer och Vidal bibliotek från en fryst lager.
    Obs: När du arbetar med nonpathogenic bakterier, Använd antingen en BSL-2 A / B biologiska säkerhetsskåp eller en BSL-1 laminär huva att säkerställa steriliteten hos kulturerna och att minimera risken för korskontaminering av biblioteket.
  2. Inkubera plattorna för 24 timmar vid 37 ° C.
  3. Förvara plattorna vid 4 ° C i upp till två veckor.
    1. Efter två veckor, kassera plattorna och ersätta dem med nygjorda plattor.
  4. Testa flera RNAi stammar parallellt genom att individuellt vaccinera en enda koloni från varje klon i 4 mL carbenicillin-kompletteras LB i en enda väl av en 24-väl djupt-väl tallrik eller i ett sterilt provrör.
    Obs: Tetracyklin har rapporterats att minska effektiviteten av RNAi. Använd den inte i detta media.
  5. Placera 24-väl djupt plattor i en skakande inkubator optimerad för rundbottnade plattor och inkubera vid 37 ° C i 16 h under omskakning vid 950 rpm.
    Obs: Det är svårt att få enhetliga bakterietillväxt i rundbottnade plattorna med en konventionell skakningar inkubator. Skakande inkubatorn behöver kunna skaka på minst 750 rpm för kulturerna att växa ordentligt. I avsaknad av en specialiserad shaker är det möjligt att odla varje kultur i en individuell röret. Kulturer kan överföras till 24-väl plattan för centrifugering efteråt, om så önskas.
  6. Samla in bakterierna genom centrifugering i 5 minuter vid 2000 x g.
  7. Dekantera supernatanten genom invertering plattan och skakning. Återsuspendera RNAi bakterier i 100 µL av S Basal (5,85 g NaCl, 1 g K2HPO4, 6 g KH2PO4 upplöses i 1 L ultrarent vatten och steriliseras genom autoklav).
  8. Pipettera återsuspenderade bakterier i ett lämpligt antal brunnar rundbottnade NGM platta (Nematoden tillväxt medier, 3 g NaCl, 2,5 g pepton, 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 25 mL fosfatbuffert (belopp per liter: 132 mL av K2HPO4 (1 M) och 868 mL av KH2PO4 (1 M)) och 18 g agar per liter vatten) kompletteras med IPTG (1 mM slutlig koncentration) och carbenicillin (100 μg/mL koncentration).
    1. Använd 3,5 mL av NGM media per brunn 6-well plate, 1 mL per brunn 24-well platta eller 150 µL per brunn av plattan med 96 brunnar.
    2. Använda 100 μL/brunn av bakterier för 6-väl plattan; 50 μL/brunn för 24-väl; eller 20 μL/brunn för plattan med 96 brunnar. Låt torka.
      Obs: Torkning utförs normalt i en steril flöde huva att främja snabba, enhetlig torkning. Det är mycket viktigt att enhetliga torkning. Undvik uttorkning, eftersom sprickor i ägarn främja grävande av maskar. Detta leder till mask förluster och potentiella igensättning av vätska-hanteringssystem.
  9. Använda förberedda plåtarna direkt eller förvara dem vid 4 ° C i upp till två veckor för senare användning.
    Obs: För att förhindra plattorna torka ut, de kan tätas med plast paraffin filma eller placeras i en tätt förslutna behållare med fuktiga.

3. underhåll och beredning av C. elegans

Obs: Innan experiment, generera en synkroniserad befolkning på dräktig, vuxen hermafroditiska maskar som följer.

  1. Tvätta dräktig vuxna (dvs. med flera embryon synliga inom gonad) från 4-6 10-cm NGM plattor i en 15 mL koniska rör genom att lägga till 4 mL S Basal plattan, virvlande försiktigt och sedan hälla i en 15 mL koniska rör.
  2. Pellet maskar via centrifugering vid 1 000 x g i 30 sekunder.
  3. Aspirera supernatanten, utan för att störa pelleten mask.
  4. Tillsätt 3,5 mL mask blekmedel lösning (slutlig koncentration 0,5 M NaOH, 1% natriumhypoklorit, i sterilt vatten) till mask pellet och blanda genom att vända i 1 minut.
  5. Kort vortex och centrifugera vid 1 000 x g i 30 sekunder.
  6. Aspirera eller Dekantera supernatanten, utan för att störa pelleten mask.
  7. Tillsätt 3,5 mL färsk mask blekmedel lösning till mask pelleten.
  8. Kraftfullt blanda maskar i blekmedel lösning. Regelbundet (ca var tionde sekund) inspektera visuellt maskar i dissekera Mikroskop. Se för mask nagelband att bryta, släppa ägg. När de flesta av de vuxna maskarna har varit upplöst (~ 95%), späd blekmedel till 15 mL med S basala att stoppa matsmältningen.
    Obs: Äggskal är mer motståndskraftiga mot blekmedel än vuxna vävnader, men de kan lösas upp under långvarig exponering. För att undvika ägg upplösning, Utsätt inte ägg för att mask blekmedel lösning längre än 7 minuter. Om äggskal förstörs överdrivet, kommer att embryon dö.
  9. Pellet embryon vid 1 000 x g i 30 sekunder och aspirera eller Dekantera supernatanten utan att ta bort pelleten av embryon.
  10. Återsuspendera maskar i S basal till en slutlig volym av 15 mL att späda ut återstående blekmedel lösning.
  11. Upprepa steg för tvätt (3,9-3.10) tre gånger för totalt 4 i följd tvättar.
  12. Efter den fjärde tvättningen, sug ut supernatant och lägga till upp till 5 eller 6 mL steril S Basal i 15 mL koniska röret. Målet är att resuspendera embryon till en koncentration av ~ 50 maskar per µL.
    Obs: S Basal beror på storleken på ägg pelleten; Ju större pelleten, den mer S basala är nödvändigt.
  13. Inkubera koniska röret över natten på en bordsskiva rotator i rumstemperatur eller 48 h vid 15 ° C. Larver kläcks, men larval development kommer att arrestera skede L1 (L1 diapause) på grund av näringsämnen frihetsberövande.
  14. Undersöka embryona i dissekera Mikroskop för att kontrollera att de flesta av dem har kläckts och gripits på L1 utvecklingsstadiet.
  15. Bestämma antalet mask genom att ta 20 µL av masken prep och späda ut den med 80 µL av S Basal. Pipettera 10 µL utspädda mask lösning direkt på en tom NGM-tallrik. Upprepa 2 gånger.
    1. Räkna larverna i varje plats och Bestäm medeltalet. Dividera detta genomsnitt med 2 för att få en ungefärlig antal maskar per µL i masken prep. Worm preps kan sedan användas för förökning plattor eller experiment.
      Obs: Efter 4-5 dagar, utsvultna larver kommer att börja dö; Kassera prep på denna punkt.
  16. För att sprida belastningen, pipett ett lämpligt antal L1 maskar (5.000-6.000) på 3-4 10-cm NGM plattor fläckig med koncentrerad OP50 E. coli – ”superfood” (E. coli OP50 fläckig på 25 X koncentration (dvs. 1 L av övernattning OP50 kultur som odlas i LB ger 40 mL 25 X OP50 superfood); 2 mL av denna koncentrerade bakteriesuspensionen är fläckig på varje 10 cm NGM plattan).
  17. För att förbereda plattor för experiment, gör du något av följande (för ”grundläggande protokollet” Använd 3.17.1 inställningar, för ”RNAi skärmen Ställ in” användning steg 3.17.2 - 3.17.4 i förekommande fall):
    1. Pipett ~ 5000 maskar/10 cm platta som ympats med RNAi eller OP50 superfood.
    2. Pipett ~ 500 maskar per brunn i en 6-well platta som ympats med RNAi.
    3. Pipett ~ 300 maskar per brunn i en 24-well platta seedade med RNAi.
    4. Pipettera ~ 100 maskar per brunn i en plattan med 96 brunnar seedade med RNAi.
      Obs: Instruktioner för hur RNAi var seedade se steg 2,7-2,9 i förberedelse av RNAi bakterier.
  18. Om en bördig stam av maskar används, inkubera maskar vid 25 ° C för ~ 44-48 h. användning dessa maskar så snabbt som möjligt efter befolkningen har uppnått lämplig ålder. Detta minimerar effekterna av ägg kläcks inom maskar under analysen.
  19. Om stammen används temperatur-sterila (t.ex., fer-15(b26); fem-1(hc17) eller glp-4(bn2)), inkubera maskar vid 15 ° C för ~ 16 h och sedan överföra till 25 ° C för 44 h att slutföra utvecklingen och förhindra embryogenes.

4. flytande döda Assay Setup (grundläggande protokoll)

Obs: Detta är ett protokoll för en bakteriell stam och en källa av maskar.

  1. Använda en cell-skrapa, ta bort den P. aeruginosa från en SK plattan och återsuspendera i ~ 5 mL S Basal. Skala upp om det behövs. Mät den optiska densiteten av bakteriesuspensionen med en spektrofotometer (OD600)
  2. Förbereda 24 mL utspädd lager av P. aeruginosa i Basal S på OD600 ≈ 0,09 (3 X slutlig koncentration). Se 4.6.2 för slutliga innehåll per brunn och skala volymen av bakteriell utspädning med detta.
  3. Tillsätt 21 mL flytande långsam döda media (3 g NaCl, 3.5 g pepton/l kompletteras med CaCl2 och MgSO4 till en slutlig koncentration på 1 mM). Med hjälp av en flerkanalspipett, över 45 µL av bakterier och media till varje brunn en plattan med 384 brunnar.
  4. Tvätta maskar från deras källa (dvssteg 3.17.1) till en 50 mL konisk tub och låt maskar sedimentera under gravitationskraften. Sug ut supernatant till 5 mL. Återsuspendera i sammanlagt 50 mL S basala.
  5. Upprepa steg 4,4 två gånger.
  6. Använda en mask-sorterare, sortera cirka 22 maskar i varje brunn av plattan med 384 brunnar.
    Obs: Inställningen sjunker varje mask i ~1.1 µL vätska. 22 maskar kommer att uppgå till 25 µL, föra analysmetod total volym 70 µL per brunn.
    1. Den slutliga sammansättningen av varje brunn består av 70 µL. 45 µL av denna volym läggs som bakteriell medium (0,03 OD600 bakterier i 24 µL S Basal och 21 µL SK kompletteras med CaCl2 och MgSO4). Den andra 25 µL läggs med 22 maskar.
    2. Om Sorteraren använt här (se Tabell för material) är inte tillgänglig, maskar kan spädas till en slutlig koncentration på 1 mask/µL i S Basal och för 25 µL per brunn med hjälp av en flerkanalspipett. Resultaten kan dock uppvisa ökad variabilitet. Alternativt är det möjligt att använda en peristaltiska flytande dispenser, som beskrivs av Leung och kollegor19.
  7. Efter maskar har sorterats in i plattan med 384 brunnar, försegla plattan med en gas-permeable film och inkubera plattorna vid 25 ° C under 24-48 h.
  8. Vid önskad tid, använda en mikroplattan bricka för att tvätta 384-väl plattan med S Basal totalt 5 gånger.
    1. Efter den andra tvätten, aspirera de flesta medier, lämnar ~ 20 µL. kraftigt skaka plattor med en mikroplattan vortexer i minst 30 sekunder för att lossa eventuellt skräp från botten av brunnarna).
  9. Efter den sista tvättningen, Aspirera supernatanten ner till 20 µL. Tillsätt 50 µL 0.98 µM-nukleinsyra fläcken (se Tabell för material) / väl av 384-väl plattan, för en slutlig koncentration på 0,7 µM.
  10. Odla i rumstemperatur för 12-16 h. Denna färg kommer endast fläcken döda maskar. Efter önskad inkubationstiden stain wash plattor med mikroplattan brickan för att ta bort eventuellt överskott (minst 3 tvättar).
  11. För datainsamling, använda en spektrofotometer eller en automatiserad Mikroskop till bild både genomlysning och fluorescens (531 nm excitation och 593 utsläpp).
    1. Använd en låg förstoring målsättning för att ge en bild av hela brunnen för att fångas.
    2. Alternativt använda flöde vermimetry. Denna teknik använder en flödescytometer för stora objekt som en mask fluorimeter, mäta storlek och fluorescens av hela organismen (dvs. C. elegans) på ett sätt som starkt liknar flödescytometri.
  12. Använd automatiserade bild analys programvara (t.ex. CellProfiler, en fri bild analys studio bygger på MatLab http://cellprofiler.org/) att beräkna de fluorescerande och totala mask områdena per brunn på ett opartiskt sätt.
    Notera: Kvoten av dessa siffror representerar bråkdel döden för varje brunn. Om en väl hade målat 7 maskar ut av 20 totalt, och sedan dödens fraktion består av 0,35 eller 35%.
    1. Före första användning, måste automatiserad bildbehandling rörledningen valideras genom manuell poängsättning. Detta görs genom att jämföra resultat från automatiserade rörledningen till poäng erhålls genom att visuellt inspektera bilder och inspelning fraktioner av döda maskar för var och en av dem. Verifieringsprocessen säkerställer att parametrarna för den automatiska imaging behandlingen är korrekta och representera data korrekt.

5. anpassning för Screening flera C. elegans stammar eller Knockdowns (RNAi skärmen Setup)

Obs: Detta är en RNAi-skärm som beskrivs för inställning av plattan 24 brunnar.

  1. Tillsätt 1 mL S Basal per brunn 24-well platta (se steg 3.17.3). Försiktigt agitera maskar genom att skaka plattan och sedan överföra maskar till en tom, steril-plattan för 24 djupa brunnar. Tillåta maskar sedimentera gravitationellt (~ 5 minuter).
  2. Sug ut supernatant, lämnar ungefär 1 mL. Tillsätt 7 mL S Basal till varje brunn.
  3. Upprepa steg 5,1-5,2 minst 2 fler gånger. Efter sista tvätt, Aspirera supernatanten, lämnar ca 400 µL.
  4. Använda funktionen Samplerkvalitet av masken Sorteraren, sortera 22 maskar från 24-well plate mask suspensionen i varje brunn av en plattan med 384 brunnar (varje brunn av en 24-well plate avkastning 8-12 brunnar i en plattan med 384 brunnar).
    1. För att undvika svält, Pipettera bakterier till 384 brunnar (en stam som fungerar enbart som livsmedel, såsom OP50, eller en patogen stam) före sortering.
      Obs: Patogener kan läggas genom följande steg 2,3-2,5 eller 6,4-6.5 och näringskälla bakterier kan spädas och lagt till genom att följa samma ordning som för P. aeruginosa.
  5. När maskar har sorterats in i plattan med 384 brunnar, lägga till små molekyler eller andra experiment-specifika material.

6. anpassning för E. faecalis

Obs: Endast skillnaderna från P. aeruginosa analysen beskrivs.

  1. Förbereda en frisk källa av E. faecalis genom strimmor bakterier från en fryst lager på BHI (hjärnan hjärtat Infusion) agar plåt och inkubation för 16 till 24 timmar vid 37 ° C.
    Obs: Utföra E. faecalis experiment inne i BSL-2 biologiska säkerhetsdragskåp att säkerställa steriliteten. Använd lämpliga säkerhetsåtgärder för att minimera risken för patogena infektion eller förorening.
  2. Plattorna kan lagras vid 4 ° C i upp till en vecka. Efter denna period, Ersätt med en färsk platta.
  3. Natten före sortering maskar, Inokulera 3-5 mL steril BHI med en enda koloni av E. faecalis. Inkubera vid 37 ° C med agitation h på 12-16.
  4. Lägga till bakterier i brunnarna när det gäller P. aeruginosa (3 x bakterier i Basal S, OD600≈0.09).
    Obs: För E. faecalis, slutliga väl sammansättning är: E. faecalis (OD600≈0.03), BHI = 10% v/v, med den återstående volymen består av S basala. Kom ihåg att 25 µL av S basala kommer att levereras med maskar.
    Obs: E. faecalis producerar tjocka biofilmer som absorberar fluorescerande fläcken, orsakar suddiga bilder. Omfattande tvätt kan vara otillräckliga för att ta bort denna biofilm. I det här fallet kan maskar överföras till en tom platta med hjälp av en flerkanalspipett. För att underlätta överföring, kan Tween 20 läggas till S Basal till en slutlig koncentration på 0,1% (v/v) Tween-20 i S Basal. Detta hjälpmedel att ta bort maskar från biofilmen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Viktiga parametrar för analysens prestanda

En riktig förståelse av biologin bakom denna analys krävs för felsökning och optimering av analysen. Därför hänvisar vi först till flera viktiga papper klarlägga mekanismerna i patogenesen av P. aeruginosa-medierad döda i flytande7,20. Förutsatt att de steg som beskrivs ovan följs (se figur 1 för en schematisk av protokollet assay) kommer en tidsberoende dödandet av C. elegans att observeras endast i närvaro av patogenen (figur 2A). Däremot i avsaknad av viktiga kosttillskott (t.ex. om pepton är kvar av media och bara S Basal läggs), kommer lite att inga döda observeras (figur 2B). Intressant, är two-step inkubering av P. aeruginosa (för 24 timmar vid 37 ° C, sedan 24 h vid 25 ° C) som är kritiska för konventionella långsam-dödande analyser, och var ursprungligen genomförts i flytande döda21, onödigt i denna analys ( Figur 2 c). Även om det är möjligt att lägga till P. aeruginosa direkt från övernattning LB kultur, därigenom avsevärt ändrar dödlighet kinetik och rekommenderas inte.

Förstå assay biologi tillåter även förenkling av analysen, om lämpligt och önskvärt. Till exempel den viktigaste drivkraften för värd döda i denna analys är den siderophore pyoverdine och värd toxicitet orsakad av pyoverdine villkoras av att dess förmåga att binda järn7. Som sådan, kan analysen förenklas genom att ersätta pyoverdine-rika filtratet, renat pyoverdine eller även vissa syntetiska järn-kelat kemikalier (t.ex. 1,10-phenanthroline) för levande bakterier, som transkriptionell svar av C. elegans till dessa behandlingar är mycket lik (figur 3)22.

Flera olika linjer av bevis talar att robustheten i den experimentella setup. Första tål installationen ett brett utbud av ursprungliga bakterie koncentrationer. Koncentrationer så låga som OD600 = 0,0025 (cirka 10 gånger lägre än rekommenderat) fortfarande utställning tid - och koncentrationsberoende dödande, även om tidpunkten Skift (figur 4A). Det andra reproducerbarheten för analysen är sådan att så få som 4 brunnar är ofta tillräckligt för att få statistiskt signifikanta data (figur 4B).

I området i närheten finns det flera ändringar som vi inte rekommenderar. Till exempel använder inledande bakterier inokulat med koncentrationer mycket högre än de som anges i protokollet. gör resultatet så tjock, biofilm-liknande material som är svårt eller omöjligt att effektivt tvätta bort, vilket komplicerar scoring dödlighet. Dessutom kan högkoncentrerad bakteriella inokulat också tävla för syre och utlösa icke-specifik värd dödande7.

En annan viktig anmärkning är att begränsa tidsperioden mellan stoppa analysen och imaging döda maskar. Observera att denna tidsram måste inkludera färgning, så det är viktigt att vara effektiv. Efter död börjar det biologiska materialet inom maskar att extrudera och/eller konsumeras av bakterier. Inom loppet av 24-32 h kvarstår endast nagelbanden. Nagelbanden fläckar mycket dåligt och är mycket ljus, vilket gör det lätt att förlora under tvättar. Det är viktigt att notera att stammar eller stam/RNAi förhållanden med mycket olika kinetik för avlivning kan kompliceras av detta fenomen (dvs. vissa maskar kan fortfarande vara vid liv medan andra har redan förlorat sitt innehåll och är omöjliga att bild). Figur 4A visar detta fenomen, som maskar på vänster sida av plattan, inokuleras med mycket låga initiala bakterie koncentrationer, är fortfarande i hög grad levande medan maskar på höger sida av plattan, som exponerades för mycket högre koncentrationer av bakterier, har tvättats bort.

En mycket viktig faktor för assay framgång är den metod som används för att samla in och analysera data. I vårt labb har vi använt minst tre metoder för att samla in data från dessa analyser: spektrofotometri, automatiserad mikroskopi och flöde vermimetry (dvs. anpassning av flöde flödescytometri tekniker till C. elegans, bokstavligen, mätning av maskar i en flödande lösning). Först av dessa metoder använder en spectophotometer för att läsa fluorescensen av färgämnet eller reporter av maskar i fråga. Denna metod har fördelen med att använda en ganska allmänt förekommande typ av utrustning (en standard spektrofotometer med en microplate reader) och är den snabbaste metoden att förvärva data. Det saknar dock det informativa innehållet som är tillgängligt från automatiserad mikroskopi och flöde vermimetry statistiska makt.

