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Derivación y diferenciación de células mesenquimales ovárico canino

Developmental Biology

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Summary

Adjunto, describimos un método para el aislamiento, expansión y diferenciación de células madre mesenquimales de tejido ovárico canino.

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Hill, A. B., Hill, J. E., Bressan, F. F., Miglino, M. A., Garcia, J. M. Derivation and Differentiation of Canine Ovarian Mesenchymal Stem Cells. J. Vis. Exp. (142), e58163, doi:10.3791/58163 (2018).

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Abstract

Interés en las células madre mesenquimales (MSCs) ha aumentado en la última década debido a su facilidad de aislamiento, expansión y cultura. Recientemente, estudios han demostrado la capacidad de diferenciación amplia que poseen estas células. El ovario representa a un candidato prometedor para las terapias basadas en células debido a que es rica en MSCs y con frecuencia se descarta después de cirugías de ovariectomía como residuos biológicos. Este artículo describe los procedimientos para el aislamiento, expansión, y la diferenciación de MSCs derivado de ovario canino, sin la necesidad de clasificación celular técnicas. Este protocolo representa una herramienta importante para la medicina regenerativa debido a la amplia aplicabilidad de estas células altamente diferenciables en ensayos clínicos y aplicaciones terapéuticas.

Introduction

El número de estudios publicados que enfoque en células madre ha aumentado sustancialmente en la última década, un esfuerzo de investigación que ha sido impulsado por el colectivo objetivo de descubrir terapias de Medicina Regenerativa de gran alcance. Las células madre tienen dos marcadores definición primarios: auto renovación y diferenciación. Las células madre mesenquimales son responsables de la facturación de tejido regular y tienen una capacidad más limitada de la diferenciación en comparación con las células madre embrionarias1. Recientemente, muchos estudios han demostrado una amplia gama de la diferenciación de MSCs y un tema en discusión es si existen diferencias entre las células madre embrionarias y adultas en todos los2.

El epitelio superficial de ovarium es una sin compromiso capa de células, relativamente menos diferenciada, que expresa ambos marcadores epiteliales y mesenquimales3, conservando la capacidad de diferenciarse en diferentes tipos de células en respuesta a señales ambientales4. La ubicación exacta de las células madre en el ovario no es conocida; sin embargo, se ha propuesto que bipotential progenitores en la túnica albugínea dan lugar a las células germinales5. Estudios inmunológicos han presumido que estas células tienen un origen estromal6 o se encuentra en o próximo a la superficie del ovario7. Puesto que las células madre mesenquimales expresa numerosos receptores que desempeñan un papel importante en la adherencia de la célula8, fue diseñado un experimento para probar la hipótesis de que la selección de una población de células con una rápida adhesión aislaría a una población de células claramente caracterizables como mesenquimales en la naturaleza. Recientemente, nuestro grupo reportó la derivación de MSCs del tejido ovárico basado en su capacidad de adherencia a la superficie de plástico de la placa de cultivo en las primeras 3 h de la cultura, con el fin de obtener una población purificada de células exhibe adherencia rápida9. Aquí, describimos el método desarrollado para el aislamiento de células madre mesenquimales del tejido ovárico.

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Protocol

Este experimento fue realizado con los ovarios de cuatro perras mestizo donados después de la cirugía electiva en un programa de esterilización canina. Este experimento fue aprobado por el Comité de ética en el uso de animales de la UNESP-FCAV (Protocolo nº 026991/13).

1. experimental Preparación

  1. Preparar o comprar 500 mL estéril de Dulbecco tamponada con fosfato solución salina (DPBS) sin calcio ni magnesio.
  2. Preparar una colagenasa stock solución mezclando 40 μg de la enzima en 1 mL de DPBS. Filtrar usando un filtro de jeringa de 0,2 μm y almacenar en alícuotas de 2 mL a-20 ° C.
  3. Preparar los medios de cultivo de glucosa baja de modificado Eagle de Dulbecco medium (DMEM) con 10% de suero fetal y 1% de los antibióticos.
  4. Recoger material estéril: tijeras y pinzas, un frasco de cultivo de tejidos, platos, tubos y pipetas de 10 mL y 5 mL.
  5. Uso de equipo de laboratorio de cultivo celular estándar: un gabinete de seguridad biológica (BSC), una incubadora de cultivo de célula fijada en 5% CO2 y 38 ° C y una centrífuga.
  6. Limpiar el BSC: con las manos enguantadas, la esterilice con el 70% EtOH, usando luces UV.

2. aislamiento de células madre mesenquimales del ovario

  1. Después de la cirugía, tenga los ovarios en PBS sobre hielo en un tubo cónico, hasta su llegada al laboratorio.
  2. Llenar dos platos de Petri de 100 mm con 10 mL de PBS.
  3. Quitar los ovarios del tubo y transferir a la primera placa de Petri con PBS. Lavar con mezcla de movimientos.
  4. Recuperar el ovario y lo coloca en otro plato. Con tijeras y pinzas estériles, moler el tejido en trozos muy pequeños, aproximadamente de 1 mm de tamaño.
  5. Transferir el tejido ovárico para un plato de Petri de 35 mm y añadir 2 mL de colagenasa. Picar un poco más el tejido.
  6. Coloque el plato Petri en la incubadora a 38 ° C por 3 h y sacuda suavemente el plato de Petri con movimientos circulares cada 20 minutos.
  7. Después de 3 horas, retire la placa de Petri de la incubadora.
  8. Transferir el contenido del plato a un tubo de 15 mL. Añadir 5 mL de medio de expansión.
  9. Invierta suavemente el tubo antes de la centrifugación. Centrifugar el tubo a 2100 x g durante 7 minutos quite el sobrenadante y resuspender el precipitado con 3 mL de medio de expansión.
  10. Transfiera el sedimento de una botella de T25. Coloque la botella en la incubadora con 5% CO2 a 38 ° C durante 3 horas.
    Nota: La parte más importante del procedimiento es cambiar los medios de comunicación después de 3 h de incubación.
  11. Quite la botella de la incubadora y retirar los medios de comunicación con el tejido restante. Añadir 3 mL de medio fresco expansión a la botella.
  12. Cambiar el medio cada 48 h y observar la botella para la confluencia celular.
    Nota: Los pasos principales del procedimiento pueden observarse en la figura 1.

3. expansión de células madre mesenquimales del ovario

  1. Paso de la célula
    1. Cuando las células alcanzan confluencia, eliminar los medios de comunicación de la botella.
    2. Lave la botella con 3 mL de PBS. Retirar el PBS.
    3. Añadir 1,5 mL de tripsina y ponga la botella en la incubadora a 38 ° C durante 3 minutos golpee suavemente la botella para ayudar a las células para separar.
      Nota: Las células deben llegar a confluencia aproximadamente 5 - 7 d después de la chapa inicial.
    4. Añadir 3 mL de medio de expansión y transferir el contenido a un tubo cónico.
    5. Centrifugar el tubo a 2100 x g durante 7 minutos quite el sobrenadante y agregar 1 mL de medio de expansión.
    6. Homogeneizar suavemente el contenido del tubo.
    7. Tomar una alícuota de 10 μl de la muestra para realizar el conteo y vuelva a colocar el tubo con las células en la incubadora de la célula.
    8. Lugar 10 μl de la mezcla en el hemocitómetro.
  2. Conteo de las células
    1. Uso objetivo de X 10 del microscopio y centrarse en las líneas de cuadrícula del hemocitómetro.
    2. Contar las células en cinco cuadrados pequeños (figura 2).
    3. Multiplique al número contado por 50.000 para estimar el número de células por mililitro.

4. diferenciación de células madre mesenquimales del ovario

Nota: Se realizaron ensayos de diferenciación según las pautas establecidas en colina et al. 9.

  1. Células por pozo, en triplicado, usando una placa de 4 pozos de cultivo en semillas 1.0 x 104 .
  2. Añadir 1 mL de medio de expansión.
  3. Frote suavemente el plato con movimientos circulares.
  4. Después de 24 h, sustituir los medios de cultivo con los medios de diferenciación deseables.
  5. Para osteogénico, adipogenic y diferenciación condrogénica, incuban las células con el medio de inducción de 30 d, con el reemplazo de los medios de comunicación cada 3 kits de diferenciación específicos d. fueron utilizados para cada uno de estos ensayos.
  6. Para la diferenciación de la estirpe neurogénica, incubar las células por 10 d en los medios de inducción, con el reemplazo de los medios de comunicación cada 3 días. Los medios utilizados aquí contienen DMEM baja glucosa, el ácido valproico 2 mM, 1 hidrocortisona μm, 10 μm forskoline, cloruro de potasio 5 mM, 5 μg/mL insulina e hidroxianisol butilado de 200 μm.
  7. De precursores de endodermo, incubar por 5 d en medios endodermo según instrucciones del fabricante del reactivo.
  8. Para la diferenciación del linaje de células germinales primordiales, incubar las células en los medios de inducción de 14 días, con el reemplazo de los medios de comunicación cada 3 d. Los medios utilizados aquí contienen DMEM, 10% FBS, piruvato de sodio 1 m m, 10 ng/mL LIF, aminoácidos no esenciales 1 mM, 2 mM L-glutamina, 5 insulina μg/mL, 0.1 mM β-mercaptoetanol, putrescina μm 60, 20 transferrina μg/mL, 10 ng/mL ratón factor de crecimiento epidérmico, 1 ng/mL humano factor de crecimiento básico del fibroblasto, 40 ng/mL humanos glial células factor neurotrófico derivado de línea y la penicilina de 15 mg/L.

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Representative Results

Aislamiento de células madre mesenquimales de ovario canino:

El procedimiento de aislamiento de MSC ovárico se resume en la figura 1. Después de la cirugía, tejido picado, digestión de la colagenasa y un cambio de los medios de comunicación 3 h después del inicio de la cultura, una supuesta población de MSC con propiedades de plástico adhesivo rápidos fue exitosamente aislada de tejido ovárico canino. Las células cosechadas rápidamente adhirieron a la superficie de plástico de la placa de cultivo y crecieron en una cultura de monocapa morfológicamente homogénea con morfología típica de MSC-como (figura 3).

Caracterización de ovario MSC In Vitro

El objetivo de la caracterización de MSC es asegurar que las células aisladas cumplen con los criterios estándar de MSC. Estos incluyen adherencia al plástico, una detección positiva de marcadores mesenquimales de la superficie y la ausencia de marcadores hematopoyéticos de la superficie, así como la capacidad de experimentar diferenciación mesodérmica.

Como se muestra en la figura 3, células derivadas del ovario fueron adheridas al plástico y exhiben una morfología de fibroblasto-como, cumplir con el primer criterio que define MSCs. Por otra parte, las células aisladas mostraron la expresión de las transcripciones para los marcadores MSC caninas CD44, CD90 y CD105. Además, MSC célula superficie antígenos específicos CD90 y CD44 fueron detectados por inmunocitoquímica y primeros análisis FACS de paso. La ausencia de los marcadores CD45 y CD34, que son antígenos de superficie de la célula hematopoyética específica, también fue confirmada por las mismas técnicas (figura 4). Esto confirma aún más que el ovario contiene las células que expresan un fenotipo específico de MSC del9. Los anticuerpos que fueron utilizados en este experimento para la caracterización de MSC canina figuran en la Tabla de materiales.

El siguiente paso en la caracterización de MSCs es alcanzar la prueba de su capacidad para diferenciarse en linajes mesodérmicos. Después de 30 días de exposición y de la cultura en los protocolos de diferenciación específicos de linaje, la coloración fue realizada para identificar un compromiso con diversos linajes (figura 5A). Un compromiso con el linaje osteogénico fue confirmado por Von Kossa tinción, que identifica los depósitos de calcio. Tinción de Safranina O proteoglicanos confirmó compromiso condrogénica y aceite rojo O lípidos tinción confirmó adipogenic compromiso. Continuando con la investigación del differentiability de estas células, fueron capaces de someterse a la diferenciación en el linaje del ectodermo, como se muestra por inmunotinción para dos marcadores de células neuroectodermales: β-tubulina y Nestin, después de la exposición de derivados de ovario MSCs en el protocolo de diferenciación de linaje neuronal durante 10 días (figura 5). Transcripciones para SOX17 y CD184, así como morfología de célula específico endodermal linaje, fueron observadas después de la exposición a los protocolos de diferenciación específicos durante 5 días (figura 5B). Finalmente, después de 14 días de exposición de ovario derivado de MSCs a germen célula medios de inducción, 4 de OCT y DDX4 fueron identificados (figura 5). Juntos, estos resultados apoyan una robusta y diversa capacidad de diferenciación de MSCs derivados de tejido ovárico, cuando expuesta diferenciación específica protocolos9.

Figure 1
Figura 1 : Pasos principales del procedimiento de aislamiento. (1) después de la cirugía, transferir los ovarios a tubos estériles con PBS, en el hielo. (2) para limpiar los ovarios, debe ser transferidas a una placa de 100 mm con PBS. (3) picar el tejido en trozos pequeños, aproximadamente de 1 mm de tamaño. (4) a fin de liberar las células de los tejidos, transferir las piezas de tejido a la placas de 35 mm y colagenasa para una digestión de 3 h en la incubadora. (5) transferir el contenido de la placa a un tubo cónico para la centrifugación. (6) placa el sedimento en una botella de T25 e incubar durante 3 h. (7) después de las primeras 3 h de la cultura, cambiar los medios de cultivo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : Hemocitómetro. Los cinco cuadrados pequeños ser contado están marcados en rojo.

Figure 3
Figura 3 : Morfología de la célula. Cuando los medios de comunicación fue cambiado a 3 h después del inicio de la cultura dio lugar a una población homogénea de células mesenquimales, que exhibieron una morfología de fibroblasto-como. Por el contrario, cuando el primer cambio de los medios de comunicación se realiza después de 48 h se observan otros tipos de células además del fibroblasto-como las células. La barra de escala = 1.000 μm. Esta cifra ha sido modificada de Hill et al. 9. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 : Perfil molecular de ovario MSC. (A) aislado células exhiben un perfil clásico de marcador MSC, siendo positivo para los tres marcadores MSC por PCR en tiempo real (CD90, CD105 y CD44). (B) por el análisis de proteínas CD44 era positiva en esas células, y carecían de la expresión de dos marcadores hematopoyéticos (CD34 y CD45). La barra de escala = 70 μm. Esta cifra ha sido modificada de Hill et al. 9. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5 : La diferenciación del ovario MSC. Las células aisladas fueron capaces de diferenciarse en linajes mesodérmicos (A) (condrogénica, osteogénico y adipogenic; la barra de escala = 70 μm). Por otra parte, las células eran capaces de diferenciar a ambos precursores endodérmicos (B) (la barra de escala = 70 μm) y (C) neurogénico (la barra de escala = 50 μm). Curiosamente, las células experimentaron la diferenciación de células germinales primordiales (D), demostrando una amplia capacidad de diferenciación de células madre mesenquimales ováricas. Esta cifra ha sido modificada de Hill et al. 9. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Aquí proporcionamos evidencia que MSCs pueden ser aislados del tejido ovárico canino, que se considera residuos biológicos después de la ovariectomía. Debido a que muchos tipos de células pueden encontrarse en el ovario, propusimos un protocolo para seleccionar MSCs en su rápida adhesión al plástico, que selecciona con éxito células que crecieron en una monocapa con una morfología de fibroblasto-como base.

El primer informe de la derivación de MSCs de médula ósea se basa en la capacidad de adhesión plástica de las MSCs durante las primeras 48 h de cultura11; sin embargo, se ha divulgado que este método tiene el potencial de aislar a una población heterogénea, fenotípicamente y funcionalmente, por lo menos para médula ósea12. El método propuesto de cultura también selecciona las células por la capacidad de adherencia del plástico y aísla las células mesenquimales de un tejido que tiene muchos tipos de células, sin la necesidad de clasificar las células deseables. Debido a que las células madre mesenquimales expresa numerosos receptores que desempeñan un papel importante en la adherencia de la célula8, fue presumido que si se selecciona una población de células con una adhesión rápida, daría lugar a una población más homogénea en el primer paso, con un perfil confiable de la MSC. Los resultados representativos proporcionan evidencia de que un ensayo de adherencia plástico de duración más corto se puede utilizar para aislar a una población morfológicamente homogénea de MSCs en el primer paso, sin necesidad de esperar a pasos más avanzados o clasificación de la célula.

Un paso crítico en este protocolo es cambiar los medios de comunicación 3 h después del inicio de la cultura. Como se muestra en la sección de resultados representativos, las células madre de ovarios caninos cumplen los tres criterios establecidos para la caracterización de MSCs: exhibieron una morfología de fibroblasto-como, eran positivas para la presencia de marcadores MSC y fueron capaces de diferenciar en dichos linajes mesenquimales como linajes osteogénicos, de adipogenic y condrogénica. Células aisladas en este experimento fueron distinguidas también con éxito en precursores endodérmicos, linajes ectodérmicas y linajes de células germinales primordiales. Las células deben llegar a confluencia aproximadamente 5-7 días después de la chapa inicial. Las células de los animales con edad avanzada pueden crecer más lentamente que las de animales jóvenes, y de esos, menos células pueden adherirse al plástico. En estos casos, la concentración de FBS en los medios de comunicación se puede aumentar a 15%.

Por lo tanto, la selección para MSCs basado en las células con capacidad de adherencia más rápido representa un procedimiento de bajo costo, sencilla y eficaz. Desde una perspectiva terapéutica, es más importante destacar que estas células representan una herramienta prometedora para la medicina regenerativa, sobre todo debido a su amplia gama de diferenciación.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores reconocen el programa de esterilización canina en la UNESP-FCAV por proporcionar amablemente los ovarios. Este trabajo fue financiado por becas del FAPESP (proceso nº 2013/14293-0) y capas.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DPBS  Thermo Fisher 14190144
Collagenase I Thermo Fisher 17100017
Tissue flask Corning CLS3056
DMEM low glucose Thermo Fisher 11054020
FBS Thermo Fisher 12484-010
TrypLE express Thermo Fisher 12604021
StemPro Adipogenesis Differentiation Kit Thermo Fisher A1007001
StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit Thermo Fisher A1007101
StemPro Osteogenesis Differentiation Kit Thermo Fisher A1007201
STEMdiff Definitive Endoderm Kit StemCell 5110
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher 15070063
CD45 AbD Serotec MCA 2035S
CD34 AbD Serotec MCA 2411GA
CD90 AbD Serotec MCA 1036G
CD44 AbD Serotec MCA 1041
Nestin Milipore MAB353
β-Tubulin  Milipore MAB1637
DDX4 Invitrogen PA5 -23378
IgG- FITC AbD Serotec STAR80F
IgG- FITC AbD Serotec STAR120F

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References

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