पालक Thylakoid के पृथक्करण देशी ग्रीन जेल ट्रो और बैंड द्वारा समय-संबंधित एकल फोटॉन गिनती का उपयोग करते हुए प्रोटीन परिसरों

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Summary

यहां हम देशी ग्रीन जेल ट्रो द्वारा solubilized thylakoid परिसरों को अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । ग्रीन जेल बैंड बाद में समय की विशेषता है संबंधित एकल फोटॉन गिनती (TCSPC) और डेटा विश्लेषण के लिए बुनियादी कदम प्रदान की जाती हैं ।

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Schwarz, E., Blanchard, G. Separation of Spinach Thylakoid Protein Complexes by Native Green Gel Electrophoresis and Band Characterization using Time-Correlated Single Photon Counting. J. Vis. Exp. (144), e58470, doi:10.3791/58470 (2019).

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Abstract

प्रकाश संश्लेषण की हल्की प्रतिक्रियाओं thylakoid झिल्ली में pigmented प्रोटीन परिसरों की एक श्रृंखला द्वारा किए जाते हैं । stoichiometry और इन परिसरों के संगठन दोनों लंबे और छोटे समय प्रक्रियाओं है कि पर्यावरण की स्थिति बदलने के लिए प्रकाश संश्लेषण के कारण तराजू पर अत्यधिक गतिशील है (यानी, गैर photochemical शमन, राज्य संक्रमण, और दीर्घकालिक प्रतिक्रिया) । ऐतिहासिक रूप से, इन प्रक्रियाओं को क्लोरोफिल प्रतिदीप्ति में परिवर्तन के संदर्भ में spectroscopically बताया गया है, और स्पेक्ट्रोस्कोपी संश्लेषक मापदंडों की निगरानी के लिए एक महत्वपूर्ण विधि बनी हुई है. वहां तरीकों की एक सीमित संख्या में अंतर्निहित प्रोटीन जटिल गतिशीलता visualized किया जा सकता है । यहां हम उच्च संकल्प जुदाई और thylakoid परिसरों, देशी ग्रीन जेल ट्रो के दृश्य के लिए एक तेज और सरल विधि का वर्णन । इस विधि समय के साथ युग्मित-हरी जेल पर अलग बैंड के क्लोरोफिल प्रतिदीप्ति गुणों के विस्तृत लक्षण वर्णन के लिए एक फोटॉन गिनती संबद्ध है ।

Introduction

संश्लेषक जीवों लगातार अपनी उत्पादकता को अधिकतम करने के लिए पर्यावरण की स्थिति को बदलने के लिए उनके शरीर विज्ञान को समायोजित करना होगा और सफलतापूर्वक पड़ोसियों के साथ प्रतिस्पर्धा1. यह विशेष रूप से प्रकाश संश्लेषण की हल्की प्रतिक्रियाओं के लिए जिंमेदार मशीनरी के सच है, के रूप में परिवेश प्रकाश स्थितियों छाया और पूर्ण धूप के बीच परिमाण के तीन आदेश द्वारा उतार चढ़ाव कर सकते हैं । इसके अतिरिक्त, सूखा, ठंडा, या गर्मी तनाव जैसे पर्यावरणीय कारकों कार्बन निर्धारण के लिए कार्बन डाइऑक्साइड की उपलब्धता को कम कर सकते हैं, जो प्रकाश प्रतिक्रियाओं के उत्पादों के लिए प्राकृतिक इलेक्ट्रॉन सिंक है । पौधों चाहिए, इसलिए, फसल और के रूप में संभव के रूप में कुशलतापूर्वक सौर विकिरण का उपयोग करते हुए आवश्यक के रूप में अतिरिक्त प्रकाश ऊर्जा के अपव्यय की क्षमता को बनाए रखने । जबकि photooxidative नुकसान अभी भी नियमित रूप से सभी प्रकाश की स्थिति2,3, अवशोषित उत्तेजना ऊर्जा को सफलतापूर्वक प्रबंधित विफलता भयावह कोशिका क्षति और मौत के लिए नेतृत्व कर सकते है के तहत होता है । कई अनुकूली तंत्र मौजूद है कि संश्लेषक तंत्र की अनुमति देने के लिए दोनों प्रचलित पर्यावरणीय परिस्थितियों में परिवर्तन करने के लिए और क्षणिक उतार चढ़ाव (यानी, दोनों लंबी और छोटी timescales पर)4। इनमें दीर्घकालिक प्रतिक्रिया (बाएं से दाएं) और गैर-photochemical शमन (NPQ) शामिल हैं । NPQ खुद को राज्य संक्रमण (क्यूटी), तेजी से inducible ऊर्जा शमन (qE), और photoinhibition (क्वी)5सहित कम से कम तीन अंय घटक घटनाएं, शामिल माना जाता है ।

इन प्रक्रियाओं को मूल रूप से मनाया गया और मोटे तौर पर स्पेक्ट्रोस्कोपी घटना के संदर्भ में परिभाषित [उदाहरण के लिए, NPQ मनाया क्लोरोफिल प्रतिदीप्ति में एक बूंद को संदर्भित करता है (क्लोरोफिल प्रतिदीप्ति के शमन) है कि की दर में वृद्धि के कारण नहीं है photochemistry]6. शब्द "राज्य संक्रमण" इसी तरह साई और PSII7से प्रतिदीप्ति के सापेक्ष राशि में मनाया परिवर्तन को संदर्भित करता है । जबकि स्पेक्ट्रोस्कोपी तकनीक है कि इन संभव घटना के गणन बनाया है [विशेष रूप से, पल्स आयाम संग्राहक (पाम) प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी] और में संश्लेषक प्रक्रियाओं को देख और विदारक के लिए एक महत्वपूर्ण साधन होने के लिए जारी vivo, जैव रसायन का एक बड़ा सौदा इन स्पेक्ट्रोस्कोपी टिप्पणियों अंतर्निहित तंत्र स्पष्ट करने के लिए आवश्यक है । राज्य संक्रमण, उदाहरण के लिए, STN7 कळेनासे और TAP38/PPH1 फॉस्फेट, क्रमशः8,9,10द्वारा LHCII प्रोटीन का एक फास्फारिलीकरण/dephosphorylation चक्र शामिल है । यह चक्र LHCII ट्रिमर्स के एक हिस्से को PSII से PSI तक ले जाकर दोनों photosystems के बीच LHCII एंटीना के भौतिक वितरण को समायोजित करता है, जिससे photosystems11,12के अवशोषण क्रॉस सेक्शन को बदल देता है । NPQ के qE घटक तेजी से violaxanthin/zeaxanthin epoxidation/de-epoxidation चक्र और PsbS प्रोटीन की क्रियाओं के माध्यम से गर्मी में अतिरिक्त उत्तेजना ऊर्जा धर्मांतरित । इस प्रक्रिया में PsbS की सटीक भूमिका को अब भी पूरी तरह13नहीं समझ पाए हैं । NPQ के क्वी घटक, photoinhibition, आम तौर पर PSII के D1 प्रोटीन को नुकसान जिंमेदार माना है । पूर्ण संश्लेषक क्षमता की बहाली के लिए एक विस्तृत मरंमत की प्रक्रिया को क्षतिग्रस्त PSII photocenters तय की आवश्यकता है । PSII मरंमत चक्र PSII परिसरों के बाहर से बाहर है, इस परिसर का ध्वस्तीकरण, क्षतिग्रस्त D1 प्रोटीन के प्रतिस्थापन, PSII परिसरों के पुनर्विधानसभा, और PSII परिसरों के आंदोलन को वापस करने के लिए शामिल है... photoinhibition और PSII धूप की सटीक प्रकृति15गहन जांच का विषय बनी हुई है ।

