Visualisierung der tangentialen Zellwanderung in den Entwicklungsländern Küken Optic Tectum

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Developmental Biology

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Summary

Wir beschreiben die Methoden für die fluoreszierenden Kennzeichnung von tangential Migration Zellen durch Elektroporation und für Zeitraffer-Aufnahmen von der markierten Zelle Bewegung in einer Wohnung-Mount-Kultur um die Migration zu visualisieren Zelle Verhalten in den Entwicklungsländern Küken optic Tectum .

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Watanabe, Y., Sakuma, C., Yaginuma, H. Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum. J. Vis. Exp. (140), e58506, doi:10.3791/58506 (2018).

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Abstract

Zeitraffer-Bildgebung ist eine leistungsfähige Methode, wandernde Zelle Verhalten zu analysieren. Nach fluoreszierende Zelle beschriften kann die Bewegung der markierten Zellen in Kultur unter Videomikroskopie aufgezeichnet werden. Für die Analyse der Zellwanderung in das sich entwickelnde Gehirn, ist Stück Kultur verbreitet Zellwanderung parallel zum Abschnitt Slice wie radial Zellwanderung beobachten. Die Slice-Kultur-Methode Zellwanderung senkrecht zur Scheibe Abschnitt, z. B. tangentiale Zellwanderung analysieren kann jedoch nur begrenzte Informationen einzuholen. Hier präsentieren wir Ihnen die Protokolle für Zeitraffer-imaging zu visualisieren, tangentiale Zellwanderung in den Entwicklungsländern Küken optic Tectum. Eine Kombination aus Zelle Kennzeichnung durch Elektroporation in Ovo und eine anschließende Wohnung-Mount-Kultur auf dem Handy-Kultur-Einsatz ermöglicht eine Erfassung der wandernde Zelle Bewegung in der horizontalen Ebene. Darüber hinaus ermöglicht unsere Methode Erkennung der einzelnen Zelle Verhalten und die kollektive Aktion einer Gruppe von Zellen auf lange Sicht. Diese Methode kann potenziell angewendet werden, um die sequenzielle Änderung der Leuchtstofflampen-mit der Bezeichnung Mikro-Struktur, einschließlich der axonalen Dehnung in die neuronale Gewebe oder Zellen Verschiebung im nicht-neuronale Gewebe zu erkennen.

Introduction

Mit der fortschreitenden Technik live Imaging hat das Studium der Zellmigration voran. Nach fluoreszierende Zelle beschriften kann die zeitliche Bewegung der markierten Zellen in einer Kulturschale oder in Vivo unter Videomikroskopie aufgezeichnet werden. In der Studie der neuronalen Entwicklung wurden die morphologische Veränderungen der Zellen migrieren oder verlängern Axone mit Zeitraffer Bildgebung analysiert. Für effektive Belichtung ist es wichtig, eine geeignete Methode für fluoreszierende Zelle Kennzeichnung und Gewebe Zubereitung, basierend auf dem Zweck des Experiments und Analyse anwenden. Für die Analyse der Zellwanderung in das sich entwickelnde Gehirn, wurde Slice Kultur allgemein zur Zellwanderung parallel zur Scheibe Abschnitt, z. B. radial Zelle Migration1,2,3beobachten. Die Slice-Kultur-System dient auch zur Erkennung von tangentialen Zelle Migration4,5, aber es ist nicht geeignet für die gerichtete Analyse in Fällen, wo die Zellen senkrecht zum Abschnitt Slice zerstreuen.

