Ansætte trykisoleret varmt vand udvinding (PHWE) til at udforske naturprodukter kemi på bachelor laboratorium

* These authors contributed equally
JoVE Journal
Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Her, anvender vi en trykisoleret varmt vand udvinding (PHWE) metode, der udnytter en umodificeret husstand espressomaskine for at indføre bachelorstuderende til naturprodukter kemi i laboratoriet. Præsenteres to eksperimenter: PHWE af eugenol og acetyleugenol fra nelliker og PHWE af seselin og (+)-epoxysuberosin fra den australske plante Correa reflexa.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Ho, C. C., Deans, B. J., Just, J., Warr, G. G., Wilkinson, S., Smith, J. A., Bissember, A. C. Employing Pressurized Hot Water Extraction (PHWE) to Explore Natural Products Chemistry in the Undergraduate Laboratory. J. Vis. Exp. (141), e58195, doi:10.3791/58195 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

En nyligt udviklede trykisoleret varmt vand udvinding (PHWE) metode, der udnytter en umodificeret husstand espressomaskine for at lette naturlige produkter forskning har også fundet programmer som en effektiv undervisningsredskab. Specifikt, er denne teknik blevet brugt til at introducere andet og tredje år universitetsstuderende til aspekter af naturprodukter kemi i laboratoriet. I denne rapport præsenteres to eksperimenter: PHWE af eugenol og acetyleugenol fra nelliker og PHWE af seselin og (+)-epoxysuberosin fra de endemiske australske plantearter Correa reflexa. Ved at ansætte PHWE i disse eksperimenter, rå fed ekstrakt, beriget med eugenol og acetyleugenol, blev fremstillet i 4-9% w/w fra nelliker ved andet år bachelorstuderende og seselin og (+)-epoxysuberosin blev isoleret i udbyttet af op til 1,1% w/w og 0,9% w/w fra C. reflexa af tredje års studerende. Den tidligere øvelse blev udviklet som en erstatning for den traditionelle damp destillation eksperiment giver en introduktion til ekstraktion og fraseparering teknikker, mens den sidstnævnte aktivitet featured guidede undersøgelse undervisningsmetoder i et forsøg på at simulere naturlige produkter bioprospecting. Dette stammer primært fra hurtige arten af denne PHWE teknik i forhold til traditionelle udvindingsmetoder, der er ofte uforenelige med den tidsbegrænsninger forbundet med bachelor laboratorieforsøg. Denne hurtige og praktiske PHWE metode kan bruges til at effektivt isolere forskellige klasser af organiske molekyler fra en række plantearter. Komplementariteten mellem denne teknik i forhold til mere traditionelle metoder er også blevet påvist tidligere.

Introduction

At isolering og identifikation af naturlige produkter er af grundlæggende betydning for det videnskabelige samfund og samfund mere generelt. 1 Bioprospecting, søge efter værdifulde organiske molekyler findes i naturen, stadig et uundværligt proces i opdagelsen af nyt stof kundeemner og potentielle terapeutiske agenter. Det anslås, at fra 1981-2014, ~ 75% af alle godkendte lille molekyle lægemidler var naturlige produkter, naturlige produkt, der stammer eller naturlige produkt-inspireret. 1 øvrigt naturprodukter besidder enorme strukturelle og kemiske mangfoldighed. Af denne grund repræsenterer de også værdifulde kemiske stilladser, der kan bruges direkte i organisk syntese eller i udviklingen af chiral ligander og katalysatorer. 2 , 3

Traditionelt, har relativt tidskrævende procedurer såsom maceration, Soxhlet udvinding og dampdestillation været grundlaget for forskning fokuseret på isolering af sekundære metabolitter fra planter. 4 mere moderne udvinding teknikker, herunder accelererede opløsningsmiddelekstraktion, har fokuseret på at reducere udvinding gange og oprettelse af grønnere protokoller. 4 , 5 i 2015, en original trykisoleret varmt vand udvinding (PHWE) metode blev rapporteret. 6 denne teknik ansat en umodificeret husstand espressomaskine til at lette hurtig og særdeles effektiv udvinding af shikimic syre fra stjerneanis. Espressomaskiner har været specielt designet og udviklet til at udtrække organiske molekyler fra passende jorden kaffebønner. At opnå dette, disse instrumenter varme vand ved temperaturer op til 96 ° C og ved tryk på typisk 9 bar. 7 med dette i tankerne, det er måske ikke overraskende at espressomaskiner kan udnyttes til at effektivt uddrag naturprodukter fra en vifte af plantemateriale.

Efterfølgende undersøgelser der involverer en lang række jordbaserede plantearter har vist denne PHWE teknik kapacitet til effektivt uddrag naturlige produkter over en relativt bred polaritet vifte. 6 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 endvidere forbindelser, der indeholder lidt følsomme funktionelle grupper, såsom aldehyder, Epoxider, glycosider og potentielt epimerizable stereogenic Centre var typisk upåvirket af udpakningsprocessen. Komplementariteten mellem denne teknik i forhold til mere traditionelle metoder er også blevet påvist. 12 , 16 dette PHWE metode har også været ansat til at isolere flere gram mængder af naturprodukter, som har været brugt til at forberede roman naturprodukt derivater og i komplekse molekyle syntese mere generelt. 8 , 11 , 17

Det blev identificeret denne nye PHWE metode kunne tjene som et nyttigt undervisningsredskab, som kunne indarbejdes i undergraduate laboratoriet. Dette stammer primært fra hurtige arten af denne teknik i forhold til de traditionelle udvindingsmetoder, som ofte er uforeneligt med de tidsmæssige begrænsninger forbundet med bachelor laboratorieforsøg. Derfor, denne teknik fortrængt den traditionelle bachelor kemi laboratorium eksperiment fokuseret på udvinding af eugenol fra nelliker beskæftiger dampdestillation på University of Tasmania. 9 , 18 siden dengang, variationer af dette eksperiment er blevet vedtaget af andre universiteter og en modificeret eksperiment med fokus på PHWE af nelliker nu funktioner i programmet bachelor kemi laboratorium på University of Sydney (vide infra ).

For at demonstrere det praktisk og gennemførligt beskæftiger denne nye PHWE tilgang til undervisningsformål, er to protokoller præsenteret som en del af denne undersøgelse. Den første del af denne betænkning fremhæver et eksperiment på PHWE af eugenol og acetyleugenol fra nelliker, som er en del af andet år bachelor laboratorium programmet på University of Sydney (figur 1). Dette eksperiment tjener til at introducere de studerende til naturprodukter kemi samtidig udvikle grundlæggende praktiske færdigheder. Den anden del er udstyret med et eksperiment på PHWE af de endemiske australske plantearter Correa reflexa som en del af det tredje år bachelor laboratorium program på University of Tasmania (figur 2). Dette eksperiment er designet til at simulere naturlig produkter bioprospecting og styrke core laboratoriemetoder. 11

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bemærk: Det er tilrådeligt, at alle procedurer er udført i et stinkskab. Studerende skal bære passende personlige værnemidler på alle tidspunkter i laboratoriet og de sikkerhedsdatablade (SDS), der er forbundet med hver reagens skal høres før brug.

1. PHWE af nelliker: isolering af eugenol og acetyleugenol

  1. Udvinding af eugenol og acetyleugenol fra nelliker
    1. Placer groft jorden nelliker (12,5 g) i et 250 mL bægerglas.
    2. Tilføje sand (12,5 g) til fed kværner og bland godt.
    3. Indsamle en portafilter (prøve rum) og indlæse kurv med hele fed-sand blandingen. Let komprimere prøven med sikret mod manipulation.
      Bemærk: Komprimere ikke blandingen for meget eller væske vil ikke flyde igennem.
    4. Placer portafilter i espresso-maskine og placere en ren 250 mL baegerglas nedenunder. Tilføje en 30% ethanol/H2O løsning til vandtank for espressomaskine, hvis det er mindre end halvt fuldt.
    5. Bruge espressomaskine til at indsamle 100 mL af ekstraktet.
      Bemærk: Konsultere en instruktør, hvis maskinen ser ud til at være tilstoppet.
    6. Tillad portafilter at afslutte dryppende og derefter fjerne det fra espresso-maskine.
      Forsigtig: Kværner og omgivende metal områder vil være varmt.
    7. Ved hjælp af en spatel, fjerne fed maler fra portafilter og kassér i affald bin.
    8. Skyl ud de resterende legemer fra portafilter med H2O under et tryk i vasken og returnere den til den næste person til at bruge.
    9. Cool fed ekstrakt i isbad, indtil temperaturen har reduceret til mindst 30 ° C.
    10. Placer ekstrakt i en 250 mL skilletragt, tilsættes 30 mL af hexan og Ryst forsigtigt.
    11. Sted skilletragt i en ring klemme monteret til en retorten stå og tillade de vandige og den organiske lag at adskille derefter indsamle den vandige (lavere) lag tilbage i 250 mL bægerglas.
      Bemærk: Det kan tage 10 minutter for lag til at adskille. Studerende rådes til at udføre opløsningsmiddel optimering af TLCs mens du venter på den første adskillelse at forekomme (Se trin 1.2).
    12. Overføre den økologiske (top) lag, (som indeholder produktet) til en ren 250 mL konisk kolbe, og derefter hælde det (vandige) bundlag tilbage i en skilletragt.
    13. Uddrag den vandige lag yderligere to gange med hexan (2 x 30 mL).
    14. Kombinere økologisk (top) lag i den samme kolbe efter hver ekstraktion.
    15. Efter den tredje væske-væske ekstraktion, hæld den kombinerede økologisk ekstrakt i en skilletragt og vaskes med 100 mL H2O ved at ryste voldsomt. Indsamle de organiske (øverste) lag i en ren 250 mL konisk kolbe og tørre ved at tilføje MgSO4 og hvirvlende kolben.
    16. Efterfølgende blandingen filtreres gennem riflet filtrerpapir indeholdt i et glas tragt ind en pre vejede 250mL runde-bunden kolbe.
      Bemærk: Solid rester (hydreret MgSO4) kan kasseres i affaldet.
    17. Fordamper opløsningsmidler (hexan) fra indsamlede filtratet ved hjælp af en roterende fordamper (vand bad temperatur: 60 ° C, vakuum pres: 350 mbar) og igen vejer kolbe indeholdende den resulterende olie.
  2. Optimering af tyndtlagskromatografi (TLC) solvent system
    Bemærk: Som gruppe studerende tildeles et opløsningsmiddel system fra 100:0 acetone: cyklohexan 0:100 acetone: cyklohexan ved instruktør til at identificere de forhold, der giver den maksimale opløsning af eugenol fra acetyleugenol.
    1. Få et TLC reference løsning af ren eugenol og acetyleugenol.
      Bemærk: De nødvendige TLC referenceopløsninger af ren eugenol og acetyleugenol blev udarbejdet af laboranter før lab sessionen.
    2. På en TLC plade, skal du markere en baseline ~1.5 cm fra bunden med en blød blyant. Mærke off tre ensartet fordelte punkter.
    3. Bruge en TLC spotter for at spotte en dråbe af ren eugenol TLC reference løsning i én vognbane, ét sted i ren acetyleugenol TLC reference løsning i tredje vognbane og en plet af hver i den anden vognbane (co stedet).
    4. Check for tilstedeværelse af eugenol og acetyleugenol på TLC-pladen ved at få vist plade under en UV-lampe (254 nm) i TLC visning kabinet.
      Bemærk: Der skal være små (1-2 mm brede) sorte pletter på den plade, hvor TLC referenceopløsninger blev spottet. Hvis der er nogen pletter eller pletter svagt, anvende en anden spot af den passende TLC løsning indtil en sort plet er observeret under UV-lys.
    5. Der tilsættes 10 mL af den tildelte opløsningsmiddel blanding til en ren, tør TLC krukke.
      Bemærk: Sikre opløsningsmiddel højden i krukken ikke overstiger ~ 1 cm.
    6. Bruge pincet, Placer forberedt TLC-pladen i TLC krukken. Luk låget af krukken.
      Bemærk: Opløsningsmidlet skal ligge under grundlinjen af TLC-pladen.
    7. Giver mulighed for at rejse op TLC-pladen. Når opløsningsmidlet er ~ 1 cm fra toppen af pladen, fjerne TLC-pladen fra krukken med pincet og markere linje af væskefronten med en blyant.
    8. Tillad opløsningsmidlet til at fordampe fra TLC-pladen (~ 1 min) og derefter se TLC-pladen under en UV-lampe (254 nm). Ved hjælp af en blyant, cirkel sorte pletter observeret på TLC-pladen.
    9. Beregne fastholdelse faktor (Rf) af eugenol og acetyleugenol ved at dividere den afstand tilbagelagt af sammensat af tilbagelagt af opløsningsmidlet.
    10. Beregn forskellen mellem Rf værdier for eugenol og acetyleugenol (ΔRf).
    11. Dele resultaterne med resten af klassen. Optage fastholdelse værdier erhvervet af andre studerende med andre opløsningsmidler nøgletal.
    12. Identificere, hvilket opløsningsmiddel system vil være bedst til at analysere de rå eugenol løsning og efterfølgende rensning trin.
      Bemærk: Den bedste TLC opløsningsmiddel forhold vil give den største adskillelse mellem eugenol og acetyleugenol angivet ved de største ΔRf -værdi. Hvis ΔRf er plottes opløsningsmiddel sammensætning, skal grafen ligne en klokkekurve.
  3. Adskillelse af eugenol og acetyleugenol ved væske-væske ekstraktion
    1. Tilføje hexan (10 mL) til den rå eugenol-holdige ekstrakt fremstillet af skridt 1.1.17, og hæld den efterfølgende løsning i en 250 mL skilletragt.
    2. Skyl runde-bunden kolben med hexan (10 mL) og Tilføj dette til en skilletragt.
    3. Uddrag hexan løsningen med 3 M vandig NaOH (2 x 25 mL) via væske-væske ekstraktion. Indsamle og kombinere de vandige nederste lag i en 250 mL konisk kolbe fra hver udvinding. Indsamle de organiske lag i en konisk kolbe på 50 mL og tørre ved at tilføje MgSO4 og hvirvlende kolben.
      Forsigtig: NaOH er ætsende. Undgå enhver kontakt med huden.
      Bemærk: Acetyleugenol forbliver i den organiske lag, mens eugenol er nu i den alkaliske vandige ekstrakt (nederste lag).
    4. Bevarer de organiske lag (økologisk løsning A) til senere TLC analyse.
    5. Slyng den koniske kolbe, som indeholder den alkaliske vandige fraktion fra trin 1.3.3 i en is-vandbad og tilsættes langsomt 10 M vandige HCl, indtil en hvid emulsion er dannet; tjekke sin surhedsgrad med Congo rød papir, ved hjælp af en pipette til at overføre en dråbe af løsningen på pH papir (det bør slå blå).
      Forsigtig: HCl er ætsende. Undgå enhver kontakt med huden. Tilsætning af HCl kan medføre kraftig boblende, HCl skal tilføjes omhyggeligt, at holde den koniske kolbe på is.
      Bemærk: Alt på 20-30 mL HCL (10 M af en vandig opløsning) vil være påkrævet.
    6. Uddrag af mælkeagtig vandig emulsion med hexan (2 x 30 mL), ved hjælp af væske-væske ekstraktion i en 250 mL kolbe at adskille. Sørg for at temperaturen i den vandige ekstrakt er ved stuetemperatur eller nedenfor før du tilføjer hexan. Kombinere de to hexan ekstrakter i en ren 100 mL konisk kolbe.
      Bemærk: Eugenol bliver nu kombineret økologisk (øverst) lag (økologisk løsning B).
    7. Tilføj MgSO4 til tørre økologisk løsning B.
    8. Analysere økologisk løsning A, økologisk løsning B, ren eugenol TLC reference og acetyleugenol TLC reference af TLC ved hjælp af optimeret TLC opløsningsmiddel forholdet identificeret i den foregående mødeperiode.
    9. Filter økologisk løsning A og B gennem riflet filterpapir i separate pre vejede 250mL runde-bunden målekolber. Kassér den solid rest (hydreret MgSO4) i affaldet.
    10. Fjerne opløsningsmidlet fra runde-bunden kolberne ved hjælp af en roterende fordamper (vand bad temperatur: 60 ° C, vakuum pres: 350 mbar).
    11. Tilføje diethylether (5 mL) til hver runde-bunden kolbe og overføre renset acetyleugenol (økologisk løsning A) og eugenol (økologisk løsning B) i en umærket, preweighed hætteglas ved hjælp af en tragt.
    12. Skyl kolben med yderligere diethylether (5 mL) ind i hætteglasset. Fordampe opløsningsmiddel ved hjælp af en roterende fordamper (vand bad temperatur: 50 ° C, vakuum pres 800 mbar) med et hætteglas vedhæftet. Optage udbyttet og etiket hætteglasset korrekt.
    13. Analysere økologisk løsning A, økologisk løsning B, ren eugenol TLC reference og acetyleugenol TLC reference af TLC ved hjælp af optimeret TLC opløsningsmiddel forholdet identificeret i den foregående mødeperiode.
      Bemærk: Vandige opløsninger kan hældes ned i vasken til bortskaffelse. Hexan og ether affald skal bortskaffes i de ikke-klorerede organiske affald flasker.

2. PHWE af Correa reflexa : isolering af seselin og (+)-epoxysuberosin

  1. Session 1. PHWE af Correa reflexa
    1. Male Correa reflexa blade (10 g) i en elektrisk krydderi kværn og derefter overføre jorden plantemateriale til et 250 mL bægerglas.
      Bemærk: Slibning bør tage 20-30 sekunder.
    2. Tilføje ~ 2 g groft sand over i bægerglasset, der indeholder plantemateriale.
    3. Mix og pakke i kurven portafilter (prøve rum). Komprimere prøven med sikret mod manipulation.
      Bemærk: Ikke pakke prøven for stramt.
    4. ~ 300 mL 35% ethanol/H2O opløsning tilsættes til espresso maskine tank.
    5. Placer portafilter i espresso-maskine og placere en ren 250 mL baegerglas nedenunder.
    6. Indsamle ~ 100 mL ekstrakt, vente på ~ 1 minut og derefter indsamle yderligere 100 mL.
      Forsigtig: Maskine og ekstrakter bliver varm på dette punkt.
    7. Cool denne blanding i iskarret og fordampe ethanol ved hjælp af en roterende fordamper (vand bad temperatur: ~ 40 ° C).
    8. Overføre den vandige ekstrakt til en skilletragt og uddrag med ethylacetat (4 x 50 mL).
      NOTE: Tid kan være nødvendigt at tillade emulsioner til at adskille mellem ekstraktioner.
    9. Kombinere de økologiske ekstrakter, tørre ved at tilføje MgSO4 og hvirvlende kolben, filtrere ved hjælp af et sintret glas tragt, og fordampe ved hjælp af en roterende fordamper (vand bad temperatur: ~ 35 ° C) til at levere den rå ekstrakt.
    10. Opnå en 1H Kernemagnetisk resonans (NMR) spektrum (Se instruktør for bistand). 11
    11. Udføre TLC analyse af den rå ekstrakt til at bestemme et passende opløsningsmiddel system at isolere de forbindelser, der er blevet udvundet.
      Bemærk: TLC analyse udføres tilsvarende procedurer beskrevet taktfast 1.2.
  2. Session 2. Adskillelse af seselin og (+)-epoxysuberosin af flash kolonne kromatografi11,19
    Bemærk: Følgende protokol indebærer brug af flash kolonne kromatografi til adskillelse af organiske forbindelser. Kontakt en instruktør for at demonstrere, hvordan til at pakke en flash silicagel kolonne.
    1. Sted kolonne (~ 30 mm i diameter) i en klemme monteres en retorten stå. Placer en 100 mL konisk kolbe under kolonnen.
    2. Udfylde en kolonne med silicagel (60 μm flash klasse) til et niveau på ~ 10 cm og derefter tilføje hexanes (~ 100 mL) til kolonnen.
    3. Placere et glas prop i kolonnen, fjerne kolonnen fra klemmen og ryste for at opnå en gylle. Placere kolonnen i klemme og så lad blandingen til at bilægge.
    4. Åbne hanen af kolonnen, og ved hjælp af en gas adapter knyttet til en trykluft linje, tom kolonne for at forlade ~ 2 mm af opløsningsmiddel over sengen af silicagel. Fjerne gas-adapteren og derefter lukke hanen.
    5. Brug hexanes opsamles i den koniske kolbe (~ 5 mL) til at vaske ned enhver silica gel fra væggene i kolonnen med Pasteur pipette monteret med en gummi septum.
    6. Gentag trin 2.2.4 og derefter tilføje en lille lag af sand (~ 1 cm) til kolonnen.
    7. Tilføje dichlormethan (~ 1mL) kolben indeholdende rå ekstrakt fra trin 2.1.9. Omhyggeligt indlæse den efterfølgende løsning til kolonnen ved hjælp af Pasteurs pipette monteret med en gummi septum. Åbne hanen af kolonnen og tillade prøven til adsorberes på silica gel.
    8. Gentag trin 2.2.7 yderligere to gange.
    9. Forsigtigt tilføje hexanes (~ 20 mL) til kolonnen. Gentag trin 2.2.4.
    10. Tilføj forsigtigt (~ 180 mL af en 15% ethylacetat/hexanes). Åbne hanen af kolonnen og bruge en gas adapter knyttet til en trykluft linje, tom kolonne for at forlade ~ 2 mm af opløsningsmiddel over sengen af silicagel, indsamle fraktioner i 10 mL reagensglas.
      Bemærk: Dette vil tillade seselin at være isoleret.
    11. Kombinere reagensglas fraktioner der indeholder seselin i en 250 mL rund bund kolbe og fordampe ved hjælp af en roterende fordamper (vand bad temperatur: ~ 35 ° C).
      Bemærk: TLC analyse bruges til at bestemme dette og er udført af analogi til procedurerne angivet i trin 1.2.
    12. Tilføj forsigtigt (~ 75 mL af en 25% ethylacetat/hexanes). Åbne hanen af kolonnen og bruge en gas adapter knyttet til en trykluft linje, tom kolonne for at forlade ~ 2 mm af opløsningsmiddel over sengen af silicagel, indsamle fraktioner i 10 mL reagensglas.
      Bemærk: Dette vil give mulighed (+)-epoxysuberosin at være isoleret.
    13. Kombinere reagensglas fraktioner der indeholder (+)-epoxysuberosin i en 250 mL runde bund kolbe og fordampe ved hjælp af en roterende fordamper (vand bad temperatur: ~ 35 ° C).
      Bemærk: TLC analyse bruges til at bestemme dette og er udført af analogi til procedurerne angivet i trin 1.2.
    14. Prøver af de isolerede forbindelser er analyseret ved hjælp af NMR spektroskopi. 11
      Bemærk: NMR spektroskopi eksperimenter er udført af en laborant.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

PHWE af nelliker. Når du forsøger at udføre trinnet væske-væske ekstraktion, stødt studerende ofte emulsioner (tilsætning af saltlage ikke var typisk effektivt). På nuværende tidspunkt blev studerende instrueret i at Lad blandingen stå i en skilletragt, mens de udforskede virkningerne af Elueringsvæskens sammensætning på adskillelse af eugenol og acetyleugenol af TLC. Det skal bemærkes, at hexan kan erstattes med enten heptan eller dichlormethan taktfast væske-væske ekstraktion. 9 studerende blev tildelt forholdet TLC opløsningsmidlet acetone og cyclohexan og forsynet med ren standarder af eugenol og acetyleugenol og derefter udført TLC analyse (figur 3). Deres resultater blev tabuleres på en tavle, og virkningerne af opløsningsmiddel sammensætning på fastholdelse faktor (Rf) og den optimale elueringsvæsken ansås i en gruppediskussion (tabel 1). De optimale opløsningsmiddel kompositioner identificeret af studerende typisk varierede fra 5-20% acetone/cyclohexan med en ΔRf mellem 0,1-0,2.

Efter TLC elueringsvæsken optimering, studerende tilbage til deres eugenol ekstraktioner. Den rå fed ekstrakt (bestående hovedsagelig af eugenol og acetyleugenol) blev isoleret i 4-9% w/w. I den anden session af dette eksperiment udnyttet studerende de forskellige syre-base egenskaber af de to store organiske molekyler til at adskille dem. ved væske-væske ekstraktion. Typisk, eugenol blev isoleret i et udbytte på 45-65% w/w af den rå ekstrakt, mens acetyleugenol blev isoleret i et udbytte på 5-10% w/w af den rå ekstrakt. Studerende derefter udnyttede den optimerede elueringsvæsken (identificeret som skitseret ovenfor) til at bestemme succes med deres væske-væske ekstraktion ved sammenligning af deres uddrag til de rene referenceprøver af TLC (figur 3). Studerende også analyseret deres rå fed ekstrakt, og deres renset eugenol og acetyleugenol prøver ved at udføre Fouriertransformation infrarød (FTIR) spektroskopi. 9 opløsningsmiddel eller vand toppe var lejlighedsvis observeret i IR spektre skyldes dårligt udført arbejde-up procedurer (eller dårlig prøveforberedelse).

Avancerede studerende begået cirka halvdelen af deres isolerede råolie til væske-væske ekstraktion beskrevet ovenfor og underkastes flash kolonne kromatografi (yderligere oplysninger findes i de supplerende oplysninger) anden del. Selv om at udfylde væske-væske ekstraktion og flash kolonne kromatografi skridt i en fire-timers session kan forekomme temmelig ambitiøs var opnåelige for de fleste af de avancerede studerende foretage dette eksperiment. Komplet adskillelse af eugenol fra acetyleugenol af flash kolonne kromatografi var sjældent opnået på grund af deres nære fastholdelse faktorer (figur 4). Studerende var dog generelt i stand til at indsamle et par fraktioner der indeholder ren eugenol. Avancerede studerende blev derefter bedt om at kommentere de to forskellige rensning teknikker som led i deres betænkning.

PHWE af Correa reflexa. Studerende udføres PHWE af Correa reflexa med minimal hjælp af laboratorie instruktør. Under trinnet væske-væske ekstraktion emulsioner typisk dannet og studerende ofte var forpligtet til at Lad blandingen stå i skilletragt (~0.25 h) med periodiske agitation af blandingen med en glasstav. Kromatografiske rensning af den rå ekstrakt blev komfortabelt afsluttet inden for fire timer laboratorium session af studerende. Seselin og (+)-epoxysuberosin blev isoleret i udbyttet af op til 1,1% w/w og 0,9% w/w, henholdsvis og isolerede prøver af begge stoffer blev analyseret af 1H og 13C NMR og FTIR spektroskopi (figur 2). Mens eleverne foretog FTIR spektroskopi eksperimenter og forberedte prøver til NMR spektroskopi, udført laboratorieteknikere NMR spektroskopi eksperimenter. Resultaterne af studerende var i overensstemmelse med tidligere offentliggjorte arbejde. 11

Selv om dette ikke er blevet forelagt i betænkningen, i praksis, dette eksperiment er også udstyret med en anden del, der udfordrer eleverne til at udføre udvinding en plantearter, der ikke er blevet undersøgt beskæftiger PHWE (flere oplysninger i støtte oplysninger).

Figure 1
Figur 1. PHWE af nelliker. 9 Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2. PHWE af Correa reflexa. 11 Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 . En repræsentativ TLC-pladen er udarbejdet af en student. (10% acetone / cyclohexan eluering). Lane 1 (E): eugenol standard; Lane 2 (rå): rå fed ekstrakt; Lane 3 (A): acetyleugenol standard). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

acetone / cyclohexan (%v/v) betyde acetyl-eugenol Rf Acetyl-eugenol Rf (σ) betyde eugenol Rf eugenol Rf (σ) betyder ΔRf antallet af TLC analyser
0 0,06 0,08 0,04 0,06 0.02 12
5 0,34 0,11 0,27 0,09 0,07 15
10 0,45 0,07 0,34 0,05 0,12 20
20 0,51 0,07 0,41 0,06 0,10 20
30 0,58 0,10 0,49 0,12 0,10 19
40 0,63 0,08 0,56 0,08 0,07 16
50 0,76 0,08 0,73 0,08 0,03 17
60 0,77 0,13 0,73 0,15 0,04 12
70 0,84 0,13 0,81 0,13 0,03 11
80 0.90 0,06 0.87 0,08 0.02 10
90 0,88 0,06 0.87 0,05 0,01 11
100 0.87 0,13 0,86 0,14 0.02 6

Bord 1. Tabel over tilbageholdelse faktorer skitserer virkning af Elueringsvæskens sammensætning på Rf.

Figure 4
Figur 4 . Repræsentative TLC plader udarbejdet af studerende. Venstre: En TLC plade, analysere resultatet af væske-væske ekstraktion trin (10% acetone / cyclohexan eluering). Lane 1 (E): eugenol referencestandard; Lane 2 (LEB): eugenol-indeholdende organiske uddrag; Lane 3 (A): acetyleugenol referencestandard; Lane 4 (LEN): acetyleugenol indeholdende organiske ekstrakt. Højre: En TLC plade, analysere resultatet af flash kolonne kromatografi trin (10% acetone / cyclohexan eluering). Numre på TLC-pladen vedrører test-tube brøkdel antallet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den klassiske procedure for isolere eugenol fra nelliker ved dampdestillation har været en del af de mellemliggende kemi laboratorium program på University of Sydney i årtier, men blev moderniseret for at ansætte PHWE metodologi i 2016 (figur 1). 9 , 18 det givet et antal fordele. For det første, udnytte husstand espressomaskiner i laboratoriemiljø straks fascineret og engageret studerende af illustrerer anvendelsen af en ikke-klassisk, alternative metode til at foretage en traditionel videnskabelig undersøgelse. Desuden, denne nye metode reduceret den tid, det tager at fuldføre udvinding og aktiveret indarbejdelse af ekstra øvelser i denne nye iteration af eksperimentet. Specifikt, tilladt dette tyndtlagskromatografi (TLC) indføres (og flash kolonne kromatografi til avancerede studerende).

Eksperimentet med fokus på PHWE af nelliker blev designet som en indledende laboratorium oplever for andet år bachelor kemi studerende og derfor det funktioner expository undervisningsmetoder. 9 denne normative opskrift-stil procedure giver mulighed for studerende med noget begrænset erfaring i organisk kemi effektivt fuldføre udvinding af eugenol fra nelliker. I dette eksperiment, er begreber som syre-base udvinding af sure forbindelser, udnytter TLC for at identificere egnede Elueringsvæskens sammensætning til kromatografi og brugen af en roterende fordamper indført eller forstærket af en kombination af on-line præ lab video uddannelse og i-person demonstrationer. I supplerende komponenter foretaget under de to tildelte sessioner, studerende i de avancerede strøm af formidlende kemi også adskilt eugenol og acetyleugenol af kolonne kromatografi og fastslået identiteten af de udpakkede komponenter ved hjælp af TLC. I den anden session, kan studerende kritisk sammenligne de to adskillelse metoder. I almindelighed, var studerende i stand til at fuldføre den samlede eksperiment inden for de tildelte to fire-timers perioder med minimal instruktion.

Eksperimentet med fokus på PHWE og isolering af seselin og (+)-epoxysuberosin fra Correa reflexa blev udviklet for mere erfarne studerende tredje år bachelor kemi studerende. Især var denne læring øvelse et resultat af en undersøgelse med oprindelse i forskningslaboratorium. 11 den første iteration af eksperimentet blev indlemmet i det tredje år bachelor kemi laboratorium program på University of Tasmania i 2015. Efter to år af revisioner og revurdering, blev dette eksperiment udført af en tredje-årige undergraduate klasse for tredje gang i 2017.

Dette eksperiment var specielt designet som en guidet-undersøgelse-baseret aktivitet, der bestræber sig på at simulere nogle af de beskæftigede i naturprodukter forskningslaboratorier og funktioner minimal skriftlige instrukser. Dette er en elev-instrueret læreproces og laboratorie instruktør spiller en central rolle i at hjælpe studerende, som de arbejder gennem eksperimentet ved at give retning som krævet. I dette eksperiment, studerende udvikle centrale laboratorium færdigheder i kromatografi og ansætte NMR spektroskopi til at udføre struktur udredning. Dette laboratorium erfaring bestyrker begrebet bioprospecting, som præsenteres for eleverne i klasseværelset og dette kan udvides til at omfatte undersøgelser af tidligere unstudied plantemateriale til at give et mere repræsentativt oplevelse af naturprodukter bioprospecting. C. reflexa er en endemisk australske plantearter, men denne prøve kan erstattes af passende blad materiale fra andre terrestriske plantearter i dette eksperiment.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Forfatterne anerkender skole Natural Sciences - kemi, University of Tasmania og School of Chemistry, University of Sydney for finansiel støtte. B.J.D. og J.J. takke den australske regering for forskerstipendier uddannelse Program.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
espresso machines Breville/Sunbeam Breville espresso machine model 800ES / Sunbeam EM3820 Café Espresso II
rotary evporators Buchi and Heidolph
cloves (plant material) Dijon Food Pty Ltd Cloves must be ground in a food processor for students.
Correa reflexa (plant material) sample obtained in Tasmania Sample collected from mature shrubs in the Thomas Crawford Reserve at the University of Tasmania
sand Ajax 1199
ethanol Redoc Chemicals E95 F3
hexanes Ajax 251
magnesium sulfate Ajax 1548
diethyl ether Merck 1009215000
silica on aluminium TLC plates Merck 1055540001
eugenol Merck 1069620100
eugenyl acetate Aldrich W246905
acetone Redox Chemicals Aceton13
cyclohexane ChemSupply CA019
silica gel 60 Trajan 5134312 40 - 63um (230-400mesh)
Congo red paper ChemSupply IS070-100S
32% hydrochloric acid Ajax 256

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Newman, D. J., Cragg, G. M. Natural Products as Sources of New Drugs from 1981 to 2014. Journal of Natural Products. 79, 629-661 (2016).
  2. Barnes, E. C., Kumar, R., Davis, R. A. The use of isolated natural products as scaffolds for the generation of chemically diverse screening libraries for drug discovery. Natural Product Reports. 33, 372-381 (2016).
  3. DeCorte, B. L. Underexplored Opportunities for Natural Products in Drug Discovery. Journal of Medicinal Chemistry. 59, 9295-9304 (2016).
  4. Bucar, F., Wube, A., Schmid, M. Natural product isolation - how to get from biological material to pure compounds. Natural Product Reports. 30, 525-545 (2013).
  5. Sticher, O. Natural product isolation. Natural Product Reports. 25, 517-554 (2008).
  6. Just, J., Deans, B. J., Olivier, W. J., Paull, B., Bissember, A. C., Smith, J. A. New Method for the Rapid Extraction of Natural Products: Efficient Isolation of Shikimic Acid from Star Anise. Organic Letters. 17, 2428-2430 (2015).
  7. Caprioli, G., Cortese, M., Cristalli, G., Maggi, F., Odello, L., Ricciutelli, M., Sagratini, G., Sirocchi, V., Tomassoni, G., Vittori, S. Optimization of espresso machine parameters through the analysis of coffee odorants by HS-SPME-GC/MS. Food Chemistry. 135, 1127-1133 (2012).
  8. Just, J., Jordan, T. B., Paull, B., Bissember, A. C., Smith, J. A. Practical isolation of polygodial from Tasmannia lanceolata: a viable scaffold for synthesis. Organic Biomolecular Chemistry. 13, 11200-11207 (2015).
  9. Just, J., Bunton, G. L., Deans, B. J., Murray, N. L., Bissember, A. C., Smith, J. A. Extraction of Eugenol from Cloves Using an Unmodified Household Espresso Machine: An Alternative to Traditional Steam Distillation. Journal of Chemical Education. 93, 213-216 (2016).
  10. Deans, B. J., Bissember, A. C., Smith, J. A. Practical Isolation of Asperuloside from Coprosma quadrifida via Rapid Pressurised Hot Water Extraction. Australian Journal of Chemistry. 69, 1219-1222 (2016).
  11. Deans, B. J., Just, J., Chetri, J., Burt, L. K., Smith, J. N., Kilah, N. L., de Salas, M., Gueven, N., Bissember, A. C., Smith, J. A. Pressurized Hot Water Extraction as a Viable Bioprospecting Tool: Isolation of Coumarin Natural Products from Previously Unexamined Correa (Rutaceae). ChemistrySelect. 2, 2439-2443 (2017).
  12. Deans, B. J., Olivier, W. J., Girbino, D., Bissember, A. C., Smith, J. A. Extraction of carboxylic acid-containing diterpenoids from Dodonaea viscosa via pressurised hot water extraction. Fitoterapia. 126, 65-68 (2018).
  13. Deans, B. J., Kilah, N. L., Jordan, G. J., Bissember, A. C., Smith, J. A. Arbutin Derivatives Isolated from Ancient Proteaceae: Potential Phytochemical Markers Present in Bellendena, Cenarrhenes and Persoonia Genera. Journal of Natural Products. 81, 1241-1251 (2018).
  14. Deans, B. J., Tedone, L., Bissember, A. C., Smith, J. A. Phytochemical profile of the rare, ancient clone Lomatia tasmanica and comparison to other endemic Tasmanian species L. tinctoria and L. polymorpha. Phytochemistry. 153, 74-78 (2018).
  15. Deans, B. J., Skierka, B., Karagiannakis, B. W., Vuong, D., Lacey, E., Smith, J. A., Bissember, A. C. Siliquapyranone: a Tannic Acid Tetrahydropyran-2-one Isolated from the Leaves of Carob (Ceratonia siliqua) by Pressurised Hot Water Extraction. Australian Journal of Chemistry. 71, (2018).
  16. Olivier, W. J., Kilah, N. L., Horne, J., Bissember, A. C., Smith, J. A. ent-Labdane Diterpenoids from Dodonaea viscosa. Journal of Natural Products. 79, 3117-3126 (2016).
  17. Rihak, K. J., Bissember, A. C., Smith, J. A. Polygodial: A viable natural product scaffold for the rapid synthesis of novel polycyclic pyrrole and pyrrolidine derivatives. Tetrahedron. 74, 1167-1174 (2018).
  18. Ntamila, M. S., Hassanali, A. Isolation of Oil of Clove and Separation of Eugenol and Acetyl Eugenol. Journal of Chemical Education. 53, 263 (1976).
  19. Still, W. C., Kahn, M., Mitra, A. Rapid chromatographic technique for preparative separations with moderate resolution. Journal of Organic Chemistry. 2923-2925 (1978).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics