Polmone microRNA Profiling attraverso il ciclo estrale in topi esposti a ozono

Immunology and Infection

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Summary

Qui descriviamo un metodo per valutare l'espressione di polmone di Mirna che sono preveduti per regolare i geni infiammatori utilizzando topi esposti all'ozono o aria filtrata nelle diverse fasi del ciclo estrale.

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Fuentes, N., Silveyra, P. Lung microRNA Profiling Across the Estrous Cycle in Ozone-exposed Mice. J. Vis. Exp. (143), e58664, doi:10.3791/58664 (2019).

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Abstract

Profilatura di MicroRNA (miRNA) è diventato di interesse per i ricercatori che lavorano in diverse aree di ricerca della biologia e della medicina. Gli studi correnti indicano un promettente futuro di utilizzando miRNA nella diagnosi e cura di malattie polmonari. Qui, viene definito un protocollo per i miRNA profilatura per misurare l'abbondanza relativa di un gruppo di Mirna preveduti che regolano i geni infiammatori nel tessuto polmonare da di un modello di topo di infiammazione delle vie aeree indotta da ozono. Perché è stato dimostrato che livelli di ormoni sessuali circolanti possono influire sulla regolazione dell'immunità innata del polmone nelle femmine, lo scopo di questo metodo è di descrivere un miRNA infiammatoria profilatura protocollo nei topi femmina, prendendo in considerazione il ciclo estrale fase di ogni animale al momento dell'esposizione all'ozono. Ci rivolgiamo anche approcci di bioinformatica applicabile a miRNA discovery e destinazione metodi di identificazione tramite limma, un software R/Bioconductor, e software di analisi funzionale per capire il contesto biologico e percorsi associati con espressione differenziale dei miRNA.

Introduction

i microRNA (Mirna) sono brevi (19-25 nucleotidi), naturale, non-codificanti molecole di RNA. Sequenze di Mirna sono evolutivi conservata tra le specie, suggerendo l'importanza di miRNA nel regolare le funzioni fisiologiche1. Profilo di espressione di microRNA ha dimostrato di essere utile per l'identificazione di Mirna che sono importanti nella regolazione di vari processi, tra cui la risposta immunitaria, differenziamento cellulare, processi di sviluppo e apoptosi2. Più recentemente, Mirna sono stati riconosciuti per il loro uso potenziale nella malattia diagnostica e terapeutica. Per i ricercatori che studiano i meccanismi di regolazione genica, espressione dei miRNA di misurazione può illuminare sistemi-livello modelli di processi normativi, soprattutto quando le informazioni di miRNA sono unite con profilatura di mRNA e altri dati su scala genomica3. D'altra parte, i miRNA hanno anche dimostrati di essere più stabili di mRNA in una gamma di tipi di campioni e sono anche misurabili con sensibilità maggiore di proteine4. Questo ha portato alla notevole interesse nello sviluppo di Mirna come biomarcatori per diverse applicazioni di diagnostiche molecolare, tra cui malattie polmonari.

Nel polmone, miRNA svolgono un ruolo importante nei processi di sviluppo e il mantenimento dell'omeostasi. Inoltre, la loro espressione anormale è stato associato con lo sviluppo e la progressione di varie malattie polmonari5. Malattia infiammatoria polmonare indotta dall'inquinamento atmosferico ha dimostrato una maggiore gravità e prognosi nelle femmine, che indica che gli ormoni e il ciclo estrale può regolare del polmone innata immunità e miRNA espressione in risposta alle sfide ambientali 6. nel presente protocollo, usiamo l'esposizione dell'ozono, che è una componente importante di inquinamento atmosferico, per indurre una forma di infiammazione polmonare in topi femminili che si verifica in assenza di immunità adattativa. Utilizzando ozono, noi stiamo inducendo lo sviluppo di hyperresponsiveness della via aerea che è associato con danno delle cellule epiteliali delle vie aeree e un aumento in neutrofili e mediatori infiammatori nelle vie aeree prossimali7. Attualmente, non esistono protocolli ben descritti a caratterizzare e analizzare Mirna attraverso il ciclo estrale in topi esposti a ozono.

Di seguito, descriviamo un metodo semplice per identificare le fasi del ciclo estrale ed espressione dei miRNA nel tessuto polmonare dei topi femminili esposti all'ozono. Ci rivolgiamo anche bioinformatica efficaci approcci all'identificazione di scoperta e di destinazione di miRNA, con un'enfasi su biologia computazionale. Analizziamo i dati di microarray utilizzando limma, un software R/Bioconductor che fornisce una soluzione integrata per l'analisi dei dati di espressione genica esperimenti8. Analisi dei dati di matrice PCR da limma ha un vantaggio in termini di potenza sul t-test basato procedure quando si utilizza il piccolo numero di matrici/campioni per confrontare l'espressione. Per comprendere il contesto biologico di risultati di espressione di miRNA, abbiamo poi utilizzato il software di analisi funzionale. Al fine di comprendere i meccanismi di regolazione trascrizionale modifiche e a prevedere i risultati probabili, il software combina i set di dati di espressione dei miRNA e conoscenza dalla letteratura9. Questo è un vantaggio se confrontato con software che basta guardare per statistica arricchimento in sovrapposizione a insiemi di Mirna.

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Protocol

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) della Penn State University.

1. valutazione della fase del ciclo estrale

  1. Frenare correttamente una femmina mouse C57BL/6 (8 – 9 settimane) utilizzando la tecnica di ritenuta del mouse con una sola mano descritta in Machholz et al.10.
  2. Riempire la pipetta di plastica sterile con 10 μL di acqua ultra-pura.
  3. Introdurre la punta della pipetta di plastica nella vagina.
  4. Sciacquare delicatamente il liquido 4 – 5 volte per raccogliere il campione.
  5. Posizionare il filo finale contenente fluido vaginale su un vetrino.
  6. Osservare il rossore vaginale non colorato sotto un microscopio chiaro con un obiettivo 20x.
    Nota: Animali che non presentano cicli regolari a causa di pseudogravidanza o altre cause devono essere escluse dall'esperimento. Si consiglia di eseguire le secrezioni vaginali quotidiane per almeno tre cicli consecutivi confermare la ciclicità.

2. esposizione all'ozono

  1. Inserire un massimo di 4 topi in due contenitori di vetro di 1,2 L con coperchi di maglia di filo e acqua ad libitum.
  2. Mettere un contenitore di vetro nel suo alloggiamento di ozono e l'altro nella camera di esposizione di aria filtrata.
  3. Regolare la concentrazione di ozono ai livelli di ozono 2 ppm e monitor regolarmente.
    Nota: L'apparato di ozono fornisce un flusso d'aria regolato (> 30 aria modifiche/h) con controllo temperatura (25 ° C) e umidità relativa (50%). Il sistema genera ozono di un ozonizzatore di scarica elettrica, che è monitorato e controllato da un analizzatore di ozono ultravioletta e controllori di flusso di massa, come descritto in precedenza11.
  4. Rimuovere i contenitori di vetro dopo 3 h di esposizione di aria ozono/filtrata. Restituire gli animali per gabbia con biancheria, cibo e acqua ad libitum.

3. polmone raccolta

  1. 4 h dopo l'esposizione, anestetizzare gli animali con un'iniezione intraperitoneale di un chetamina/xilazina cocktail (90 mg/kg ketamina, xilazina 10 mg/kg).
    Nota: Per confermare un adeguato livello di anestesia, controllare il mouse per un pedale reflex (pizzico di punta costante) e regolare l'anestetico, se necessario.
  2. Inumidire la pelle del topo con etanolo al 70%.
  3. Fare un'incisione del midline di 2 cm utilizzando un funzionamento forbici e pinzette chirurgiche per esporre la vena cava.
  4. Sacrificio di topi di transection della vena cava e l'aorta. Se necessario, inserire un ago di calibro 21 G nella vena cava sopra le vene renali per raccogliere il sangue prima del dissanguamento. In alternativa, raccogliere il sangue tramite la puntura di cuore seguendo protocolli standard.
  5. Utilizzare una forbice chirurgica per tagliare aperto la cavità addominale e rimuovere pelle/superiore muscolo, lo spostamento verso l'alto verso le costole.
  6. Utilizzare una forbice chirurgica per perforare il diaframma.
    Nota: Polmoni crollerà dal diaframma.
  7. Tagliare via la gabbia toracica utilizzando una forbice chirurgica per esporre il cuore ed i polmoni.
  8. Usando il forcipe, prendere una RNAsi-libera microcentrifuga da 1,5 mL e immergerlo in azoto liquido per riempire il tubo.
    Nota: Usare occhiali e guanti protettivi per gestire azoto liquido.
  9. Rimuovere i polmoni, inserirli nella RNAsi-libera 1,5 mL microcentrifuga riempito con azoto liquido per snap-congelare il tessuto e attendere alcuni secondi fino a quando il liquido evapora.
  10. Chiudere il coperchio del tubo e conservare il tessuto a-80 ° C fino all'utilizzo.