Die optic Tectum besteht aus einer vielschichtigen Struktur, gebildet durch radial und tangential Zellwanderung während der Embryonalentwicklung. Tectal Schichtausbildung hängt vor allem von radialen Migration der postmitotischen neuronalen Vorläuferzellen aus der ventrikulären Zone, und ihren endgültigen Bestimmungsort in den Schichten korreliert mit ihr Geburtsdatum in der ventrikulären Zone6. Für tangentiale Migration berichteten wir bereits zwei Ströme von Migrationen in den mittleren und oberflächlichen Schichten in einem entwickelnden Küken optic Tectum. In den mittleren Schichten während E6-E8 migrieren die bipolaren Zellen mit eine lange führende Prozess- und einen dünnen nachgestellten Prozess dorsal oder ventral entlang den Axon Fasciculus tectal ableitenden Axone, die dorsal-ventral7ausgeführt. Nach dieser Axophilic Migration differenzieren die Zellen multipolare Nervenzellen befindet sich in den tieferen Hautschichten. In den oberflächlichen Schichten während E7-E14 zerstreuen die Migration von Zellen horizontal durch eine verzweigte führende Prozess- und Streuung in mehrere Richtungen8zu reformieren. Nach der Migration zu dispergieren, differenzieren die letzteren Zellen schließlich oberflächliche Neuronen von verschiedenen Morphologien. In beiden Fällen ist eine Wohnung-Mount Kultur effizient, Zelle Bewegung parallel zur pial Oberfläche zu beobachten.

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für Zeitraffer-imaging zu visualisieren, tangentiale Zellwanderung in Entwicklungsländern Küken optic Tectum7,,8. Kombination von Zelle Kennzeichnung durch Elektroporation in Ovound eine anschließende Wohnung-Mount-Kultur auf dem Handy-Kultur-Einsatz ermöglicht Richtungserkennung wandernde Zelle Bewegung und Migration. Das Ziel dieser Methode ist es, Aufdeckung von sowohl einzelnen Zelle Verhalten langfristig und die kollektive Aktion einer Gruppe von Zellen in der horizontalen Ebene zu erleichtern.