राज्य संक्रमण या PSII मरंमत की तरह घटनाएं अध्ययन में कठिनाई तथ्य यह है कि वहां जटिल जैव रासायनिक प्रणालियों के यांत्रिकी कल्पना करने के लिए एक सरल तरीका नहीं है से भाग में उठता है । एक प्रक्रिया को समझने के लिए क्लासिक जैव रासायनिक दृष्टिकोण पहले अपने घटकों को अलग करने के लिए इतना है कि वे अलगाव में विशेषता हो सकती है । देशी जेल ट्रो 1980 के दशक में सफल प्रयासों से उठी और अधिक preparative तरीकों (अर्थात् सुक्रोज ढाल केंद्रापसारक और क्रोमैटोग्राफी)16के साथ thylakoid झिल्ली से photosystem परिसरों की विशेषता । डिटर्जेंट को धीरे thylakoid झिल्ली से देशी परिसरों solubilize विकसित प्रणालियों जल्द ही electrophoretic जुदाई तरीकों के लिए अनुकूलित थे, सबसे विशेष रूप से एलन और Staehelin17 और और पीटर और Thornber18, वृद्धि दे को देशी ग्रीन जेल ट्रो । जबकि प्रयोगात्मक शस्त्रागार में तकनीक की एक किस्म के बाहर केवल एक का प्रतिनिधित्व, देशी पृष्ठ आकर्षक विशेषताओं है कि यह प्रकाश संश्लेषण अनुसंधान में एक व्यापक रूप से कार्यरत विधि बना दिया है की एक संख्या है । देशी पृष्ठ अपेक्षाकृत तेज और सरल है, थोड़ा विशेष उपकरणों की आवश्यकता है, जबकि thylakoid परिसरों की एक बड़ी संख्या के एक साथ उच्च संकल्प जुदाई प्रदान करते हैं । यह मूल पृष्ठ thylakoid गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए एक सुविधाजनक उपकरण बनाता है और, जब दूसरे आयाम में मानक पृष्ठ के साथ संयुक्त रूप में के रूप में अच्छी तरह से डिटर्जेंट और बफर सिस्टम, खोजने और निस्र्पक नए thylakoid परिसरों के लिए एक बहुमुखी प्रणाली की एक किस्म ।

यह कहा जा रहा है, देशी हरी जैल विशेष रूप से अनुभवहीन हाथों में एक अविश्वसनीय तकनीक, होने के लिए एक प्रतिष्ठा पड़ा है, के रूप में यह गरीब कुछ बैंड के साथ फजी, गंदा जैल से मिलकर परिणाम का उत्पादन करने के लिए आसान है. इस समस्या का हल था, भाग में, नीले-मूल पृष्ठ19की शुरूआत के साथ । बीएन बफर सिस्टम में coommassie डाई का उपयोग प्रोटीन जुदाई को और मजबूत बनाता है । इसलिए, बीएन-पृष्ठ अक्सर एक रिश्तेदार नौसिखिया के लिए स्थापित करने के लिए और thylakoid परिसरों के उच्च संकल्प जुदाई प्रदान कर सकते हैं के लिए एक आसान और अधिक विश्वसनीय तकनीक है । इन कारणों के लिए, बीएन पेज इस क्षेत्र के अधिकांश काम के लिए पसंद की विधि बन गया है । जबकि बीएन-पृष्ठ आम तौर पर ग्रीन जेल ट्रो से चलाने के लिए धीमी है, इसकी मुख्य खामी यह है कि coommassie डाई दाग बेहोश क्लोरोफिल युक्त बैंड की पहचान के साथ हस्तक्षेप, जबकि भी बहाव स्पेक्ट्रोस्कोपी लक्षण समस्याग्रस्त ।

देशी जैल और 2d एसडीएस द्वारा प्रदान की जैव रासायनिक जानकारी-पृष्ठ स्पेक्ट्रोस्कोपी तकनीक से डेटा के साथ संयुक्त जब बहुत मजबूत किया जा सकता है । व्यवस्था की परवाह किए बिना, स्थानीय जैल का उपयोग करने के लिए परिसर की पहचान के साथ एक केंद्रीय समस्या यह है कि पहचान हमेशा चुनौती दी जा सकता है (यानी, प्रोटीन एक बैंड में पाया हमेशा comigrating परिसरों या घटकों का प्रतिनिधित्व कर सकता है, बल्कि एक भी शारीरिक प्रामाणिक जटिल से) । स्पेक्ट्रोस्कोपी लक्षण वर्णन ग्रीन जेल बैंड में pigments के बारे में भौतिक जानकारी प्रदान करता है और परिसरों के किस प्रकार वे शामिल होने की संभावना है यह निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । क्लोरोफिल प्रतिदीप्ति विशेष रूप से इस संबंध में अक्सर नाटकीय रूप से अलग स्पेक्ट्रा और प्रतिदीप्ति जंमों कि अलग संश्लेषक वर्णक-प्रोटीन परिसरों की विशेषता है की वजह से उपयोगी है । जबकि सरल स्थिर राज्य 77K प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रा ऐतिहासिक मूल जेल परिसरों की पहचान की पुष्टि करने में उपयोगी हो गया है, आधुनिक समय से संबंधित एकल फोटॉन गिनती (TCSPC) बहुत अधिक जानकारी प्रदान कर सकते हैं. TCSPC न केवल प्रतिदीप्ति जंमों पर आधारित परिसरों के लक्षण वर्णन की अनुमति देता है, लेकिन यह भी एक जटिल भीतर वर्णक्रमीय घटकों के बीच ऊर्जा हस्तांतरण के विस्तृत विवरण संभव बनाता है । लक्षण वर्णन के इस तरह के विभिंन देशी जेल प्रणालियों फैलता है और नए ख्यात परिसरों के उपयोग के रूप में तेजी से आवश्यक होता जा रहा है की खोज की, प्रोटीन परिसरों की पहचान की अनुमति के लिए बेहतर प्रमाणीकृत और नए प्रदान कैसे इन परिसरों काम के बारे में भौतिक जानकारी ।

इस पत्र में हम एक तरीका है कि देशी जेल ट्रो के साथ कम या कोई अनुभव होने की अनुमति देता है प्रदान करने के लिए उच्च गुणवत्ता के संकल्प को प्राप्त करने के लिए देशी thylakoid परिसरों के प्रकाश प्रतिक्रियाओं के यांत्रिकी की जांच के प्रयोजन के लिए संश्लेषण. इस बुनियादी तकनीक तो प्रयोगकर्ता के विवेक पर संवर्धित किया जा सकता है परिणाम में सुधार या अंय प्रजातियों के लिए प्रयोज्यता का विस्तार । हम तो TCSPC के लिए देशी ग्रीन जेल बैंड subjecting के लिए प्रक्रिया का वर्णन है, साथ ही साथ बुनियादी विश्लेषण और तकनीक द्वारा प्रदान की डेटा की प्रस्तुति के लिए कुछ कदम । TCSPC विश्लेषण के साथ देशी जेल ट्रो के युग्मन प्रमाणीकरण और बैंड के भीतर प्रोटीन परिसरों के भौतिक लक्षण वर्णन प्रदान करके इन जेल प्रणालियों की उपयोगिता फैली हुई है । ग्रीन जेल प्रणाली यहां वर्णित है कि एलन और Staehelin द्वारा विकसित17 कुछ संशोधनों के साथ पर आधारित है और Schwarz एट अलमें इस्तेमाल किया है कि के रूप में ही है । 20. इस प्रणाली के कई में से एक है, लेकिन विशिष्ट सुविधाओं है कि इस पद्धति के लिए उपयोगी होते हैं । यह काफी तेजी से इतना है कि thylakoid अलगाव, जेल ट्रो, और TCSPC विश्लेषण सुविधाजनक एक दिन में प्रदर्शन किया जा सकता है, obviating नमूना भंडारण और क्षरण की संभावित समस्याओं । हम यह भी पाते है कि इस विधि अनुभवहीन उपयोगकर्ताओं के हाथों में मजबूत है, जबकि अभी भी परिणाम है कि अच्छा करने के लिए बेहतर से लेकर, अनुकूलन की डिग्री के आधार पर प्रदान करते हैं ।

यह ध्यान में रखना महत्वपूर्ण है कि एक देशी जेल पर visualized परिसरों दोनों डिटर्जेंट और बफर इस्तेमाल किया प्रणालियों पर निर्भर करता है, साथ ही जांच के तहत जीव के जीव विज्ञान पर । विभिंन डिटर्जेंट और बफर सिस्टम तरजीही परिसर के विभिंन प्रकार अलग है, और एक दिया संश्लेषक जीव अंय जीवों से अलग परिसरों होगा, जिनमें से सभी किसी भी परिस्थिति में मौजूद होगा । यहां वर्णित प्रणाली विशेष रूप से साई megacomplexes के अध्ययन के लिए अनुकूल है, के रूप में Schwarz एट अलमें वर्णित है । 20, लेकिन यह PSII megacomplexes का अध्ययन करने वालों के लिए स्पेक्ट्रम की अधिक स्थिरीकरण अंत पर पड़ता है । thylakoid प्रोटीन के देशी जेल ट्रो में इस्तेमाल विभिंन डिटर्जेंट और बफर सिस्टम के एक व्यापक अध्ययन के लिए, यह Järvi एट अलकी समीक्षा करने की सिफारिश की है । 21 और Rantala एट अल. 22.

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Protocol

1. स्टॉक समाधान देशी ग्रीन जैल डालने के लिए तैयारी

  1. ४०% ग्लिसरॉल, २०० mm glycine, और १०० mm Tris पीएच ८.३ के लिए बफर शामिल जैल हल करने के लिए एक 4x केंद्रित बफर समाधान तैयार करें ।
  2. ४०% ग्लिसरॉल, २०० mm glycine, और १०० mm Tris पीएच ६.३ के लिए बफर शामिल जैल स्टैकिंग के लिए एक 4x केंद्रित बफर समाधान तैयार करें ।
  3. मोल्ड की वृद्धि को रोकने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इन बफ़र्स की दुकान ।
    नोट: बफ़र्स 4 ° c पर महीनों के लिए स्थिर हैं, इसलिए निरंतर उपयोग के लिए प्रत्येक बफ़र की 100-200 मिलीलीटर की तैयारी अनुशंसित है ।
  4. २५० मिमी Tris एचसीएल पीएच ८.३, १.९२ मीटर glycine, और 1% एसडीएस युक्त 10x चल बफर के 1 एल तैयार करें । benchtop पर 10x चल रहे बफर स्टोर ।

2. Thylakoids के अलगाव और Solubilization के लिए स्टॉक समाधान तैयारी

  1. ५० mm Tris बफर (पीएच 7), 10 मिमी MgCl2, और 10 मिमी KCl, और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर युक्त TMK homogenization बफर के १०० मिलीलीटर तैयार करें ।
    नोट: thylakoid नमूनों को अनुमन्य और हेर-फेर के लिए यह मुख्य बफर है । वैकल्पिक रूप से, ध्यान केंद्रित स्टॉक समाधान तैयार किया जा सकता है और आवश्यक के रूप में पतला (Tris बफर, MgCl2, और KCl सभी आसानी से 1 मीटर ध्यान केंद्रित के रूप में benchtop पर संग्रहीत किया जा सकता है) ।
  2. thylakoid solubilization डिटर्जेंट, बी-decyl maltoside (डीएम) और एन-octyl बी डी-glucoside (ओग) के शेयर समाधान तैयार, TMK बफर में प्रत्येक डिटर्जेंट 20% डब्ल्यू में भंग करके/1 एमएल aliquots में-20 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज ।
  3. thylakoid solubilization बफर (SB) है, जो भी नमूना लोड हो रहा है बफर तैयार करते हैं ।
    1. सबसे पहले, TMK बफर और ग्लिसरॉल के 3 mls के 7 mls के संयोजन से TMK-ग्लिसरॉल बफर बनाओ ।
    2. TMK-ग्लिसरॉल बफर के ८०० μL के लिए, डीएम स्टॉक समाधान के १०० μL और μL स्टॉक सॉल्यूशन के १०० ओग जोड़ें । इस SB काम समाधान स्टोर, 2% डीएम और 2% ओग, 1 मिलीलीटर aliquots में-20 डिग्री सेल्सियस पर जम युक्त ।
      नोट: प्रत्येक aliquot की आवश्यकता के अनुसार गल और जम सकती है ।

3. बाद में उपयोग के लिए हरी मिनी जैल डालना

  1. अलग स्टैकिंग तैयार करें और 15 मिलीलीटर डिस्पोजेबल परीक्षण ट्यूबों में जेल समाधान को हल ।
    नोट: प्रदान की मात्रा १.५ mm प्लेट स्पेसर का उपयोग कर एक मिनी जेल के लिए पर्याप्त हैं ।
    1. स्टैकिंग जेल समाधान बनाने के लिए, 4x स्टैकिंग जेल बफर के १.२५ मिलीलीटर, ४०% acrylamide स्टॉक समाधान (39:1 सी) की ०.५ मिलीलीटर, और पानी की ३.२५ मिलीलीटर का मिश्रण 1x स्टैकिंग बफर में 4% acrylamide की 5 मिलीलीटर देना । हल करने के लिए जेल समाधान बनाने के लिए १.८७५ एमएल के 4x हल बफर, ०.९४ मिलीलीटर की ४०% acrylamide स्टॉक समाधान (39:1 C), और ४.७ मिलीलीटर पानी की ७.५ मिलीलीटर देने के लिए 5% acrylamide में 1x समाधान बफर ।
  2. संपति जेल डालो ।
    1. 10% अमोनियम persulfate (एपीएस) के ५० μL को हल करने के लिए जेल समाधान जोड़ें, फिर TEMED के 10 μL जोड़ें, ट्यूब कैप, और धीरे से पलटने के लिए कई बार मिश्रण । तुरंत जेल प्लेटों के बीच जेल समाधान डालना, को हल करने जेल के शीर्ष के बीच लगभग 1 सेमी जा रहा है और स्टैकिंग जेल के लिए कंघी दांत के नीचे ।
    2. धीरे जेल के स्तर को सुलझाने जेल के शीर्ष पर १००% इथेनॉल पिपेट ।
      नोट: जेल 15 मिनट के भीतर सेट नहीं करता है, तो ताजा अनुप समाधान किया जाना चाहिए और/या नए TEMED इस्तेमाल किया जाना चाहिए ।
    3. के बाद जेल बहुलक है (जेल और इथेनॉल के बीच इंटरफेस आसानी से दिखाई जाएगी और कदम नहीं होगा जब जेल इत्तला दे दी है), बंद इथेनॉल और एक शोषक कागज के साथ दाग डालना ।
  3. स्टैकिंग जेल डालो ।
    1. स्टैकिंग जेल समाधान के लिए 10% एपीएस के 25 μL जोड़ें, TEMED के 5 μL जोड़ें, फिर कैप और एक ही तरीके से संपति जेल के रूप में मिश्रण करने के लिए पलटना । प्लेटों के बीच अंतरिक्ष पूरी तरह से भरा हुआ है और एक 10-अच्छी तरह से कंघी डालने जब तक संपति जेल के शीर्ष पर जेल समाधान डालो ।
      नोट: जब इस्तेमाल किया जा करने के लिए तैयार है, कंघी जेल से हटा दें और कुओं पानी से कुल्ला, सुनिश्चित करें कि कुओं सीधे और जेल से अबाधित कर रहे हैं । जेल में जगह में कंघी के साथ संग्रहीत किया जा सकता है 4 डिग्री सेल्सियस कम कई दिनों के लिए ।

4. पालक के पत्तों से क्रूड Thylakoid झिल्ली का अलगाव

नोट: सभी कदम बाहर बर्फ पर किया जाना चाहिए पूर्व ठंडा उपकरण और बफ़र्स का उपयोग कर । मंद प्रकाश की भी सिफारिश की है । प्रयोगकर्ता के विवेक और अध्ययन के तहत जैविक प्रक्रियाओं पर निर्भर करता है, को छेड़ो और/फॉस्फेट अवरोधकों TMK बफ़र्स के लिए ताजा homogenization से पहले जोड़ा जाना चाहिए ।

  1. पूरी तरह से homogenize पालक एक गिलास Dounce homogenizer के साथ TMK बफर में छोड़ देता है ।
    नोट: बफर के लगभग 1 से 2 मिलीलीटर सामान्य रूप से एक छोटे से बच्चे पालक पत्ती के लिए पर्याप्त है । एक भी बच्चे पालक पत्ती आम तौर पर पर्याप्त सामग्री प्रदान करने के लिए एक १.५ mm मिनी जेल पर कई कुओं लोड कर सकते हैं ।
  2. अघुलनशील मलबे को हटाने के लिए क्रूड लीफ homogenate को फिल्टर करें ।
    1. एक सरल फ़िल्टरिंग डिवाइस बनाने के लिए, एक नाजुक कार्य पोंछ आधे में कटौती और यह तिमाहियों में गुना । एक 5 मिलीलीटर डिस्पोजेबल सिरिंज और TMK बफर के साथ पोंछ पूर्व गीला के तल में नाजुक टास्क पोंछे पैक ।
    2. अतिरिक्त बफर नाजुक कार्य पोंछे से बाहर प्रेस करने के लिए सिरिंज गोताख़ोर का प्रयोग करें और सुनिश्चित करें कि पोंछ फ़िल्टर गोताख़ोर निकाल दिया गया है के बाद सिरिंज के नीचे करने के लिए मजबूती से दबाया जाता है ।
    3. पिपेट को पोंछे फिल्टर के केंद्र पर पत्ता homogenate और फिल्टर के माध्यम से homogenate पारित करने के लिए गोताख़ोर का उपयोग करें । एक १.५ मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब में फ़िल्टर्ड homogenate लीजिए ।
  3. thylakoid झिल्ली सहित, अघुलनशील सामग्री गोली करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए ५,००० x g पर homogenate केंद्रापसारक । supernatant त्यागें और TMK बफर के 1 मिलीलीटर में गोली resuspend ।
  4. प्रत्येक नमूने क्लोरोफिल की एक ही कुल राशि, नीचे वर्णित के रूप में होता है ताकि प्रत्येक resuspend thylakoid नमूना की मात्रा का समायोजन करके प्रत्येक नमूने में क्लोरोफिल की मात्रा को सामान्य.
    नोट: यह एक नमूना डिटर्जेंट की एक ही मात्रा में solubilized होने की अनुमति देगा और गोली मात्रा में अंतर के कारण solubilization में परिवर्तनशीलता को कम करता है ।
    1. resuspend thylakoid झिल्ली के प्रत्येक नमूने से क्लोरोफिल निकालने के लिए, एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में एक ५० μL aliquot ले और इसे करने के लिए μL के ९५० मेथनॉल जोड़ें । कई बार पलटने से ट्यूब और मिक्स कैप ।
    2. मेथनॉल/क्लोरोफिल निकालने के लिए 10 मिनट के लिए १०,००० एक्स जी में छर्रों उपजी प्रोटीन ।
    3. Porra एट अलके अनुसार supernatant युक्त वर्णक के क्लोरोफिल एकाग्रता का निर्धारण । 23. ६५२ और ६६५ एनएम एक spectrophotometer और एक 1 सेमी cuvette का उपयोग कर पर अवशोषक रीडिंग ले लो । निर्धारित कुल क्लोरोफिल एकाग्रता नीचे समीकरण का उपयोग:
      Chls a + b (μg/mL) = २२.१२ (abs ६५२ nm) + २.७१ (abs ६६५ एनएम)
    4. एक गाइड के रूप में क्लोरोफिल एकाग्रता माप का प्रयोग, हटाने और प्रत्येक नमूने से कुछ मात्रा को त्यागें, आवश्यक के रूप में, ताकि प्रत्येक ट्यूब क्लोरोफिल की एक ही कुल राशि शामिल हैं ।
  5. पुन: ५,००० एक्स जी पर 10 मिनट के लिए केंद्रापसारक द्वारा thylakoid झिल्ली गोली निकालें और supernatant को त्यागें । गोली के किसी भी aspirating बिना सभी supernatant को दूर करने के लिए सावधान रहें ।

5. देशी जैल पर लोड करने के लिए Thylakoid झिल्ली की Solubilization

  1. गल एक aliquot के TMK 30% ग्लिसरॉल डिटर्जेंट सॉल्यूशन (SB) और पलटने के लिए कई बार मिश्रण. इसे बर्फ पर रखें ।
  2. SB के उपयुक्त मात्रा को जोड़कर thylakoid गोली भंग 1 मिलीग्राम/एमएल के क्लोरोफिल एकाग्रता देने के लिए ।
    नोट: यह एकाग्रता इष्टतम solubilization की स्थिति है, जो empirically निर्धारित किया जाना चाहिए खोजने के लिए एक प्रारंभिक बिंदु है । क्लोरोफिल एकाग्रता नमूने के बीच ही रखा जाना चाहिए करने के लिए वैध तुलना की अनुमति है ।
  3. पिपेट ऊपर और नीचे बार समय के लिए नमूने के फेन से बचने के लिए सावधान किया जा रहा है । thylakoid नमूनों को solubilize की अनुमति देने के लिए बर्फ पर रखें ।
    नोट: कम से Solubilize 10 मिनट के लिए । Solubilization समय काफी लंबा होना चाहिए कि नमूनों के बीच Solubilization समय में अंतर को कम किया जाता है.
    उदाहरण: यदि सभी नमूनों को solubilize करने के लिए 3 मिनट की आवश्यकता है, तो solubilization के लिए लगभग 30 मिनट की अनुमति होनी चाहिए ।
  4. केंद्रापसारक solubilized thylakoids पर १०,००० x जी में 4 डिग्री सेल्सियस के लिए अघुलनशील सामग्री गोली ।
    नोट: Solubilized thylakoid नमूने घंटे के लिए बर्फ पर स्थिर हैं, लेकिन भंडारण पर-७० ° c से बचा जाना चाहिए, के रूप में फ्रीज-गल चक्र megacomplex बैंड की हानि में परिणाम कर सकते हैं ।

6. देशी जेल ट्रो द्वारा Solubilized Thylakoid प्रोटीन की जुदाई

  1. पहले तैयार देशी जेल पर सीधे चरण ५.४ में तैयार solubilized thylakoid supernatant लोड । एक १.५ mm जेल के लिए, solubilized thylakoid के 15 μL को अच्छी तरह से लोड करें ।
  2. एसडीएस-पृष्ठ जैल 1x चल बफर का उपयोग कर के रूप में अनिवार्य रूप से एक ही तरीके से देशी ग्रीन जेल भागो । चलाने के १०० V पर जेल और गीले बर्फ पर जेल के प्रतिरोधक ताप को कम करने के लिए चलाने की अवधि के लिए पूरे जेल टैंक जगह है ।
    नोट: जेल (चित्रा 1) जेल के नीचे तक पहुंचने के लिए प्रवास के मोर्चे पर मुक्त वर्णक के लिए लगभग 2 घंटे की आवश्यकता चाहिए ।

7. देशी ग्रीन जैल से Thylakoid कॉम्प्लेक्स बैंड्स का एक्साइज

नोट: एक्साइज जेल से ब्याज की विशिष्ट बैंड की अनुमति के लिए आवश्यक है बैंड बीम पथ में रखा जा करने के लिए और आसपास के परिसरों से आवारा प्रतिदीप्ति को रोकने के लिए एकत्र किया जा रहा से ।

  1. ट्रो सेल से जेल निकालें और आसुत पानी के साथ जेल प्लेटों से दूर चल बफर कुल्ला । जेल से ऊपर थाली निकालें और आसुत जल के साथ जेल कुल्ला ।
  2. निचली शीशे की प्लेट पर जेल रखें और जेल और प्लेट को बर्फ पर लगाएं । जब उपयोग में नहीं, अंधेरे में जेल रखने के लिए और एक प्लास्टिक लपेटो बाहर सुखाने से रोकने के साथ कवर ।
  3. ग्लास प्लेट पर शेष जेल के साथ, TCSPC विश्लेषण के लिए तैयार जब ब्याज की प्रत्येक बैंड उत्पाद । एक तेज स्केलपेल या उस्तरा ब्लेड के साथ साफ रूप से एक्साइज बैंड और ध्यान रखना है कि एक्साइज बैंड कोई दूषित बैंड सामग्री शामिल हैं ।

8. कमरे के तापमान स्थिर-राज्य प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रा का संग्रह

  1. प्रत्येक जटिल है कि TCSPC द्वारा विश्लेषण किया जाएगा के लिए, एक कमरे के तापमान प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रम ६०० और ८०० एनएम के बीच एक प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग कर लिया जाता है ।
    नोट: उत्तेजना तरंग दैर्ध्य इस स्पेक्ट्रम इकट्ठा करने के लिए इस्तेमाल किया तरंग दैर्ध्य TCSPC के लिए इस्तेमाल मैच चाहिए ।

9. ग्रीन जेल बैंड के TCSPC

नोट: TCSPC सेटअप के चित्रण के लिए चित्र 2 देखें ।

  1. सैंडविच जेल टुकड़ा दो ग्लास माइक्रोस्कोपी स्लाइड के बीच । का प्रयोग करें मास्किंग टेप, माइक्रोस्कोपी स्लाइड में से एक के प्रत्येक छोर पर रखा और कई बार जोड़, स्पेसर बनाने के लिए ताकि स्लाइड एक साथ मजबूती से जेल टुकड़ा सेक के बिना आयोजित किया जा सकता है ।
    नोट: यह खुर्दबीन स्लाइड के बीच और जेल टुकड़ा के माध्यम से पारित करने के लिए लेजर बीम के लिए एक रास्ता बना देगा ।
  2. एक चिकनी अंतरफलक है कि संकेत बिखरने कम हो जाएगा बनाने के लिए गिलास स्लाइड के किनारे पर जेल टुकड़ा करने के लिए पानी की एक छोटी राशि जोड़ें ।
  3. बीम पथ में जेल काट/स्लाइड सैंडविच कि किरण हमले प्लेटों के खुले किनारे के माध्यम से जेल टुकड़ा, प्रतिदीप्ति उत्सर्जन की अनुमति कांच स्लाइड जिसमें जेल सैंडविच, सीधा करने के लिए बीम पथ के पक्ष के माध्यम से हो सकता है ।
    नोट: उत्तेजना तरंग दैर्ध्य प्रयोग पर निर्भर करेगा । ४३५ एनएम के एक तरंग दैर्ध्य दोनों क्लोरोफिल एक और क्लोरोफिल बी उत्तेजित होगा, जबकि ४६५ एनएम अधिमानी क्लोरोफिल बी उत्तेजित होगा इस मामले में, ४३५ एनएम उत्तेजना तरंग दैर्ध्य के रूप में इस्तेमाल किया गया था ।
  4. प्रत्येक परिसर के लिए प्रतिदीप्ति उत्सर्जन स्पेक्ट्रम भर में नियमित अंतराल पर १०,००० कुल डेटा बिंदुओं को इकट्ठा । उदाहरण के लिए, हर 10 एनएम डेटा इकट्ठा, ६८० एनएम से शुरू और ७५० एनएम पर समाप्त ।
    नोट: ताजा नमूना photobleaching पर्याप्त संकेत संग्रह से बचाता है कि घटना में उपलब्ध है कि इतना अध्ययन किया जा करने के लिए प्रत्येक जटिल के लिए एकाधिक जेल बैंड तैयार.

10. TCSPC (डाटा एनालिसिस)

  1. एक दिया परिसर के लिए, पहले सभी तरंग दैर्ध्य एकत्र के लिए प्रत्येक क्षय वक्र की चोटी ऊंचाई को सामान्य.
    नोट: यह कदम दास के निर्माण के लिए आवश्यक नहीं है, लेकिन क्षय curves के लिए अनुमति देता है मढ़ा जा करने के लिए और नेत्रहीन की तुलना में डेटा का एक पहला निरीक्षण के रूप में एक दूसरे के साथ ।
  2. पूंछ-नीचे वर्णित के रूप में जटिल के स्थिर राज्य प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रम के लिए प्रत्येक क्षय वक्र मैच ।
    1. एक timepoint के बाद जो क्षय संकेत बाहर चपटा है, आमतौर पर कुछ नैनोसेकंड के बाद चुनें ।
    2. प्रत्येक तरंग दैर्ध्य के लिए, क्षय वक्र को सामान्य ताकि चयनित timepoint पर संकेत तीव्रता कि तरंग दैर्ध्य पर स्थिर राज्य प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रम के मूल्य के बराबर है (यानी, चयनित timepoint पर एक साथ सभी तरंग दैर्ध्य के मूल्यों फिर से संभलकर राज्य प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रम बनाना होगा).
  3. नीचे वर्णित के रूप में पूंछ-मिलान क्षय घटता से क्षय-एसोसिएट स्पेक्ट्रा (दास) का निर्माण ।
    1. पूंछ से डेटा बिंदुओं का प्रयोग-मिलान क्षय curves नियमित समय अंतराल पर प्रतिदीप्ति तीव्रता बनाम तरंग दैर्ध्य भूखंडों की एक श्रृंखला का निर्माण (जैसे, हर 10 ps) । उदाहरण के लिए, ५० ps पर दास ५० ps बनाम तरंग दैर्ध्य में प्रत्येक क्षय वक्र के मूल्य की साजिश रचने के द्वारा बनाई गई है ।
    2. समय के साथ प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रम की क्षय से पता चलता है कि एक झरना शैली साजिश बनाने के लिए क्षय जुड़े स्पेक्ट्रा के सभी ओवरले.

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Representative Results

ग्रीन जेल ट्रो के लिए प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 1में प्रस्तुत कर रहे हैं । लेन 1 पालक thylakoids के ग्रीन जेल ट्रो के लिए आदर्श परिणाम का एक उदाहरण प्रदान करता है, जिसमें स्पष्ट, तेज हरी बैंड की एक अधिकतम संख्या दिखाई दे रहे हैं । इन परिणामों के हिस्से में कुछ हद तक असामान्य हैं, क्योंकि नहीं लेन 1 में देखा बैंड के सभी एक दिए गए नमूने में आम तौर पर मौजूद हैं. अतिरिक्त नमूना क्लीनअप, thylakoid solubilization से पहले chloroplast आइसोलेशन के रूप में, और ग्रैडिएंट जेल ट्रो (4-7% acrylamide) भी सामान्य रूप से इष्टतम परिणाम प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं । लेन 2 और 3 वर्तमान और अधिक विशिष्ट परिणाम एक 5% गैर ढाल जेल के साथ संयोजन के रूप में यहां विस्तृत प्रोटोकॉल का उपयोग कर हासिल की । लेन 4, 5, और 6 thylakoid नमूना के अंडर-solubilization की डिग्री बढ़ाने के कारण खराब परिणामों का एक उदाहरण प्रदान करते हैं । लेन 7 ठेठ Arabidopsis thylakoids के बजाय पालक के साथ प्राप्त परिणामों का एक उदाहरण प्रदान करता है । ध्यान दें कि Arabidopsis के लिए जेल के शीर्ष पर megacomplex बैंड के लिए खराब हो जाते है पालक में उन की तुलना में हल कर रहे हैं ।

मूल ग्रीन जेल बैंड से डेटा एकत्रित करने के लिए उपयोग किया गया TCSPC सेटअप का ग्राफ़िक चित्रण चित्र 2में दिखाया गया है । आकृति 3 TCSPC डेटा के रूप में चरण 10 में वर्णित संग्रहीत किया गया है के बाद विश्लेषण प्रारंभ करने के लिए कोई विशिष्ट वर्कफ़्लो दिखाता है । जब TCSPC डेटा एकत्र किया जाता है, एक दिया तरंग दैर्ध्य में प्रत्येक वक्र डेटा बिंदुओं की एक मनमानी संख्या का प्रतिनिधित्व करता है, या "मायने रखता है." जब इन घटता एक दूसरे के साथ मढ़ा, जैसा चित्र 3में दिखाया गया है, curves एक दूसरे के साथ तुलना नहीं की जा सकती सीधे क्योंकि वे एक ही स्तर पर प्रतिनिधित्व नहीं कर रहे है और सभी एक ही शुरू करने के समय बिंदु पर पंजीकृत नहीं हो सकता है । डेटा विश्लेषण में पहला कदम इसलिए अपनी इसी साधन प्रतिक्रिया समारोह (IRF) के लिए प्रत्येक वक्र तुलना है । किसी दिए गए वक्र के लिए IRF का पीक समय t = 0 के लिए सेट है, और इसी प्रतिदीप्ति क्षय वक्र के अग्रणी किनारे सेट है IRF के अग्रणी किनारे ओवरलैप करने के लिए, जैसा चित्र 3 बीमें दिखाया गया है । यह बाद में विश्लेषण के लिए एक ही समय रजिस्टर करने के लिए सभी curves सेट होगा ।

हालांकि यह दास के निर्माण के लिए आवश्यक नहीं है, सभी curves को सामान्य करने के लिए इस बिंदु पर एक ही शिखर ऊंचाई करने के लिए डेटा की एक पहली विश्लेषण के रूप में किया जा करने के लिए घटता के बीच एक उपयोगी तुलना की अनुमति देता है. चित्रा 3सी में, चित्र 3 ए में प्रस्तुत LHCII के लिए एक ही क्षय घटता समय पंजीकरण के बाद दिखाए जाते हैं, चित्र में के रूप में बीमें, और चोटी ऊंचाई सामांय । के रूप में चित्रा 3 डीमें देखा, विभिंन परिसरों से पीक सामान्यीकृत क्षय घटता तो एक दिया तरंग दैर्ध्य में एक दूसरे के साथ मढ़ा जा सकता है, की अनुमति परिसरों के बीच व्यवहार में मतभेद visualized होगा । उदाहरण के लिए, LHCII एक विशिष्ट रूप से लंबे समय तक रहता है प्रतिदीप्ति कि धीरे क्षय, जबकि साई प्रतिदीप्ति दृढ़ता से बुझती है, बहुत तेजी से चरमरा गई है । बैंड 5 प्रतिदीप्ति क्षय वक्र बहुत विचारोत्तेजक डेटा का एक दिलचस्प उदाहरण प्रदान करता है, भाग में, क्योंकि यह स्पष्ट रूप से biphasic है । बैंड के लिए प्रारंभिक प्रतिदीप्ति क्षय वक्र 5 परिसर के लिए साई के रूप में एक ही दर इस प्रकार लगभग ५०० पुनश्च अभी भी अधिक तेजी से इसके बाद क्षय । इस तरह के पेचीदा परिणाम क्षय संबंधित स्पेक्ट्रा (दास) के निर्माण से आगे विस्तार में विश्लेषण किया जा सकता है.

चित्रा 4में, प्रतिनिधि दास झरना भूखंडों LHCII और बैंड 5 परिसर के लिए दिखाए जाते हैं । दास का निर्माण पहले की आवश्यकता है कि एक जटिल दिया परिसर के लिए कमरे के तापमान प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रम के लिए पूंछ मिलान के लिए क्षय घटता है, के रूप में ११.२ कदम में वर्णित है । LHCII के लिए पूंछ मिलान क्षय curves के परिणाम चित्रा 4aमें दिखाए जाते हैं । दास तो इन curves से निर्माण कर रहे है के रूप में चरण ११.३ में वर्णित है । LHCII के लिए दास क्षय वक्र चित्रा 4a में दिखाया गया है और परिणाम चित्रा 4Bमें प्रस्तुत कर रहे है से निर्माण किया गया । दास के बीच 0 और १०० पुनश्च स्पष्टता के लिए लोप कर दिया गया, और केवल हर १०० अलग LHCII के लिए विशिष्ट रूप से धीमी क्षय के कारण उसके बाद पुनश्च प्रस्तुत किया । LHCII के लिए दास गतिशील सुविधाओं की कमी के लिए उल्लेखनीय है, और LHCII प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रम का आकार समय के साथ संकेत क्षय के रूप में ही रहता है. प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रम की सड़न में भी देरी हो रही है, १०० पीएस को मैक्सिमम प्रतिदीप्ति तक पहुंचने की जरूरत है । यह पता चलता है, के रूप में पृथक प्रकाश संचयन प्रोटीन परिसरों के लिए उंमीद की जाएगी, कि ऊर्जा प्रतिदीप्ति क्षय के रूप में परिसर के भीतर ऊर्जावान अलग pigments के बीच स्थानांतरित नहीं है । इस के लिए अपवाद पहले १०० पुनश्च के दौरान होने वाली स्पेक्ट्रम में बदलाव, संभवतः जटिल भर में उत्तेजना ऊर्जा के प्रारंभिक पुनर्वितरण के कारण है ।

बैंड 5 परिसर के लिए दास चित्रा 4cमें दिखाया गया है, LHCII के लिए दिखाया गया है कि इसी तरह के फैशन में निर्माण किया । बैंड 5 कई मायनों में LHCII के लिए एक शिक्षाप्रद कंट्रास्ट प्रदान करता है । LHCII की तुलना में, बैंड से प्रतिदीप्ति 5 बहुत अधिक तेजी से क्षय, केवल 30 पुनश्च में अधिकतम तीव्रता तक पहुंचने और ५०० पी एस के बाद प्रारंभिक तीव्रता से कम 20% करने के लिए क्षय । बैंड 5 परिसर के प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रम भी उत्सर्जन क्षय के रूप में दिलचस्प गतिशीलता के एक नंबर प्रदर्शित । 0 और ६० पर स्पेक्ट्रा की तुलना पुनश्च स्पष्ट रूप से प्रतिदीप्ति में ६८० और ७१० एनएम पर प्रतिदीप्ति की कीमत पर ७२० एनएम में वृद्धि से पता चलता है । इसके बाद, ६८० एनएम में चोटी ६९० एनएम की ओर खिसकती है और व्यापक है, जबकि ७२० एनएम पर चोटी ७१० एनएम की ओर वापस शिफ्ट (जैसे, ६० पी एस से ५०० ps की तुलना करें) । इस प्रकार के डेटा LHCII से साई एंटीना और अंततः साई कोर के लिए ऊर्जा हस्तांतरण के लिए सबूत उपलब्ध कराने, जबकि unconnected LHCII ऐंटेना प्रोटीन की उपस्थिति से बाहर शासन में मदद करता है ।

इन गतिशीलता भी ६८० एनएम, ६९० एनएम, ७१० एनएम, और ७२० एनएम के आसपास अनसुलझे चोटियों होने की संभावना है कि सुझाव है । यह डेटा इसलिए एक उदाहरण प्रदान करता है जहां वर्णक्रमीय सुविधाओं को करीब के अंतराल पर TCSPC डेटा एकत्रित करके बेहतर तरीके से सुलझाया जा सकता है (उदा. हर 10 एनएम के बजाय प्रत्येक 5 एनएम) । यहां तक कि उच्च वर्णक्रमीय संकल्प के अभाव में, हालांकि, बैंड 5 परिसर के लिए दास एक जटिल के भीतर कई fluorescing प्रजातियों के बीच ऊर्जा हस्तांतरण के लिए सबूत का एक उदाहरण हैं । वहां भी ७४० एनएम के ऊपर एक तेजी से चरमरा चोटी प्रतीत होता है, सुझाव है कि डेटा भी एक व्यापक स्पेक्ट्रम पर एकत्र किया जाना चाहिए आगे वर्णक्रमीय सुविधाओं में शामिल हैं ।

Figure 1
चित्रा 1: प्रतिनिधि ग्रीन जेल परिणाम । ग्रीन जेल बैंड TCSPC विश्लेषण के अधीन हैं लेबल साई-LHCII (photosystem मैं LHCII megacomplexes), साई (photosystem मैं LHCI), बैंड 5 (साई-LHCII परिसर), PSII-LHCII (photosystem द्वितीय और संबद्ध प्रकाश संचयन परिसर द्वितीय), PSII (photosystem द्वितीय कोर परिसर), और LHCII (प्रकाश कटाई परिसर द्वितीय) । लेन 1 solubilization और ग्रीन जेल ट्रो पर एक 4-7% acrylamide ढाल जेल से पहले chloroplast अलगाव से उत्पंन एक आदर्श बैंडिंग पैटर्न से पता चलता है । लेन 2 और 3 साधारण thylakoid अलगाव और ट्रो से औसत परिणाम दिखाने के एक गैर ढाल 5% acrylamide जेल पर । गलियाँ 4-6 के तहत बढ़ती गंभीरता दिखाने के solubilization । लेन 7 सरल प्रोटोकॉल का उपयोग कर Arabidopsis के लिए प्रतिनिधि परिणामों से पता चलता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: समय की योजनाबद्ध-एकल फोटॉन गिनती साधन संबंधित. प्रकाश स्रोत एक निष्क्रिय मोड-बंद NdYVO4 लेजर कि पंप एक गुहा डाई लेजर फेंक दिया है । 5-चर दोहराव दरों और तरंग दैर्ध्य पर पुनश्च दालों एक autocorrelator का उपयोग कर विशेषता है । दालों विभाजित कर रहे हैं, एक एक संदर्भ photodiode करने के लिए जा रहा है और बाकी नमूना रोमांचक भाग के साथ । नमूना उत्सर्जन एक खुर्दबीन उद्देश्य का उपयोग कर एकत्र की है, और ध्रुवीकरण घटकों दो डिटेक्शन चैनलों का उपयोग कर पाए जाते हैं । नमूना उत्सर्जन का पता लगाने इलेक्ट्रॉनिक्स का उपयोग कर हल समय है इंगित किया गया, जहां CFD = निरंतर अंश भेदभावकर्ता, टीएसी = समय से आयाम कनवर्टर, और एमसीए = मल्टी चैनल विश्लेषक । समय रिज़ॉल्यूशन इंस्ट्रूमेंट प्रतिसाद फ़ंक्शन (ca. ४० ps) से निर्धारित होता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: प्रतिनिधि कच्चे TCSPC डेटा और सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति क्षय घटता. (क) LHCII के लिए कच्चे TCSPC डेटा के ओवरले । TCSPC डेटा ६७० एनएम और ७४० एनएम के बीच हर 10 एनएम एकत्र किया गया था (ख) एक प्रतिनिधि वक्र प्रतिदीप्ति डेटा के समय पंजीकरण के साधन प्रतिक्रिया समारोह (IRF) दिखा । (ग) सभी curves उनके संबंधित IRFs के लिए पंजीकृत किया गया था के बाद 1 की अधिकतम पीक ऊंचाई करने के लिए सामान्यीकृत (A) से LHCII डेटा । (घ) साई, PSII, PSII-LHCII, LHCII, और बैंड 5 के लिए ६८० एनएम पर प्रतिदीप्ति क्षय curves के ओवरले । सभी क्षय curves 1 की अधिकतम चोटी ऊंचाई करने के लिए सामान्यीकृत थे । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: झरना शैली दास का निर्माण । (क) दास भूखंडों के निर्माण के लिए तैयारी में LHCII के लिए क्षय वक्रों का पुच्छ मिलान. (ख) समय टी के लिए LHCII के लिए दास भूखंडों = 0, १०० से ५०० ps के लिए हर १०० ps के लिए, और १००० ps. (ग) बैंड 5 हर 30 टी = 0 से २१० ps और हर १०० ps के लिए पी एस के लिए दास भूखंडों ५०० पी एस के लिए । दोनों (ख) और (ग) के लिए, समय = 0 IRF है, जो ४० पुनश्च है द्वारा परिभाषित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

एक सफल thylakoid solubilization और देशी जेल रन महत्वपूर्ण विरूपण या बैंड के धब्बा के बिना जेल पर कई अलग दिखाई हरी बैंड के संकल्प में परिणाम होगा । जेल, एक उच्च डिटर्जेंट एकाग्रता, एक गलत नमूना पीएच, undissolved सामग्री, जेल भी तेजी से या बहुत अधिक तापमान पर चल रहा है, और एक अनुचित रूप से डाला जेल सभी कारक है कि खराब हल thylakoid परिसरों में योगदान कर सकते हैं । जबकि जेल ही (जैसे, acrylamide ढाल सांद्रता) की शर्तों का अनुकूलन, यह ब्याज की बैंड के संकल्प को अधिकतम करने में मदद कर सकते हैं । यह हमारा अनुभव है कि solubilization स्थितियों और जीव विज्ञान नमूना सामग्री ही सबसे महत्वपूर्ण मूल हरी जैल पर हल thylakoid परिसरों की गुणवत्ता और मात्रा में योगदान कारक हैं । यह याद रखना महत्वपूर्ण है कि सभी जटिल सभी जैविक परिस्थितियों में मौजूद नहीं रहेंगे ।

देशी हरी जैल सामान्य एसडीएस-पृष्ठ मिनी जैल के रूप में अनिवार्य रूप से एक ही तरीके से डाला जाता है । जैल सुबह में डाला जा सकता है और बाद में एक ही दिन का उपयोग करने के लिए तैयार हैं, या वे जेल में कंघी और प्रदर्शन में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन के साथ कई दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है । मानक, आसानी से उपलब्ध 39:1 C acrylamide समाधान स्टैकिंग और संपति जैल दोनों डालने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । तथाकथित "बड़ी ताकना" जैल उच्च acrylamide का उपयोग किया जा सकता: बीआईएस-acrylamide अनुपात (जैसे, 100:1 ग) जैल के शीर्ष पर megacomplexes की जुदाई को बढ़ाने के लिए, लेकिन हम पाते हैं कि यह भी कम तेजी से हल बैंड में परिणाम करने के लिए जाता है. हमारे अनुभव में, उच्चतम बैंड संकल्प (अलग बैंड की सबसे बड़ी संख्या के साथ) कम सी अनुपात में हासिल की है और एक रैखिक acrylamide 5-7% की एकाग्रता ढाल के साथ । हालांकि, अगर एक ढाल पूर्व उपलब्ध नहीं है, बहुत संतोषजनक बैंड जुदाई और संकल्प के आसपास 5% acrylamide की एक संपति जेल एकाग्रता के साथ प्राप्त किया जा सकता है । यह महत्वपूर्ण है कि ट्रो अपेक्षाकृत कम वोल्टेज पर बाहर किया जा जेल, जो परिसरों स्वभाव सकता है हीटिंग को कम करने के लिए, और मूल परिसरों उच्च संकल्प के साथ एक दूसरे से अलग करने की अनुमति है ।

यहां दी thylakoid अलगाव के लिए विधि तेजी से लेकिन अपेक्षाकृत "गंदा" है (यानी, यह अंय organelles या thylakoid झिल्ली से अंय कोशिका झिल्ली से chloroplasts अलग करने का प्रयास नहीं करता है) । यह thylakoid परिसरों और बाद में प्रतिदीप्ति-आधारित माप visualizing के प्रयोजनों के लिए पर्याप्त है, क्योंकि केवल क्लोरोफिल युक्त प्रोटीन की कल्पना कर रहे हैं । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि अन्य बहाव अनुप्रयोगों के लिए (जैसे, दूसरा आयाम एसडीएस-पृष्ठ और प्रोटीन का पता लगाने), गैर-thylakoid प्रोटीन मौजूद होंगे । यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि सबसे अच्छा संकल्प प्राप्त होता है जब chloroplasts solubilization से पहले अलग कर रहे हैं, संभवतः solubilization से पहले अघुलनशील सामग्री को हटाने के कारण. यहाँ वर्णित विधि का पालन करते समय, अन्य homogenization विधियों जैसे ब्लेंडर का उपयोग किया जा सकता है, लेकिन एक ग् Dounce homogenizer तेजी से और प्रभावी होता है और सभी homogenized लीफ सामग्री को मात्रात्मक बनाए रखने की अनुमति देता है । बफर-टू-लीफ सामग्री का अनुपात हमारे ज्ञान के लिए महत्वपूर्ण नहीं दिखाई देता है । लगभग एक बच्चे पालक पत्ती के एक आधे के लिए बफर के 2 मिलीलीटर एक सुविधाजनक प्रारंभिक बिंदु है, लेकिन प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के आधार पर समायोजित किया जा सकता है ।

क्लोरोफिल के लिए solubilization बफर के उचित अनुपात ग्रीन जेल प्रदर्शन के अनुकूलन के लिए महत्वपूर्ण है और एक दिया संयंत्र प्रजातियों या प्रयोगात्मक सेटअप के लिए प्रयोगकर्ता द्वारा निर्धारित किया जाना चाहिए । उचित solubilization एक सफेद स्टार्च गोली के ऊपर एक स्पष्ट, गहरे पन्ना-ग्रीन supernatant में परिणाम होगा । सफेद गोली के शीर्ष पर हरे रंग की सामग्री की एक परत इंगित करता है कि thylakoids के तहत किया गया है-solubilized । के तहत solubilization से बचा जाना चाहिए, के रूप में यह जेल पर गरीब प्रवास में परिणाम होगा, बैंड के धब्बा सहित, और एक सटीक बैंडिंग पैटर्न प्रदान नहीं करेगा । इस विधि द्वारा उत्पादित thylakoid छर्रों resuspend और solubilize करने के लिए आसान होना चाहिए. कॉंपैक्ट छर्रों के मामले में जो जल्दी से resuspend नहीं किया जा सकता है और homogeneously एक वैकल्पिक पद्धति की सिफारिश की है । नमूने पहले TMK-ग्लिसरॉल बफर की आधी मात्रा में resuspend किया जा सकता है, जो तो TMK की एक अतिरिक्त आधा मात्रा जोड़ा-ग्लिसरॉल बफर डिटर्जेंट की एक 2x एकाग्रता युक्त ।

से अधिक solubilization भी बचा जाना चाहिए, क्योंकि यह कुछ megacomplex बैंड के घनत्व के नुकसान में परिणाम हो सकता है । साथ ही, यह ओवर-solubilization के लिए जेल पर नमूना की एक बड़ी मात्रा लोड करके बनाने के लिए संभव नहीं है-हमने पाया है कि एक १.५ mm जेल पर अच्छी तरह से नमूना प्रति के 15 μL से अधिक लोड हो रहा है जुदाई की गुणवत्ता कम कर देता है; हालांकि, ऐसा करने के लिए कम बहुतायत के साथ परिसर कल्पना करने के लिए वांछनीय हो सकता है । इसके विपरीत, 15 μL से कम लोड हो रहा है बैंड संकल्प में सुधार और धब्बा कम कर सकते हैं, लेकिन कुछ कम घनत्व बैंड की दृश्यता कम हो जाएगा । सामान्य में, दोनों वृद्धि हुई प्रोटीन एकाग्रता और बढ़ी हुई डिटर्जेंट एकाग्रता बैंड विरूपण और जेल धब्बा करने के लिए योगदान.

ग्रीन जेल परिसरों के समय-संबंधित एकल फोटॉन काउंटिंग (TCSPC) विश्लेषण के लिए, उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य को उनके विवेक पर प्रयोगकर्ता द्वारा चुना जाना चाहिए । हमारे प्रयोजनों के लिए, चुना उत्तेजना तरंग दैर्ध्य ४३५ एनएम था, जो दोनों क्लोरोफिल एक और क्लोरोफिल बी उत्तेजित हो सकता है विभिंन तरंग दैर्ध्य, तथापि, विशिष्ट क्लोरोफिलों या अंय pigments अधिक चुनिंदा उत्तेजित (उदाहरण के लिए इस्तेमाल किया, एक उत्तेजना ४६५ एनएम के आसपास तरंग दैर्ध्य को तरजीह देंगे क्लोरोफिल बी उत्तेजित) । इसी तरह, एक प्रतिदीप्ति उत्सर्जन स्पेक्ट्रम ६८० से ७४० एनएम के लिए एक क्षेत्र को कवर LHCII, साई, और PSII के लिए रिपोर्ट उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के आधार पर चुना गया था । इसलिए, इस क्षेत्र में हमारे प्रयोजनों के लिए ब्याज की सभी प्रासंगिक वर्णक्रम सुविधाओं को शामिल किया गया । तरंग दैर्ध्य अंतराल जिस पर डेटा एकत्र कर रहे है भी प्रयोगकर्ता के विवेक पर निर्भर हैं । हर 10 एनएम के बजाय हर 5 एनएम के रूप में छोटे अंतराल, यह एक अधिक विस्तृत क्षय जुड़े स्पेक्ट्रम का निर्माण करने के लिए संभव बना देगा, लेकिन यह अधिक समय की आवश्यकता है और आवश्यक नहीं हो सकता है. इसके विपरीत, अब अंतराल प्रासंगिक वर्णक्रमीय विवरण को हल करने में विफल हो सकता है ।

बस विभिंन परिसरों से सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति क्षय घटता ओवरले उन परिसरों के बारे में जानकारी प्रकट प्रदान कर सकते हैं । प्रतिदीप्ति LHCII से, उदाहरण के लिए, विशिष्ट रूप से लंबे समय तक रहता है, जबकि प्रतिदीप्ति साई से अधिक तेजी से क्षय । ध्यान इस बिंदु पर लिया जाना चाहिए साधन प्रतिक्रिया समारोह (IRF) के खिलाफ डेटा की जांच करने के लिए सुनिश्चित करें कि मनाया क्षय कैनेटीक्स अस्थाई साधन की प्रतिक्रिया समय से हल कर रहे हैं ।

TCSPC डेटा से क्षय से जुड़े स्पेक्ट्रा (दास) का निर्माण chromophores के बीच ऊर्जा हस्तांतरण के एक बहुत अधिक विस्तृत चित्र बनाता है जो बस अलग क्षय घटता पर देख से संभव है की तुलना में एक जटिल के भीतर. जब दास का निर्माण, स्थिर राज्य प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रम के लिए TCSPC क्षय curves के पूंछ मिलान आवश्यक है क्योंकि TCSPC द्वारा एकत्र संकेत की तीव्रता मनमानी है । ऐसे ५,००० पुनश्च के रूप में लंबे समय अंक पर, तथापि, एक दिया तरंग दैर्ध्य में प्रतिदीप्ति तीव्रता (क्षय की "पूंछ") कि तरंग दैर्ध्य के लिए स्थिर राज्य प्रतिदीप्ति तीव्रता के रूप में ही है । स्थिर-राज्य प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रम इसलिए TCSPC क्षय के सभी को सामान्य करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि उनकी पूंछ स्थिर राज्य स्पेक्ट्रम के बराबर हैं. यह प्रत्येक क्षय वक्र के लिए प्रतिदीप्ति संकेत की सही सापेक्ष तीव्रता देता है । दास की पूरी श्रृंखला, जब एक साथ झरना साजिश शैली में मढ़ा, समय के साथ प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रम के क्षय का एक ग्राफिक चित्रण प्रदान करता है । यदि भूखंडों लंबे समय अंक के लिए बाहर किया जाता है (क्षय curves की पूंछ के लिए) झरना भूखंड स्थिर राज्य प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रम के लिए सभी तरह क्षय होगा । सबसे जल्द समय बिंदु, दूसरी ओर, TCSPC साधन की प्रतिक्रिया समारोह द्वारा निर्धारित किया जाता है ।

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Disclosures

लेखकों के हितों का कोई टकराव की घोषणा ।

Acknowledgments

मिशिगन राज्य विश्वविद्यालय में रसायन विज्ञान विभाग द्वारा अनुदान और सहायता प्रदान की गई ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glycine Sigma G8898
Tris base Sigma #648310
SDS Sigma L3771
Decyl Maltoside Sigma D7658 n-decyl beta d maltopyranoside, not dodecyl maltoside or alpha decyl maltoside
Octyl Glucoside Sigma O8001
Acrylamide BioRad 161-0148 37.5/1 C 40% solution
TEMED BioRad 161-0800
Ammonium Persulfate BioRad 161-0700
Magnesium Chloride Sigma M2670
Potassium Chloride Sigma P9333

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References

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