4. RNA preparazione

  1. Polverizzare tutto polmoni utilizzando un polverizzatore di tessuto in acciaio inox.
    Nota: Il polverizzatore di tessuto deve essere disposto in azoto liquido prima dell'uso. Dopo ogni utilizzo con soluzione di RNasi, pulire il polverizzatore.
  2. Dividere i polmoni polverizzati e inserire due provette da 1,5 mL (metà del polmone).
  3. Aggiungere 500 µ l di tiocianato di guanidinium per provetta e mescolare.  Omogeneizzare ogni campione utilizzando 18g, 21g e aghi 23 G, rispettivamente.
    Nota: I campioni possono essere addizionati con 5.6 x 108 copie di un piccolo RNA spike-in control (da una specie diversa) prima di procedere con l'estrazione.
  4. Aggiungere 500 µ l di etanolo per ogni campione e vortex per 15 s.
  5. Carico la miscela in una colonna di spin in una provetta e centrifugare a 12.000 x g per 1 min. scartare il flusso continuo.
  6. Per dnasi I trattamento (in colonna);
    1. Aggiungere 400 µ l di RNA Wash Buffer e centrifugare a 12.000 x g per 1 min.
    2. In un tubo di RNAsi-libera, aggiungere 5 µ l di dnasi I e 75 µ l di digestione del DNA: 1x buffer e mescolare. Aggiungere il mix direttamente alla matrice colonna.
    3. Incubare a temperatura ambiente per 15 min.
  7. Aggiungere 400 µ l di soluzione di prelavaggio RNA alla colonna e centrifugare a 12.000 x g per 1 min. scartare il flusso continuo e ripetere questo passaggio.
  8. Aggiungere 700 µ l di tampone di lavaggio di RNA alla colonna e centrifugare a 12.000 x g per 1 min. scartare il flusso continuo.
  9. Centrifugare a 12.000 x g per 2 minuti rimuovere il tampone rimanenti. Trasferire la colonna in una provetta di RNAsi-libera.
  10. Per eluire il RNA, aggiungere 35 µ l di acqua privo di DNasi e RNasi direttamente alla matrice colonna e centrifugare a 12.000 x g per 1,5 min.
  11. Misurare la concentrazione di RNA totale (260 nm) e purezza utilizzando uno spettrofotometro. Seguire le istruzioni per eseguire la quantificazione di RNA in un campione di 1,5 µ l aliquota. Spegnete lo strumento con acqua privo di DNasi e RNasi utilizzato per eluizione.
    Nota: Un rapporto di 260/280 di ~2.0 è generalmente accettato come "puro" per il RNA. Concentrazione di RNA tipica varia solitamente tra 750 e 2.500 ng / µ l.
  12. Conservare a-80 ° C.

5. miRNA Profiling

  1. Retrò-trascrivere piccoli RNA, uso 200 ng di RNA totale.
    1. Preparare la miscela di reazione d'inversione-trascrizione su ghiaccio (volume totale per reazione è di 20 µ l). Per ogni reazione, aggiungere 4 µ l di tampone, 2 µ l di 10 x mescolano nucleotidi, 2 µ l di trascrittasi inversa e 2 µ l di acqua RNAsi-libera: 5x. Mescolare tutti i componenti e aliquota in 600 µ l RNAsi-libera tubi di plastica (10 µ l di miscela per reazione).
      Nota: Il mix master di d'inversione-trascrizione contiene tutti i componenti necessari per la sintesi del cDNA del primo-filo tranne modello RNA.
      Nota: Quando si prepara il mix master, calcolare il volume in eccesso (10%).
    2. Aggiungere il modello di RNA (200 ng in 10 µ l) in ogni provetta contenente mix master d'inversione-trascrizione. Mix, centrifuga per 15 s a 1.000 x ge memorizzarli sul ghiaccio fino alla messa in termociclatore o blocco asciutto.
    3. Incubare per 60 min a 37 ° C.
    4. Incubare per 5 minuti a 95 ° C e mettere i tubi sul ghiaccio.
    5. Diluire il cDNA aggiungendo 200 µ l di acqua RNAsi-libera in ogni reazione di d'inversione-trascrizione di 20 µ l.
  2. Eseguire PCR in tempo reale utilizzando la risposta infiammatoria del Mouse e autoimmunità miRNA Array di PCR.
    1. Preparare una miscela di reazione (volume totale 1100 µ l): per ogni reazione, aggiungere 550 µ l di 2 x PCR mix master, 110 µ l di miscela primer universale: 10x, 340 µ l di acqua RNAsi-libera e µ l 340 del modello cDNA (diluito reazione dal punto 5.1.5).
    2. Aggiungere 10 µ l di miscela di reazione ad ogni pozzetto del quieto pre-caricato matrice PCR utilizzando una pipetta multicanale.
    3. Sigillare il miRNA piastra PCR Array con pellicola adesiva ottico.
    4. Centrifugare la piastra per 1 min a 1.000 x g a temperatura ambiente per rimuovere le bolle.
    5. Programmare il ciclatore in tempo reale, la fase di attivazione iniziale di PCR per 15 min a 95 ° C, 3-passo ciclismo contenente denaturazione per 15 s a 94 ° C, ricottura per 30 s a 55 ° C e l'estensione per 30 s a 70 ° C per 40 cicli di numero.
      Nota: Segui produttore ciclismo condizioni istruzioni per impostare il ciclatore in tempo reale. Eseguire il passaggio di curva di dissociazione incorporato nel software cycler in tempo reale.
    6. Eseguire analisi di dati.

6. analisi dei dati

  1. Estrarre valori Ct dal software real time PCR per ciascun campione in un software di analisi.
    Nota: Ct A valore di 34 è considerato come Cut-off. Se i campioni contengono spike-in controllo (ad esempio, cel-mir-39), normalizzare i valori di Ct nel Raccoglitore in controllo per ciascun campione. Potrebbero essere necessario impostare manualmente i valori di soglia. Valori basali vengono impostati automaticamente.
  2. Normalizzare i valori di Ct al Ct medio di sei comandi di pulizie di miRNA: SNORD61, SNORD68, SNORD72, SNORD95, SNORD96A, RNU6-2, utilizzando la seguente equazione:
    ΔCt = (Ct_Target − Ct_housekeeping)
  3. Per fold modificare calcoli, calcolare i valori di ΔΔCt utilizzando un campione specifico del controllo, utilizzando l'espressione relativa equazione12:
    espressione di miRNA relativa:
    2-essereCt, dove - ∆∆Ct =-[∆ CT test - controllo ∆ CT]
    Nota: Un cambiamento di piega di 200 è considerato come Cut-off.
  4. Esportare piega modificare i valori di espressione per eseguire analisi statistiche su R utilizzando il pacchetto limma Bioconductor8.
  5. Correggere per i confronti multipli usando il metodo Benjamini-Hochberg13.
    Nota:  Una copia dello script R è disponibile presso: http://psilveyra.github.io/silveyralab/. Analizzati dati e DataSet sono disponibili presso il Gene Expression Omnibus sotto il numero GSE111667, anche https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE111667.

7. analisi dei dati: Analisi funzionale Software

  1. Organizzare il dataset. Includono i miRNA con loro rapporti di ceppo rispettive espressioni e valori di p. Vedere la tabella 1 per la formattazione del set di dati specifico.
  2. Software di analisi funzionale aperta (versione 01-10).
  3. Caricare il set di dati utilizzando il seguente formato: formato di File: "formato flessibile", contiene intestazione di colonna: "Sì", selezionare il tipo di identificatore: "miRBase (maturo)", piattaforma di matrice utilizzato per esperimenti: scegliere la piattaforma di matrice.
    Nota: Accettati sono formati di file. txt (file di testo delimitato da tabulazione), xls (file excel) e diff (file cuffdiff).
  4. Selezionare "Dedurre Observations" e verificare che il gruppo sperimentale di etichettatura sia corretto.
  5. Vai a "Sintesi di Dataset" di rivedere l'importo totale dei miRNA mappati e non mappati.
  6. Fare clic sul pulsante "nuovo" nella parte superiore sinistra del programma. Selezionare "Nuovo MicroRNA destinazione filtro" e caricare un dataset di microRNA.
    1. Impostare origine: TarBase, ingegno esperti risultati, miRecords.
    2. Impostata la fiducia: sperimentalmente osservato o alta (predetto).
    3. Selezionare "Aggiungi colonne" di includere una varietà di informazioni biologiche sulle destinazioni quali specie, malattie, tessuti, percorsi e altro ancora.
    4. Per concentrarsi su obiettivi che hanno cambiato espressione nell'esperimento, selezionare "Aggiungi / Sostituisci mRNA dataset". Utilizzare "Accoppiamento di espressione" per individuare i microRNA con i livelli di espressione di uguali o diversi.
      Nota: L'analisi di filtro fornirà microRNA nomi e simboli, mRNA bersaglio, la fonte che descrive la relazione di destinazione e il livello di confidenza del rapporto previsto (Figura 2).
  7. Fare clic su "Aggiungi a My Pathway" per inviare il dataset filtrato ad una tela di percorso ed esplorare altre relazioni biologiche.
  8. Utilizzare Progettazione percorso per creare un modello di pubblicazione-qualità degli effetti di microRNA.
  9. Un'opzione alternativa consiste nel creare un'analisi di base.
    1. Per tipo di analisi di base, selezionare "Analisi dell'espressione".
    2. Per tipo di misura, selezionare "Expr rapporto Log".
    3. Riepilogo di filtro di analisi: considera solo molecole e/o relazioni dove: (specie = mouse) AND (fiducia = sperimentalmente osservati) AND (origini dati = "Ingegno esperto risultati", "Ingegno ExpertAssist risultati", "miRecords", "TarBase", o " TargetScan umani").
    4. Selezionare un limite di valore di p = 0,05.
    5. Eseguire l'analisi.
      Nota: La relazione comprenderà: vie canoniche, analisi di regolatori a Monte, malattie e funzioni, effetti di regolatore, reti, molecole e altro ancora.

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Representative Results

I tipi differenti delle cellule osservati negli strisci vengono utilizzati per identificare la fase del ciclo estrale del mouse (Figura 1). Questi sono identificati dalla morfologia delle cellule. Durante il proestro, le cellule sono quasi esclusivamente gruppi di cellule epiteliali nucleate forma circolare, ben formate (Figura 1A). Quando il mouse è in fase di estro, le cellule sono cellule epiteliali squamous cornified, presenti nel cluster densamente imballato (Figura 1B). Durante il Metaestro, cellule epiteliali cornified e leucociti polimorfonucleari sono visti (Figura 1). In Diestro, leucociti (cellule piccole) sono generalmente più prevalente (Figura 1).

Abbiamo estratto il RNA da quattro polmoni del mouse seguendo il protocollo descritto in precedenza. Le concentrazioni di acido nucleico (ng / µ l) ha variato fra 1197.9 e 2178.1 con una media di 1583.1 ± 215 (tabella 1). La media rapporto A260/A280 variava da 2,010 a 2.020 con una media di 2.016 ± 0,002. D'altra parte, i rapporti A260/A230 osservati ha oscillato tra 2.139 e 2.223 con una media di 2.179 ± 0,018.

La tabella 2 Mostra i risultati di espressione differenziale ottenuti con limma su R. Abbiamo calcolato superiori Mirna differenzialmente espressi tra topi esposti all'ozono o aria in proestro (utilizzando il comando toptable)14filtrata. La prima colonna indica il valore del log2-fold fold cambiamento nell'espressione di miRNA tra ozono e aria filtrata esposto animali. La colonna t rappresenta la moderata t-statistica calcolata per ciascun miRNA nel confronto. Le colonne p.value e adj.p.value rappresentano p-valori associati per ogni confronto prima e dopo la regolazione di test multipli, rispettivamente. Regolazione per i confronti multipli è stato fatto con il Benjamini e di Hochberg metodo per controllare il tasso di falsi scoperta15. Rappresenta colonna B il registro-probabilità che i miRNA differenzialmente espresso8.

Abbiamo effettuato il miRNA destinazione filtro e core analisi che include l'analisi del percorso di arricchimento. Dopo aver caricato un elenco di 14 miRNAswith il rapporto di log di espressione significativa e il p-valore, tutti loro sono stati mappati dal filtro di destinazione di miRNA (tabella 3). I risultati sono stati filtrati e ordinati per raggiungere determinate vie, in questo caso la "risposta immunitaria cellulare". L'analisi di base fornito informazioni sulle vie canoniche, malattie e funzione, regolatori e reti (tabella 4). Il software di analisi funzionale realizzata un'analisi di rete che mostra la relazione tra i miRNA di interesse e di altre molecole (Figura 3).

Figure 1
Figura 1: identificazione delle fasi del ciclo estrale. (A) proestro (cellule epiteliali prevalentemente nucleate); (B) estro (principalmente anucleated cornified la cellule); (C) Metaestro (tutti i tre tipi di cellule); e (D) diestro 2 (maggioranza dei leucociti). Barra della scala = 100 µm. ingrandimento = 20x. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: risultati rappresentativi di software di analisi funzionale: filtro di destinazione miRNA. Profilo completo di miRNA nelle diverse fasi del ciclo estrale. Dopo aver eseguito filtro miRNA, il software fornisce elenchi dettagliati dei geni e dei composti implicati in malattie e altri fenotipi, che è possibile filtrare e ordinare per raggiungere determinate vie, in questo caso "Risposta immunitaria cellulare". Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: risultati rappresentativi di software di analisi funzionale: reti. Confronto tra reti influenzata dall'esposizione di aria o ozono filtrata nelle femmine nelle diverse fasi del ciclo estrale. Diagramma delle reti biologiche connesse con Mirna nei polmoni dei topi femminili esposti ad aria filtrata vs ozono in proestro (A) o non-proestro fasi (B). Questa figura è stata modificata da Fuentes et al.6. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

ID Acido nucleico (ng / µ l) A260/A280 A260/A230
Campione 1 1197.930 2.015 2.192
Campione 2 1355.703 2.018 2.223
Campione 3 2178.104 2.020 2.163
Campione 4 1600.837 2,010 2.139
Media 1583.144 ± 215 2.016 ± 0.002 2.179 ± 0,018

Tabella 1: esempio di concentrazioni di RNA e rapporti di assorbanza a 260, 230 e 280 nm da campioni di tessuto polmonare purificato da quattro topi. Concentrazioni sono state misurate con uno spettrofotometro.

logFC t P.Value ADJ. P.Val B
MMU-miR-694 1.492 4.071 0.000153 0.009514 0,759
MMU-miR-9-5 p 0.836 3.916 0.000254 0.009514 0.289
MMU-miR-221-3 p 0.385 3.106 0.003014 0.075361 -1.982
MMU-miR - 181d - 5p 0.597 2.891 0.005516 0.103424 -2.526
MMU-miR-98-5 p 0,558 2.699 0.009243 0.138649 -2.987
MMU-miR-712-5p 0.667 2,563 0.013169 0.164609 -3.299
MMU-miR-106a - 5p -0.528 -2.412 0.019278 0.206547 -3.632

Tabella 2: LIMMA analisi risultati per Mirna differenzialmente espressi nelle femmine esposti all'ozono vs . aria filtrata nella fase di proestro.