Automatiserad mikroskopi är ett annat alternativ. Ett antal mikroplattan bildgivande system är för närvarande på marknaden, allt i priser som är överkomliga för en enskild utredare (t.ex. en Bio-Tek Cytation5) till större, dyrare och högre kvalitet maskiner som är mer vanligt förekommande i kärna Faciliteter (t.ex. molekylär enheter ImageXpress Mikroskop). I praktiken är de flesta av dessa lösningar mottaglig för scoring de flesta skärmar och analyser. Mest automatiserade imaging plattformar kan också kopplas till nedströms programvara för bildbehandling (t.ex. MetaMorph, ImageJ, Gene5 eller Cell Profiler) för att främja utbytet av information. Exempel på nyttan av behandlingen visas i figur 5 och figur 6. När signal-brus-förhållandet är hög (som i figur 5), analysen är enkel och diskriminera mellan positiva och negativa förhållanden är trivialt. I dessa fall kan även svaga träffar lätt identifieras. Många analyser, har dock en svagare signal-brus-förhållande. Till exempel ökar behandling av rosa-1::GFP22 maskar (med konstituerande mCherry uttryck i deras pharynges) med 1,10-phenathroline nivån av rosa-1::GFP. För analys av data, är den inducerbara GFP-reportern normaliserat till konstituerande mCherry signalen (figur 6). I det här fallet reportern har svagare uttryck eller inte är aktiverad i majoriteten av maskar. Genomföra ytterligare bildbehandling verktyg, som Cell Profiler, som kan minska bakgrund och förstärka signalen kan därför fördelaktiga.

Slutligen, om en COPAS FlowPilot är tillgänglig, kan det användas uppkopplingstyp via flöde vermimetry. Mycket som mer bekant begreppet flödescytometri, kan detta instrument användas för att mäta fluorescensen av C. elegans i åtminstone två eller tre kanaler samtidigt. Denna metod är mycket mottagliga för förvärvet av data med hög statistisk signifikans, men genomströmning är mycket minskat jämfört med automatiserad mikroskopi. Mest betydande fördelen med flöde vermimetry är förmågan att analysera hela masken populationer som en enda grupp för testmetod, snarare än att dela upp dem i flera brunnar och analysera genomsnittet av brunnarna. Analysera stora grupper på detta sätt dramatiskt förbättrar den statistiska styrkan och tillåter att upptäcka även små effekter.

Ändringar av flytande dödande analysens

Senaste utvecklingen av analysen har utvidgat dess användbarhet av inklusive testmetoder aktivering av fluorescerande reportrar (figur 6), med medelhög - till hög genomströmning RNAi tekniker (figur 3), och även substitution av originalet patogenen.

Det mest uppenbara skälet att använda RNAi ställa in är att testa för värd försvar vägar mot P. aeruginosa (eller andra patogener). Exempel på RNAi Nedslagning av gener som är relevanta för överlevnad i analysen visas i figur 3. Överensstämmer med tidigare observationer20,23,24,25, daf-2(RNAi) förbättrad C. elegans överlevnad under exponering för P. aeruginosa, medan daf-16) RNAi), zip-2(RNAi) och cebp-1(RNAi) förkortas det. Som nämnts, ingår enklast RNAi i analysen växande maskar på rundbottnade tallrikar där var väl innehåller en olika RNAi-klon. På grund av den höga viskositeten av agar och små volymer inblandade är det svårt att uppnå enhetliga, bubbla-fri påfyllning av 96 brunnar plattor utan specialutrustning. Dessutom kan torkning de bakteriestammar som transporterar RNAi också vara en fråga, som yttre brunnarna torka snabbare än inre brunnar, leder till icke-enhetlig och betydande potential för agar sprickbildning. Som nämnts ovan, uppmuntrar detta maskar att burrow, minskning av antalet djur för screening och risker igensättning vätska-hantering maskiner. För båda dessa skäl är 24 brunnar lättare att arbeta med än 96 brunnar. Även om detta minskar assay genomströmning, förbättrar tillförlitlighet och föreslås, särskilt för inledande skärmar.

Slutligen har analysen ändrats analysen för att ersätta P. aeruginosa med E. faecalis. (I princip substitution med andra bakteriearter bör inte ge onödigt svårigheter, förutsatt att lämpliga odling och exponeringsförhållanden identifieras.) Den viktigaste faktorn att beakta är media kraven av patogener, både för tillväxt och utveckling och för framkallande av virulens. Gram positiva, opportunistisk patogen E. faecalis kräver exempelvis näringsrika media (som BHI) och inkubation vid högre temperaturer jämfört med P. aeruginosa14,26. Genom att dessa faktorer beaktas, anpassning av den analysen att använda E. faecalis var enkelt. Som nämnts för P. aeruginosa, såg vi tidsberoende dödande (figur 7). Intressant, liknade tidpunkten för döden tidigare publicerade analyser som används före infektion på agar plattor26, trots avsaknaden av detta steg, vilket kan tyda på att mekanismerna som är involverade i patogenesen varierar.

Figure 1
Figur 1: system för vätskebaserade C. elegans P. aeruginosa infektion assay. Steg med nematoder förökning och förberedelser på vänster sida, bakteriell beredning är till höger. Steg som innefattar både är centrerade. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Dödandet av C. elegans av P. aeruginosa är specifika och kräver rätt bakteriell kost. (A) C. elegans död i närvaro av E. coli och P. aeruginosa. (B) C. elegans död i närvaro av P. aeruginosa med (höger) och utan (vänster) långsam döda media lagt till att blanda (dvs S basala endast). Basal S är en minimal media och innehåller inte de näringsämnen som krävs för bakterietillväxt och hindrar produktionen av pyoverdine. (C) C. elegans död i närvaro av olikt beredda P. aeruginosa. p < 0,01, baserat på Student's t-test. Felstaplar representera S.E.M. 10 brunnar användes per biologiska replikat per tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: C. elegans motstånd mot P. aeruginosa beror på värd immun vägar. En panel av valda RNAi knockdowns behandlades med antingen P. aeruginosa (A) eller 1,10-phenanthroline (en kemisk kelator som härmar exponering för P. aeruginosa i vätska) (B). p < 0,01, #p < 0,05, baserat på Student's t-test. Felstaplar representera S.E.M. 10 brunnar användes per biologiska replikat per tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: C. elegans dödandet av P. aeruginosa är robust och beror på bakteriell koncentration. (A-B) representativa bilder (A) och (B) kvantifiering av C. elegans död efter exponering för varierande koncentrationer av P. aeruginosa för 72 h. p-värdena beräknades utifrån elevens t -testa. Skalstapeln i (A) är 1 mm. 16 brunnar användes per biologiska replikat per tillstånd. BF: Ljusa fält, FL: fluorescens. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: förvärv och image databehandling av ett test med en stark signal. (A) representativa bilder av levande (negativ kontroll) och döda (positiv kontroll) C. elegans. (B) statistisk analys av negativa och positiva kontroller baserat på data förvärvsmetoden, bearbetningsläge och antal brunnar analyseras. (C) fluorescens analyserades för maskar från fyra enskilda brunnar i en plattan med 96 brunnar (två positiva och två negativa kontrollbrunnar). Varje innehöll väl ~ 100 maskar. Varje punkt i diagrammet representerar en enda mask, visar den time-of-flight (som korrelerar med, men på grund av den ringlande av levande maskar, ofullständigt representerar storlek) och de uppmätta fluorescensen för maskar som färgas med Sytox Orange. Positiv kontroll maskar dödades pre av värmeexponering. På grund av förändringar i spänningen och form av döda maskar (som kan ses i (A), döda maskar visas mer rod-liknande och har några kropp böjar tillämpas) döda maskar jämfört med deras levande motsvarigheter, och har en längre TOF. p-värdena beräknades utifrån Student's t-test. Skalstapeln i (A) är 1 mm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: förvärv och image databehandling av ett test med en måttlig signal. (A) representativa bilder av C. elegans bär en inducerbara rosa-1::GFP reporter och en mCherry konstituerande markör (för att normalisera uttrycket av gener från extrachromosomal array). C. elegans utsätts DMSO (negativ kontroll) eller 1,10-phenanthroline (positiv kontroll). (B) statistisk analys av negativa och positiva kontroller baserat på data förvärvsmetoden, bearbetningsläge och antal brunnar analyseras. (C), fyra enskilda brunnar i en plattan med 96 brunnar (två positiva och två negativa kontrollbrunnar) analyserades med hjälp av flödet vermimetry. p-värdena beräknades utifrån Student's t-test. Skalstapeln i (A) är 1 mm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7: C. elegans dödandet av E. faecalis är robust och tid beroende. (A-B) representativa bilder (A) och (B) kvantifiering av C. elegans död efter exponering för E. faecalis. p < 0,01, baserat på Student's t-test. 10 brunnar användes per biologiska replikat per tillstånd. Felstaplar representera S.E.M. skalstapeln i (A) är 1 mm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denna assay (eller liknande analyser där andra patogener ersätts för P. aeruginosa eller E. faecalis) är användbar för en mängd ändamål, inklusive läkemedelsutveckling. Det är också användbart för att hantera grundläggande biologiska frågor, såsom att fastställa virulensfaktorer, förtydligandet av värd försvar vägar, och att fastställa rättsliga maskineriet inblandad i värd-patogen interaktionen.

Även om P. aeruginosa flytande dödande analysen är robust, finns det flera punkter där noggrann uppmärksamhet bör ägnas minimera risken för misslyckande. Först, som nämnts, måste bakteriell källa plattan för P. aeruginosa vaccinationer förbli frisk, lest bakterierna förlora virulens, trots övernattning tillväxt i LB. Det andra är nyckeln till att se till att kalcium och magnesium läggs till P. aeruginosa döda analyser. Utan den kommer virulens avsevärt att äventyras. Slutligen är det värt att notera att maskar uppfödda på HT115 (för RNAi-baserade analyser) kommer att dö betydligt senare än maskar uppfödda på OP50 (N. Kirienko, personlig kommunikation). För detta resonera, om byter till RNAi-baserade studier, är det viktigt att empiriskt bestämma den bästa tidpunkten för analysen.