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Protocol

1. Electroporation In Ovo

  1. Bereiten Sie vor, dass der Ausdruck Plasmid DNA fluoreszierende Kennzeichnung in hoher Konzentration. Isolieren Sie DNA aus 200 mL Bakterienkultur von der alkalischen Lyse-Methode mit Anionen-Austausch Spalten entsprechend des Herstellers Protokoll (Table of Materials). Mischen Sie pCAGGS-EGFP und pCAGGS-mCherryNuc auf eine Endkonzentration von 4 µg/µL.
    Hinweis: Endotoxin-freie Plasmid DNA Reinigung möglicherweise für die Elektroporation bevorzugt.
  2. Inkubieren Sie fruchtbaren Hühnereier horizontal bei 38 ° C 70 % Relative Luftfeuchtigkeit.
  3. Nach 2,5 Tagen 5 mL Albumin (Eiweiß) aus der Spitzen Seite des Eies mit 20 mL Spritze mit einer 18-Gauge-Nadel zu eliminieren und die Nadelloch mit Klebeband abdichten.
  4. Schneiden Sie die Spitze des die Eierschale mit gebogenen Schere zu öffnen ein Loch 2 cm im Durchmesser und überprüfen das Entwicklungsstadium des Embryos unter dem Stereomikroskop (17. Etappe von Hamburger und Hamilton9). Das Loch wieder mit Klebeband abdichten.
    Hinweis: Dieser Schritt kann jederzeit während der E2.5-E3.0 ausgeführt werden. 1.3 und 1.4 Schritte reduzieren Sie die Lautstärke des Embryos im Ei, eine enge Bindung des wachsenden Embryos und die Blutgefäße an der Oberschale zu vermeiden.
  5. Weiter Inkubation bis E5.5.
  6. Bereiten Sie vor, bevor Elektroporation 10 µL der genannten Plasmid DNA gefärbt mit 0,5 µL schnell grün (25 mg/mL), 10 mL autoklaviert Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit Penicillin (100 Einheiten/mL) und Streptomycin (100 μg/mL) und Mikropipetten hergestellt aus Glas-Kapillare mit einer Mikropipette Prozessor. Schneiden Sie die distalen Spitze der Mikropipette eine geeignete Größe der Poren abhängig von der Menge der DNA für die Injektion zu machen.
  7. Schneiden Sie die versiegelte Oberschale mit einer Schere zu öffnen ein Loch 2,5 cm im Durchmesser und legen Sie das Ei stabil unter dem Stereo-Mikroskop. Fügen Sie ein paar Tropfen PBS in die Eizelle. Die Viruswenig Membran, die den Embryo ohne Blutung mit zwei feinen Pinzette abziehen. Entfernen Sie das Amnion vom Kopf des Embryos.
  8. Beim Drehen des Kopfes mit einer Microspatula, injizieren 0,1-1 μL der farbigen DNA in den linksventrikulären Hohlraum der linken optic Tectum mit einer Mikropipette an einen Saugschlauch angeschlossen.
    Hinweis: Die Menge an DNA injiziert hängt vom Zweck des Experiments. Konzentrierte DNA-Lösung sollte sinken und entlang der Ventrikelwand befestigen.
  9. Legen Sie ein paar Forcep-Art Elektroden (3 mm quadratisch Elektroden mit 7 mm Abstand), so dass das Zielgebiet des optischen Tectumis zwischen (Abbildung 1Schritt 1) platziert.
    Hinweis: Die DNA ist elektroporiert auf der Anodenseite.
  10. Laden Sie einen Pre-Puls von 30 V, 1 ms mit einem Intervall von 5 ms und vier nachfolgenden Impulse von 6 V, 5 ms mit einem Intervall von 10 ms mit dem Pulsgenerator.
    Hinweis: Die elektronischen Zustand richtet sich nach der Größe und Abstand der Elektroden. Es sollte stark genug sein, effiziente Transfektion zu erreichen muss, es jedoch bescheiden genug, um die normale Entwicklung der Zielgewebe zu gewährleisten.
  11. Das Loch mit Klebeband abdichten und weiter Inkubation. Genießen Sie die Elektroden in PBS, Eiweiss mit einer Interdentalbürste in einer Plastikschale zu entfernen. Wiederholen Sie 1.7-1.11 für jedes Ei.

2. Wohnung-Mount-Kultur auf die Zelle einfügen

  1. Bereiten Sie einen Tag vor der Wohnung-Mount-Kultur, die beschichteten Zelle Kultur einfügen. Schwimmen Sie einige Zelle Kultur Einsätze auf dem autoklaviert destilliertes Wasser in der Kulturschale 10-cm-Zelle. Eine Lösung von 8 µg/mL Laminin und 80 µg/mL Poly-L-Lysin zur Deckung der Einsätze und lassen die gefloateten Einsätze in der Zelle Kultur CO2 Inkubator bei 37 ° C über Nacht zu laden.
    Hinweis: Am nächsten Tag können die beschichteten Wendeschneidplatten bei 4 ° c gespeichert werden
  2. Am Tag der Kultur an E7.0 entfernen Sie die Laminin-Poly-L-Lysin-Lösung aus dem Einfügen und platzieren Sie die Einlage in eine untere Glasschale (Abbildung 1Schritt2) gefüllt mit 1,1 mL Kulturmedium (60 % reduzierte Serum Mittel, 20 % F12, 10 % fötalen Rinderserum, 10 % Küken Serum, 50 Einheiten/mL Penicillin, 50 μg/mL Streptomycin). Halten Sie die Schüssel in die Zelle Kultur CO2 Inkubator bei 37 ° C.
    Hinweis: Das Medium kann während der gesamten Kultur drei Tage lang ohne Änderung verwendet werden.
  3. Bereiten Sie das Kultur-Setup. Legen Sie eine feuchte Kammer-Einheit auf eine invertierte confocal Mikroskop mit einem Gasstrom von 40 % O2 und 5 % CO2 (Gas-Controller) bei 38 ° C (Temperatur-Controller).
  4. Durchschneiden Sie der Kopf des Embryos mit einer Schere. Kneifen Sie begeben Sie sich mit der Zange in die eiskalte Hanks' Balanced Salzlösung (HBSS) in der Kulturschale 6-cm-Zelle.
  5. Isolieren der elektroporiert optic Tectum mit zwei feinen Pinzette. Übertragen der Tectum mit einer Pipette aus Kunststoff in einer anderen Schüssel mit eiskaltem HBSS gefüllt. Verwenden Sie die konkave Glasschale Sitz mit schwarzem Silikon als Unterteller für das Schneiden.
  6. Überprüfen Sie die Position der Beschriftung unter dem Fluoreszenz stereoskopische Mikroskop. Das tectal Gewebe der Kennzeichnung Umgebung mit einem mikrochirurgischen Messer ausschneiden. Stellen Sie sicher die Richtung des Gewebes in der Tectum (anterior-Posterior, dorsal-Ventral).
  7. Übertragen Sie das beschriftete Gewebe mit einer Kunststoff-Pipette auf den Einsatz, so dass die Pia-Seite auf den Einsatz angebracht ist. Legen Sie das tectal Gewebe in die gewünschte Richtung zu und entfernen Sie überschüssige HBSS (Abbildung 1Schritt2).
  8. Wiederholen Sie 2,4 bis 2,7 zur anderen Geweben auf der gleichen Vorbereitung einfügen. Legen Sie die Schale in die vorgewärmte Kammer in der invertierten confocal Mikroskop (Abbildung 1Schritt 3).

3. Time-Lapse Imaging

  1. Die fluoreszierende Etikettierung zu überprüfen und das Gesichtsfeld in der invertierten confocal Mikroskop konzentrieren. Starten Sie die konfokale Laser-Einheiten und versuchen Sie, probieren die konfokalen Scan um die Richtung und Position des Gewebes entlang der X- und Y-Achse im Bereich anzupassen. Verwenden Sie die 10 X oder 20 X Objektiv ohne Immersionsöl.
  2. Wählen Sie die Scan-Größe (z. B. 512 x 512 dpi). Entscheiden Sie das Intervall und die Gesamtreichweite des konfokalen Scans entlang der z-Achse. Nehmen Sie eine 5 oder 10 µm-Intervall für den 100 µm-Bereich. Bestimmen Sie das Zeitintervall für die konfokale Bildgebung und Total imaging-Dauer (z. B. 10 min Abständen über 48 h).
    Hinweis: Zur Vermeidung von Laser Phototoxizität verbieten Sie Scannen in der hohe Scan-Größe mit kurzen Z-Intervalle für die Z-Langstrecken oder mit kurzen Zeitintervallen während der langen bildgebenden Dauer. Beispielsweise wenn Sie eine hohe Scan-Größe (z. B. 1024 X 1024 dpi) anwenden, verringern Sie die Anzahl der Scans entlang der z-Achse.
  3. Satz, die Parameter der konfokalen laufendem Programm gemäß 3.2 und starten Sie imaging.
  4. Nach dem Imaging, kombinieren Sie die konfokale Bilder bei verschiedenen z-Achse Z-Stapel Bilder mit Schwerpunkt Feineinstellung zu jedem Zeitpunkt zu liefern.
  5. Fügen Sie die Z-Stapel Bilder an verschiedenen Zeit-Punkt und konstruieren Sie einen Zeitraffer-Film im AVI-Format.

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Representative Results

Abbildung 2 zeigt die visualisierte oberflächliche tangentiale Migration in einer Wohnung-Mount-Kultur zu einer verstrichene Zeit (0, 9, 18, 27 h) nach Beginn der Aufzeichnung. Film 1 ist ein Zeitraffer Film von 10 Minuten-Intervallen über einen Zeitraum von 28 h 50 min. Der Rahmen ist für die Fokussierung auf die Migration von Zellen von den beschrifteten unteren linken Ecke des Rahmens auf den unmarkierten Raum (Abbildung 3A) ausgewählt. Die Massenbewegung der Migration von Zellen (GFP; obere linke Panel, Film 1) und ihre Kerne (mCherry-Nuc; oberen rechten Bereich) mit dem zusammengeführten Film (untere Leiste, Film 1) beobachtet werden. Direktionalität der Zellwanderung kann untersucht werden, indem Sie auf die Dispergieren Zellen von den beschrifteten Mitte in alle Richtungen (Movie 2, Abb. 3 b).

Die klare Bilder von der Atom-Bewegung (Movie 2; mCherry-Nuc, rechts) ermöglicht es uns, die nukleare Zellwanderung durch automatische Nachführung mit einem Partikel Tracker Plugin10 von einem Fidschi Bildverarbeitungsanwendung von ImageJ11 verfolgen (Film 3, Abb. 3 b). Zeitliche Änderungen der Bahnen der tangentialen Migration können visualisiert werden, um die Dispergierung Migration in Omni-Richtungen zu beweisen.

Einzelne Zelle Verhalten mit der sequenziellen morphologische Veränderung des führenden Prozesses, trailing Prozess und Kerne kann mit höherer Vergrößerung Bilder von 5 min-Intervallen (Movie 4, Abbildung 3) manifestiert.

Eine andere Art von tangentialen Migration in die Mittelschichten7 kann mit ein ähnliches Protokoll (Film 5, Abbildung 3D) visualisiert werden. Bidirektionale lineare Migration entlang den Axon Fasciculus läuft dorsal, Ventral (von oben nach unten) ist offensichtlich7.

Figure 1
Abbildung 1: Protokoll-Flow-Chart. Schritt 1: Electroporation in Ovo. Schritt 2: Verlegung tectal Gewebe, so dass die Pia-Seite auf den Einsatz angebracht ist. Schritt 3: Invertierte fluoreszierende Mikroskop mit konfokale Laser-Einheit. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Visualisierung der oberflächlichen tangential Migration in der Wohnung-Mount Kultur. Tangential Migration von Zellen (GFP; obere Leiste) und Kern (mCherry-Nuc; untere Leiste) in die oberflächlichen Schichten der optic Tectum werden bei 0, 9, 18, 27 h nach Beginn der Kultur von E7.0 gezeigt. Die Zellen in der unteren linken Ecke des Rahmens sind bei 0 h gekennzeichnet (siehe Abbildung 3A). Maßstab: 100 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3. Schematische Abbildung illustriert die Mount-Bedingungen für Zeitraffer-Aufnahmen. Die Form der fluoreszierenden Beschriftung (grün), anfängliche Richtung der Zellwanderung (Magenta) und video-Frame (schwarzes Quadrat) waren illustriert mit Vergrößerung der Objektivlinse (Obj) und digitaler Zoom (Zoom) in das obere Feld mit Tag der Elektroporation (EP ) und Beginn der Kultur (Kultur) im unteren Feld. (A) Film 1, (B) Film 2 und 3, (C) Movie 4, (D) Film 5. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Movie 1
Film 1. Visualisierung der oberflächlichen tangential Migration in einer Wohnung-Mount Kultur. Bewegung der tangential Migration von Zellen (GFP; obere linke Panel) und ihre Kerne (mCherry-Nuc; rechten oberen Bereich) in den oberflächlichen Schichten des optic Tectum nach Beginn der Kultur von E7.0. Das zusammengefügte Bild wird im unteren Fensterbereich angezeigt. Die Zellen an der unteren linken Ecke des Rahmens um 0 Uhr beschriftet sind (siehe Abbildung 3A), und der Zeitraffer Aufnahmen wurden mehr als 28 h und 50 min. Maßstabsleiste: 100 µm. Bitte klicken Sie hier um dieses Video anzusehen. Mit der rechten Maustaste herunterladen.

Movie 2
Film 2. Dispergieren Bewegung der tangential Migration von Zellen (GFP; links) und ihre Kerne (mCherry-Nuc; rechts) von der Mitte der beiden Platten erscheinen mehr als 48 h (siehe Abb. 3 b). Maßstab: 100 µm. Bitte klicken Sie hier um dieses Video anzusehen. Mit der rechten Maustaste herunterladen.

Movie 3
Film 3. Bahnen der tangentialen Migration. Verschiebung des Zellkerns (der rechten Hälfte des Movie 2) wurde verfolgt, um die Flugbahnen der tangentialen Migration zu visualisieren. Maßstabsleiste; 100 µm. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzuzeigen. Mit der rechten Maustaste herunterladen.

Movie 4
Film 4. Einzelne Zelle Verhalten in stärkerer Vergrößerung. Bewegung der einzelnen Zellen (GFP; links) und ihre Kerne (mCherry-Nuc; rechts) werden angezeigt, in der höheren Vergrößerung über 24 h (siehe Abbildung 3). Verzweigte Prozess des führenden Prozesses kann erkannt werden. Maßstab: 100 µm. Bitte klicken Sie hier um dieses Video anzusehen. Mit der rechten Maustaste herunterladen.

Movie 5
Film 5. Mittlere Schicht Migration. Bewegung der tangential Migration von Zellen (GFP; links) und ihrem Kern (mCherry-Nuc; rechts) in den tectal mittleren Schichten werden über 24 h nach Beginn der Kultur von E6.0 angezeigt (siehe Abbildung 3D). Lineare Migration Achse dorsal-Ventral (von oben nach unten) ist bemerkenswert. Maßstab: 100 µm. Bitte klicken Sie hier um dieses Video anzusehen. Mit der rechten Maustaste herunterladen.

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Discussion

Das oben beschriebene Protokoll ist für die Erkennung von Zellwanderung in oberflächlichen Schichten6,8optimiert. Es ist anwendbar für die Erkennung von Mittelschicht Migration Bäche (Movie 5)6,7, nur durch Verschieben der Zeitplan für die Elektroporation (E5.5, E4.5) und dem Beginn der Kultur und Bildgebung (E7.0, E6.0).

Das vorgestellte Verfahren besteht aus Zelle Kennzeichnung durch Elektroporation in Ovo, flach-Mount Kultur und Time-Lapse confocal Imaging (Abbildung 1). Zunächst einmal ist es eine Voraussetzung, dass die Kulturbedingungen optimiert werden soll, um das Gewebe gesund und wächst normalerweise als in Vivo. Es ist auch entscheidend, um sicherzustellen, dass die Ausrichtung des Gewebes zur Erkennung von Zellwanderung geeignet ist. Für solche Zwecke wenden wir eine Wohnung-Mount-Kultur auf Zelle einfügen, die erleichtert die Beobachtung der horizontalen Zelle Dispersion und reiche Medium mit hoher Sauerstoff versorgt. Nach Sicherstellung der Kultur Zustand und Orientierung, es ist wichtig für die Visualisierung der entgegenstehende Bedingungen des besser fluoreszierende Kennzeichnung mit den wenigsten elektronischen anpassen und Foto-Schäden. Für die bessere Bezeichnung, wählen wir einen Ausdruck Vektor mit einer effizienten Promoter und Electroporate konzentriert DNA. Wenigsten Schaden um zu erreichen, ist es wichtig, moderieren den elektrischen Zustand der Elektroporation, senken die DNA-Konzentration, und die Gesamtzeit der Laserbestrahlung.

Ein Vorteil dieses Protokolls mit der Wohnung-Mount-Kultur auf die Zelle einfügen ist die tangentiale Zellwanderung auf lange Sicht zu beobachten. Generell ist es schwierig zu bestimmen, wie lange das Gewebe in der Kultur der physiologischen Bedingungen im Vergleich zu, dass in Ovounterhält. Am allerwenigsten oberflächliche tangential Migration weiter über 72 h nach Beginn der Kultur im E7.0, die normalen zellulären Streuung, dass in Ovo-8ähnlich zeigt. Darüber hinaus ist frische Gewebe zu Beginn der Kultur und der Bildgebung vorbereitet, Migration in einem späteren Stadium zu beobachten. Es ist auch vorteilhaft, daß Zelle Hubraum über einen langen Zeitraum verfolgt werden kann, weil die Zellen bewegt sich horizontal in die oberflächliche flachen Platten aus der Tectum bleiben in der Nähe der Objektivlinse. Mit dem konfokalen System erleichtert auch Tracking Handy-Bewegung entlang der z-Achse. Auf der anderen Seite ist ein Nachteil dieser Methode, dass die Wohnung-Mount-Kultur nicht immer für andere Arten der Migration wie radial Migration zu rekapitulieren relevant sein kann. Wenn die Methode angewendet wird, um radiale Migration in die tectal Scheibe auf dem Einsatz zu beobachten, erhöht die Dicke des tectal Gewebes nicht so schnell wie, dass in Ovo. Die Slice-Kultur-Methode in das Kollagen Gel möglicherweise besser, diese Schicht Entwicklung zu rekapitulieren.

Da unsere Methode die Beobachtung der horizontalen Bewegung parallel zur Kultur einfügen ermöglicht, kann potenziell zur Erkennung von sequentiellen Änderung der Leuchtstofflampen-mit der Bezeichnung Mikro-Struktur, einschließlich der axonalen Dehnung in das Nervengewebe angewendet werden oder Zelle Verschiebung in den nicht-Nervengewebe. Beispielsweise können nach Kennzeichnung commissural Axone in den Entwicklungsländern Neuralrohr durch Elektroporation, Bewegungen der Pre- und Post-Kreuzung Axone über die Bodenplatte in der Open-Book-Kultur Einritzen der Dach-Platte visualisiert werden. Vorausgesetzt, dass die entsprechende Kultur Bedingung auf die Zelle einfügen für die Reproduktion in Vivo Bedingungen verfügbar ist, bietet unsere Methode eine effektive Methode um horizontale Bewegungen der verschiedenen Zelltypen und Strukturen zu visualisieren.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde unterstützt von JSPS KAKENHI Grant-Nummer 15K 06740, Y.W.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials
NucleoBond Xtra Midi Plus EF MACHEREY-NAGEL 740422.5 endotoxin-free plasmid DNA purification kit
20 ml syringe TERUMO SS-20ESZ
18 gauge needle TERUMO NN-1838R
Fast Green Wako 061-00031
100x penicillin and streptomycin Gibco 15140-122
glass capillary tube Narishige G-1
cell culture insert Millipore Millicell CM-ORG
Laminin SIGMA L2020 coating of culture insert
poly-L-Lysine Peptide Institute 3075 coating of culture insert
glass bottom dish Matsunami D11130H
Opti-MEM Gibco 31985-070 culture medium
F12 Gibco 11765-054 culture medium
fetal bovine serum Gibco 12483 culture medium
chick serum Gibco 16110082 culture medium
10xHBSS Gibco 14065-056
microsurgical knife Surgical specialties cooperation 72-1501
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
curved scissors AS ONE No.11
micropipette processor SUTTER INSTRUMENT P97/IVF
forceps-type electrode BEX LF646P3x3
pulse generator BEX CUY21EX electroporator
fluorescence stereoscopic microscope Leica MZ16F
inverted fluorescence microscope Olympus IX81
gas controller Tokken MIGM/OL-2
temperature controller Tokai Hit MI-IBC
laser confocal unit Olympus FV300

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References

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