Mirna ID Osservazione 1 Osservazione 1 Osservazione 2 Osservazione 2
Rapporto expr Log Valore di P Rapporto expr Log Valore di P
MMU-miR-694 1.492 0.000153 0.543319208 0.0021385
MMU-miR-9-5 p 0.836 0.000254 0.677595421 0.004997439
MMU-miR-221-3 p 0.385 0.003014
MMU-miR - 181d - 5p 0.597 0.005516 0.342276659 0.106467657
MMU-miR-98-5 p 0,558 0.009243 0.455392799 0.034724699
MMU-miR-712-5p 0.667 0.013169
MMU-miR-106a - 5p -0.528 0.019278

Tabella 3: esempio di formato per l'upload di multi-osservazione dei set di dati al software di analisi funzionale. Più sperimentale espressioni differenziali possono essere raggruppate in un singolo foglio di calcolo e caricate, e possono essere aggiunto come molte osservazioni come necessario. Colonne: ID 1) Mirna; 2) osservazione 1: Rapporto di Expr Log; 3) osservazione 1: Valore P; 4) osservazione 2: Rapporto di Expr Log; 5) l'osservazione 2: Valore di P.

Non-proestro Proestro
R. geni presi di mira da differenzialmente espressi Mirna
CAMK2N1 PAFAH1B2 SEC23A ABCB9 FGD4 SLC25A27
AUTOMOBILI PDE4B SNX5 APOO FRMD4B SLC38A1
CYP24A1 PDE7A SYT4 ARHGEF38 GPR137B TMCC1
DBF4 PGM3 THAP12 AVEN HMBS TRIM71
HMGN2 PNP TMED7 CASP3 METAP1 XKR8
KMT5A REV1 TNFAIP2 CCNJ MITF ZCCHC11
LRRC17 RPS19BP1 TNFRSF10C CMTR2 MYC ZIM3
MDH2 RRAD TP53 CNMD RGMB ZNF181
MIS18A SEC62 UBE2V2 DSCR8 SLC14A1
ZNF420
B. le differenze nelle malattie top e biofunctions
Malattie e disordini Valore di P Malattie e disordini Valore di P
Malattia infiammatoria 3.84E-02 - 3.84E-05 Anomalie e lesioni organismal 4.96E-02 - 2.77E-14
Risposta infiammatoria 3.84E-02 - 3.84E-05 Malattia del sistema riproduttivo 2.15 E-02 - 2.77E-14
Anomalie e lesioni organismal 4.17E-02 - 4.17E-05 Cancro 4.96E-02 - 1.27E-10
C. principali funzioni molecolari e cellulari
Funzioni molecolari e cellulari P Valore Funzioni molecolari e cellulari P Valore
Sviluppo cellulare 2.05 E-02 - 5.26E-07 Movimento cellulare 3.77E-02 - 4.47E-07
Cellulare compromesso 3.75E-04 - 3.75E-04 Sopravvivenza e morte cellulare 4.91E-02 - 5.61E-06
Ciclo cellulare 2.62E-03 - 2.62E-03 Sviluppo cellulare 4.97E-02 - 1.38 E-06
D. top sistema fisiologico sviluppo e funzione
Sviluppo e funzione P Valore Sviluppo e funzione P Valore
Sviluppo organismal 4.17E-02 - 1.31 E-03 Sviluppo embrionale 3.30E-02 - 2.12E-05
Sviluppo embrionale 1.29E-02 - 1.29E-02 Funzione e lo sviluppo del tessuto connettivo 1, 79E-02 - 6.10E-05
Funzione e lo sviluppo del tessuto connettivo 1.93E-02 - 1.93E-02 Morfologia del tessuto 7.88E-05 - 7.88E-05
E. Top rete funzioni collegate
Funzioni di rete collegate Punteggio ottenuto Funzioni di rete collegate Punteggio ottenuto
Sviluppo cellulare, malattia infiammatoria, risposta infiammatoria Organismal lesioni e anomalie, malattia del sistema riproduttivo, cancro
6 19

Tabella 4: software di analisi funzionale Riepilogo delle femmine esposte all'ozono in non-proestro vs fasi proestro. Il software di analisi funzionale permette l'analisi delle principali vie canoniche, regolatori a Monte, malattie & funzioni, funzioni superiore, reti effetto regolatore e più. Questa tabella è stata modificata da Fuentes et al.6.

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Discussion

MicroRNA profiling è una tecnica vantaggiosa sia per la diagnosi delle malattie e ricerca meccanicistico. In questo manoscritto, abbiamo definito un protocollo per la valutazione dell'espressione dei miRNA che sono preveduti per regolare i geni infiammatori nei polmoni dei topi femminili esposti all'ozono nelle fasi differenti ciclo estrale. Metodi per la determinazione del ciclo estrale, ad esempio il metodo di rilevamento visivo, sono stati descritti16. Tuttavia, questi si basano su misure una tantum e pertanto non sono affidabili. Per identificare con precisione tutte le fasi del ciclo estrale in femmine che ciclo regolarmente, è consigliato il metodo qui descritto. Inoltre, questo semplice protocollo utilizzabile anche per stimare indirettamente le fluttuazioni ormonali giornaliere nei topi. Per evitare l'attivazione delle risposte infiammatorie indesiderate a causa di irritazione vaginale, campionamento deve essere eseguita solo una volta al giorno. A causa della variabilità nella lunghezza ciclo e alloggiamento influenze, è importante eseguire il protocollo per due o tre cicli completi prima di utilizzare gli animali in un esperimento considerando la fase del ciclo.

Per l'estrazione di RNA dal tessuto polmonare, una procedura accurata è fondamentale. Questo protocollo descrive un metodo di un giorno per isolare RNA dal tessuto polmonare che produce alta qualità RNA. Modifiche al protocollo del produttore dovevano estrarre efficientemente RNA dai polmoni. Abbiamo aggiunto un'ulteriore centrifugazione dopo aggiunta del tampone di lavaggio per rimuovere quanto più buffer come possibile. Abbiamo anche eluito RNA con 35 µ l di acqua privo di DNasi e RNasi, centrifugazione la colonna per 1,5 min garantire livelli di alta concentrazione. Spettrofluorimetro risultati hanno confermato l'efficacia del nostro protocollo di estrazione di RNA. Il rapporto di assorbanza a 260 e 280 nm (rapporto A260/280) è frequentemente utilizzato per valutare la purezza delle preparazioni di RNA. L'assorbanza massima per gli acidi nucleici è 260 e 280 nm, rispettivamente. È accettato come "puro" per RNA se il rapporto è circa 2.017. Allo stesso modo, per il rapporto di assorbanza di contaminazione A260/A230, i valori per la purezza sono nel range di 2,0 – 2,218. In questo studio, i rapporti di A260/A280 e A260/A230 medio osservati erano 2.016 ± 0,002 e 2.179 ± 0,018, rispettivamente (tabella 1). Di conseguenza, il nostro protocollo di estrazione di RNA riusciva. Un altro vantaggio del protocollo utilizzato è l'aggiunta del trattamento della dnasi. Questo è importante per evitare la contaminazione del DNA di genomic19. Una limitazione di questo protocollo di isolamento del RNA è l'utilizzo di colonne di purificazione di disfarsi dei rifiuti attraverso precipitazione utilizzando alcool perché alcuni detriti del polmone possono ostruire la membrana parzialmente o completamente, con conseguente bassa resa. Inoltre, se il passaggio di omogeneizzazione non viene eseguita con attenzione, grandi quantità di polmone RNA può essere facilmente perso o degradati. Se si ottengono rese basse di RNA, RNA può essere ri-purificato ed eluito in un volume più piccolo. In alternativa, RNA può essere precipitato durante la notte seguente protocolli pubblicati20.

Microarray tecnologie applicate alla profilatura di miRNA sono promettenti strumenti in molti campi di ricerca. Nel nostro studio, abbiamo usato le matrici PCR, che offrono il vantaggio di più alta soglia di rilevamento e strategie di normalizzazione per il rilevamento di Mirna differenzialmente espressi vs altre tecnologie come matrici basate su probe miRNA21. Una limitazione di questo protocollo è che richiede una quantità minima di partenza materiale di RNA e disponibilità di specifici set di primers per i miRNA di interesse, al contrario di altre tecniche disponibili come RNAseq. Un altro vantaggio di matrici basati sulla PCR è la possibilità di utilizzare non-miRNA geni di riferimento per la normalizzazione di qPCR (ad esempio small nucleolar RNA o SNORDs) per calcolare l'espressione differenziale dei miRNA. Infine, l'utilizzo di matrici PCR fornisce diverse opzioni per l'analisi dei dati, che vanno da strumenti online forniti dai fabbricanti, ai metodi convenzionali per rilevare l'espressione differenziale però Real-Time PCR. Analisi statistica con limma è conveniente per entrambi i microarrays e matrici basati sulla PCR e utilizza l'empirical Bayes moderato f- statistiche22. Qui, indichiamo che entrambi i valori di p e q-valori (regolati per le prove multiple) può essere ottenuti con il comando toptable regolazione della soglia del tasso di falsi scoperta ed identificazione differenzialmente espressi Mirna.

Software per l'analisi funzionale è un'applicazione basata su web per l'analisi dei dati nel contesto del percorso. Il software offre ai ricercatori le abilità di ricerca potente che possono aiutare a set di dati del frame o obiettivi specifici nel contesto, all'interno di un quadro più ampio del significato biologico. Anche se l'ambiente software è flessibile a diversi tipi di analisi (cioè, metabolomica, SNPs, proteomica, microRNA, tossicologia, ecc.), il nostro obiettivo è quello di evidenziare gli aspetti di analisi di miRNA. Dopo aver caricato un elenco di 14 Mirna con espressione significativa registro-rapporti e p-valori, tutti sono stati mappati dal software. Abbiamo effettuato il miRNA filtro e core analisi del target, che comprende l'analisi del percorso di arricchimento. Tuttavia, tali analisi considerano geni per i quali i 14 miRNA sono previsti a destinazione e non i miRNA se stessi. Nella sezione risultati sono elencate uscite come: percorsi canonici, malattie e funzione, geni presi di mira da Mirna differenzialmente espressi, lo sviluppo del sistema fisiologico, regolatori e reti (tabella 4). La visualizzazione del percorso è mostrata sotto la scheda di rete, dove Mirna e molecole vengono visualizzate come nodi cliccabili collegati con informazioni associate al gene di interesse (Figura 3). Un vantaggio del software di analisi funzionale è i risultati di alta qualità miRNA-relative, compreso interazioni sia sperimentalmente Validate e previste. I database del software di analisi funzionale comprendono: sperimentalmente convalidate microRNA-mRNA interazioni database23,24, predetto microRNA-mRNA interazione database con interazioni di basso-fiducia esclusi (ad es., Letteratura risultati (ad esempio, correlate a microRNA risultati manualmente a cura dalla letteratura pubblicata, sperimentalmente convalidati umani, ratto e mouse microRNA-mRNA interazioni database (ad esempio, miRecords)26e Scan target)25 gli esperti scientifici). Altri studi che hanno confrontato l'efficacia e l'usabilità degli strumenti di bioinformatica per analizzare vie connesse con l'espressione di miRNA conferma l'efficacia di questo software27. Nel complesso, computazionali metodi sono conveniente, meno dispendio di tempo e possono facilmente essere convalidati con i metodi molecolari. Con la crescita costante e l'accumulo di dati biomedici, metodi di bioinformatica diventeranno sempre più potenti nella scoperta dei meccanismi di miRNA-mediata dei processi biologici e malattia.

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Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere nessun interessi concorrenti.

Acknowledgments

Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni dal NIH K01HL133520 (PS) e K12HD055882 (PS). Gli autori ringraziano il Dr. Joanna Floros per l'assistenza con gli esperimenti di esposizione di ozono.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6J mice The Jackson Laboratory 000664 8 weeks old
UltraPure Water Thermo Fisher Scientific 10813012
Sterile plastic pipette Fisher Scientific 13-711-25 Capacity: 1.7 mL
Frosted Microscope Slides Thermo Fisher Scientific 2951TS
Light microscope Microscope World MW3-H5 10x and 20x objective
Ketathesia- Ketamine HCl Injection USP Henry Schein Animal Health 55853 90 mg/kg. Controlled drug.
Xylazine Sterile Solution Lloyd Laboratories 139-236 10 mg/kg. Controlled Drug.
Ethanol Fisher Scientific BP2818100 Dilute to 70% ethanol with water.
21 G gauge needle BD Biosciences 305165
Syringe Fisher Scientific 329654 1 mL
Operating Scissors World Precision Instruments 501221, 504613 14 cm, Sharp/Blunt, Curved and 9 cm, Straight, Fine Sharp Tip
Tweezer Kit World Precision Instruments 504616
Spectrum Bessman Tissue Pulverizers Fisher Scientific 08-418-1 Capacity: 10 to 50 mg
RNase-free Microfuge Tubes Thermo Fisher Scientific AM12400 1.5 mL
TRIzol Reagent Thermo Fisher Scientific 15596026
Direct-zol RNA MiniPrep Plus Zymo Research R2071
NanoDrop Thermo Fisher Scientific ND-ONE-W
miScript II RT kit Qiagen 218161
Mouse Inflammatory Response & Autoimmunity miRNA PCR Array Qiagen MIMM-105Z
Thin-walled, DNase-free, RNase-free PCR tubes Thermo Fisher Scientific AM12225 for 20 μL reactions
miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control Qiagen 219610
Microsoft Excel Microsoft Corporation https://office.microsoft.com/excel/
Ingenuity Pathway Analysis Qiagen https://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuity-pathway-analysis/
R Software The R Foundation https://www.r-project.org/
Thermal cycler or chilling/heating block General Lab Supplier
Microcentrifuge General Lab Supplier
Real-time PCR cycler General Lab Supplier
Multichannel pipettor General Lab Supplier
RNA wash buffer Zymo Research R1003-3-48 48 mL
DNA digestion buffer Zymo Research E1010-1-4 4 mL
RNA pre-wash buffer Zymo Research R1020-2-25 25 mL
Ultraviolet ozone analyzer Teledyne API Model T400 http://www.teledyne-api.com/products/oxygen-compound-instruments/t400
Mass flow controllers Sierra Instruments Inc Flobox 951/954 http://www.sierrainstruments.com/products/954p.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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