Basınçlı sıcak su ayıklama (PHWE) doğal ürünler Kimya Lisans Laboratuvarı keşfetmek için istihdam

* These authors contributed equally
JoVE Journal
Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Burada, biz doğal ürünler Kimya Laboratuvarı lisans tanıtmak bir değiştirilmemiş ev espresso makinesi kullanan bir basınçlı sıcak su ayıklama (PHWE) yöntemini kullanır. İki deney sunulmaktadır: PHWE eugenol ve karanfil ve PHWE seselin ve (+) acetyleugenol-epoxysuberosin--dan Avustralya bitki Correa reflexa.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Ho, C. C., Deans, B. J., Just, J., Warr, G. G., Wilkinson, S., Smith, J. A., Bissember, A. C. Employing Pressurized Hot Water Extraction (PHWE) to Explore Natural Products Chemistry in the Undergraduate Laboratory. J. Vis. Exp. (141), e58195, doi:10.3791/58195 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Doğal ürünler araştırma kolaylaştırmak için bir değiştirilmemiş ev espresso makinesi kullanan bir son zamanlarda geliştirilen basınçlı sıcak su ayıklama (PHWE) yöntemini de uygulamaları bir etkili öğretim aracı olarak buldu. Özellikle, bu teknik yönleri doğal ürünler Kimya Laboratuvarı ile ikinci ve üçüncü sınıf lisans öğrencileri takdim etmek için kullanmıştı. Bu raporda, iki deney sunulmaktadır: eugenol ve karanfil ve seselin ve (+) PHWE acetyleugenol PHWE-epoxysuberosin--dan Avustralya endemik bitki türleri Correa reflexa. Bu deneylerde PHWE istihdam ederek eugenol ve acetyleugenol, zenginleştirilmiş ham karanfil özü, 4-%9 w/w karanfil üzerinden ikinci yıl lisans ve seselin ve (+) tarafından elde edildi-epoxysuberosin ilâ 1.1 g/g ve % 0,9 w/w verimleri izole C. reflexa üçüncü sınıf öğrencileri tarafından. Eski egzersiz ikinci etkinliği destekli-istemi öğretim yöntemleri benzetimini yapmak için bir çaba özellikli iken çıkarma ve ayırma teknikleri, giriş sağlayan geleneksel buhar damıtma deneyi için bir yedek olarak geliştirilmiştir doğal ürünler bioprospecting. Bu öncelikle bu PHWE teknik kez lisans laboratuvar deneyleri ile ilişkili zaman kısıtlamaları ile uyumsuz geleneksel çıkarma yöntemleri göre hızlı doğa türetilmiştir. Bu hızlı ve pratik PHWE Yöntem verimli bir şekilde bitki türleri bir dizi organik moleküllerin çeşitli sınıflar yalıtmak için kullanılabilir. Bu teknik daha geleneksel yöntemleri göre tamamlayıcı niteliği de daha önce kanıtlanmıştır.

Introduction

Yalıtım ve doğal ürünler tanımlaması bilimsel topluluk ve toplum için temel öneme sahip daha genel olarak vardır. 1 Bioprospecting, arama, doğadaki değerli organik moleküller için vazgeçilmez bir süreç keşif potansiyel terapötik ajanlar ve yeni ilaç yol olarak kalır. 1981-2014 ~ %75-in tüm onaylı küçük molekül ilaç ilaçlar doğal ürünler, doğal ürün kaynaklı veya doğal ürün esinlenen, tahmin edilmektedir. 1 Ayrıca, doğal ürünler çok büyük yapısal ve kimyasal çeşitlilik sahip. Bu nedenle, onlar da doğrudan organik sentez veya kiral ligandlar ve katalizörler geliştirilmesi kullanılabilir değerli kimyasal iskele temsil eder. 2 , 3

Geleneksel olarak, nispeten zaman yoğun yordamlar maserasyon, Soxhlet ayıklama ve buhar damıtma gibi bitkilerden sekonder metabolitler yalıtım odaklı araştırma dayanak olmuştur. 4 hızlandırılmış solvent ekstraksiyon, dahil olmak üzere daha modern ayıklama teknikleri ayıklama kez azaltmak ve daha yeşil protokollerin oluşturulması üzerinde odaklanmıştır. 4 , 5 2015 yılında, orijinal bir basınçlı sıcak su ayıklama (PHWE) yöntemi bildirildi. 6 shikimic asit hızlı ve özellikle verimli çekme--dan Yıldız anason kolaylaştırmak için bir değiştirilmemiş ev espresso makinesi bu tekniği istihdam. Espresso Makineleri özel olarak tasarlanmış ve organik moleküllerin uygun şekilde çekilmiş kahve çekirdekleri çıkarmak için tasarlanmış. Bu, bu aletleri ısı su kadar 96 ° c sıcaklık ve basınç genellikle 9 çubuğunun elde etmek için. 7 bu düşünce bu espresso makineleri verimli bir şekilde doğal ürünler bitki materyali aralığından ayıklamak için kullanılması gereken belki de şaşırtıcı değildir.

Karasal bitki türleri çeşitli içeren sonraki çalışmalar verimli bir şekilde doğal ürünler nispeten geniş polarite aralığında ayıklamak için bu PHWE teknik kapasitesini göstermiştir. 6 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 Ayrıca, biraz duyarlı fonksiyonel gruplar içeren bileşikler aldehitler, epoksitler, glikosidler ve epimerizable stereogenic gibi potansiyel olarak merkezleri tarafından ayıklama işlemi genellikle etkilenmemiş idi. Bu teknik daha geleneksel yöntemleri göre tamamlayıcı niteliği de göstermiştir. 12 , 16 bu PHWE yöntemi de çok gram miktarları roman doğal ürün türev hazırlamak için kullanılan doğal ürünlerin ve karmaşık molekül sentezi daha genel olarak izole etmek için istihdam edilmiştir. 8 , 11 , 17

Bu yeni PHWE yöntemi lisans laboratuvarda dahil edilebilir bir yararlı öğretim aracı olarak hizmet verebilir olduğunu tespit edilmiştir. Bu öncelikle bu tekniğin kez lisans laboratuvar deneyleri ile ilişkili zaman kısıtlamaları ile uyumsuz geleneksel çıkarma yöntemleri göre hızlı doğa türetilmiştir. Sonuç olarak, bu teknik eugenol çekme--dan karanfil buhar-damıtma Tazmanya Üniversitesi, istihdam odaklı geleneksel lisans kimya laboratuvar deneyi üstlenilmekle. 9 , 18 o zamandan beri bu deney varyasyonları diğer üniversiteler ve şimdi özellikleri Sydney Üniversitesi lisans kimya laboratuvar programında karanfil PHWE üzerinde odaklanan değiştirilmiş bir deney tarafından benimsenmiştir (Infra vide ).

Pratiklik ve eğitim amaçlı bu yeni PHWE yaklaşım istihdam fizibilite göstermek için iki protokol bu çalışmanın bir parçası sunulur. Bu raporun ilk bölümünde bir deney PHWE eugenol ve Sydney Üniversitesi (Şekil 1) ikinci sınıf lisans laboratuvar programı'nın parçası olan acetyleugenol dan karanfil üzerinde vurgular. Bu deney öğrenciler için doğal ürünler Kimya temel pratik becerilerini geliştirirken tanıtmak için hizmet vermektedir. Bir deney üzerinde PHWE Correa reflexa Tazmanya Üniversitesi (Şekil 2) adlı üç yıllık lisans laboratuvar programı'nın parçası olan Avustralya endemik bitki türlerinin özellikleri ikinci bölüm. Bu deney doğal ürünler bioprospecting taklit ve çekirdek laboratuvar teknikleri güçlendirmek üzere tasarlanmıştır. 11

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Not: Tüm yordamları bir duman mahallede gerçekleştirilmesini tavsiye edilir. Öğrenciler her zaman uygun kişisel koruyucu ekipman laboratuvarda giymek zorunda ve her reaktif ile ilişkili güvenlik bilgi formları (SDS) kullanmadan önce istişare gerekir.

1. PHWE karanfil: yalıtım eugenol ve acetyleugenol

  1. Eugenol ve acetyleugenol çekme--dan karanfil
    1. Kaba zemin karanfil (12,5 g) 250 mL kabı içinde yerleştirin.
    2. Kum (12,5 g) diş biler ekleyin ve iyice karıştırın.
    3. Bir portafilter (örnek bölme) toplamak ve tüm karanfil-kum karışımı sepetle yük. Örnek dış müdahale ile hafifçe sıkıştırın.
      Not: karışım çok fazla sıkıştırma veya sıvı akışı değil.
    4. Portafilter espresso makinesi getirin ve bir temiz 250 mL ölçek altındaki yerleştirin. Bu daha yarısı dolu daha az ise % 30 etanol/H2O çözüm espresso makinesi su deposu ekleyin.
    5. Espresso makinesi 100 mL özü toplamak için kullanın.
      Not: makine tıkanmış görünüyorsa bir eğitmen başvurun.
    6. Damlama bitirmek ve sonra espresso makinesi kaldırmak portafilter izin verir.
      Dikkat: Biler ve metal çevresindeki sıcak olacak.
    7. Bir spatula kullanarak, diş biler portafilter kaldır ve atık çöp kutusuna atın.
    8. Portafilter H2O lavaboya musluk altında ile gelen kalıntı katı dışarı durulama ve kullanmak sonraki kişi için geri.
    9. Serin karanfil özü bir buz banyosu kadar en az 30 ° c sıcaklık azalttı
    10. Özü 250 mL HCI'yi Huni içine yerleştirin, hekzan 30 mL ekleyin ve hafifçe sallayın.
    11. Yer ayıran bir yüzük kelepçe hunide bir imbik standına monte ve sulu ve organik katmanları ayrı sonra sulu (alt) tabaka geri 250 mL kabı toplamak izin verir.
      Not: Bu ayırmak katmanları için 10 dakika sürebilir. Öğrenciler (1.2 adımlara bakın) gerçekleşmesi ilk ayrılması için beklenirken TLCs solvent optimizasyonu gerçekleştirmek için tavsiye edilir.
    12. (Hangi ürünü içeren) organik (üst) katmanı bir temiz 250 mL konik şişesi aktarabilir ve sonra alt (sulu) tabaka geri HCI'yi huni dökün.
    13. Bir daha sulu katman hekzan (2 x 30 mL) ile iki kez ayıklayın.
    14. Organik (üst) katman aynı şişeyi her çıkarma sonra birleştirin.
    15. Üçüncü sıvı-sıvı ekstraksiyon sonra kombine organik özü HCI'yi Huni içine dökün ve şiddetle sallayarak H2O 100 mL ile yıkayın. Organik (üst) katmanı bir temiz 250 mL konik şişesi toplamak ve MgSO4 ekleme ve şişeye girdap gibi kuru.
    16. Yivli filtre kağıdı bir önceden ağırlığını 250 mL yuvarlak alt şişesi cam huni içinde bulunan aracılığıyla takip eden karışımı filtre.
      Not: Atık katı kalıntı (sulu MgSO4) atılır.
    17. Solvent (hekzan) bir döner buharlaştırıcı kullanarak toplanan filtrate buharlaşır (su banyo sıcaklığı: 60 ° C, vakum basıncı: 350 mbar) ve sonuç yağ içeren şişeye yeniden tartın.
  2. İnce katmanlı Kromatografi (TLC) çözücü sistemi optimizasyonu
    Not: bir grup olarak, öğrenciler bir çözücü sistemi 100:0 aseton: Siklokekzan 0:100 aseton: Siklokekzan için acetyleugenol eugenol maksimum çözünürlük sağlar oranı belirlemek için eğitmen tarafından atanır.
    1. Saf eugenol ve acetyleugenol bir TLC başvuru çözüm edinin.
      Not: Gerekli TLC başvuru çözümleri saf eugenol ve acetyleugenol laboratuvar oturum önce Laboratuar teknisyenleri tarafından hazırlanmıştır.
    2. TLC tabağa temel ~1.5 cm altındaki yumuşak bir kalemle işaretlemek. Off üç eşit aralıklı noktaları işaretlemek.
    3. TLC gözetleyicisi saf eugenol TLC başvuru çözümde bir lane, saf acetyleugenol TLC başvuru çözüm üçüncü şeritte bir fincan ve bir nokta her ikinci şeritte (ortak nokta) bir damla spot için kullanın.
    4. Kontrol eugenol ve acetyleugenol TLC plaka üzerinde varlığı için bir UV lamba altında plaka görüntüleyerek (254 nm) içinde kabine ile ilgilenen TLC.
      Not: Nerede TLC başvuru çözümleri tespit edildi plaka üzerinde küçük (1-2 mm genişliğinde) siyah noktalar olmalıdır. Hiçbir noktalar vardır ya lekeler soluk görünür, siyah bir nokta UV ışığı altında görülmektedir kadar başka bir yer uygun TLC çözüm uygulanır.
    5. 10 mL ayrılmış solvent karışımı bir temiz, Kuru TLC kavanoz ekleyin.
      Not: kavanozun içinde çözelti yükseklik ~ 1 cm aşmaz olun.
    6. Cımbız kullanarak, hazırlanan TLC plaka TLC kavanoza yerleştirin. Kavanozun kapağını kapatın.
      Not: Solvent TLC plaka temel altında yalan gerekir.
    7. TLC plaka kadar seyahat çözücü olanak sağlar. Çözücü kalenin tepesinden ~ 1 cm olduğunda, TLC plaka kavanozdan cımbız ile kaldırın ve solvent ön hattının bir kalemle işaretlemek.
    8. Solvent TLC plaka (~ 1 dk) buharlaşır sonra TLC plaka bir UV lamba altında görüntülemek izin (254 nm). Bir kalem kullanarak, TLC plaka üzerinde gözlenen siyah noktalar daire içine alın.
    9. Koruma faktörü (Rf) eugenol ve acetyleugenol bileşik tarafından yolculuk mesafe çözücü tarafından seyahat mesafeye göre bölerek hesaplayın.
    10. Acetyleugenol (ΔRf) ve eugenol Rf değerleri arasındaki farkı hesaplama.
    11. Sınıfın geri kalanıyla paylaşmak sonuçları. Diğer çözücü oranları ile diğer öğrenciler tarafından alınan saklama değerlerini kaydedin.
    12. Solvent hangi sistem-ecek var olmak ham eugenol çözüm ve sonraki arıtma adımları çözümlemek en iyi tanımlayın.
      Not: En iyi TLC solvent oranı eugenol ve acetyleugenol en büyük ΔRf değeri tarafından belirtilen arasındaki büyük ayrılık sağlayacaktır. ΔRf çözücü kompozisyon karşı çizilir, grafik bir çan eğrisi benzemelidir.
  3. Eugenol ve sıvı-sıvı ekstraksiyon tarafından acetyleugenol ayrılması
    1. 1.1.17 adımından elde edilen ham eugenol içeren ayıklamak için hekzan (10 mL) ekleyin ve ardından gelen çözüm 250 mL HCI'yi huni dökün.
    2. Yuvarlak alt şişeye hekzan (10 mL) ile durulayın ve bu HCI'yi huni ekleyin.
    3. 3 M sulu NaOH (2 x 25 mL) ile hekzan çözüm yolu ile sıvı-sıvı ekstraksiyon ayıklayın. Toplamak ve bir 250 mL konik şişesi her ayıklama gelen sulu alt katmanlarda birleştirmek. 50 mL konik şişesi organik katmanda toplamak ve MgSO4 ekleme ve şişeye girdap gibi kuru.
      Dikkat: NaOH aşındırıcı. Herhangi bir cilt ile temasından sakının.
      Not: eugenol alkalin sulu özü (alt katmanları) Şimdi ise Acetyleugenol organik katmanda kalır.
    4. Organik korumak katmanı (organik çözüm A) daha sonra TLC analiz için.
    5. Bir buz-su banyosunda 1.3.3. adımdaki alkalin sulu kesir içeren konik şişeye girdap ve beyaz bir emülsiyon kurdu kadar 10 M sulu HCl yavaş yavaş ekleyin; Kongo kırmızısı kağıt, bir pipet çözüm (o mavi açmalısınız) pH kağıdı üzerine bir damla aktarmak için kullanma ile onun asitlik denetleyin.
      Dikkat: HCl aşındırıcı. Herhangi bir cilt ile temasından sakının. HCl ilavesi dinç köpüren neden olabilir, HCl dikkatle, buz üzerinde konik şişesi tutarak eklenmelidir.
      Not: 20-30 mL HCL (sulu bir çözüm 10 M) Toplam gerekli olacaktır.
    6. Sıvı-sıvı ekstraksiyon bir 250 mL şişe ayıran kullanarak sütlü sulu emülsiyon hekzan (2 x 30 mL) ile ayıklayın. Sulu özü sıcaklığı oda sıcaklığında veya aşağıdaki hekzan eklemeden önce olduğundan emin olun. İki hekzan özleri temiz 100 mL konik şişesi içine birleştirmek.
      Not: Eugenol şimdi kombine organik (üst) olacaktır katmanları (organik çözüm B).
    7. MgSO organik çözüm B. Kuru4 ekleyin
    8. Organik çözüm A, organik çözüm B, saf eugenol TLC başvuru ve acetyleugenol TLC referans önceki oturumda tanımlanan en iyi duruma getirilmiş TLC solvent oranı kullanarak TLC tarafından analiz.
    9. Organik çözüm A ve B yivli filtre kağıdı ile ayrı önceden ağırlığını 250 mL yuvarlak dipli şişeler filtre. Katı kalıntı (sulu MgSO4) atık atmak.
    10. Çözücü bir rotary evaporatör kullanarak yuvarlak dipli şişeler kaldırmak (su banyo sıcaklığı: 60 ° C, vakum basıncı: 350 mbar).
    11. Her yuvarlak alt şişesi dietil eter (5 mL) ekleyin ve saf acetyleugenol (organik çözüm A) ve eugenol (organik çözüm B) bir huni kullanarak bir etiketsiz, preweighed şişe aktarmak.
    12. Daha fazla dietil eter (5 mL) ile balonun şişe durulayın. Rotary evaporatör kullanarak solvent buharlaşır (su banyo sıcaklığı: 50 ° C, vakum basınç 800 mbar) ile bir şişe bağlama. Verim kaydetmek ve uygun bir şekilde şişe etiket.
    13. Organik çözüm A, organik çözüm B, saf eugenol TLC başvuru ve acetyleugenol TLC referans önceki oturumda tanımlanan en iyi duruma getirilmiş TLC solvent oranı kullanarak TLC tarafından analiz.
      Not: Sulu çözümler lavaboya bertarafı için aşağı dökülür gerekir. Eter ve hekzan atık atılmalıdır olmayan klorlu organik atık şişelerde.

2. PHWE Correa reflexa : yalıtım seselin ve (+)-epoxysuberosin

  1. Oturum 1. Correa reflexa PHWE
    1. Correa reflexa yaprakları (10 g) bir elektrik baharat değirmeni eziyet ve sonra yere bitki materyali 250 mL kabı transfer.
      Not: Kabuğu çıkarılmış tane ürünleri 20-30 saniye sürer.
    2. Ekle ~ bitki materyali içeren kabı için kaba kum 2 g.
    3. Mix ve sepet içine sürüsü portafilter (örnek bölme). Örnek dış müdahale ile sıkıştırın.
      Not: örnek çok sıkı paketi değil.
    4. ~ 300 mL % 35 etanol/H2O çözeltisi espresso makinesi tank için ekleyin.
    5. Portafilter espresso makinesi getirin ve bir temiz 250 mL ölçek altındaki yerleştirin.
    6. ~ 100 mL ekstresinin toplamak, ~ 1 dakika bekleyin ve daha sonra daha fazla 100 mL toplamak.
      Dikkat: Makine ve özler bu noktada sıcak olacak.
    7. Bu karışımı buz banyosu içinde serin ve bir döner buharlaştırıcı kullanarak etanol buharlaşır (su banyo sıcaklığı: ~ 40 ° C).
    8. HCI'yi bir huni için sulu özü aktarmak ve etil asetat (4 x 50 mL) ayıklayın.
      Not: Saat emülsiyonlar çekimi arasında ayırmak izin vermek için gerekli olabilir.
    9. Organik özler birleştirmek, MgSO4 ekleyerek kuru ve şişeye dönen, sinterlenmiş cam huni kullanarak filtre uygulama ve döner buharlaştırıcı kullanarak buharlaşır (su banyo sıcaklığı: ~ 35 ° C) ham özü sağlamak için.
    10. 1H nükleer manyetik rezonans (NMR) spektrum elde etmek (eğitmen yardım için bakınız). 11
    11. Elde edilmiştir bileşiklerin izole etmek için uygun bir çözücü sistemi belirlemek için ham ekstresinin TLC çözümlemesi gerçekleştirin.
      Not: 1.2. adımda açıklanan yordamlara kıyasen TLC çözümleme yapılır.
  2. Oturum 2. Seselin ve (+) ayrımı-flaş sütun Kromatografi11,19 tarafından epoxysuberosin
    Not: Aşağıdaki protokol flaş sütun Kromatografi kullanımı organik bileşiklerin ayrılması için içerir. Lütfen flash silika jel sütun paketi nasıl göstermek için bir eğitmen başvurun.
    1. Yer bir kelepçe (~ 30 mm çapında) sütununda bir imbik standına monte. Sütunun altında 100 mL konik şişeye koyun.
    2. Silika jel (60 mikron flash grade) ~ 10 cm bir seviyeye ile doldurmak belgili tanımlık sütun ve sütun hexanes (~ 100 mL) ekleyin.
    3. Bir cam kapalı sütuna getirin, kelepçe sütun kaldırmak ve bir bulamaç elde etmek için sallamak. Sütun kelepçe içinde yerleştirin ve yerleşmek karışım izin verin.
    4. Sütun dokunun açın ve bir gaz adaptörü kullanarak bir basınçlı hava hattı, boş ~ 2 mm lik solvent silika jel yatağın üstünde bırakmak sütun eklenir. Gaz adaptörü çıkarın sonra musluğu kapat.
    5. Kauçuk septum ile donatılmış bir Pasteur pipet ile herhangi bir silika jel sütun duvarlarından aşağı yıkamak için konik şişeye (~ 5 mL) toplanan hexanes kullanın.
    6. Adımları yineleyin 2.2.4 sonra kum (~ 1 cm) küçük bir katman için sütun ekleyin.
    7. Diklorometan ekleyin (~ 1mL) şişeye için ham içeren hulâsa--dan adım 2.1.9. Dikkatle takip eden çözüm lastik septum ile donatılmış bir Pasteur pipet kullanarak sütun üzerine yükleyin. Sütun dokunun açın ve örnek Silis jeli absorbe sağlar.
    8. Adım 2.2.7 iki kez daha tekrarlayın.
    9. Dikkatle hexanes (~ 20 mL) sütununu ekleyin. 2.2.4 arasındaki adımları yineleyin.
    10. Dikkatle (~ 180 mL % 15 etil asetat/hexanes çözeltisi) ekleyin. Açık musluk-in sütun ve bir gaz adaptörü kullanarak bir basınçlı hava hattı, boş ~ 2 mm lik solvent silika jel, kesirler 10 mL test tüpleri toplama yatağın üstünde bırakmak sütun bağlı.
      Not: Bu seselin izole edilmesi izin verir.
    11. Seselin 250 mL yuvarlak alt kabı içinde içeren deney tüpü kesirler birleştirmek ve bir döner buharlaştırıcı kullanarak buharlaşır (su banyo sıcaklığı: ~ 35 ° C).
      Not: TLC analiz bunu belirlemek için kullanılır ve 1.2. adımda açıklanan yordamlara kıyasen gerçekleştirilir.
    12. Dikkatle (~ 75 mL % 25 etil asetat/hexanes çözeltisi) ekleyin. Açık musluk-in sütun ve bir gaz adaptörü kullanarak bir basınçlı hava hattı, boş ~ 2 mm lik solvent silika jel, kesirler 10 mL test tüpleri toplama yatağın üstünde bırakmak sütun bağlı.
      Not: Bu izin verir (+)-izole olmak epoxysuberosin.
    13. (+) İçeren deney tüpü kesirler birleştirmek-epoxysuberosin 250 mL yuvarlak alt şişesi ve döner buharlaştırıcı kullanarak buharlaşır (su banyo sıcaklığı: ~ 35 ° C).
      Not: TLC analiz bunu belirlemek için kullanılır ve 1.2. adımda açıklanan yordamlara kıyasen gerçekleştirilir.
    14. Örnekleri izole bileşiklerin NMR spektroskopisi kullanılarak analiz edilir. 11
      Not: NMR spektroskopisi deneyler bir laboratuvar teknisyeni tarafından gerçekleştirilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Karanfil PHWE. Sıvı-sıvı ekstraksiyon adımı gerçekleştirmek çalışırken, öğrenciler (tuzlu su ilavesi genellikle etkili değildi) emülsiyonlar kez karşılaştı. Bu aşamada öğrencilerin eugenol ve acetyleugenol ayrılması eluent kompozisyon etkilerini araştırdı iken ayıran hunide durmak karışım izin verin TLC tarafından emredildi. Bu o hekzan ya heptane ya da sıvı-sıvı ekstraksiyon adımda diklorometan ile yedek olabilir unutulmamalıdır. 9 öğrenci aseton ve Siklokekzan TLC, solvent oranı tahsis edildi ve eugenol ve acetyleugenol saf standartları ile sağlanan ve sonra TLC Analizi (Şekil 3) gerçekleştirilir. Sonuçları bir beyaz tahta üzerinde tablo ve saklama faktörü (Rf) ve optimum eluent solvent kompozisyon etkileri bir Grup Tartışması (Tablo 1) kabul edildi. Genellikle % 5 – 20 aseton/Siklokekzan 0.1-0.2 arasında ΔRf ile arasında değişiyordu öğrenciler tarafından tanımlanan optimum solvent kompozisyonlar.

TLC eluent optimizasyonu, öğrenciler kendi eugenol çekimi için döndürdü. (Esas olarak eugenol ve acetyleugenol oluşan) ham karanfil özü 4-%9 w/w izole. Bu deney ikinci oturumda, öğrenciler tarafından sıvı-sıvı ekstraksiyon ayırmak için iki büyük organik moleküllerin farklı asit-baz özelliklerini kullandı. Genellikle, acetyleugenol % 5-10 w/w ham ekstresinin bir verim içinde izole iken eugenol % 45-65 w/w ham ekstresinin bir verim içinde izole. Öğrenciler daha sonra kullanılan (yukarıda belirtildiği gibi tanımlanır) en iyi duruma getirilmiş eluent kendi özleri saf başvuru örnekleri TLC (Şekil 3) tarafından karşılaştırılması tarafından kendi sıvı-sıvı ekstraksiyon başarısını belirlemek için. Fourier dönüşümü kızılötesi (FTIR) spektroskopisi gerçekleştirerek öğrenciler de kendi ham karanfil özü ve onların saf eugenol ve acetyleugenol örnekleri analiz. 9 su veya solvent dorukları bazen IR spectra kötü yürütülen çalışma yordamları (ya da zavallı numune hazırlama) nedeniyle gözlenmiştir.

İleri seviyedeki öğrenciler yaklaşık yarısı onların izole ham petrol yukarıda açıklanan sıvı-sıvı ekstraksiyon taahhüt ve diğer bölüme flaş sütun Kromatografi (daha fazla bilgi destek bilgilerini verilmiştir) tabi. Sıvı-sıvı ekstraksiyon ve flaş sütun Kromatografi adımları tek bir dört saatlik oturumda Tamamlanıyor oldukça iddialı gibi görünse bu bu deney üstlenen gelişmiş öğrencilere çoğu için ulaşılabilir. Acetyleugenol flaş sütun Kromatografi tarafından tam ayrılması eugenol ve onların yakın tutma faktörler (Şekil 4) nedeniyle nadiren sağlanır. Ancak, öğrenciler genellikle saf eugenol içeren birkaç kesirleri toplamak başardık. İleri seviyedeki öğrenciler daha sonra onların rapor bir parçası olarak iki farklı arıtma teknik yorum istendi.

PHWE, Correa reflexa. Öğrenciler Correa reflexa PHWE laboratuvar eğitmen en az yardımı ile yapılır. Sıvı-sıvı ekstraksiyon adım sırasında genellikle emülsiyonlar oluşmuş ve öğrenciler sık sık HCI'yi huni (~0.25 h) stand karışımı karışımı bir cam çubuk ile periyodik ajitasyon ile izin vermek için gerekli idi. Ham özü kromatografik arıtma konforlu öğrenciler tarafından dört saatlik laboratuvar oturum içinde tamamlandı. Seselin ve (+)-epoxysuberosin sırasıyla ilâ %1,1 w/w ve % 0,9 w/w, verimi izole ve her iki bileşiklerin izole örnekleri 1H ve 13C NMR ve FTIR spektroskopisi (Şekil 2) tarafından analiz. Öğrenciler FTIR spektroskopisi deneyler ve NMR spektroskopisi için hazırlanan örneklere üstlendi iken, Laboratuar teknisyenleri NMR spektroskopisi deneyler yapılır. Öğrenciler tarafından elde edilen sonuçlar daha önce yayımlanmış çalışma ile tutarlı edildi. 11

Bu uygulamada, bu raporda sunulmuştur değil, ancak bu deneme de çıkarma yapmak için öğrenciler (daha fazla bilgi desteklemek için sağlanan PHWE istihdam araştırılmamıştır bir bitki türü zorluklar bir ikinci bölümü özellikleri bilgi).

Figure 1
Şekil 1. Karanfil PHWE. 9 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2. PHWE, Correa reflexa. 11 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 . Bir öğrenci tarafından hazırlanan bir temsilcisi TLC plaka. (% 10 aseton / Siklokekzan elüsyon). Lane 1 (E): eugenol standart; Lane 2 (ham): ham karanfil özü; Lane 3 (A): acetyleugenol standart). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

aseton / Siklokekzan (%v/v) Asetil-eugenol Rdemekf Asetil-eugenol Rf (σ) Eugenol R demekf Eugenol Rf (σ) ΔRdemekf TLC analizleri sayısı
0 0,06 0,08 0,04 0,06 0,02 12
5 0,34 0,11 0,27 0,09 0,07 15
10 0,45 0,07 0,34 0,05 0,12 20
20 0.51 0,07 0,41 0,06 0,10 20
30 0,58 0,10 0,49 0,12 0,10 19
40 0,63 0,08 0.56 0,08 0,07 16
50 0,76 0,08 0,73 0,08 0.03 17
60 0.77 0,13 0,73 0,15 0,04 12
70 0,84 0,13 0,81 0,13 0.03 11
80 0,90 0,06 0,87 0,08 0,02 10
90 0,88 0,06 0,87 0,05 0,01 11
100 0,87 0,13 0.86 0,14 0,02 6

Tablo 1. Eluent kompozisyon Rfüzerinde etkisi özetleyen saklama faktörleri tablo.

Figure 4
Şekil 4 . Öğrenciler tarafından hazırlanan temsilcisi TLC plakaları. Sol: sıvı-sıvı ekstraksiyon adım sonucunu analiz TLC plaka (% 10 aseton / Siklokekzan elüsyon). Lane 1 (E): eugenol referans standardı; Lane 2 (LEB): eugenol içeren organik ayıklamak; Lane 3 (A): acetyleugenol referans standardı; Lane 4 (LEN): acetyleugenol içeren organik özü. Sağ: flaş sütun Kromatografi adım sonucunu analiz TLC plaka (% 10 aseton / Siklokekzan elüsyon). TLC plaka numaraları tüp kesir numarasıyla ilgilidir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Eugenol karanfil gelen buhar damıtma tarafından izole klasik yordamı Sydney Üniversitesi ara kimya laboratuvar programı'nın parçası onlarca yıl olmuştur ama PHWE metodoloji (Şekil 1) 2016 yılında istihdam için modernize. 9 , 18 bu sayı bir yarar sağladı. İlk olarak, ev espresso makineleri laboratuvar ortamında hemen kullanan hayran ve geleneksel bir bilimsel çalışma etkisi için klasik olmayan, alternatif bir yöntem uygulanması gösteren öğrenciler meşgul. Buna ek olarak, bu yeni yöntem ayıklanmasını tamamlamak için geçen süre azaltılmış ve ek egzersizleri birleşme deney bu yeni yineleme içine etkin. Özellikle, bu ince katmanlı Kromatografi (TLC) tanıttı olabilir (ve sütun Kromatografi gelişmiş öğrenciler için flash için) izin verdi.

Gibi bir tanıtım laboratuvar deneyim ikinci sınıf lisans Kimya öğrenciler için ve bu nedenle bu özellikleri yorumlayan öğretim yöntemleri karanfil PHWE üzerinde odaklanan deney tasarlanmıştır. 9 bu daha kuralcı tarifi tarzı yordamı organik kimya verimli eugenol çekme--dan karanfil tamamlamak için biraz sınırlı deneyimi olan öğrenciler sağlar. Bu deneyde, asit-baz ayıklama kromatografi için uygun eluent kompozisyon ve bir döner buharlaştırıcı kullanımını belirlemek için TLC kullanan asidik bileşiklerin gibi kavramları tanıttı veya on-line öncesi laboratuar video birleşimi ile güçlendirilmiş Eğitim ve yüze gösteriler. İki ayrılmış oturumları sırasında üstlenilen tamamlayıcı bileşenleri, Gelişmiş Akış Aracı Kimya öğrencileri da eugenol ve acetyleugenol sütun Kromatografi tarafından ayrılmış ve ayıklanan bileşenleri kimliğini tespit TLC kullanarak. İkinci oturumda, öğrencilerin eleştirel iki ayırma yöntemleri karşılaştırabilirsiniz. Genel olarak, öğrenciler en az öğretim ile ayrılmış iki dört saatlik süreler içinde genel deneme tamamlamak başardık.

PHWE ve yalıtım seselin ve (+) üzerinde odaklanan deneme-epoxysuberosin Correa reflexa dan daha tecrübeli öğrenciler üç yıllık lisans Kimya öğrencileri için geliştirilmiştir. Özellikle, bu öğrenme egzersiz araştırma laboratuvarı kaynaklanan bir çalışma sonucu olmuştur. 11 deneme ilk yinelemesi üçüncü sınıf lisans kimya laboratuvar programına Tazmanya Üniversitesi, 2015 yılında dahil oldu. Gözden geçirip düzeltme ve yeniden değerlendirme iki yıl sonra bu deney 2017 üçüncü kez bir üçüncü sınıf lisans sınıfı tarafından gerçekleştirildi.

Bu deney, özellikle bazı doğal ürünler araştırma laboratuvarları ve özellikleri en az yazılı talimatlar yaklaşımlar benzetimini yapmak için çaba göstermektedir rehberlik araştırmaya dayalı bir etkinlik olarak tasarlanmıştır. Bu bir öğrenci yönlendirilmiş öğrenme deneyimi ve laboratuvar eğitmen deneme gerektiği gibi yön sağlayarak çalışırken öğrencilere yardımcı önemli bir rol oynar. Bu deneyde, öğrenciler Kromatografi anahtar laboratuvar becerileri geliştirmek ve NMR spektroskopisi yapısı aydınlatma gerçekleştirmek için kullanır. Bu laboratuvar deneyimi sınıf öğrencilerine sunulan bioprospecting kavramı pekiştirir ve bu-ebilmek var olmak erişmek için doğal ürünler daha temsili bir deneyim sunmak için daha önce hazırlanmadan bitki materyali üzerinde çalışmalar bioprospecting. C. reflexa bir Avustralya endemik bitki türleri, ancak, bu örnek diğer karasal bitki türleri bu deneyde uygun yaprak malzeme için yedek olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Yazarlar Doğal Bilimler - kimya, Tazmanya Üniversitesi ve kimya okul, University of Sydney mali destek için kabul. B.J.D. ve J.J. Avustralya hükümeti araştırma eğitim programı bursu için teşekkür ederiz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
espresso machines Breville/Sunbeam Breville espresso machine model 800ES / Sunbeam EM3820 Café Espresso II
rotary evporators Buchi and Heidolph
cloves (plant material) Dijon Food Pty Ltd Cloves must be ground in a food processor for students.
Correa reflexa (plant material) sample obtained in Tasmania Sample collected from mature shrubs in the Thomas Crawford Reserve at the University of Tasmania
sand Ajax 1199
ethanol Redoc Chemicals E95 F3
hexanes Ajax 251
magnesium sulfate Ajax 1548
diethyl ether Merck 1009215000
silica on aluminium TLC plates Merck 1055540001
eugenol Merck 1069620100
eugenyl acetate Aldrich W246905
acetone Redox Chemicals Aceton13
cyclohexane ChemSupply CA019
silica gel 60 Trajan 5134312 40 - 63um (230-400mesh)
Congo red paper ChemSupply IS070-100S
32% hydrochloric acid Ajax 256

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Newman, D. J., Cragg, G. M. Natural Products as Sources of New Drugs from 1981 to 2014. Journal of Natural Products. 79, 629-661 (2016).
  2. Barnes, E. C., Kumar, R., Davis, R. A. The use of isolated natural products as scaffolds for the generation of chemically diverse screening libraries for drug discovery. Natural Product Reports. 33, 372-381 (2016).
  3. DeCorte, B. L. Underexplored Opportunities for Natural Products in Drug Discovery. Journal of Medicinal Chemistry. 59, 9295-9304 (2016).
  4. Bucar, F., Wube, A., Schmid, M. Natural product isolation - how to get from biological material to pure compounds. Natural Product Reports. 30, 525-545 (2013).
  5. Sticher, O. Natural product isolation. Natural Product Reports. 25, 517-554 (2008).
  6. Just, J., Deans, B. J., Olivier, W. J., Paull, B., Bissember, A. C., Smith, J. A. New Method for the Rapid Extraction of Natural Products: Efficient Isolation of Shikimic Acid from Star Anise. Organic Letters. 17, 2428-2430 (2015).
  7. Caprioli, G., Cortese, M., Cristalli, G., Maggi, F., Odello, L., Ricciutelli, M., Sagratini, G., Sirocchi, V., Tomassoni, G., Vittori, S. Optimization of espresso machine parameters through the analysis of coffee odorants by HS-SPME-GC/MS. Food Chemistry. 135, 1127-1133 (2012).
  8. Just, J., Jordan, T. B., Paull, B., Bissember, A. C., Smith, J. A. Practical isolation of polygodial from Tasmannia lanceolata: a viable scaffold for synthesis. Organic Biomolecular Chemistry. 13, 11200-11207 (2015).
  9. Just, J., Bunton, G. L., Deans, B. J., Murray, N. L., Bissember, A. C., Smith, J. A. Extraction of Eugenol from Cloves Using an Unmodified Household Espresso Machine: An Alternative to Traditional Steam Distillation. Journal of Chemical Education. 93, 213-216 (2016).
  10. Deans, B. J., Bissember, A. C., Smith, J. A. Practical Isolation of Asperuloside from Coprosma quadrifida via Rapid Pressurised Hot Water Extraction. Australian Journal of Chemistry. 69, 1219-1222 (2016).
  11. Deans, B. J., Just, J., Chetri, J., Burt, L. K., Smith, J. N., Kilah, N. L., de Salas, M., Gueven, N., Bissember, A. C., Smith, J. A. Pressurized Hot Water Extraction as a Viable Bioprospecting Tool: Isolation of Coumarin Natural Products from Previously Unexamined Correa (Rutaceae). ChemistrySelect. 2, 2439-2443 (2017).
  12. Deans, B. J., Olivier, W. J., Girbino, D., Bissember, A. C., Smith, J. A. Extraction of carboxylic acid-containing diterpenoids from Dodonaea viscosa via pressurised hot water extraction. Fitoterapia. 126, 65-68 (2018).
  13. Deans, B. J., Kilah, N. L., Jordan, G. J., Bissember, A. C., Smith, J. A. Arbutin Derivatives Isolated from Ancient Proteaceae: Potential Phytochemical Markers Present in Bellendena, Cenarrhenes and Persoonia Genera. Journal of Natural Products. 81, 1241-1251 (2018).
  14. Deans, B. J., Tedone, L., Bissember, A. C., Smith, J. A. Phytochemical profile of the rare, ancient clone Lomatia tasmanica and comparison to other endemic Tasmanian species L. tinctoria and L. polymorpha. Phytochemistry. 153, 74-78 (2018).
  15. Deans, B. J., Skierka, B., Karagiannakis, B. W., Vuong, D., Lacey, E., Smith, J. A., Bissember, A. C. Siliquapyranone: a Tannic Acid Tetrahydropyran-2-one Isolated from the Leaves of Carob (Ceratonia siliqua) by Pressurised Hot Water Extraction. Australian Journal of Chemistry. 71, (2018).
  16. Olivier, W. J., Kilah, N. L., Horne, J., Bissember, A. C., Smith, J. A. ent-Labdane Diterpenoids from Dodonaea viscosa. Journal of Natural Products. 79, 3117-3126 (2016).
  17. Rihak, K. J., Bissember, A. C., Smith, J. A. Polygodial: A viable natural product scaffold for the rapid synthesis of novel polycyclic pyrrole and pyrrolidine derivatives. Tetrahedron. 74, 1167-1174 (2018).
  18. Ntamila, M. S., Hassanali, A. Isolation of Oil of Clove and Separation of Eugenol and Acetyl Eugenol. Journal of Chemical Education. 53, 263 (1976).
  19. Still, W. C., Kahn, M., Mitra, A. Rapid chromatographic technique for preparative separations with moderate resolution. Journal of Organic Chemistry. 2923-2925 (1978).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics