Impiegando l'estrazione con acqua calda pressurizzata (PHWE) per esplorare la chimica di prodotti naturali in laboratorio dello studente non laureato

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Chemistry

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Summary

Qui, ci avvaliamo di un metodo di estrazione (PHWE) di acqua calda pressurizzata, che utilizza la macchina da caffè espresso per la casa non modificato per introdurre gli studenti universitari alla chimica di prodotti naturali in laboratorio. Due esperimenti sono presentati: PHWE di eugenolo e acetyleugenol da chiodi di garofano e PHWE di seselin e (+)-epoxysuberosin dalla pianta australiana Correa reflexa.

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Ho, C. C., Deans, B. J., Just, J., Warr, G. G., Wilkinson, S., Smith, J. A., Bissember, A. C. Employing Pressurized Hot Water Extraction (PHWE) to Explore Natural Products Chemistry in the Undergraduate Laboratory. J. Vis. Exp. (141), e58195, doi:10.3791/58195 (2018).

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Abstract

Un metodo di estrazione (PHWE) di acqua calda pressurizzata sviluppato di recente che utilizza la macchina da caffè espresso per la casa non modificato per facilitare la ricerca dei prodotti naturali ha trovato anche applicazioni come strumento di insegnamento efficace. In particolare, questa tecnica è stata utilizzata per introdurre gli studenti universitari secondo e terzo anno agli aspetti della chimica di prodotti naturali in laboratorio. In questo rapporto, vengono presentati due esperimenti: il PHWE di eugenolo e acetyleugenol da chiodi di garofano e il PHWE di seselin e (+)-epoxysuberosin da specie vegetali endemiche australiano Correa reflexa. Utilizzando PHWE in questi esperimenti, l'estratto grezzo spicchio, arricchita in eugenolo e acetyleugenol, è stata ottenuta in 4-9% w/w da spicchi di secondo anno laureandi e seselin e (+)-epoxysuberosin sono stati isolati in rendimenti di fino a 1,1% w/w e 0,9% w/w da C. reflexa di studenti del terzo anno. L'esercizio precedente è stato sviluppato come un sostituto per l'esperimento di distillazione di vapore tradizionale che fornisce un'introduzione alle tecniche di estrazione e separazione, mentre l'attività di quest'ultimo caratterizzato da metodi di insegnamento guidato-inchiesta nel tentativo di simulare prodotti naturali bioprospecting. Questo deriva principalmente dalla natura rapida di questa tecnica PHWE rispetto a metodi di estrazione di tipo tradizionale che sono spesso incompatibili con i vincoli di tempo connessi con gli esperimenti del laboratorio dello studente non laureato. Questo metodo PHWE rapido e pratico può essere utilizzato per isolare in modo efficiente varie classi di molecole organiche da una gamma di specie di piante. La natura complementare di questa tecnica rispetto a metodi più tradizionali, inoltre è stata dimostrata in precedenza.

Introduction

L'isolamento e l'identificazione dei prodotti naturali sono di fondamentale importanza per la comunità scientifica e la società più in generale. 1 Bioprospecting, alla ricerca di preziose molecole organiche presenti in natura, rimane un processo indispensabile nella scoperta di nuovi farmaci e agenti terapeutici potenziali. Si stima che, a partire dal 1981-2014 ~ 75% di tutti i farmaci approvati piccola molecola erano prodotti naturali, naturale prodotto derivato o naturale prodotto di ispirazione. 1 inoltre, prodotti naturali possiedono enormi diversità strutturali e chimiche. Per questo motivo, essi rappresentano anche preziosi ponteggi chimici che possono essere direttamente utilizzati nella sintesi organica o nello sviluppo di ligandi chirali e catalizzatori. 2 , 3

Tradizionalmente, relativamente dispendiose procedure come la macerazione, estrazione di Soxhlet e distillazione a vapore sono stati il cardine della ricerca incentrata sull'isolamento di metaboliti secondari da piante. 4 tecniche di estrazione più moderni, tra cui estrazione accelerata con solvente, si sono concentrati su riducendo i tempi di estrazione e stabilendo protocolli più verde. 4 , 5 nel 2015, è stato segnalato un originale metodo di estrazione (PHWE) di acqua calda pressurizzata. 6 questa tecnica impiegata una macchinetta della famiglia non modificato per facilitare l'estrazione rapida e particolarmente efficiente di acido shikimico dall'anice stellato. Macchine espresso sono stati specificamente progettate e ingegnerizzate per estrarre molecole organiche da terra in modo appropriato i chicchi di caffè. Per raggiungere questo, questi strumenti riscaldare l'acqua a temperature fino a 96 ° C e a pressioni di in genere 9 bar. 7 con questo in mente, forse non è sorprendente che macchine da caffè espresso possono essere utilizzate per estrarre in modo efficiente prodotti naturali da una fascia di materiale vegetale.

Studi successivi, che coinvolge una varietà di specie di piante terrestri hanno dimostrato la capacità di questa tecnica PHWE di estrarre in modo efficiente prodotti naturali attraverso una gamma relativamente ampia di polarità. 6 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 inoltre, composti contenenti gruppi funzionali in qualche modo sensibili, come aldeidi, epossidi, glicosidi e potenzialmente epimerizable stereogenico centri erano tipicamente influenzate dal processo di estrazione. Inoltre è stata dimostrata la natura complementare di questa tecnica rispetto a metodi più tradizionali. 12 , 16 metodo di questo PHWE è stato impiegato anche per isolare multi-grammo quantità di prodotti naturali, che sono stati utilizzati per preparare derivati romanzo prodotto naturale e nella sintesi della molecola complessa più in generale. 8 , 11 , 17

È stato identificato che questo nuovo metodo PHWE potrebbe servire come uno strumento didattico utile che poteva essere incorporato nel laboratorio dello studente non laureato. Questo deriva principalmente dalla natura rapida di questa tecnica riguardante i metodi di estrazione di tipo tradizionale che sono spesso incompatibili con i vincoli di tempo connessi con gli esperimenti del laboratorio dello studente non laureato. Di conseguenza, questa tecnica ha soppiantato l'esperimento di laboratorio di chimica laurea tradizionale incentrato sull'estrazione di eugenolo dai chiodi di garofano che impiegano la distillazione a vapore presso l'Università di Tasmania. 9 , 18 da quel momento, variazioni di questo esperimento sono state adottate da altre università e un esperimento modificato concentrandosi sul PHWE di chiodi di garofano ora caratteristiche del programma di laboratorio di chimica dello studente non laureato presso l'Università di Sydney (vide infra ).

Al fine di dimostrare la praticità e la fattibilità dell'impiego di questo nuovo approccio PHWE per fini didattici, due protocolli sono presentati nell'ambito di questo studio. La prima parte della presente relazione mette in evidenza un esperimento su PHWE di eugenolo e acetyleugenol dai chiodi di garofano, che fa parte del programma dello studente non laureato laboratorio secondo anno presso l'Università di Sydney (Figura 1). Questo esperimento serve ad introdurre gli studenti alla chimica di prodotti naturali durante lo sviluppo di abilità pratiche fondamentali. La seconda parte presenta un esperimento su PHWE di specie vegetali endemiche australiano Correa reflexa che fa parte del programma dello studente non laureato laboratorio terzo anno presso l'Università di Tasmania (Figura 2). Questo esperimento è progettato per simulare bioprospecting prodotti naturali e tecniche di laboratorio di nucleo di rafforzare. 11

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Protocol

Nota: È consigliabile che tutte le procedure vengono eseguite in una cappa aspirante. Studenti devono indossare dispositivi di protezione individuale appropriati a tutte le ore in laboratorio e le schede di sicurezza (SDS) che associate a ciascun reagente devono essere consultate prima dell'uso.

1. PHWE di chiodi di garofano: isolamento di eugenolo e acetyleugenol

  1. Estrazione di eugenolo e acetyleugenol dai chiodi di garofano
    1. Posto grossolanamente chiodi di garofano macinati (12,5 g) in un becher da 250 mL.
    2. Aggiungere sabbia (12,5 g) per la macina di chiodi di garofano e mescolare bene.
    3. Raccogliere un portafiltro (campione vano) e caricare il cestello con l'intera miscela di chiodi di garofano-sabbia. Comprimere leggermente il campione con il pressino.
      Nota: Non comprimere troppo la miscela o liquido non scorre attraverso.
    4. Posizionare il portafiltro nella macchina caffè espresso e posizionare un becher da 250 mL pulito sotto di esso. Aggiungere una soluzione al 30% etanolo/H2O al serbatoio dell'acqua della macchina espresso, se è di meno che mezzo pieno.
    5. Utilizzare la macchina espresso per raccogliere 100 mL dell'estratto.
      Nota: Consultare un istruttore se la macchina sembra essere intasato.
    6. Consentire il portafiltro finire gocciolante e quindi rimuoverlo dalla macchina caffè espresso.
      Attenzione: La macina e le aree circostanti di metallo sarà calde.
    7. Con una spatola, rimuovere la macina di chiodi di garofano dal portafiltro e gettare nel cestino dei rifiuti.
    8. Risciacquare i residui solidi dal portafiltro con H2O sotto un rubinetto nel lavandino e restituirlo per la prossima persona da utilizzare.
    9. Cool lo spicchio estrarre in un bagno di ghiaccio, fino a quando la temperatura è ridotta di almeno 30 ° C.
    10. Posizionare l'estratto in un imbuto separatore da 250 mL, aggiungere 30 mL di esano e agitare delicatamente.
    11. Posto nell'imbuto separatore in un morsetto ad anello montato su uno stand della storta e consentire gli strati acquosi ed organici di separare poi raccogliere lo strato acquoso (inferiore) nuovamente dentro il becher da 250 mL.
      Nota: Può prendere per 10 minuti per i livelli separare. Gli studenti sono invitati a eseguire Ottimizzazione solvente di TLCs durante l'attesa per la prima separazione si verificano (vedere i passaggi 1.2).
    12. Trasferire lo strato organico (superiore) (che contiene il prodotto) in una beuta pulito 250 mL e poi versare lo strato di fondo (acquoso) nuovamente dentro l'imbuto separatore.
    13. Estrarre lo strato acquoso un ulteriore due volte con esano (2 x 30 mL).
    14. Combinare gli strati organici (superiori) nel pallone stesso dopo ogni estrazione.
    15. Dopo la terza estrazione liquido-liquido, versare l'Estratto organico combinato nell'imbuto separatore e lavare con 100 mL di H2O agitando vigorosamente il flacone. Raccogliere lo strato organico (in alto) in una beuta da 250 mL pulito e asciutto aggiungendo MgSO4 e agitando la beuta.
    16. Filtrare la miscela che ne derivano attraverso carta da filtro scanalato in contenuto in un imbuto di vetro in un pre-pesato pallone da 250mL.
      Nota: Il residuo solido (idrata MgSO4) può essere scartato nei rifiuti.
    17. Far evaporare il solvente (esano) dal filtrato raccolto utilizzando un evaporatore rotante (bagno temperatura acqua: 60 ° C, pressione di vuoto: 350 mbar) e ripesare la beuta contenente l'olio risultante.
  2. Ottimizzazione del sistema solvente di cromatografia di strato sottile (TLC)
    Nota: Come un gruppo, gli studenti verranno assegnati un sistema solvente da 100:0 acetone: cicloesano a 0:100 acetone: cicloesano dall'istruttore per identificare il rapporto che fornisce la risoluzione massima di eugenolo da acetyleugenol.
    1. Ottenere una soluzione di riferimento di TLC di eugenolo puro e acetyleugenol.
      Nota: Le soluzioni di riferimento di TLC necessarie di eugenolo puro e acetyleugenol sono state preparate dai tecnici di laboratorio prima della sessione di laboratorio.
    2. Su un piatto di TLC, segnare una linea di base ~1.5 cm dal fondo con una matita morbida. Tracciare tre punti equidistanti.
    3. Utilizzare uno spotter TLC per individuare una goccia della soluzione di riferimento di puro eugenolo TLC in una corsia, uno spot di soluzione di riferimento di puro acetyleugenol TLC in terza corsia e un posto di ciascuno nella seconda corsia (co-posto).
    4. Verificare la presenza di eugenolo e acetyleugenol sulla piastra TLC visualizzando la piastra sotto una lampada UV (254 nm) in TLC visualizzazione mobile.
      Nota: Dovrebbe esserci macchie nere piccole (1-2 mm di larghezza) sulla piastra dove le soluzioni di riferimento di TLC sono state avvistate. Se ci sono macchie o le macchie appaiono sbiadite, applicare un altro punto della soluzione appropriata di TLC fino a quando si osserva una macchia nera sotto la luce UV.
    5. Aggiungere 10 mL della miscela solvente allocata a un barattolo di TLC pulito e asciutto.
      Nota: L'altezza di solvente nel vaso non superi ~ 1 cm.
    6. Con una pinzetta, posizionare la piastra di TLC preparata nel vaso del TLC. Chiudere il coperchio del barattolo.
      Nota: Il solvente deve trovarsi di sotto della linea di base della piastra TLC.
    7. Consentire il solvente viaggiare la piastra di TLC. Una volta che il solvente è ~ 1 cm dalla parte superiore della piastra, rimuovere la piastra di TLC dal vaso con le pinzette e segna la linea del fronte del solvente con una matita.
    8. Il solvente evapora dalla piastra di TLC (~ 1 min) e poi Mostra la piastra di TLC sotto una lampada UV (254 nm). Con una matita, cerchio le macchie nere osservate sulla piastra di TLC.
    9. Calcolare il coefficiente di conservazione (Rf) di eugenolo e acetyleugenol dividendo la distanza percorsa dal composto dalla distanza percorsa dal solvente.
    10. Calcolare la differenza tra i valori dif R per eugenolo e acetyleugenol (ΔRf).
    11. Condividere i risultati con il resto della classe. Registrare i valori di ritenzione acquistati dagli altri studenti con altri rapporti di solventi.
    12. Identificare quale sistema solvente sarà migliore per analizzare la soluzione grezza eugenolo e passaggi di purificazione successiva.
      Nota: Il miglior rapporto solvente TLC fornirà la massima separazione tra eugenolo e acetyleugenol indicato con il valore dif ΔR più grande. Se ΔRf è tracciata contro composizione solvente, il grafico dovrebbe essere simile a una curva a campana.
  3. Separazione di eugenolo e acetyleugenol di estrazione liquido-liquido
    1. Aggiungere l'estratto grezzo contenenti eugenolo, ottenuto dal passaggio 1.1.17 esano (10 mL) e versare la soluzione che ne derivano in un imbuto separatore da 250 mL.
    2. Risciacquare il pallone con esano (10 mL) e aggiungere a questo l'imbuto separatore.
    3. Estrarre la soluzione di esano con 3 M NaOH acquoso (2 x 25 mL) tramite estrazione liquido-liquido. Raccogliere e combinare gli strati di fondo acquoso in una beuta da 250 mL da ogni estrazione. Raccogliere lo strato organico in una beuta da 50 mL e asciugare aggiungendo MgSO4 e agitando la beuta.
      Attenzione: NaOH è corrosivo. Evitare il contatto con la pelle.
      Nota: Acetyleugenol rimane nello strato organico, mentre l'eugenolo è ora nell'estratto acquoso alcalino (strati di fondo).
    4. Mantenere l'organico strato (soluzione organica A) per un'analisi successiva di TLC.
    5. Agitare il matraccio conico contenente la frazione acquosa alcalina dal punto 1.3.3 in un bagno di acqua e ghiaccio e lentamente aggiungere 10 M HCl acquoso fino a formare un'emulsione bianca; controllare l'acidità con la carta di colore rosso di Congo, utilizzando una pipetta per trasferire una goccia della soluzione sulla carta pH (dovrebbe girare blu).
      Attenzione: HCl è corrosivo. Evitare il contatto con la pelle. Aggiunta di HCl può causare bolle vigoroso, HCl dovrebbe aggiungersi con attenzione, mantenere il matraccio conico su ghiaccio.
      Nota: Un totale di 20-30 mL di HCl (10 M di una soluzione acquosa) sarà richiesto.
    6. Estrarre l'emulsione acquosa latteo con esano (2 x 30 mL), mediante estrazione liquido-liquido in un separatore beuta da mL 250. Assicurarsi che la temperatura dell'estratto acquoso sia a temperatura ambiente o inferiore prima di aggiungere l'esano. Combinare i due estratti di esano in una beuta da mL 100 pulito.
      Nota: L'eugenolo sarà ora nella combinata organici (top) strati (soluzione organica B).
    7. Aggiungere MgSO4 per asciugare la soluzione organica B.
    8. Analizzare organica soluzione A, soluzione organica B, riferimento TLC puro eugenolo e riferimento TLC acetyleugenol da TLC usando il rapporto solvente ottimizzato a TLC identificato nella sessione precedente.
    9. Filtro soluzione organica A e B attraverso carta da filtro scanalata in separata palloni a turno-fondo 250mL pre-pesati. Scartare il residuo solido (idrata MgSO4) nei rifiuti.
    10. Rimuovere il solvente dai palloni turno-fondo utilizzando un evaporatore rotante (bagno temperatura acqua: 60 ° C, pressione di vuoto: 350 mbar).
    11. Aggiungere etere etilico (5 mL) per ogni pallone e trasferire la acetyleugenol purificata (soluzione organica A) ed eugenolo (soluzione organica B) in una fiala senza etichetta, prepesata utilizzando un imbuto.
    12. Risciacquare la beuta con ulteriore di etere etilico (5 mL) nel flaconcino. Far evaporare il solvente mediante evaporatore rotante (acqua temperatura del bagno: 50 ° C, pressione di vuoto 800 mbar) con allegato un flaconcino. Registrare la resa ed etichettare il flacone in modo appropriato.
    13. Analizzare organica soluzione A, soluzione organica B, riferimento TLC puro eugenolo e riferimento TLC acetyleugenol da TLC usando il rapporto solvente ottimizzato a TLC identificato nella sessione precedente.
      Nota: Soluzioni acquose possono essere versate nel lavandino per lo smaltimento. Esano ed etere rifiuti devono essere smaltiti nelle bottiglie dei rifiuti organiche non clorurati.

2. PHWE di Correa reflexa : isolamento di seselin e (+)-epoxysuberosin

  1. Sessione 1. PHWE di Correa reflexa
    1. Macinare Correa reflexa foglie (10 g) in un macinino elettrico delle spezie e quindi trasferire il materiale vegetale di terra in un becher da 250 mL.
      Nota: Rettifica dovrebbe prendere 20-30 secondi.
    2. Aggiungi ~ 2G di sabbia grossolana per il becher contenente materiale vegetale.
    3. Mix e pack nel cesto del portafiltro (campione vano). Comprimere il campione con il pressino.
      Nota: Non premere eccessivamente pack il campione.
    4. Aggiungere ~ 300 mL di soluzione al 35% etanolo/H2O il serbatoio della macchina espresso.
    5. Posizionare il portafiltro nella macchina caffè espresso e posizionare un becher da 250 mL pulito sotto di esso.
    6. Raccogliere ~ 100 mL di estratto, attendere ~ 1 minuto e poi raccogliere altri 100 mL.
      Attenzione: La macchina ed estratti sarà caldi a questo punto.
    7. Raffreddare la miscela in bagno di ghiaccio e far evaporare l'etanolo mediante un evaporatore rotante (bagno temperatura acqua: ~ 40 ° C).
    8. Trasferire l'estratto acquoso di un imbuto separatore ed estrarre con acetato di etile (4 x 50 mL).
      Nota: Ora è necessario per consentire di emulsioni separare tra le estrazioni.
    9. Combinare gli estratti organici, a secco con l'aggiunta di MgSO4 e vorticoso la beuta, filtrare utilizzando un imbuto di vetro sinterizzato ed evaporare utilizzando un evaporatore rotante (bagno temperatura acqua: ~ 35 ° C) per fornire l'estratto grezzo.
    10. Ottenere uno spettro di risonanza magnetica nucleare (NMR) 1H (Vedi l'istruttore per l'assistenza). 11
    11. Eseguire analisi TLC di greggio estratto per determinare un appropriato sistema solvente per isolare i composti che sono stati estratti.
      Nota: TLC analisi viene eseguita per analogia alle procedure descritte al punto 1.2.
  2. Sessione 2. Separazione di seselin e (+)-epoxysuberosin da flash colonna cromatografia11,19
    Nota: Il seguente protocollo prevede l'utilizzo di cromatografia a colonna flash per la separazione di composti organici. Si prega di consultare un istruttore per dimostrare come imballare una colonna di gel di silice flash.
    1. Posto la colonna (~ 30 mm di diametro) in un morsetto montato ad un basamento della storta. Posto una beuta da 100 mL sotto la colonna.
    2. Riempire la colonna con gel di silice (60 μm flash grado) ad un livello di ~ 10 cm e quindi aggiungere esano (~ 100 mL) per la colonna.
    3. Inserire un tappo di vetro nella colonna, rimuovere la colonna dalla pinza e agitare per ottenere un impasto. Sistemare la colonna nel morsetto e poi lasciare che la miscela di stabilirsi.
    4. Aprire il rubinetto della colonna e, utilizzando un adattatore gas associato ad una linea di aria compressa, vuota sulla colonna per lasciare ~ 2mm di solvente sopra il letto di gel di silice. Rimuovere l'adattatore gas quindi chiudere il rubinetto.
    5. Utilizzare l'esano raccolti nel matraccio conico (~ 5 mL) per lavare giù qualsiasi gel di silice dalle pareti della colonna con una pipetta Pasteur dotata di un setto di gomma.
    6. Ripetere il passaggio 2.2.4 poi aggiungere un piccolo strato di sabbia (~ 1 cm) nella colonna.
    7. Aggiungere il diclorometano (~ 1mL) nel matraccio contenente il greggio estratto dal passaggio 2.1.9. Caricare accuratamente la soluzione conseguente sulla colonna utilizzando una pipetta Pasteur dotata di un setto di gomma. Aprire il rubinetto della colonna e lasciare il campione essere assorbito il gel di silice.
    8. Ripetere il passaggio 2.2.7 due volte un ulteriore.
    9. Aggiungere con cautela esano (~ 20 mL) alla colonna. Ripetere il punto 2.2.4.
    10. Aggiungere con cautela (~ 180 mL di una soluzione di acetato di etile/esano 15%). Aperto il rubinetto della colonna e, utilizzando un adattatore gas collegato ad una linea di aria compressa, vuota sulla colonna per lasciare ~ 2mm di solvente sopra il letto di gel di silice, raccogliendo le frazioni in provette 10 mL.
      Nota: Questo permetterà seselin di essere isolato.
    11. Combinare le frazioni di provetta contenente seselin in un pallone a fondo tondo da 250 mL e far evaporare utilizzando un evaporatore rotante (bagno temperatura acqua: ~ 35 ° C).
      Nota: Analisi TLC viene utilizzato per determinare questo e viene eseguita per analogia alle procedure descritte al punto 1.2.
    12. Aggiungere con cautela (~ 75 mL di una soluzione di acetato di etile/esano 25%). Aperto il rubinetto della colonna e, utilizzando un adattatore gas collegato ad una linea di aria compressa, vuota sulla colonna per lasciare ~ 2mm di solvente sopra il letto di gel di silice, raccogliendo le frazioni in provette 10 mL.
      Nota: Questo permetterà (+)-epoxysuberosin di essere isolato.
    13. Combinare le frazioni di provetta contenente (+)-epoxysuberosin in un round di 250 mL fondo boccetta ed evaporare utilizzando un evaporatore rotante (bagno temperatura acqua: ~ 35 ° C).
      Nota: Analisi TLC viene utilizzato per determinare questo e viene eseguita per analogia alle procedure descritte al punto 1.2.
    14. Campioni di composti isolati vengono analizzati utilizzando la spettroscopia NMR. 11
      Nota: Gli esperimenti di spettroscopia NMR sono eseguiti da un tecnico di laboratorio.

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Representative Results

PHWE di chiodi di garofano. Quando si tenta di eseguire il passaggio di estrazione liquido-liquido, gli studenti incontrano spesso emulsioni (l'aggiunta di salamoia non era in genere efficace). In questa fase, gli studenti sono stati incaricati di lasciare che la miscela di stand in imbuto mentre hanno esplorato gli effetti della composizione di eluente sulla separazione di eugenolo e acetyleugenol da TLC. Dovrebbe essere notato che esano può essere sostituito con eptano o diclorometano nel passaggio di estrazione liquido-liquido. 9 studenti sono stati assegnati un rapporto solvente TLC di acetone e cicloesano e forniti con puro standard di eugenolo e acetyleugenol e quindi eseguite analisi TLC (Figura 3). I loro risultati sono stati tabulati su una lavagna, e gli effetti di composizione solvente sul coefficiente di conservazione (Rf) e l'eluente ottima sono stati considerati in una discussione di gruppo (tabella 1). Le composizioni di solvente ottimale identificate dagli studenti in genere hanno variati da 5-20% acetone/cicloesano con un ΔRf tra 0.1-0.2.

Dopo ottimizzazione di eluente TLC, studenti tornò in loro estrazioni di eugenolo. L'estratto grezzo spicchio (composta principalmente da eugenolo e acetyleugenol) è stato isolato in 4-9% w/w. Nella seconda sessione di questo esperimento, gli studenti sfruttavano le diverse proprietà acido-base delle due principali molecole organiche per separarli mediante estrazione liquido-liquido. In genere, l'eugenolo è stato isolato in una resa di 45-65% w/w di greggio estratto mentre acetyleugenol è stato isolato in una resa del 5-10% w/w di greggio estratto. Gli studenti poi utilizzate l'eluente ottimizzato (identificato come indicato in precedenza) per determinare il successo della loro estrazione liquido-liquido tramite confronto dei loro estratti per i campioni di riferimento puro da TLC (Figura 3). Studenti hanno analizzato anche loro estratto grezzo chiodi di garofano e loro campioni purificati di eugenolo e acetyleugenol mediante l'esecuzione di spettroscopia di trasformata di Fourier infrarossa (FTIR). 9 picchi solvente o acqua sono state osservate occasionalmente negli spettri IR a causa di procedure di lavoro mal eseguite (o preparazione del campione povero).

Studenti di livello avanzato commessi circa la metà del loro petrolio greggio isolato per l'estrazione liquido-liquido sopra descritto e sottoposto l'altra porzione di cromatografia a colonna flash (più informazioni sono fornite le informazioni di supporto). Anche se completare l'estrazione liquido-liquido e flash colonna cromatografia passaggi in una singola sessione di quattro ore può sembrare piuttosto ambizioso questo era realizzabile per la maggior parte degli studenti avanzati intraprendendo questo esperimento. La separazione completa di eugenolo da acetyleugenol da cromatografia a colonna flash è stata realizzata raramente dovuto i loro fattori di ritenzione stretta (Figura 4). Tuttavia, gli studenti erano generalmente in grado di raccogliere poche frazioni contenenti eugenolo puro. Studenti di livello avanzato sono stati quindi chiesto di commentare le due tecniche di depurazione diversi come parte della loro relazione.

PHWE di Correa reflexa. Gli studenti eseguita la PHWE di Correa reflexa con assistenza minima dell'istruttore laboratorio. Durante la fase di estrazione liquido-liquido emulsioni in genere formano e gli studenti spesso erano tenuti a lasciare che la miscela di stare nell'imbuto separatore (~0.25 h) con periodica agitazione della miscela con una bacchetta di vetro. La purificazione cromatografica di greggio estratto è stata completata comodamente all'interno della sessione di quattro ore laboratorio dagli studenti. Seselin e (+)-epoxysuberosin sono stati isolati in rendimenti di fino a 1,1% w/w e 0,9% w/w, rispettivamente e isolati campioni di entrambi i composti sono stati analizzati da 1H e 13C NMR e FTIR spectroscopy (Figura 2). Mentre gli studenti si sono impegnati gli esperimenti di spettroscopia FTIR e campioni preparati per spettroscopia NMR, tecnici di laboratorio eseguirono esperimenti di spettroscopia NMR. I risultati ottenuti dagli studenti erano costanti con il lavoro precedentemente pubblicato. 11

Anche se questo non è stato presentato in questo rapporto, in pratica, questo esperimento dispone anche di una seconda parte che sfida gli studenti a eseguire l'estrazione una specie di pianta che non è stata studiata che impiegano PHWE (ulteriori informazioni sono fornite in supporto informazioni).

Figure 1
Figura 1. PHWE di chiodi di garofano. 9 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Nella figura 2. PHWE di Correa reflexa. 11 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3 . Un piatto rappresentativo di TLC preparato da uno studente. (10% di acetone / eluizione cicloesano). Lane 1 (E): eugenolo standard; corsia 2 (greggio): spicchio di greggio estratto; Vicolo 3 (A): acetyleugenol standard). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

acetone / cicloesano (%v/v) dire dell'acetile-eugenolo Rf acetile-eugenolo Rf (σ) significa eugenolo Rf eugenolo Rf (σ) dire ΔRf numero di analisi TLC
0 0,06 0.08 0,04 0,06 0,02 12
5 0,34 0,11 0,27 0,09 0.07 15
10 0.45 0.07 0,34 0.05 0.12 20
20 0.51 0.07 0.41 0,06 0.10 20
30 0,58 0.10 0,49 0.12 0.10 19
40 0,63 0.08 0,56 0.08 0.07 16
50 0,76 0.08 0,73 0.08 0,03 17
60 0,77 0.13 0,73 0.15 0,04 12
70 0.84 0.13 0.81 0.13 0,03 11
80 0.90 0,06 0,87 0.08 0,02 10
90 0.88 0,06 0,87 0.05 0,01 11
100 0,87 0.13 0.86 0,14 0,02 6

Tabella 1. Tabella dei fattori di mantenimento che illustra l'effetto della composizione di eluente su Rf.

Figure 4
Figura 4 . Lastre TLC rappresentante preparati dagli studenti. A sinistra: Una TLC piastra analizzando il risultato del passaggio di estrazione liquido-liquido (10% di acetone / eluizione cicloesano). Lane 1 (E): norma di riferimento eugenolo; corsia 2 (LEB): organici contenenti eugenolo estratto; Vicolo 3 (A): acetyleugenol norma di riferimento; corsia 4 (LEN): acetyleugenol-contenere l'Estratto organico. A destra: Una TLC piastra analizzando il risultato del passaggio di cromatografia flash colonna (10% di acetone / eluizione cicloesano). Numeri sulla piastra di TLC riguardano il numero di frazione provetta. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

La procedura classica per l'isolamento di eugenolo dai chiodi di garofano tramite distillazione a vapore è stata parte del programma di laboratorio di chimica intermedia presso l'Università di Sydney per decenni, ma è stata modernizzata per impiegare la metodologia PHWE nel 2016 (Figura 1). 9 , 18 ciò ha fornito un numero di vantaggi. In primo luogo, utilizzando macchine da caffè espresso della famiglia nell'ambiente di laboratorio immediatamente affascinato e impegnati studenti illustrando l'applicazione di un metodo non-classica, alternativo per effettuare uno studio scientifico tradizionale. Inoltre, questo nuovo metodo riduce il tempo impiegato per completare l'estrazione e abilitato l'incorporazione di esercizi supplementari in questa nuova iterazione dell'esperimento. In particolare, questo ha permesso di cromatografia di strato sottile (TLC) per essere introdotto (e flash cromatografia a colonna per studenti di livello avanzato).

L'esperimento concentrandosi sul PHWE di chiodi di garofano è stato progettato come un laboratorio introduttivo esperienza per gli studenti del secondo anno laurea chimica e per questo motivo metodi di insegnamento espositivo caratteristiche. 9 questo ricetta-stile più prescrittivo, procedura permette agli studenti con un po ' limitata esperienza in chimica organica per completare in modo efficiente l'estrazione di eugenolo dai chiodi di garofano. In questo esperimento, concetti come estrazione acido-base di composti acidi, utilizzando TLC per identificare la composizione di eluente adatto per cromatografia e l'uso di un evaporatore rotante sono introdotte o rinforzate da una combinazione di video on-line di pre-laboratorio dimostrazioni di addestramento e di persona. In componenti complementari svolte durante le due sessioni allocate, studenti nel flusso avanzato di chimica intermedia anche separati eugenolo e acetyleugenol da cromatografia a colonna e determinato l'identità dei componenti estratti utilizzo di TLC. Nella seconda sessione, gli studenti potrebbero confrontare criticamente i metodi di separazione di due. In generale, gli studenti sono stati in grado di completare l'esperimento globale entro i due periodi di quattro ore allocati con istruzioni minime.

L'esperimento concentrandosi sul PHWE e l'isolamento di seselin e (+)-epoxysuberosin da Correa reflexa è stato sviluppato per gli studenti di terzo anno laurea chimica gli studenti più esperti. In particolare, questo esercizio di apprendimento era un risultato di uno studio originario nel laboratorio di ricerca. 11 la prima iterazione dell'esperimento fu incorporata il programma di laboratorio di chimica dello studente non laureato terzo anno presso l'Università di Tasmania nel 2015. Dopo due anni di revisioni e di rivalutazione, questo esperimento è stato effettuato da una classe di laurea di terzo anno per la terza volta nel 2017.

Questo esperimento è stato specificamente progettato come un'attività guidate-basata sull'indagine che si sforza per simulare alcuni degli approcci impiegati in laboratori di ricerca di prodotti naturali e caratteristiche minime istruzioni scritte. Si tratta di un'esperienza di apprendimento dell'allievo diretto e l'istruttore di laboratorio svolge un ruolo chiave nell'aiutare gli studenti che lavorano attraverso l'esperimento fornendo direzione come richiesto. In questo esperimento, gli studenti sviluppano competenze di laboratorio chiave nella cromatografia e impiegano la spettroscopia NMR per eseguire delucidazione della struttura. Questa esperienza di laboratorio rafforza il concetto di bioprospecting che viene presentata agli studenti in classe e questo può essere esteso agli studi su materiale precedentemente vegetale per fornire un'esperienza più rappresentativa dei prodotti naturali bioprospecting. C. reflexa è una specie di pianta endemica australiana, tuttavia, in questo esempio può essere sostituito con materiale appropriato foglia da altre specie di piante terrestri in questo esperimento.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Gli autori riconoscono la scuola di scienze naturali - chimica, Università della Tasmania e la scuola di chimica, The University of Sydney per il sostegno finanziario. B.J.D. e J.J. ringraziare il governo australiano per ricerca formazione programma di borse di studio.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
espresso machines Breville/Sunbeam Breville espresso machine model 800ES / Sunbeam EM3820 Café Espresso II
rotary evporators Buchi and Heidolph
cloves (plant material) Dijon Food Pty Ltd Cloves must be ground in a food processor for students.
Correa reflexa (plant material) sample obtained in Tasmania Sample collected from mature shrubs in the Thomas Crawford Reserve at the University of Tasmania
sand Ajax 1199
ethanol Redoc Chemicals E95 F3
hexanes Ajax 251
magnesium sulfate Ajax 1548
diethyl ether Merck 1009215000
silica on aluminium TLC plates Merck 1055540001
eugenol Merck 1069620100
eugenyl acetate Aldrich W246905
acetone Redox Chemicals Aceton13
cyclohexane ChemSupply CA019
silica gel 60 Trajan 5134312 40 - 63um (230-400mesh)
Congo red paper ChemSupply IS070-100S
32% hydrochloric acid Ajax 256

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References

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