För att döda analyser med antingen P. aeruginosa eller E. faecalis, är det viktigt att se till att det finns tillräckligt med mat för utvecklingen av maskar från L1 scenen tills de är redo att användas i analysen. Svält, även på kort sikt, är känd för att aktivera ett antal värd försvar vägar, såsom DAF-2/DAF-16 insulin/IGF signalering nätverk27. Våra data tyder på att DAF-16/FOXO aktiveras redan något genom att vara odlade i flytande20, och ytterligare aktivering är starkt önskvärt, eftersom DAF-16/FOXO främjar ett bredspektrigt patogen motstånd23.

Slutligen är det viktigt att använda helt steril maskar i någon analysmetod som bygger på mortalitet som en avläsning. Om maskar är bördig, orsakar att vara i vätska svårigheter i äggläggning. Som ett resultat, kläcks några av embryon i den överordnade, så småningom orsakar dess död. Därför använder vi i allmänhet en genetisk lesion, såsom glp-4(bn2)28, som visar en helt penetrant sterila fenotyp för dessa analyser. Användningen av kemikalier som hindra embryonal utveckling men ändå tillåta äggläggning, såsom 5-fluorodeoxyuridine (FUdR), bör undvikas eftersom de kan också störa bakteriell tillväxt och utveckling.

I allmänhet har vi funnit det ganska bra att planera flera tidpunkter för analys. Även om analysen är robust och tidpunkten är generellt konsekventa, kan stokastiska och omärklig förändringar skifta tidpunkten för döden i analysen inom 2-4 timmar. När felsökning är nödvändig, är det ofta användbart att först överväga den enklaste av svar; dvs, förbereda färska media, ignorera de senaste bakteriekulturerna och åter strimma bakteriestammar från fryst lager, etc. endast mycket sällan dessa åtgärder inte återställer analysen till funktionalitet.

Tack vare den relativa enkelheten för metoden, kan en mängd olika ändringar enkelt utföras. Byter maskar från en enhetlig glp-4(bn2) bakgrund för hög genomströmning RNAi skärmar, såsom de beskrivs häri, är användbart för identifiering av värd svar vägar för ett brett utbud av xenobiotika och giftiga kemikalier. Exempelvis genom att lägga samma kemiska eller toxin i varje brunn av RNAi plattor (t.ex. Cry5B toxin, phenanthroline, etc.), kan vägar att ändrar känsligheten för dessa toxiner lätt identifieras. Dessa typer av skärmar kan också användas för att identifiera försvar nätverk mot någon av arsenalen av patogener som infekterar C. elegans.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de har inga intressekonflikter avslöja.

Acknowledgments

Denna studie stöddes av cancerprevention och Research Institute of Texas (CPRIT) Award RR150044, Welch stiftelsen forskning Grant C-1930, och av de nationella institut för hälsa K22 AI110552 tilldelas NVK. Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut om att offentliggöra eller beredning av manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
COPAS FP BioSorter Union Biometrica Large object flow cytometer/worm sorter
Cytation 5 BioTek
EL406 Washer Dispenser BioTek
Multitron Pro Infors HT
24 Deep-Well RB Block Thermo Fisher Scientific CS15124
384-Well plate Greiner Bio-One MPG-781091
Nematode Growth Media (NGM) Amount per liter: 18 grams agar, 3 grams NaCl, 2.5 grams Peptone, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Phospate buffer, and 973 mL of milli-Q water
Slow Killing (SK) plates Amount per liter: 18 grams agar, 3 grams NaCl, 3.5 grams Peptone, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Phospate buffer, and 973 mL of milli-Q water
Slow Killing (SK) media Amount per liter:  3 grams NaCl, 3.5 grams Peptone, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Phosphate buffer, and 973 mL of milli-Q water
Lysogeny Broth (LB) USBiological Life Sciences L1520
Brian Heart Infusion broth (BHI) Research Products International Corp 50-488-526
Worm Bleach Solution Amount per 100 mL: 10 mL of 5 M NaOH solution, 20 mL of 5% Sodium Hypochlorite Solution, and 70 mL of sterile water
S Basal Amount per liter: 5.85 grams NaCl, 6 grams KH2PO4, 1 gram K2HPO4, and 1 Liter of milli-Q water
Agar USBiological Life Sciences A0930
NaCl USBiological Life Sciences S5000
Peptone USBiological Life Sciences P3300
CaCl2 USBiological Life Sciences
MgSO4 Fisher Scientific M63-500
Phospate buffer amount per liter: 132 mL of K2HPO4 (1M) and 868 mL of KH2PO4 (1M)
KH2PO4 Acros Organics 7778-77-0
K2HPO4 USBiological Life Sciences P5100
5% Sodium Hypochlorite Solution BICCA 7495.5-32
NaOH solution Fisher Scientific SS255-1
Breathe-easy Diversified Biotech BEM-1
SYTOX Orange Nucleic Acid Stain Fisher Scientific S11368
Bacterial Strains
P. aeruginosa (PA14)
E. faecalis(OG1RF)
E. coli superfood (OP50)
E. coli RNAi expressing bacteria (HT115)
Worm Strains
glp-4(bn2) (Beanan and Strome, 1992, PMID: 1289064)
PINK-1::GFP reporter (Kang et al., 2018, PMID: 29532717)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Falagas, M. E., et al. Pandrug-resistant Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii infections: Characteristics and outcome in a series of 28 patients. International Journal of Antimicrobial Agents. 32, (5), 450-454 (2008).
  2. Hsueh, P. R., et al. Pandrug-resistant Acinetobacter baumannii causing nosocomial infections in a university hospital, Taiwan. Emerging Infectious Diseases. 8, (8), 827-832 (2002).
  3. Wang, C. Y., et al. Pandrug-resistant Pseudomonas aeruginosa among hospitalised patients: clinical features, risk-factors and outcomes. Clinical Microbiology and Infection. 12, (1), 63-68 (2006).
  4. Yao, Y., et al. Draft genome sequences of pandrug-resistant Serratia marcescens clinical isolates harboring blaNDM-1. Genome Announcements. 5, (3), (2017).
  5. Utari, P. D., Quax, W. J. Caenorhabditis elegans reveals novel Pseudomonas aeruginosa virulence mechanism. Trends in Microbiology. 21, (7), 315-316 (2013).
  6. Conery, A. L., Larkins-Ford, J., Ausubel, F. M., Kirienko, N. V. High-throughput screening for novel anti-infectives using a C. elegans pathogenesis model. Current Protocols in Chemical Biology. 6, (1), 25-37 (2014).
  7. Kirienko, N. V., et al. Pseudomonas aeruginosa disrupts Caenorhabditis elegans iron homeostasis, causing a hypoxic response and death. Cell Host & Microbe. 13, (4), 406-416 (2013).
  8. Kirienko, D. R., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. A high-content, phenotypic screen identifies fluorouridine as an inhibitor of pyoverdine biosynthesis and pseudomonas aeruginosa virulence. mSphere. 1, (4), (2016).
  9. Manning, A. J., et al. A high content microscopy assay to determine drug activity against intracellular Mycobacterium tuberculosis. Methods. 127, 3-11 (2017).
  10. Marwaha, S., et al. N-acylated derivatives of sulfamethoxazole and sulfafurazole inhibit intracellular growth of Chlamydia trachomatis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58, (5), 2968-2971 (2014).
  11. Kota, K. P., et al. Integrating high-content imaging and chemical genetics to probe host cellular pathways critical for Yersinia pestis infection. PLoS One. 8, (1), e55167 (2013).
  12. Arif, M., et al. Quantification of cell infection caused by Listeria monocytogenes invasion. Journal of Biotechnology. 154, (1), 76-83 (2011).
  13. Jayamani, E., et al. Characterization of a Francisella tularensis-Caenorhabditis elegans pathosystem for the evaluation of therapeutic compounds. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61, (9), (2017).
  14. Moy, T. I., et al. High-throughput screen for novel antimicrobials using a whole animal infection model. ACS Chemical Biology. 4, (7), 527-533 (2009).
  15. Rajamuthiah, R., et al. Whole animal automated platform for drug discovery against multi-drug resistant Staphylococcus aureus. PLoS One. 9, (2), e89189 (2014).
  16. Breger, J., et al. Antifungal chemical compounds identified using a C. elegans pathogenicity assay. PLoS Pathogens. 3, (2), e18 (2007).
  17. Garvis, S., et al. Caenorhabditis elegans semi-automated liquid screen reveals a specialized role for the chemotaxis gene cheB2 in Pseudomonas aeruginosa virulence. PLoS Pathogens. 5, (8), e1000540 (2009).
  18. Zhou, Y. M., et al. An efficient and novel screening model for assessing the bioactivity of extracts against multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa using Caenorhabditis elegans. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 75, (9), 1746-1751 (2011).
  19. Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains. Journal of Visual Experiments. (51), (2011).
  20. Kirienko, N. V., Ausubel, F. M., Ruvkun, G. Mitophagy confers resistance to siderophore-mediated killing by Pseudomonas aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, (6), 1821-1826 (2015).
  21. Kirienko, N. V., Cezairliyan, B. O., Ausubel, F. M., Powell, J. R. Pseudomonas aeruginosa PA14 pathogenesis in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 1149, 653-669 (2014).
  22. Kang, D., Kirienko, D. R., Webster, P., Fisher, A. L., Kirienko, N. V. Pyoverdine, a siderophore from Pseudomonas aeruginosa, translocates into C. elegans, removes iron, and activates a distinct host response. Virulence. 1-41 (2018).
  23. Garsin, D. A., et al. Long-lived C. elegans daf-2 mutants are resistant to bacterial pathogens. Science. 300, (5627), 1921 (2003).
  24. Estes, K. A., Dunbar, T. L., Powell, J. R., Ausubel, F. M., Troemel, E. R. bZIP transcription factor zip-2 mediates an early response to Pseudomonas aeruginosa infection in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, (5), 2153-2158 (2010).
  25. Tjahjono, E., Kirienko, N. V. A conserved mitochondrial surveillance pathway is required for defense against Pseudomonas aeruginosa. PLoS Genetics. 13, (6), e1006876 (2017).
  26. Moy, T. I., et al. Identification of novel antimicrobials using a live-animal infection model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, (27), 10414-10419 (2006).
  27. Henderson, S. T., Bonafe, M., Johnson, T. E. daf-16 protects the nematode Caenorhabditis elegans during food deprivation. The Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 61, (5), 444-460 (2006).
  28. Beanan, M. J., Strome, S. Characterization of a germ-line proliferation mutation in C. elegans. Development. 116, (3), 755-766 (1992).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics