संश्लेषण, लक्षण वर्णन, और एक्स्ट्रापल्मोनरी तपेदिक का पता लगाने के लिए सुपरपैरामैग्नेटिक आयरन ऑक्साइड नैनोप्रोब्स का आवेदन

Medicine

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Summary

माइकोबैक्टीरियम तपेदिक एंटीजन के लिए सीरोलॉजिकल डायग्नोस्टिक परीक्षणों में सुधार करने के लिए, हमने असाधारण तपेदिक का पता लगाने के लिए सुपरपैरामैग्नेटिक आयरन ऑक्साइड नैनोप्रोब्स विकसित किए।

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Lee, C. N., Chiu, L. H., Fang, C. L., Yeh, S. D., Zuo, C. S., Chen, S. C., Kuo, L. K., Wang, Y. M., Lai, W. F. T. Synthesis, Characterization, and Application of Superparamagnetic Iron Oxide Nanoprobes for Extrapulmonary Tuberculosis Detection. J. Vis. Exp. (156), e58227, doi:10.3791/58227 (2020).

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Abstract

सुपरपैरामैग्नेटिक आयरन ऑक्साइड (एसपीआईओ) नैनोकणों और माइकोबैक्टीरियम तपेदिक सतह एंटीबॉडी (एमटीबीएसएबी) को शामिल करते हुए एक आणविक इमेजिंग जांच को एक्स्पल्मोनरी तपेदिक (ईटीबी) के लिए इमेजिंग संवेदनशीलता को बढ़ाने के लिए संश्लेषित किया गया था । एक एसपीआईओ नैनोप्रोब को एमटीबीएसएबी के साथ संश्लेषित और संयुग्मित किया गया था। शुद्ध एसपीआईओ-एमटीबीएसएबी नैनोप्रोब को टीएम और एनएमआर का उपयोग करके विशेषता थी। जांच की लक्ष्यीकरण क्षमता का निर्धारण करने के लिए, SPIO-MtbsAb नैनोप्रोब्स को एमटीबी के साथ इन विट्रो इमेजिंग परख के लिए इनोडो इमेजिंग परख के लिए इनक्यूबेटेड किया गया था और चुंबकीय अनुनाद (एमआर) के साथ वीवो जांच में एमटीबी-टीका वाले चूहों में इंजेक्ट किया गया था । एमटीबी और टीएचपी1 कोशिकाओं के चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) पर कंट्रास्ट एन्हांसमेंट डिडक्शन ने एसपीआईओ-एमटीबीएसएबी नैनोप्रोब एकाग्रता के आनुपातिक दिखाई । एमटीबी संक्रमित चूहों में नसों में SPIO-MtbsAb नैनोप्रोप इंजेक्शन के 30 min के बाद, दानेदार साइट के संकेत तीव्रता टी 2 भारित एमआर छवियों में 14 गुना से बढ़ाया गया था कि PBS इंजेक्शन प्राप्त चूहों में की तुलना में । एमटीबीएसएबी नैनोप्रोब्स का उपयोग ईटीबी का पता लगाने के लिए एक उपन्यास तौर-तरीकों के रूप में किया जा सकता है।

Introduction

विश्व स्तर पर, एक्सट्रापल्मोनरी तपेदिक (ईटीबी) तपेदिक (टीबी) के मामलों के एक महत्वपूर्ण अनुपात का प्रतिनिधित्व करता है। फिर भी, ईटीबी निदान अक्सर अपनी कपटी नैदानिक प्रस्तुति और नैदानिक परीक्षणों पर खराब प्रदर्शन के कारण याद किया जाता है या देरी हो जाती है; झूठे परिणामों में एसिड-फास्ट बेसिली के लिए थूक स्मीयरनकारात्मक, हिस्टोपैथोलॉजी पर दानेदार ऊतक की कमी, या माइकोबैक्टीरियम तपेदिक (एमटीबी) संस्कृति में विफलता शामिल हैं। विशिष्ट मामलों के सापेक्ष, ईटीबी कम बार होता है और इसमें एमटीबी बेसिली की थोड़ी मुक्ति शामिल है। इसके अलावा, यह आमतौर पर दुर्गम-से-पहुंच साइटों पर स्थानीयकृत होता है, जैसे लिम्फ नोड्स, प्लीउरा और ऑस्टियोआर्टिकुलर क्षेत्र1। इस प्रकार, पर्याप्त नैदानिक नमूनों को प्राप्त करने के लिए आक्रामक प्रक्रियाएं, जो जीवाणु पुष्टि को जोखिम भरा और कठिन बनाती हैं,आवश्यक 2,3,4हैं।

ईटीबी के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंटीबॉडी डिटेक्शन परीक्षण नैदानिक पहचान के लिए अविश्वसनीय हैं क्योंकि उनकी संवेदनशीलता (0.00-1.00) और विशिष्टता (0.59-1.00) सभी बाह्य साइटों के लिएसंयुक्त 5। इंटरफेरॉन-ए-, कल्चर फिल्ट्रेट प्रोटीन (सीएफपी) और अव्यक्त और सक्रिय टीबी के निदान के लिए प्रारंभिक गुप्त एंटीजेनिक लक्ष्य (ESAT) के लिए एंजाइम से जुड़े इम्यूनोस्पॉट (ELISPOT) परखों का उपयोग किया गया है। हालांकि, ईटीबी6,7,8के निदान के लिए परिणाम विभिन्न रोग स्थलों के बीच भिन्न होते हैं। इसके अलावा, त्वचा पीपीडी (शुद्ध प्रोटीन व्युत्पन्न) और क्वांटिफेरन-टीबी अक्सर झूठे नकारात्मक परिणाम9प्रदान करते हैं । क्वांटिफेरन-टीबी-2जी एक संपूर्ण रक्त प्रतिरक्षा प्रतिक्रियापराहै, जिसके लिए प्रभावित अंग से नमूने की आवश्यकता नहीं होती है और यह एक वैकल्पिक नैदानिक उपकरण6,10,11हो सकता है। आमतौर पर टीबी दिमागी पहचान के लिए उपयोग किए जाने वाले अन्य नैदानिक तरीके, जैसे पॉलीमरेज चेन रिएक्शन, अभी भी नैदानिक निदान12,13को आत्मविश्वास से बाहर करने के लिए बहुत असंवेदनशील हैं। ये पारंपरिक परीक्षण बाह्य संक्रमण स्थल की खोज करने के लिए अपर्याप्त नैदानिक जानकारी प्रदर्शित करते हैं। इस प्रकार, उपन्यास नैदानिक तौर-तरीकों की चिकित्सकीय आवश्यकता होती है।

आणविक इमेजिंग का उद्देश्य उपन्यास उपकरण ों को डिजाइन करना है जो सीधे वीवो14,15में रोग प्रक्रियाओं के विशिष्ट आणविक लक्ष्यों को स्क्रीन कर सकते हैं । एक टी-2 भारित एनएमआर कंट्रास्ट एजेंट सुपरपैरामैग्नेटिक आयरन ऑक्साइड (एसपीआईओ), चुंबकीय अनुनाद (एमआर) इमेजिंग (एमआरआई)16,17की विशिष्टता और संवेदनशीलता को काफी बढ़ा सकता है । इस नए कार्यात्मक इमेजिंग मोडलिटी ठीक लिगामेंट-रिसेप्टर बातचीत के माध्यम से आणविक स्तर पर ऊतक परिवर्तन स्केच कर सकते हैं । इस अध्ययन में, एसपीआईओ नैनोकणों को शामिल करते हुए एक नई आणविक इमेजिंग जांच को ईटीबी निदान के लिए एमटीबी सरफेस एंटीबॉडी (एमटीबीएसएबी) के साथ संजूगेट करने के लिए संश्लेषित किया गया था । एसपीआईओ नैनोप्रोब ऊतकों और निकायों के लिए न्यूनतम आक्रामक हैं18,19. इसके अलावा, ये नैनोप्रोब्स अपने पैरामैग्नेटिक गुणों के कारण कम सांद्रता पर सटीक एमआर छवियों को प्रदर्शित कर सकते हैं। इसके अलावा, एसपीआईओ नैनोप्रोब्स कम से कम एलर्जी प्रतिक्रियाओं को प्राप्त करते हैं क्योंकि लोहे के आयनों की उपस्थिति सामान्य शरीर विज्ञान का हिस्सा है। यहां, ईटीबी को लक्षित करने वाले एसपीआईओ-एमटीबीएसएबी नैनोप्रोब्स की संवेदनशीलता और विशिष्टता का मूल्यांकन सेल और पशु मॉडल दोनों में किया गया था। परिणामों ने दिखा दिया कि नैनोप्रोब्स ईटीबी निदान के लिए अतिसंवेदनशील इमेजिंग एजेंटके रूप में लागू थे।

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Protocol

पशु प्रयोग के बारे में सभी प्रोटोकॉल प्रयोगशाला पशुओं की देखभाल और उपयोग के लिए स्वास्थ्य दिशानिर्देशों के राष्ट्रीय संस्थानों के अनुसार प्रयोगशाला पशु प्रजनन के लिए मानक ऑपरेटिंग प्रक्रियाओं का पालन करता है और 8वां संस्करण, 2011 द्वारा अनुमोदित है संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति।

1. एसपीआईओ नैनोपार्टिकल संश्लेषण

  1. कमरे के तापमान पर dextran-लेपित आयरन ऑक्साइड चुंबकीय नैनोकणों को सख्ती से डीएक्सटीएन टी-40 (5 मिलील; 50% डब्ल्यू/डब्ल्यू) और जलीय फेसीएल3× 6H2O (0.45 ग्राम; 2.77 mmol) और FeCl2×4H2O (0.32 ग्राम; 2.52 mmol) समाधान के मिश्रण को तेजी से हिलाते हुए तैयार करें।
  2. एनएच4ओह (10 लाख; 7.5% v/v) तेजी से जोड़ें।
  3. इसके अलावा 1 घंटे के लिए काले निलंबन हलचल; बाद में, 10 मिन के लिए 17,300 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र और फिर कुल हटा दें।
  4. जेल फिल्ट्रेशन क्रोमेटोग्राफी20द्वारा अनबाउंड डीएक्सटीएन टी-40 से अंतिम एसपीआईओ उत्पादों को अलग करें।
  5. प्रतिक्रिया मिश्रण (कुल मात्रा = 5 मिलीग्राम) को 2.5 सेमी × 33 सेमी कॉलम में लोड करें और पीएच 7.0 पर 0.1 एम एनए एसीटेट और 0.15 एम एनसीएल वाले बफर समाधान के साथ एल्यूट करें।
  6. शून्य मात्रा में शुद्ध dextran-लेपित लोहे के ऑक्साइड चुंबकीय नैनोकणों को इकट्ठा करें और क्रमशः हाइड्रोक्लोरिक एसिड और फिनॉल/सल्फ्यूरिक एसिड विधियों20का उपयोग करके 330 और 490 एनएम पर लोहे और dextran के लिए कॉलम eluates परख ें।

2. SPIO-MtbsAb संश्लेषण

  1. पहले बताए गए तरीकों21,22का उपयोग करके एसपीआईओ-कंजुगेट ईडीबीई ।
  2. संश्लेषण SPIO-EDBE-succinic anhydride (एसए) ।
    1. 24 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर SPIO-EDBE और एसए (1 ग्राम; 10 μmol) के एक क्षारीय समाधान (5 एम NaOH; 10 mL)) हिलाओ ।
    2. आणविक असुरक्षित झिल्ली ट्यूबिंग (12,000-14,000 मेगावाट कटऑफ) का उपयोग करके आसुत पानी के 2 एल के 2 0 परिवर्तनों के साथ समाधान को डायलिज़ करें। प्रत्येक परिवर्तन के लिए 6 घंटे।
  3. अंत में, एसपीआईओ-ईडीबीई-एसए (4 मिलीग्राम/एफए के 4 मिलीग्राम/एमएल) के 100 माइक्रोन को 4.5 मिलीग्राम/एमएल एमटीबीएसएबी के 400 माइक्रोन में जोड़ें ताकि 1 का उपयोग करके एसपीआईओ-एमटीबीएसएबी को संश्लेषित किया जा सके। -हाइड्रोक्सीबेंजोट्रिज़ोल और (बेंजोट्रिज़ोल-1-इलक्सी) ट्रिप्रीरोलिडिनोफोस्फोनियम हेक्साफ्लोरोफॉस्फेट उत्प्रेरक के रूप में और 24 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर समाधान हलचल।
  4. अंत में, जेल फिल्ट्रेशन क्रोमेटोग्राफी के माध्यम से अनबाउंड एंटीबॉडी से समाधान अलग करें।
  5. 2.5 सेमी × 33 सेमी कॉलम पर प्रतिक्रिया मिश्रण (5 मिलील) लोड करें और पीबीएस बफर का उपयोग करके एल्यूट करें। एक बिकिनोइनिक एसिड प्रोटीन परख किट23का उपयोग कर एबी-नैनोपार्टिकल कॉम्प्लेक्स (यानी, नैनोप्रोब) की पुष्टि करें ।

3. कण आकृति विज्ञान अवलोकन और विश्राम स्तर माप

  1. 100 केवी के वोल्टेज पर ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके औसत कण आकार, आकृति विज्ञान और आकार वितरण की जांच करें।
    1. ड्रॉप-एक २००-जाल तांबे ग्रिड और हवा कमरे के तापमान पर सूखी पर समग्र फैलाव डाली यह माइक्रोस्कोप पर लोड करने से पहले ।
  2. 20 मेगाहर्ट्ज और 37.0 डिग्री सेल्सियस ± 0.1 डिग्री सेल्सियस पर एनएमआर रिलैक्रोमीटर का उपयोग करनैनोप्रोब्स के विश्राम समय मूल्यों(टी1 और टी2)को मापें।
    1. प्रत्येक माप से पहले आराम का अंशांकन करें।
    2. आर 1 और आर2 मूल्यों को क्रमशः, आर1 और आर2 आराम20निर्धारित करने के लिए उलटा वसूली और Carr-Purcell-Meiboom-गिल पल्स अनुक्रम के माध्यम से उत्पन्न आठ डेटा अंक से रिकॉर्ड करें ।

4. सेल इमेजिंग

  1. आरपीएमआई 1640 में मानव मोनोसाइट्स टीएचपी-1 की खेती करें, जिसमें 10 प्रतिशत भ्रूण गोजातीय सीरम, 50 μg/mL gentamycin सल्फेट, 100 यूनिट/एमएल पेनिसिलिन जी सोडियम, 100 ग्राम स्ट्रेप्टोमाइसिन सल्फेट, और 0.25 μg/mL कवकजोन में 5% सीओ2 इनक्यूबेटर 37 डिग्री सेल्सियस पर।
  2. इनक्यूबेट एसपीआईओ-एमटीबीएसएबी नैनोप्रोब्स (2 एमएम) के साथ 106 कॉलोनी बनाने वाली इकाइयां (सीएफयू) माइकोबैक्टीरियम बोविस बीसीजी की 1 × 107 एक्टिवेटेड मोनोसाइट्स के साथ माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब (1 एमएल) में 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए।
  3. 200 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र ट्यूब और अलौकिक त्यागें। मध्यम (200 μL) में छर्रों को फिर से भंग करें।
  4. एक तेजी से ढाल इको पल्स अनुक्रम (पुनरावृत्ति समय (टीआर) = 500 का उपयोग कर नमूनों को स्कैन करें; इको टाइम (टीई) = 20; नैनोप्रोब की विशिष्टता और संवेदनशीलता21,22निर्धारित करने के लिए 3.0-टी एमआरआई के माध्यम से फ्लिप एंगल = 10 डिग्री।

5. बीसीजी (बैसिलस कैस्टेलेट-गुएरिन) टीका

  1. Sauton के माध्यम में lyophilized वैक्सीन या जीवाणु स्टॉक का पुनर्गठन और फिर खारा के साथ शेयर पतला जब तक ठीक से फैलाया के रूप में पहले24वर्णित है ।
  2. एडइम्यून (ताइपेई, ताइवान) (कनॉट स्ट्रेन) से प्राप्त एम बोविस बीसीजी के एक जीवित तनु तनाव का टीका; इम्मुसिस्ट एवेंटिस, पाश्चर मेरियूक्स) 0.1 मिली/माउस (यानी, 107 सीएफयू) की मात्रा में चूहों की बाईं या दाएं पृष्ठीय स्कैपुलर त्वचा में, जैसा कि पहले23वर्णित है। नकारात्मक नियंत्रण के रूप में चूहों में खारा इंजेक्ट करें। बीसीजी टीका के बाद रोजाना जानवरों की निगरानी करते हैं।
  3. कार्बन डाइऑक्साइड इच्छामृत्यु का उपयोग कर बैक्टीरिया टीका के 1 महीने बाद जानवरों का बलिदान करें। इनट्रेडरमल टीका साइट से ऊतक ों की कटाई। 10% फॉर्मेलिन में ऊतक को ठीक करें और 5-10 μm पर धारावाहिक वर्गों के लिए पैराफिन में एम्बेड करें। हेमेटोक्सिलिन/eosin और Ziehl-Neelsen दाग के साथ हेमेटक्सीलिन/eosin और Ziehl-Neelsen दाग के साथ एसिड फास्ट बैक्टीरिया24 और फेरिक आयरन25के लिए बर्लिन नीले रंग के साथ दाग ।

6. वीवो एमआरआई में

  1. पशु संज्ञाहरण के लिए चूहों में केटामाइन (80 मिलीग्राम/किलोग्राम शरीर का वजन) और जाइलाज़ीन (12 मिलीग्राम/किलोग्राम शरीर का वजन) को चूहों में इंजेक्ट करें।
  2. चूहों की पूंछ नसों में SPIO-TbsAb जांच (2 nmol/200 μL) इंजेक्ट करें । जांच इंजेक्शन से पहले और तुरंत बाद एमआर छवि चूहों और फिर 30 मेंस के लिए हर 5 मिन T2-भारित तेजी से स्पिन-इको छवियों (टीआर = 3000) प्राप्त करने के लिए; ते = 90; देखने के क्षेत्र = 8) ।
  3. मात्रात्मक रूप से सिग्नल तीव्रता (एसआई) का उपयोग करके सभी एमआर छवियों का विश्लेषण करें, एमटीबी ग्रैनुलोमा केंद्र के तुलनीय स्थानों में रुचि के परिभाषित क्षेत्रों का मापन और एक कणवक्षीय क्षेत्र से सटी पीठ की मांसपेशी।
  4. सूत्र का उपयोग करके कंट्रास्ट एजेंटों के एसआई माप(सिप्रे; नियंत्रण) और 0-3 घंटे के बाद (सिपोस्ट) इंजेक्शन का उपयोग करके सापेक्ष सिग्नल संवर्द्धन की गणना करें

    [(सिबाद- सिप्रे)/सिप्रे] × 100

    जहां सिप्रे पूर्व बढ़ाया स्कैन पर घाव का एसआई है और सिबाद21,22के बाद बढ़ाया स्कैन पर घाव का एसआई है ।

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Representative Results

SPIO-MtbsAb नैनोप्रोब संश्लेषण और लक्षण वर्णन
एसपीआईओ नैनोकणों को एमटीबीएसएबी के साथ संजूगेट करने के लिए डिजाइन किया गया था। एसपीआईओ नैनोकणों की सतह पर स्थिर dextran को एपिक्लोरोहिड्रिन द्वारा क्रॉसलिंक किया गया था। बाद में dextran सिरों पर प्राथमिक अमीन कार्यात्मक समूहों को सक्रिय करने के लिए EDBE के साथ एसपीआईओ नैनोकणों को शामिल किया गया था। इसके बाद एसए को एसपीआईओ-ईडीबीई-एसए बनाने के लिए संयुग्मित किया गया । एसपीआईओ-एमटीबीएसएबी नैनोप्रोब्स ने युग्मन एजेंटों की उपस्थिति में एसपीआईओ-ईडीबीई-एसए के साथ एमटीबीएबी के संयोजन के माध्यम से अंतिम चरण में गठित किया। SPIO-MtbsAb नैनोप्रोब्स(चित्रा 1)की TEM छवि दर्शाती है कि SPIO-MtbsAb नैनोप्रोब्स एक अच्छी तरह से फैलाया उपस्थिति थी । एसपीआईओ-एमटीबीएसएबी नैनोप्रोब कोर का औसत आकार 3.8 ± 0.4 एनएम (200 कण गणना) था।

जलीय समाधान में, नैनोप्रोब्स के आराम मूल्य, आर1 और आर2क्रमशः 20 मेगाहर्ट्ज और 37.0 डिग्री सेल्सियस ± 0.1 डिग्री सेल्सियस पर 23 ± 3 और 151 ± 8 एमएम-1एस-1थे। SPIO-MtbsAb नैनोप्रोब्स का आर1/आर2 अनुपात Resovist के समान था; हालांकि, आर 1 औरआर2 के Resovist (26 और १६४mM-1एस-1,क्रमशः) SPIO-MtbsAb नैनोप्रोब्स की तुलना में कुछ अधिक थे ।

इन विट्रो एसपीआईओ-एमटीबीएसएबी नैनोप्रोब लक्षण वर्णन और इमेजिंग
सबसे पहले, हमने ज़िहल-नीलसन धुंधला(चित्रा 2ए)के माध्यम से एम बोविस बीसीजी, एक एसिड-फास्ट बैक्टीरिया का पता लगाया। बैक्टीरिया अलग थे और फिर फेरिक लोहे युक्त जांच के साथ सुसंस्कृत, बर्लिन नीले धुंधला(चित्रा 2बी)के माध्यम से पहचाने जाने योग्य । एसपीआईओ-एमटीबीएसएबी नैनोप्रोप की एमटीबी-टारगेटिंग डिग्री टी-2-भारित एमआरआई के माध्यम से निर्धारित की गई थी; नकारात्मक वृद्धि बैक्टीरियल सेल से जुड़ी जांच की मात्रा के अनुपात में थी। नैनोप्रोब्स की उपस्थिति में एसआई में कमी एकाग्रता पर निर्भर तरीके से हुई(चित्रा 2सी)। 2, 1, और 0.5 m M पर, एमटीबी के साथ संयुग्मित नैनोप्रोब्स ने 97.67 ± 3.05, 131.67 ± 4.51 और 257.33 ± 5.03 के एसआई का प्रदर्शन किया, क्रमशः, 1 एमएम नॉनकॉन्जुगाट नैनोप्रोब के लिए 90.75 ± 2.47 के एसआई को सभी उच्च। पीबीएस (एसआई = 1073.43 ± 13.62) की तुलना में, टीबी केवल समूह (एसआई = 957.33 ± 12.53) में लगभग कोई सिग्नल कमी नोट नहीं की गई थी। इस प्रकार, SPIO जांच विशेष रूप से एमटीबी बेसिली लक्षित; इसके अलावा, बढ़ी हुई एमआर छवियों पर, एसआई एसपीआई नैनोकणों की मात्रा में वृद्धि के साथ कम हो गया।

इसी तरह, बढ़ी हुई एमआर छवियों पर एसआई में कटौती नैनोप्रोब्स के साथ टीएचपी-1 मोनोसाइट्स की खेती के बाद 1 घंटे नोट की गई थी। टीबी समूह के एसआई में एक महत्वपूर्ण कमी नोट किया गया था जब 1 mM (एसआई = 225.33 ± 8.58) और 2 mM (एसआई = 104 ± 2.16) नैनोप्रोब्स की सांद्रता केवल पीबीएस (एसआई = 1005.33 ± 16.74) के साथ प्रशासित समूहों की तुलना में नियोजित किया गया था या नैनोपीआर के साथ प्रशासित नहीं किया गया था ओब (एसआई = 991 ± 8.98)। एमआरआई एसआई 1 और 2 mM नैनोप्रोब्स के लिए एमटीबी समूहों में कमी के लिए है कि सकारात्मक 1 mM नैनोप्रोब अकेले समूह (एसआई = 112.33 ± 3.68) में तुलनीय था। उपरोक्त परिणामों के अनुसार, एसपीआईओ-एमटीबीएसएबी नैनोप्रोब्स नैनोप्रोब-सक्रिय टीएचपी-1 मोनोसाइट तस्करी की निगरानी में सहायता कर सकता है ।

वीवो एसपीआईओ-एमटीबीएसएबी नैनोप्रोप इमेजिंग में
सेल इमेजिंग के बाद, हमने ईटीबी के लिए वीवो एमआरआई में प्रभावकारिता निर्धारित की। एसपीआईओ-एमटीबीएसएबी नैनोप्रोब्स को नसों में एमटीबी संक्रमित चूहों को इंजेक्ट किया गया था । इंजेक्शन के बाद एमटीबी कणवृह क्षेत्र 0.5 घंटे में एक स्पष्ट रूप से पता लगाने योग्य एमआर सिग्नल नोट किया गया था; हालांकि, 1 घंटे के इंजेक्शन के बाद पृष्ठभूमि में उच्चतम एसआई देखा गया। एमटीबी कणिका क्षेत्र(चित्रा 3)में एमआर सिग्नलिंग में उल्लेख किया गया था। एसआई (SIpre) और बाद (SIpost) विपरीत एजेंट इंजेक्शन से पहले मापा गया था । जांच इंजेक्शन के एक घंटे बाद, एमटीबी ग्रैनुलमाटोस क्षेत्रों में सिग्नल में कमी की टी2-भारित वृद्धि(चित्रा 3बी)नियंत्रण स्थलों(चित्रा 3ए;-1.68% ± 1.32% और -23.43% ± 7.24%) की तुलना में लगभग 14 गुना अधिक थी; पी एंड एलटी; 0.001) ।

एसपीआईओ-एमटीबीएसएबी नैनोप्रोब्स का हिस्टोलॉजिकल और इम्यूनोहिस्टोकेमिकल मूल्यांकन
C57BL/6 चूहों में संक्रमण के 1 महीने बाद एक चमड़े के दानेदार ग्रैनुलोमा विकसित किया गया था । लिम्फोसाइट और एपिथेलिओइड-मैक्रोफेज एग्रीगेट के साथ इन घावों के भीतर नए रक्त संवहनी को नोट किया गया था। संगठित ग्रैनुलोमा उत्तरोत्तर हो गया था(चित्र4ए)। एसपीआईओ-एमटीबीएसएबी एमआर संकेतों के साथ टीबी के घावों का सहसंबंध एंटी-एमटीबीएसएबी के साथ एमटीबी सरफेस एंटीजन की इम्यूनोहिस्टोकेमिकल प्रतिक्रिया के माध्यम से आगे निर्धारित किया गया था। सकारात्मक MtbsAb अभिव्यक्ति दानेदार क्षेत्रों में पता चला था(चित्रा 4बी),एसिड के साथ तेजी से बेसिली घाव साइट पर सकारात्मक धुंधला(चित्रा 4सी)। बर्लिन ब्लू, एक फेरिक आयरन पॉजिटिव दाग, एमटीबी के लिए जांच की संवेदनशीलता का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । बर्लिन ब्लू-पॉजिटिव SPIO जांच MtbsAb(चित्रा 4डी)के रूप में एक ही स्थान में पाया गया था । सभी सहस्थानीयकृत जोड़े चित्र4ए-डीमें दिखाए गए थे ।

Figure 1
चित्रा 1: TEM में SPIO-MtbsAb नैनोप्रोब्स का मतलब कोर आकार । एसपीआईओ-एमटीबीएसएबी नैनोप्रोब कोर का औसत आकार 3.8 ± 0.4 एनएम था, जो टेम छवि विश्लेषण (200 कण गणना) का उपयोग करके मापा जाता था। स्केल बार = 15 एनएम। इस आंकड़े को हमारे पिछले अध्ययन26से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: एसपीआईओ-एमटीबीएसएबी नैनोप्रोब के इन विट्रो लक्षण वर्णन। एसिड-फास्ट बेसिली की पहचान(ए)ज़िहल-नीलसन धुंधला और(बी)नैनोप्रोब के फेरिक लोहे के संयोजन बर्लिन ब्लू धुंधला के माध्यम से पहचाने गए बैक्टीरिया के माध्यम से की जाती है । (C)टी-भारित एमआरआई में एसपीआईओ-एमटीबीएसएबी नैनोप्रोब्स के बाद नकारात्मक वृद्धि को प्रदर्शित किया गया है। एमटीबी के साथ नैनोप्रोब्स के समावेश के बाद एसआई होने वाली खुराक-निर्भर रूप से समाप्त करना: (1) 90.75 ± 2.47 (1.0 मीटर प्रति मीटर जांच); (2) 97.67 ± 3.05 (एमटीबी + 2.0 m जांच); (3) 131.67 ± 4.51 (एमटीबी +1.0 m जांच); (4) 257.33 ± 5.03 (एमटीबी + 0.5 एमएम जांच); (5) 957.33 ± 12.53 (एमटीबी +0 एमएम जांच); (6) 1073.43 ± 13.62 (पीबीएस) । पीबीएस नियंत्रण समूह में कोई पता लगाने योग्य सिग्नल कमी नोट नहीं की गई। (D)नैनोप्रोब्स के साथ ऊष्मायन के बाद टीएचपी-1 मोनोसाइट्स 1 एच में खुराक-निर्भर नकारात्मक वृद्धि। (सी) और (डी) में स्केल बार 5 मिमी हैं। इस आंकड़े को हमारे पिछले अध्ययन26से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: C57BL/6 माउस के चमड़े के नीचे ईटीबी घावों में वीवो एसपीआईओ-एमटीबीएसएबी नैनोप्रोब्स में। (A)नियंत्रण और(ख)एमटीबी कणिका क्षेत्र । जांच प्रशासन के बाद नियंत्रण क्षेत्रों 1 घंटे की तुलना में एमटीबी कणिका क्षेत्रों में एमआर सिग्नलिंग में एक महत्वपूर्ण 14 गुना कमी पाई जाती है (-1.68% ± 1.32% बनाम -23.43% ± 7.24%, पी एंड एलटी; 0.001)। परिणाम के रूप में दिया जाता है ± SDs । सांख्यिकीय तुलना दो पूंछ छात्र टी परीक्षण का इस्तेमाल किया । पी एंड एलटी; 0.05 को महत्वपूर्ण माना गया। इस आंकड़े को हमारे पिछले अध्ययन26से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: हिस्टोलॉजी, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री, एसिड-फास्ट और बर्लिन ब्लू धुंधला के सहसंबंध। एमटीबी कणिका क्षेत्रों की हिस्टोलॉजी मुख्य रूप से लिम्फोसाइट्स और एपिथेलिओइड मैक्रोफेज का प्रदर्शन करती है। इन घावों में देखे गए लिम्फोसाइट्स और एपिथेलियोइड मैक्रोफेज का नियोवैस्कुलराइजेशन और प्रचुर मात्रा में एकत्रीकरण। (क)संगठित कणिकाउत्तरोत्तर विकसित होने के लिए दिखाई दे रही है । (ख)इम्यूनोहिस्टो केमिकल धुंधला कणों में एमटीबीएसएबी अभिव्यक्ति का प्रदर्शन करता है, जबकि(सी)एसिड-फास्ट बेसिली उन्हीं क्षेत्रों में बिखरे हुए हैं । (घ)बर्लिन ब्लू धुंधला SPIO जांच colocalized MtbsAb क्षेत्रों में पाए जाते हैं । फेरिक लोहे के लिए बर्लिन ब्लू धुंधला एमटीबी के लिए जांच conjugation दर्शाता है । स्केल बार १०० μm हैं । इस आंकड़े को हमारे पिछले अध्ययन26से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

प्रासंगिक अध्ययनों के समान, एसपीआईओ-एमटीबीएसएबी नैनोप्रोब्स के बारे में हमारे निष्कर्षों ने एमटीबी27,28के लिए एक महत्वपूर्ण विशिष्टता का प्रदर्शन किया। माउस मॉडल में टीबी इंजेक्शन लगने के 1 महीने बाद सबसे नीचे एमटीबी ग्रेनुलोमा पाया गया। ठेठ टीबी कणिका हिस्टोलॉजी निष्कर्षों में लिम्फोसाइट घुसपैठ, एपिथेलियोइड मैक्रोफेज की उपस्थिति और नियोवैस्कुलराइजेशन शामिल थे। टीबी के घावों में एसिड-फास्ट बेसिली बिखरे हुए थे, जो एमटीबीएसएबी इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के निष्कर्षों की पुष्टि करते थे । यह एमटीबी सतह एंटीजन और एमटीबीएसएबी के बीच एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का संकेत दिया । बर्लिन ब्लू ने एमटीबीएसएबी के साथ उन्हीं क्षेत्रों पर प्रकाश डाला, एसिड-फास्ट एमटीबी के साथ संकीर्तन के लिए जांच की विशिष्टता की पुष्टि की ।

विशेष रूप से, एमटीबी और मोनोसाइटिक THP1 कोशिकाओं के लिए एमआरआई पर नकारात्मक विपरीत वृद्धि की सीमा एसपीआईओ-एमटीबीएसएबी नैनोप्रोब एकाग्रता के आनुपातिक थी। जब एमटीबी ग्रैनुलोमास वाले चूहों को SPIO-MtbsAb नैनोप्रोब्स प्रशासित किया गया था, तो ग्रैनुलोमस साइट पर 14 गुना सिग्नल कमी पीबीएस इंजेक्शन के साथ एक विरोधी साइट की तुलना में टी2-भारित एमआर छवियों पर नोट की गई थी। यह विपरीत एजेंट के एक महत्वपूर्ण संचय को इंगित करता है। परिणाम कंट्रास्ट एजेंट के विशिष्ट लक्ष्यीकरण प्राप्त करने के लिए एक संभावना प्रदर्शित करते हैं, जो नैदानिक निदान के लिए खुराक की आवश्यकता को कम कर सकता है।

हमारे निष्कर्षों से संकेत मिलता है कि ये नैनोप्रोब्स एमटीबी कणिकाओं के घावों में एक पता लगाने योग्य मात्रा जमा करते हैं। इन परिणामों की पुष्टि एंटी-एचएमटीबीएसएबी का उपयोग करके एसपीआईओ नैनोप्रोब विकसित करके की जा सकती है। के रूप में है SPIO चुंबकीय लोहा ऑक्साइड कोर एमआरआई विपरीत एजेंटों में T2 छोटा प्रेरित करने के लिए लागू किया गया है, निष्कर्षनैदानिक निदान अनुप्रयोगों के लिए इसी तरह की कोशिका व्यवहार का पता लगाने के लिए एक व्यावहारिक और noninvasive दृष्टिकोण का सुझाव है ।

यहां, हम 2 भागों के प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं: वर्ग 4 से 6 सेल और पशु इमेजिंग हैं। तकनीक सेल की खेती, पशु प्रयोगों और ऑप्टिकल इमेजिंग को कवर करती है। धारा 1 से 3 जांच संश्लेषण हैं। कुछ महत्वपूर्ण कदम प्रयोग को दोहराने में मदद करेंगे। एसपीआईओ नैनोपार्टिकल संश्लेषण का महत्वपूर्ण कदम एक dextran-लेपित आयरन ऑक्साइड चुंबकीय नैनोकणों को तैयार करना है; यह तेजी से हलचल और पूरी तरह से dextran टी-४०, जलीय FeCl3-6H2O, और FeCl2-4H2O एक कमरे के तापमान पर समाधान मिश्रण करने के लिए महत्वपूर्ण है । धारा 2, एसपीआईओ-एमटीबीएसएबी संश्लेषणके लिए महत्वपूर्ण कदम, SPIO-EDBE-SA को SPIO-EDBE-SA के लिए SPIO-EDBE-SA के लिए SPIO-EDBE-SA के लिए संयुग्मण कर रहा है एसपीआईओ-MtbsAb संश्लेषण । उचित उत्प्रेरक का चयन करने के लिए और पर्याप्त रूप से कमरे के तापमान पर समाधान हलचल के रूप में अच्छी तरह से महत्वपूर्ण हैं । और धारा 3, कण आकृति विज्ञान अवलोकन और विश्राम स्तरमाप नकेल के लिए महत्वपूर्ण कदम, प्रत्येक माप से पहले आराम का जांचना है। जांच के आकार की सटीक गणना करने के लिए, रिलैक्रोमीटर का एक अंशांकन भी महत्वपूर्ण है।

इस अध्ययन में एम बोविस बीसीजी और खरगोश एंटी एमटीबी का इस्तेमाल किया गया। गोजातीय और खरगोश स्रोतों की क्रॉसरीएक्टिविटी को हल्का माना जाता था, हालांकि आंकड़ों ने साबित कर दिया कि एमटीबीएसएबी-संयुग्मित एसपीआईओ ने एम बोविस बीसीजी के साथ मजबूत बातचीत का खुलासा किया। हमारे निष्कर्ष का सुझाव दिया है कि SPIO नैनोजांच विशेष रूप से टीबी लक्ष्य । नैनोप्रोब और एमटीबी बैक्टीरिया के ऊष्मायन में नकारात्मक वृद्धि तरीके की खुराक-निर्भर दिखाई दी, जबकि एमआरआई पर एसपीआईओ नैनोप्रोब्स के लिए देखी गई वृद्धि में कमी एसपीआईओ कणों के अस्तित्व से सहसंबद्ध थी । हमारे आंकड़ों के आधार पर, नैनोप्रोब की विशिष्टता को बढ़ाने के लिए संभावित एंटीबॉडी-कॉन्जुर्गेशन दृष्टिकोणों का पता लगाने के लिए आगे अनुसंधान का स्वागत किया जाएगा ।

पूर्व अध्ययनों से पता चलता है कि एसपीआईओ इस अध्ययनमें इस्तेमालकी जाने वाली एकाग्रता पर कोशिका गतिविधि में फेरबदल किए बिना न्यूनतम साइटोटॉक्सिकिटी को दिखाता है पूर्व अनुसंधान के साथ समझौते में, हमारे परिणामों ने टीएचपी-1 कोशिकाओं को एसपीआईओ नैनोप्रोब्स के न्यूनतम प्रभाव का प्रदर्शन किया। टीएचपी-1 कोशिकाओं को 1 घंटे के लिए बैक्टीरिया संजुगन के साथ एसपीआईओ नैनोप्रोब्स के साथ इनक्यूबेटेड किया गया था। एसआई ने अकेले नैनोप्रोब उपचार या पीबीएस के बिना नियंत्रण समूह की तुलना में 1 mM या 2 mM नैनोप्रोब्स की एकाग्रता के साथ एमटीबी समूहों में महत्वपूर्ण गिरावट पेश की। परिणाम SPIO नैनोप्रोब की सुरक्षा का समर्थन करता है, और नैनोप्रोब की संवेदनशीलता को मान्य करने के लिए अन्य बैक्टीरियल लोड लागू करने वाले अधिक अध्ययन स्वागत योग्य हैं।

हमारे अध्ययन की एक सीमा यह थी कि हमने चूहों में एसपीआईओ-एमटीबीएसएबी नैनोप्रोब के जैव वितरण की मात्रा निर्धारित नहीं की थी। इसके अलावा, हमने नैनोप्रोब के इंट्रावैस्कुलर हाफलाइफ और लिवर जमाव की जांच नहीं की, जो एमटीबी घावों पर स्थित टीएचपी-1 कोशिकाओं को जांच के उजागर समय को बदल सकता है। बायोडिग्रेडेशन पर आगे शोध की आवश्यकता है। इसके अलावा, एमआरआई अंतर नहीं कर सका कि क्या SPIO नैनोप्रोब्स विशेष रूप से बैक्टीरिया या मोनोसाइट्स से बांध सकते हैं या क्या इन जांचों को एंडोसाइटोस किया गया था ।

निष्कर्ष में, हमने जैव संगत एसपीआईओ-एमटीबीएसएबी नैनोप्रोब्स तैयार करने और चित्रित करने के लिए एक स्पष्ट और व्यवहार्य प्रोटोकॉल विकसित किया है। ये नैनोप्रोब हाइड्रोफिलिक हैं और शारीरिक परिस्थितियों में अच्छी तरह से तितर-बितर होते हैं; वे कम सांद्रता पर न्यूनतम साइटोटॉक्सिक होते हैं। इसके अलावा, ये एसपीआईओ-एमटीबीएसएबी नैनोप्रोब्स एमटीबी संक्रमण को लक्षित करने और उनका पता लगाने में सक्षम बनाते हैं, जैसा कि हमारे इन विट्रो और वीवो अध्ययनों में दिखाया गया है। इस प्रकार, एसपीआईओ-एमटीबीएसएबी नैनोप्रोब्स को ईटीबी का पता लगाने के लिए एमआरआई कंट्रास्ट एजेंट के रूप में लागू किया जा सकता है।

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Disclosures

इस अध्ययन में जांची गई सामग्रियों में किसी भी लेखक की मालिकाना रुचि नहीं है।

Acknowledgments

लेखक इस शोध कार्य को करने के लिए अर्थव्यवस्था मंत्रालय ताइवान (अनुदान एनएससी-101-2120-एम-038-001, अधिकांश 104-2622-बी-038-007, अधिकांश 105-2622-बी-038-004) से वित्तीय सहायता के लिए आभारी हैं। इस पांडुलिपि को वालेस अकादमिक संपादन द्वारा संपादित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(benzotriazol-1-yloxy) tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate Sigma-Aldrich
1-hydroxybenzotriazole Sigma-Aldrich
dextran(T-40) GE Healthcare Bio-sciences AB
epichlorohydrin, 2,2'-(ethylenedioxy)bis(ethylamine) Sigma-Aldrich
ferric chloride hexahydrate Fluka
ferrous chloride tetrahydrate Fluka
Human monocytic THP-1
M. bovis BCG Pasteur Mérieux Connaught strain; ImmuCyst Aventis
MRI GE medical Systems 3.0-T, Signa
NH4OH Fluka
NMR relaxometer Bruker NMS-120 Minispec
Sephacryl S-300 GE Healthcare Bio-sciences AB
Sephadex G-25 GE Healthcare Bio-sciences AB
SPECTRUM molecular porous membrane tubing, 12,000 -14,000 MW cut off Spectrum Laboratories Inc
TB surface antibody- Polyclonal Antibody to Mtb Acris Antibodies GmbH BP2027
transmission electron microscope JEOL JEM-2000 EX II

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References

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