Einsatz von unter Druck stehenden Heißwasserextraktion (PHWE), Naturstoffchemie im Grundstudium Labor zu erkunden

* These authors contributed equally
JoVE Journal
Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Hier beschäftigen wir eine heißes Wasser unter Druck (PHWE) Extraktionsmethode, die was eine unveränderte Haushalts Espressomaschine nutzt um Studenten Naturstoffchemie im Labor näher zu bringen. Zwei Experimente werden vorgestellt: PHWE Eugenol und Acetyleugenol aus Nelken und PHWE Seselin und (+)-Epoxysuberosin von der australischen Pflanze Correa Reflexa.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Ho, C. C., Deans, B. J., Just, J., Warr, G. G., Wilkinson, S., Smith, J. A., Bissember, A. C. Employing Pressurized Hot Water Extraction (PHWE) to Explore Natural Products Chemistry in the Undergraduate Laboratory. J. Vis. Exp. (141), e58195, doi:10.3791/58195 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Eine neu entwickelte Hot-Druckwasser-Extraktion (PHWE)-Methode, die nutzt eine unveränderte Haushalts Espressomaschine um Naturprodukte Forschung zu erleichtern hat auch Anwendungen als wirksame Lehrmittel gefunden. Insbesondere wurde diese Technik zur zweiten und dritten Jahr Studenten Aspekte der Naturstoffchemie im Labor vorstellen. In diesem Bericht werden zwei Experimente vorgestellt: das PHWE Eugenol und Acetyleugenol aus Nelken und PHWE Seselin und (+)-Epoxysuberosin von der australischen endemische Pflanzenarten Correa Reflexa. Durch den Einsatz von PHWE in diesen Experimenten, erhielt die rohen Nelke-Extrakt, Eugenol und Acetyleugenol, bereichert in 4-9 % w/w aus Nelken vom zweiten Jahr Studenten und Seselin und (+)-Epoxysuberosin wurden Renditen von bis zu 1,1 % w/w und 0,9 % w/w aus isoliert C. Reflexa durch dritte Studienjahr. Die ehemalige Übung wurde entwickelt als Ersatz für das traditionelle Dampf-Destillation-Experiment bietet eine Einführung in die Extraktion und Trennung Techniken, während diese Tätigkeit geführte Untersuchung Lehrmethoden in einer Bemühung vorgestellten zu simulieren Naturprodukte Bioprospektion. Dies ist in erster Linie auf die schnelle Natur dieser PHWE Technik im Vergleich zu traditionellen Extraktionsmethoden, die oft unvereinbar mit der Zeitknappheit Bachelor Laborexperimente zugeordnet sind. Diese schnelle und praktische PHWE-Methode kann verwendet werden, um verschiedene Klassen von organischen Molekülen aus einer Reihe von Pflanzenarten effizient zu isolieren. Auch die Komplementarität dieser Technik im Vergleich zu herkömmlichen Methoden zuvor nachgewiesen.

Introduction

Die Isolierung und Identifizierung von Naturprodukten sind von grundlegender Bedeutung für die wissenschaftliche Gemeinschaft und die Gesellschaft im Allgemeinen. 1 Bioprospektion, die Suche nach wertvollen organischen Molekülen in der Natur, bleibt ein unverzichtbarer Prozess bei der Entdeckung der neuen Droge führt und potenzielle Therapeutika. Es wird geschätzt, dass ~ 75 % der alle zugelassenen niedermolekulare Medikamente wurden von 1981 bis 2014, Naturprodukte, natürliche Produkt abgeleitet oder natürliche Produkt inspirierte. 1 im übrigen Naturprodukte besitzen enorme strukturelle und chemische Vielfalt. Aus diesem Grund stellen sie auch wertvolle chemische Gerüste, die direkt in der organischen Synthese oder bei der Entwicklung von chiralen Liganden und Katalysatoren verwendet werden können. 2 , 3

Traditionell wurden relativ zeitintensive Verfahren wie Mazeration, Soxhlet-Extraktion und Wasserdampf-Destillation die Hauptstütze der Forschung konzentrierte sich auf die Isolierung von Sekundärmetaboliten aus Pflanzen. 4 modernere Extraktionstechniken, einschließlich beschleunigte Lösemittelextraktion konzentrierten sich auf die Extraktion verkürzen und Schaffung grüner Protokolle. 4 , 5 im Jahr 2015 wurde eine Originalmethode heißes Druckwasser-Extraktion (PHWE) berichtet. 6 diese Technik verwendet eine unveränderte Haushalt Espresso-Maschine, die schnelle und vor allem effiziente Gewinnung von Shikimic Säure aus Sternanis zu erleichtern. Espresso-Maschinen wurden speziell entworfen und entwickelt, um organische Moleküle aus entsprechend gemahlenen Kaffeebohnen zu extrahieren. Dieser, diese Instrumente Wärme Wasser bei Temperaturen bis zu 96 ° C und bei Drücken von in der Regel 9 Bar zu erreichen. 7 mit diesem im Verstand ist es vielleicht nicht verwunderlich, dass Espressomaschinen genutzt werden können, um effizient Naturprodukte aus einer Palette von Pflanzenmaterial extrahieren.

Nachfolgende Studien mit einer Vielzahl von terrestrischen Pflanzen zeigten die Kapazität dieser PHWE Technik effizient Naturprodukte in einem relativ breiten Polarität zu extrahieren. 6 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 im übrigen waren Verbindungen mit etwas empfindlich Funktionsgruppen wie Aldehyde, Epoxide, Glykoside und potenziell Epimerizable Stereogenic mitten durch die Extraktion in der Regel unberührt. Die Komplementarität dieser Technik im Vergleich zu herkömmlichen Methoden wurde ebenfalls nachgewiesen. 12 , 16 das PHWE Methode wurde auch eingesetzt, um Multi-Gramm-Mengen von natürlichen Produkten, die verwendet wurden, um neuartige Naturprodukt Derivate vorzubereiten und in komplexen Moleküls Synthese allgemein zu isolieren. 8 , 11 , 17

Es wurde festgestellt, dass diese neue PHWE Methode als nützliche Lehrmittel dienen könnte, die im Grundstudium Labor integriert werden konnte. Dies ist in erster Linie auf die schnelle Natur dieser Technik im Vergleich zu traditionellen Extraktionsmethoden, die oft unvereinbar mit der Zeitknappheit Bachelor Laborexperimente zugeordnet sind. Folglich, verdrängt diese Technik der traditionellen Bachelor Chemie-Labor-Experiment konzentrierte sich auf die Gewinnung von Eugenol aus Nelken mit Dampf-Destillation an der University of Tasmania. 9 , 18 seit dieser Zeit Variationen dieses Experiments angenommen von anderen Universitäten und eine modifizierte Experiment mit Schwerpunkt auf das PHWE Knoblauchzehen nun Funktionen im Bachelor Chemie-Labor-Programm an der University of Sydney (vide infra ).

Um die Zweckmäßigkeit und Durchführbarkeit der Einsatz dieser neuen PHWE Ansatzes für Unterrichtszwecke zu demonstrieren, sind zwei Protokolle im Rahmen dieser Studie präsentiert. Der erste Teil dieses Berichts unterstreicht ein Experiment auf das PHWE Eugenol und Acetyleugenol aus Nelken ist Teil des zweiten Studienjahres Bachelor Labor-Programms an der University of Sydney (Abbildung 1). Dieses Experiment dient der Naturstoffchemie Studenten vorzustellen, während grundlegende praktische Fähigkeiten zu entwickeln. Der zweite Teil bietet ein Experiment auf das PHWE der australischen endemische Pflanzenarten Correa Reflexa ist Teil des Programms dritten Studienjahr Bachelor Labor an der University of Tasmania (Abbildung 2). Dieses Experiment soll Naturprodukte Bioprospektion zu simulieren und Kern-Labor-Techniken zu verstärken. 11

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Hinweis: Es ist ratsam, dass alle Eingriffe in einem Abzug durchgeführt werden. Studenten tragen geeigneten persönlichen Schutzausrüstung zu allen Zeiten im Labor und die Sicherheitsdatenblätter (SDB) zugeordnete jedes Reagens müssen vor Gebrauch konsultiert werden.

1. PHWE Nelken: Isolation von Eugenol und Acetyleugenol

  1. Gewinnung von Eugenol und Acetyleugenol aus Nelken
    1. Legen Sie grob gemahlene Nelken (12,5 g) in einen 250-mL-Becherglas.
    2. Die Knoblauchzehe schleift Sand (12,5 g) hinzufügen und gut verrühren.
    3. Sammeln Sie ein Siebträger (Probenraum) zu und laden Sie den Korb mit dem gesamten Nelke-Sand-Gemisch. Die Probe mit dem Stopfer leicht zu komprimieren.
      Hinweis: Die Mischung nicht zu viel komprimieren oder Flüssigkeit fließt nicht durch.
    4. Positionieren Sie den Filterhalter in der Espresso-Maschine und platzieren Sie eine saubere 250-mL-Becherglas darunter zu. Fügen Sie eine 30 % Ethanol/H2O Lösung in den Wassertank der Espressomaschine, wenn es weniger als halb voll ist.
    5. Verwenden Sie die Espresso-Maschine, um 100 mL des Extrakts zu sammeln.
      Hinweis: Ein Kursleiter wenden der Maschine scheint verstopft werden.
    6. Lassen Sie den Filterhalter tropft zu beenden und entfernen sie dann aus der Espresso-Maschine.
      Achtung: Die schleift und Metall Umgebung wird heiß.
    7. Mit einem Spatel, die Knoblauchzehe schleift aus dem Siebträger entfernen und entsorgen in den Mülleimer.
    8. Spülen Sie die restlichen Feststoffe aus den Filterhalter mit H2O unter einem Wasserhahn in der Spüle und wieder für die nächste Person zu verwenden.
    9. Cool die Knoblauchzehe extrahieren in ein Eisbad, bis die Temperatur auf mindestens 30 ° c reduziert hat
    10. Legen Sie den Extrakt in einen 250-mL separatory Trichter, geben Sie 30 mL Hexan zu und schütteln Sie leicht.
    11. Ort der Scheidetrichter in ein Klemmring auf ein Stativ montiert und ermöglichen die wässrigen und organische Schichten zu trennen, dann sammeln die wässrige (Unterschicht) wieder in der 250-mL-Becherglas.
      Hinweis: Es dauert 10 Minuten für die Schichten zu trennen. Studierende sollten Lösungsmittel Optimierung der TLCs während des Wartens auf die erste Trennung auftreten (siehe Schritt 1.2) durchzuführen.
    12. Übertragen Sie die organische (oben) Schicht (enthält das Produkt) in eine saubere 250 mL konische Kolben, und gießen Sie dann die Bodenschicht (wässrigen) zurück in den separatory Trichter.
    13. Extrahieren Sie die wässrige Schicht weitere zwei Mal mit Hexan (2 x 30 mL).
    14. Kombinieren Sie die organische (oben) Schichten in die gleiche Flasche nach jeder Extraktion.
    15. Gießen Sie nach der dritten flüssig-flüssig-Extraktion den kombinierten organischen Extrakt in den separatory Trichter und waschen mit 100 mL H2O durch kräftig schütteln. Bio (Deckschicht) in einem sauberen 250 mL konische Kolben sammeln und trocknen durch Hinzufügen von MgSO4 und wirbeln die Küvette.
    16. Filtern Sie die daraus resultierenden Mischung durch geriffelte Filterpapier in einem Glastrichter in einem vorgewogene 250mL Rundboden Kolben enthalten.
      Hinweis: Der feste Rückstand (hydratisiert MgSO4) kann im Abfall entsorgt werden.
    17. Verdunstet das Lösungsmittel (Hexan) aus das gesammelte Filtrat mit einem Drehverdampfer (Bad Wassertemperatur: 60 ° C, Vakuum-Druck: 350 Mbar) und erneut wiegen die Flasche enthält das resultierende Öl.
  2. Optimierung der Lösungsmittelsystem Dünnschichtchromatographie (TLC)
    Hinweis: Als eine Gruppe Studenten zugeordnet werden ein Lösungsmittelsystem aus 100:0 Aceton: Cyclohexan 0:100 Aceton: Cyclohexan vom Kursleiter, das Verhältnis zu identifizieren, die die maximale Auflösung von Eugenol aus Acetyleugenol bietet.
    1. Erhalten Sie eine TLC-Referenzlösung reine Eugenol und Acetyleugenol.
      Hinweis: Die erforderlichen TLC Referenzlösungen von reinen Eugenol und Acetyleugenol wurden von Laboranten vor des Versuches vorbereitet.
    2. Markieren Sie auf einem Teller TLC eine Basislinie ~1.5 cm über dem Boden mit einem weichen Bleistift. Markieren Sie drei gleichmäßig verteilte Punkte.
    3. Verwenden Sie ein TLC-Spotter, um einen Tropfen des reinen Eugenol TLC Referenzlösung einspurig, ein Ort der reinen Acetyleugenol TLC Referenzlösung auf der dritten Spur und ein Ort des jeweils in der zweiten Spur (Co Ort) zu erkennen.
    4. Überprüfen Sie das Vorhandensein von Eugenol und Acetyleugenol auf die TLC Platte durch Anzeigen der Platte unter UV-Licht (254 nm) in der TLC Kabinett anzeigen.
      Hinweis: Es sollte kleine (1-2 mm breit) schwarze Flecken auf der Platte, wo die TLC Referenzlösungen entdeckt wurden. Gibt es keine Flecken oder Flecken, schwache, wenden Sie eine andere Stelle der TLC-Lösung bis ein schwarzen Fleck unter UV-Licht beobachtet wird.
    5. Einem sauberen, trockenen TLC Glas 10 mL der zugewiesenen Lösungsmittelgemisches hinzufügen.
      Hinweis: Sicherstellen Sie, dass die Lösungsmittel Höhe in das Glas ~ 1 cm nicht überschreitet.
    6. Mit einer Pinzette, platzieren Sie die vorbereitete TLC Platte in das TLC-Glas. Schließen Sie den Deckel des Glases.
      Hinweis: Das Lösungsmittel muss unterhalb der Grundlinie der TLC Platte liegen.
    7. Lassen Sie das Lösungsmittel, die TLC Platte zu reisen. Sobald das Lösungsmittel ~ 1 cm vom oberen Rand der Platte ist, die TLC Platte aus dem Glas mit einer Pinzette zu entfernen und die Linie der Lösungsmittel Front mit einem Bleistift markieren.
    8. Ermöglichen die Lösemittel verdunsten von TLC Platte (~ 1 min) dann einen Überblick über die TLC Platte unter UV-Licht (254 nm). Kreisen Sie mit einem Bleistift die schwarzen Flecken auf die TLC Platte beobachtet.
    9. Berechnen Sie die Aufbewahrung Faktor (Rf) Eugenol und Acetyleugenol dividiert die zurückgelegte Strecke durch die Verbindung von der zurückgelegten Strecke durch das Lösungsmittel.
    10. Berechnen Sie die Differenz zwischen der R-f -Werte für Eugenol und Acetyleugenol (ΔRf).
    11. Teilen Sie die Ergebnisse mit dem Rest der Klasse. Zeichnen Sie die Aufbewahrung Werte von anderen Studenten mit anderen Lösungsmittel Verhältnissen übernommen.
    12. Ermitteln Sie, welche Lösungsmittelsystem beste rohe Eugenol Lösung und anschliessende Reinigungsschritte zu analysieren.
      Hinweis: Das beste Lösungsmittel TLC-Verhältnis bieten die größte Trennung zwischen Eugenol und Acetyleugenol mit der größten ΔR-f -Wert bezeichnet. Wenn ΔRf gegen Lösungsmittel Zusammensetzung gezeichnet wird, sollte der Graph eine Glockenkurve ähneln.
  3. Trennung von Eugenol und Acetyleugenol durch flüssig-flüssig-Extraktion
    1. Die grobe Eugenol-haltiger Extrakt aus Schritt 1.1.17 Hexan (10 mL) hinzu, und füllen Sie die folgenden Lösung in einen 250-mL separatory Trichter.
    2. Spülen Sie den Rundboden-Kolben mit Hexan (10 mL) und fügen Sie diese an den separatory Trichter.
    3. Extrahieren Sie die Hexan Lösung mit 3 M wässriger NaOH (2 x 25 mL) über flüssig-flüssig-Extraktion. Sammle und kombiniere die wässrige unteren Schichten in einem konischen 250-mL-Kolben aus jeder Extraktion. Die organische Schicht in einem 50 mL konische Kolben sammeln und trocknen durch Hinzufügen von MgSO4 und wirbeln die Flasche.
      Achtung: NaOH ist ätzend. Vermeiden Sie den Kontakt mit der Haut.
      Hinweis: Acetyleugenol bleibt in der organischen Schicht, während Eugenol jetzt in den alkalischen wässrigen Extrakt (unteren Schichten ist).
    4. Behalten die organische Schicht (organische Lösung A) für die spätere Analyse der TLC.
    5. Wirbeln Sie die konischen Kolben, der die alkalische wässrige Fraktion aus Schritt 1.3.3 in ein Eis-Wasserbad enthält und dazugeben Sie 10 M wässrige HCl langsam, bis eine weiße Emulsion gebildet wird; Überprüfen Sie die Säure mit Kongo-rot Papier, mit einer Pipette einen Tropfen der Lösung auf pH-Papier übertragen (es sollte blau).
      Achtung: HCl ist ätzend. Vermeiden Sie den Kontakt mit der Haut. Zugabe von HCl kann kräftig sprudeln, HCl sollte hinzugefügt werden, sorgfältig, den konischen Kolben auf dem Eis zu halten.
      Hinweis: Insgesamt 20-30 mL HCl (10 M von einer wässrigen Lösung) wird erforderlich sein.
    6. Extrahieren Sie die milchige wässrige Emulsion mit Hexan (2 x 30 mL), mit flüssig-flüssig-Extraktion in einer 250 mL Flasche zu trennen. Stellen Sie sicher, dass die Temperatur des wässrigen Extraktes bei Raumtemperatur oder unten vor dem Hinzufügen der Hexan. Kombinieren Sie die zwei Hexan-Extrakte in einem sauberen 100 mL konische Kolben.
      Hinweis: Das Eugenol werden nun in der kombinierten organischen (oben) Schichten (organische Lösung B).
    7. Fügen Sie MgSO4 trocknen organische Lösung B.
    8. Analysieren Sie organische Lösung A, organische Lösung B, reine Eugenol TLC Verweis und Acetyleugenol TLC Verweis von TLC mit dem optimierten TLC Lösungsmittel Verhältnis in der vorherigen Sitzung identifiziert.
    9. Filtern Sie organische Lösung A und B durch geriffelte Filterpapier in separaten vorgewogene 250mL Rundboden Fläschchen. Entsorgen Sie den festen Rückstand (hydratisiert MgSO4) in den Abfall.
    10. Entfernen des Lösungsmittels aus der Rundboden-Kolben mit einem Drehverdampfer (Bad Wassertemperatur: 60 ° C, Vakuum-Druck: 350 Mbar).
    11. Jedem Rundboden-Kolben Diethylether (5 mL) hinzu und übertragen Sie die gereinigten Acetyleugenol (organische Lösung A) und Eugenol (organische Lösung B) in einem unbeschrifteten, preweighed Fläschchen mit einem Trichter.
    12. Spülen Sie die Flasche mit weiteren Diethylether (5 mL) in die Flasche. Verdunstet das Lösungsmittel mit einem Drehverdampfer (Bad Wassertemperatur: 50 ° C, Vakuumdruck 800 Mbar) mit einem Fläschchen Zubehör. Aufzeichnen des Ertrags und das Fläschchen entsprechend beschriften.
    13. Analysieren Sie organische Lösung A, organische Lösung B, reine Eugenol TLC Verweis und Acetyleugenol TLC Verweis von TLC mit dem optimierten TLC Lösungsmittel Verhältnis in der vorherigen Sitzung identifiziert.
      Hinweis: Wässrige Lösungen können in den Ausguss für Entsorgung gegossen werden. Hexan und Äther Abfälle sollten in den nicht-Chlorierte organische Abfall Flaschen entsorgt werden.

2. PHWE Correa Reflexa : Isolierung von Seselin und (+)-Epoxysuberosin

  1. Sitzung 1. PHWE Correa reflexa
    1. Mahlen Sie Correa Reflexa Blätter (10 g) in eine elektrische Gewürz Mühle, und übertragen Sie dann das Boden Pflanzenmaterial auf eine 250-mL-Becherglas.
      Hinweis: Das Schleifen sollte 20-30 Sekunden dauern.
    2. Fügen Sie ~ 2 g aus grobem Sand, die Becher mit Pflanzenmaterial.
    3. Mix und Pack in den Korb von den Filterhalter (Probenraum). Komprimieren Sie die Probe mit dem Stopfer.
      Hinweis: Packen Sie die Probe nicht zu fest.
    4. Die Espresso-Maschine-Tank ~ 300 mL 35 % Ethanol/H2O Lösung hinzufügen.
    5. Positionieren Sie den Filterhalter in der Espresso-Maschine und platzieren Sie eine saubere 250-mL-Becherglas darunter zu.
    6. ~ 100 mL Extrakt zu sammeln, ~ 1 Minute warten und dann eine weitere 100 mL zu sammeln.
      Achtung: Die Maschine und die Extrakte an dieser Stelle wird heiß.
    7. Diese Mischung im Eisbad abkühlen und verdunsten das Ethanol mit einem Drehverdampfer (Bad Wassertemperatur: ~ 40 ° C).
    8. Wässrigen Extrakt zu einem separatory Trichter zu übertragen und mit Ethylacetat (4 x 50 mL) zu extrahieren.
      Hinweis: Zeit kann erforderlich sein, um Emulsionen zu trennen zwischen Extraktionen zu ermöglichen.
    9. Kombinieren der Bio-Extrakte, trocknen durch Zugabe von MgSO4 und Verwirbelung der Küvette, Filtern mit einem gesinterten Glastrichter und verdampfen mit einem Drehverdampfer (Bad Wassertemperatur: ~ 35 ° C) zu den rohen Extrakt.
    10. Ein 1H-Kernspinresonanz (NMR)-Spektrum zu erhalten (siehe Kursleiter für Hilfe). 11
    11. Führen Sie TLC Analyse des rohen Extraktes zu bestimmen, einen geeigneten Lösungsmittelsystem, die Verbindungen zu isolieren, die extrahiert wurden.
      Hinweis: TLC Analyse erfolgt analog zu Verfahren in Schritt 1.2 beschrieben.
  2. Sitzung 2. Trennung von Seselin und (+)-Epoxysuberosin von Flash-Spalte Chromatographie11,19
    Hinweis: Das folgende Protokoll beinhaltet die Verwendung von Flash-Säulenchromatographie für die Trennung von organischen Verbindungen. Bitte konsultieren Sie Instruktor zu demonstrieren, wie man eine Flash-Silica-Gel-Spalte zu packen.
    1. Ort der Spalte (~ 30 mm im Durchmesser) in einer Klemme versehen, um ein Stativ. Legen Sie einen 100-mL konische Kolben unter der Spalte.
    2. Füllen Sie die Spalte mit Silica-Gel (60 μm Flash-Klasse) auf ein Niveau von ca. 10 cm und dann die Spalte Hexanes (~ 100 mL) hinzu.
    3. Platzieren Sie ein Glasstopfen in der Spalte, entfernen Sie die Spalte aus der Klemme zu und schütteln Sie, um eine Suspension zu erhalten. Setzen Sie die Säule in die Klemme und dann lassen Sie die Mischung zu begleichen.
    4. Öffnen Sie den Hahn der Spalte und mit einem Gas-Adapter an eine Druckluftleitung, leere Spalte um ~ 2 mm des Lösungsmittels über dem Bett von Kieselgel lassen. Die Gas-Adapter zu entfernen, dann den Hahn schließen.
    5. Verwenden Sie die Hexanes gesammelt in den konischen Kolben (ca. 5 mL) Waschen Sie Silica-Gel von den Wänden der Spalte mit einer Pasteurpipette mit einer Gummiseptum ausgestattet.
    6. Wiederholen Sie Schritt 2.2.4 dann eine kleine Schicht von Sand (~ 1 cm) in der Spalte.
    7. Hinzufügen von Dichlormethan (~ 1mL) in den Kolben mit dem Rohöl aus Schritt 2.1.9 extrahieren. Laden Sie sorgfältig die anschließende Lösung auf die Säule mit einer Pasteurpipette mit einem Gummiseptum ausgestattet. Öffnen Sie den Hahn der Spalte und lassen Sie die Probe auf das Kieselgel adsorbieren.
    8. Wiederholen Sie Schritt 2.2.7 weitere zwei Male.
    9. Die Spalte sorgfältig Hexanes (~ 20 mL) hinzufügen. Wiederholen Sie Schritt 2.2.4.
    10. Hinzugeben Sie vorsichtig (~ 180 mL einer 15 % igen Ethylacetat/Hexanes Lösung). Offen befestigt der Hahn der Spalte und mit einem Gas-Adapter eine Druckluftleitung, leere Spalte um ~ 2 mm des Lösungsmittels über dem Bett von Kieselgel, die Brüche in 10-mL-Röhrchen sammeln lassen.
      Hinweis: Dies ermöglicht Seselin isoliert werden.
    11. Kombinieren Sie das Reagenzglas Brüche mit Seselin in einem 250-mL Rundboden-Kolben und verdampfen mit einem Drehverdampfer (Bad Wassertemperatur: ~ 35 ° C).
      Hinweis: TLC Analyse wird verwendet, um dies zu bestimmen und wird durch Analogie zur in Schritt 1.2 beschriebenen Verfahren durchgeführt.
    12. Hinzugeben Sie vorsichtig (~ 75 mL einer 25 % igen Ethylacetat/Hexanes Lösung). Offen befestigt der Hahn der Spalte und mit einem Gas-Adapter eine Druckluftleitung, leere Spalte um ~ 2 mm des Lösungsmittels über dem Bett von Kieselgel, die Brüche in 10-mL-Röhrchen sammeln lassen.
      Hinweis: Dadurch wird (+)-Epoxysuberosin isoliert werden.
    13. Kombinieren Sie das Reagenzglas Brüche mit (+)-Epoxysuberosin in einen 250-mL-Runde untere Kolben und verdampfen mit einem Drehverdampfer (Bad Wassertemperatur: ~ 35 ° C).
      Hinweis: TLC Analyse wird verwendet, um dies zu bestimmen und wird durch Analogie zur in Schritt 1.2 beschriebenen Verfahren durchgeführt.
    14. Proben der isolierten Verbindungen sind mittels NMR-Spektroskopie analysiert. 11
      Hinweis: NMR-Spektroskopie-Experimente werden von einem Labortechniker durchgeführt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

PHWE der Nelken. Beim Versuch, die flüssig-flüssig-Extraktionsschritt durchführen, begegnet Studenten oft Emulsionen (die Zugabe von Salzwasser in der Regel nicht wirksam war). Zu diesem Zeitpunkt wurden Studenten angewiesen, lassen Sie die Mischung in den Scheidetrichter stehen, während sie die Auswirkungen der Eluent Zusammensetzung auf die Trennung von Eugenol und Acetyleugenol untersucht von TLC. Es sei darauf hingewiesen, dass das Hexan Heptan oder Dichlormethan in der flüssig-flüssig-Extraktionsschritt ersetzt werden kann. 9 Studenten bekamen eine TLC Lösungsmittel Verhältnis von Aceton und Cyclohexan und reine Standards von Eugenol und Acetyleugenol und dann TLC Analyse (Abbildung 3) durchgeführt. Ihre Ergebnisse wurden auf einem Whiteboard tabellarisch dargestellt, und die Auswirkungen der Lösungsmittel Zusammensetzung auf der Retention-Faktor (Rf) und die optimale Laufmittel galten in einer Gruppendiskussion (Tabelle 1). Die optimale Lösungsmittel Kompositionen von Studenten in der Regel reichte von 5-20 % Aceton/Cyclohexan mit einem ΔRf zwischen 0,1-0,2 identifiziert.

Nach TLC Laufmittel Optimierung wieder mehr Studenten ihre Eugenol Extraktionen. Der Rohe Nelken Extrakt (hauptsächlich aus Eugenol und Acetyleugenol) wurde in 4-9 % w/w isoliert. In der zweiten Sitzung dieses Experiments ausgenutzt Studenten die unterschiedlichen Säure-Basen-Eigenschaften von zwei großen organischen Molekülen durch flüssig-flüssig-Extraktion zu trennen. Eugenol wurde in der Regel in einer Ausbeute von 45-65 % w/w der Rohöl-Extrakt isoliert, während Acetyleugenol eine Rendite von 5 bis 10 % w/w der Rohöl-Extrakt isoliert wurde. Studenten dann genutzt die optimierte Laufmittel (gekennzeichnet wie oben beschrieben) zu bestimmen, den Erfolg ihrer flüssig-flüssig-Extraktion durch Vergleich von deren Extrakte, die reinen Referenzproben von TLC (Abbildung 3). Schüler analysiert auch ihre rohen Nelke-Extrakt und ihre gereinigten Eugenol und Acetyleugenol Proben durch Fourier-Transform Infrarotspektroskopie (FTIR) ausführen. 9 Lösungsmittel oder Wasser Gipfel wurden gelegentlich in IR-Spektren durch schlecht ausgeführten Arbeit-Up-Verfahren (oder schlechte Probenvorbereitung) beobachtet.

Fortgeschrittene Schüler verpflichtet, etwa die Hälfte ihrer isolierten Rohöl die flüssig-flüssig-Extraktion oben beschriebenen und den andere Teil Flash-Säulenchromatographie (weitere Informationen sind in die unterstützenden Informationen entnehmen) unterzogen. Obwohl die Vollendung der flüssig-flüssig-Extraktion und Flash-Spalte Chromatographie Schritte in einer vierstündigen Sitzung ziemlich ehrgeizig erscheinen war dies für den Großteil der fortgeschrittenen Studenten dieses Experiment erreichbar. Die vollständige Trennung von Eugenol Acetyleugenol durch Flash-Säulenchromatographie wurde selten durch ihre enge Bindung Faktoren (Abbildung 4) erreicht. Studenten konnten sich jedoch in der Regel ein paar Brüche mit reinen Eugenol zu sammeln. Fortgeschrittene Schüler wurden dann gebeten, zu kommentieren, die zwei verschiedene Reinigungstechniken im Rahmen ihres Berichts.

PHWE von Correa Reflexa. Studenten durchgeführt das PHWE Correa Reflexa mit minimaler Unterstützung des Lehrers Labor. Bei der flüssig-flüssig-Extraktion Emulsionen in der Regel gebildet und Studenten oft waren erforderlich, um die Mischung in den separatory Trichter (~0.25 h) stehen unter regelmäßigen Rühren der Mischung mit einem Glasstab zu ermöglichen. Die chromatographische Reinigung des rohen Extraktes war bequem innerhalb der vier-Stunden-Labor-Sitzung von Teilnehmern beendet. Seselin und (+)-Epoxysuberosin wurden jeweils in Renditen von bis zu 1,1 % w/w und 0,9 % w/w, isoliert und analysiert wurden vereinzelte Proben der beiden Verbindungen durch 1H und 13C-NMR und FTIR-Spektroskopie (Abbildung 2). Während Studenten der FTIR-Spektroskopie-Experimenten und vorbereiteten Proben für die NMR-Spektroskopie unternahm, durchgeführt Laboranten NMR-Spektroskopie-Experimenten. Die Ergebnisse von Studenten waren konsistent mit zuvor veröffentlichte Arbeit. 11

Obwohl dies in diesem Bericht, in der Praxis nicht vorgelegt worden ist bietet dieses Experiment auch einen zweiten Teil, der Studenten die Extraktion durchführen einer Pflanzenart, mit denen nicht untersucht worden ist Herausforderungen, beschäftigt PHWE (weitere Informationen in der Unterstützung kostenfrei Informationen).

Figure 1
Abbildung 1. PHWE der Nelken. 9 Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2. PHWE von Correa Reflexa. 11 Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 . Eine repräsentative TLC Platte von einem Schüler vorbereitet. (10 % Aceton / Cyclohexan Elution). Bahn 1 (E): Eugenol standard; Bahn 2 (Rohöl): Crude Nelken Extrakt; Bahn 3 (A): Acetyleugenol standard). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Aceton / Cyclohexan (%v/v) meine Acetyl-Eugenol Rf Acetyl-Eugenol Rf (σ) meine Eugenol Rf Eugenol Rf (σ) meine ΔRf Anzahl der TLC-Analysen
0 0,06 0,08 0,04 0,06 0.02 12
5 0,34 0,11 0,27 0,09 0,07 15
10 0,45 0,07 0,34 0.05 0.12 20
20 0.51 0,07 0,41 0,06 0.10 20
30 0,58 0.10 0.49 0.12 0.10 19
40 0,63 0,08 0,56 0,08 0,07 16
50 0,76 0,08 0,73 0,08 0,03 17
60 0,77 0.13 0,73 0,15 0,04 12
70 0,84 0.13 0.81 0.13 0,03 11
80 0.90 0,06 0,87 0,08 0.02 10
90 0,88 0,06 0,87 0.05 0,01 11
100 0,87 0.13 0,86 0,14 0.02 6

Tabelle 1. Tabelle der Aufbewahrung Faktoren skizziert die Wirkung des Elutionsmittels Zusammensetzung auf Rf.

Figure 4
Abbildung 4 . Repräsentative TLC-Platten von Studenten vorbereitet. Links: Eine TLC Platte analysieren die Ergebnisse der flüssig-flüssig-Extraktionsschritt (10 % Aceton / Cyclohexan Elution). Bahn 1 (E): Eugenol Referenzstandard; Bahn 2 (LEB): Eugenol-haltigen organischen extrahieren; Bahn 3 (A): Acetyleugenol Referenz-Standard; Bahn 4 (LEN): Acetyleugenol-haltigen organischen Extrakt. Rechts: Eine TLC Platte analysieren das Ergebnis des Flash-Spalte Chromatographie Schritts (10 % Aceton / Cyclohexan Elution). Zahlen auf die TLC Platte beziehen sich auf die Nummer Testschlauch Bruchteil. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Das klassische Verfahren zur Isolierung von Eugenol aus Nelken durch Wasserdampf-Destillation ist seit Jahrzehnten Teil des Programms Mittelstufe Chemie-Labor an der Universität von Sydney aber wurde modernisiert, um PHWE Methodik im Jahr 2016 (Abbildung 1) zu beschäftigen. 9 , 18 Dies bot eine Reihe Vorteile. Erstens nutzt Haushalts Espressomaschinen in der Laborumgebung sofort fasziniert und engagierte Studenten durch die Darstellung der Anwendung einer nicht-klassischen, alternative Methode, eine traditionelle wissenschaftliche Studie zu bewirken. Darüber hinaus ist diese neue Methode reduziert die Zeit, um die Extraktion abgeschlossen und ermöglicht die Einbindung der zusätzliche Übungen in diesem neuen Iteration des Experiments. Konkret erlaubt dies Dünnschichtchromatographie (TLC) eingeführt werden (und Flash-Säulenchromatographie für Fortgeschrittene).

Das Experiment mit Schwerpunkt auf das PHWE Nelken wurde als eine einleitende Labor Erfahrung für zweiten Studienjahr Bachelor Chemiestudenten und aus diesem Grund es Funktionen erklärende Lehrmethoden konzipiert. 9 dieser mehr normativ, Rezept-Stil Verfahren können Studenten mit etwas wenig Erfahrung in der organischen Chemie, die Gewinnung von Eugenol aus Nelken effizient abzuschließen. In diesem Experiment Konzepte wie Säure-Base-Extraktion von aciden Verbindungen, Verwendung von TLC geeignet Laufmittel Zusammensetzung für die Chromatographie und die Verwendung von einem Drehverdampfer identifizieren eingeführt oder verstärkt durch eine Kombination aus Online-Pre-Lab video Ausbildung und persönliche Demonstrationen. In ergänzenden Komponenten während der zwei zugeordneten Sitzungen durchgeführt Studenten im fortgeschrittenen Stream der Vermittler Chemie auch Eugenol und Acetyleugenol durch Säulenchromatographie getrennt und bestimmt die Identität der extrahierten Komponenten Verwendung von TLC. In der zweiten Session konnten Studenten der beiden Trennverfahren kritisch vergleichen. Im Allgemeinen konnten die Schüler das allgemeine Experiment innerhalb der zugewiesenen zwei vierstündigen mit minimalen Anweisung abgeschlossen.

Das Experiment mit Schwerpunkt auf die PHWE und Isolierung von Seselin und (+)-Epoxysuberosin von Correa Reflexa für erfahrenere Schüler dritten Studienjahr Bachelor Chemiestudenten entwickelt wurde. In dieser Lernübung war ein Ergebnis einer Studie mit Ursprung im Forschungslabor. 11 die erste Iteration des Experiments wurde im dritten Studienjahr Bachelor Chemie-Labor-Programm an der University of Tasmania in 2015 aufgenommen. Nach zwei Jahren der Revisionen und Neubewertung wurde dieses Experiment von einer dritten Studienjahr Bachelor-Klasse zum dritten Mal im Jahr 2017 durchgeführt.

Dieses Experiment wurde speziell als geführte Untersuchung-basierende Tätigkeit, die sich bemüht, einige der Ansätze Naturprodukte Forschungslabors und Funktionen minimale schriftliche Anweisungen zu simulieren. Dies ist eine Erfahrung der Schüler gerichtet und die Labor-Lehrer spielt eine Schlüsselrolle bei der Unterstützung der Studenten arbeiten durch die Bereitstellung Richtung je nach Bedarf durch das Experiment. In diesem Experiment entwickeln Schlüssellabor Fähigkeiten in der Chromatographie und NMR-Spektroskopie zur Strukturaufklärung führen zu beschäftigen. Diese Laborerfahrung stärkt das Konzept der Bioprospektion der Schüler im Unterricht vorgelegt wird und dies zu Studien auf bisher unerforschte Pflanzenmaterial eine repräsentativere Erfahrung von Naturprodukten erweitert werden Bioprospektion. C. Reflexa ist eine australische endemische Pflanzenarten, aber dieses Beispiel für entsprechende Blattmaterial aus anderen terrestrischen Pflanzenarten in diesem Experiment ersetzt werden kann.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Die Autoren erkennen der School of Natural Sciences - Chemie, Universität von Tasmanien und der School of Chemistry, The University of Sydney für finanzielle Unterstützung. B.J.D. und j.j. danken die australische Regierung für Forschungsstipendien Training Programm.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
espresso machines Breville/Sunbeam Breville espresso machine model 800ES / Sunbeam EM3820 Café Espresso II
rotary evporators Buchi and Heidolph
cloves (plant material) Dijon Food Pty Ltd Cloves must be ground in a food processor for students.
Correa reflexa (plant material) sample obtained in Tasmania Sample collected from mature shrubs in the Thomas Crawford Reserve at the University of Tasmania
sand Ajax 1199
ethanol Redoc Chemicals E95 F3
hexanes Ajax 251
magnesium sulfate Ajax 1548
diethyl ether Merck 1009215000
silica on aluminium TLC plates Merck 1055540001
eugenol Merck 1069620100
eugenyl acetate Aldrich W246905
acetone Redox Chemicals Aceton13
cyclohexane ChemSupply CA019
silica gel 60 Trajan 5134312 40 - 63um (230-400mesh)
Congo red paper ChemSupply IS070-100S
32% hydrochloric acid Ajax 256

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Newman, D. J., Cragg, G. M. Natural Products as Sources of New Drugs from 1981 to 2014. Journal of Natural Products. 79, 629-661 (2016).
  2. Barnes, E. C., Kumar, R., Davis, R. A. The use of isolated natural products as scaffolds for the generation of chemically diverse screening libraries for drug discovery. Natural Product Reports. 33, 372-381 (2016).
  3. DeCorte, B. L. Underexplored Opportunities for Natural Products in Drug Discovery. Journal of Medicinal Chemistry. 59, 9295-9304 (2016).
  4. Bucar, F., Wube, A., Schmid, M. Natural product isolation - how to get from biological material to pure compounds. Natural Product Reports. 30, 525-545 (2013).
  5. Sticher, O. Natural product isolation. Natural Product Reports. 25, 517-554 (2008).
  6. Just, J., Deans, B. J., Olivier, W. J., Paull, B., Bissember, A. C., Smith, J. A. New Method for the Rapid Extraction of Natural Products: Efficient Isolation of Shikimic Acid from Star Anise. Organic Letters. 17, 2428-2430 (2015).
  7. Caprioli, G., Cortese, M., Cristalli, G., Maggi, F., Odello, L., Ricciutelli, M., Sagratini, G., Sirocchi, V., Tomassoni, G., Vittori, S. Optimization of espresso machine parameters through the analysis of coffee odorants by HS-SPME-GC/MS. Food Chemistry. 135, 1127-1133 (2012).
  8. Just, J., Jordan, T. B., Paull, B., Bissember, A. C., Smith, J. A. Practical isolation of polygodial from Tasmannia lanceolata: a viable scaffold for synthesis. Organic Biomolecular Chemistry. 13, 11200-11207 (2015).
  9. Just, J., Bunton, G. L., Deans, B. J., Murray, N. L., Bissember, A. C., Smith, J. A. Extraction of Eugenol from Cloves Using an Unmodified Household Espresso Machine: An Alternative to Traditional Steam Distillation. Journal of Chemical Education. 93, 213-216 (2016).
  10. Deans, B. J., Bissember, A. C., Smith, J. A. Practical Isolation of Asperuloside from Coprosma quadrifida via Rapid Pressurised Hot Water Extraction. Australian Journal of Chemistry. 69, 1219-1222 (2016).
  11. Deans, B. J., Just, J., Chetri, J., Burt, L. K., Smith, J. N., Kilah, N. L., de Salas, M., Gueven, N., Bissember, A. C., Smith, J. A. Pressurized Hot Water Extraction as a Viable Bioprospecting Tool: Isolation of Coumarin Natural Products from Previously Unexamined Correa (Rutaceae). ChemistrySelect. 2, 2439-2443 (2017).
  12. Deans, B. J., Olivier, W. J., Girbino, D., Bissember, A. C., Smith, J. A. Extraction of carboxylic acid-containing diterpenoids from Dodonaea viscosa via pressurised hot water extraction. Fitoterapia. 126, 65-68 (2018).
  13. Deans, B. J., Kilah, N. L., Jordan, G. J., Bissember, A. C., Smith, J. A. Arbutin Derivatives Isolated from Ancient Proteaceae: Potential Phytochemical Markers Present in Bellendena, Cenarrhenes and Persoonia Genera. Journal of Natural Products. 81, 1241-1251 (2018).
  14. Deans, B. J., Tedone, L., Bissember, A. C., Smith, J. A. Phytochemical profile of the rare, ancient clone Lomatia tasmanica and comparison to other endemic Tasmanian species L. tinctoria and L. polymorpha. Phytochemistry. 153, 74-78 (2018).
  15. Deans, B. J., Skierka, B., Karagiannakis, B. W., Vuong, D., Lacey, E., Smith, J. A., Bissember, A. C. Siliquapyranone: a Tannic Acid Tetrahydropyran-2-one Isolated from the Leaves of Carob (Ceratonia siliqua) by Pressurised Hot Water Extraction. Australian Journal of Chemistry. 71, (2018).
  16. Olivier, W. J., Kilah, N. L., Horne, J., Bissember, A. C., Smith, J. A. ent-Labdane Diterpenoids from Dodonaea viscosa. Journal of Natural Products. 79, 3117-3126 (2016).
  17. Rihak, K. J., Bissember, A. C., Smith, J. A. Polygodial: A viable natural product scaffold for the rapid synthesis of novel polycyclic pyrrole and pyrrolidine derivatives. Tetrahedron. 74, 1167-1174 (2018).
  18. Ntamila, M. S., Hassanali, A. Isolation of Oil of Clove and Separation of Eugenol and Acetyl Eugenol. Journal of Chemical Education. 53, 263 (1976).
  19. Still, W. C., Kahn, M., Mitra, A. Rapid chromatographic technique for preparative separations with moderate resolution. Journal of Organic Chemistry. 2923-2925 (1978).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics