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Forniamo un metodo semplice ed efficiente per trapiantare 2'-deossiguanosina trattata E18.5 tiromusnella capsula renale di un topo nudo. Questo metodo dovrebbe aiutare nello studio sia della funzione epiteliale timica che della maturazione delle cellule T.
Il trapianto di timo è un metodo importante per indagare la funzione cellulare epiteliale del timo e la maturazione delle cellule T in vivo. Questo protocollo semplice ed efficiente può essere utilizzato per isolare e coltura il topo 18,5 timo per il successivo trapianto in una capsula renale. Il protocollo per il trapianto di timo 18.5 può essere modificato per il trapianto timico in altre fasi di sviluppo o per altri tessuti di dimensioni simili.
Inoltre, questa procedura è molto semplice. I dettagli per alcuni dei francobolli della custodia devono essere esaminati attentamente quando si esegue questa tecnica per la prima volta. Questa procedura contiene manipolazioni dettagliate che possono essere meglio illustrate con la visualizzazione.
Dopo il sacrificio, pulire il giorno embrionale 18,5 topo incinta con 70%etanolo e utilizzare strumenti sterilizzati autoclavati per fare un taglio a forma di V sull'addome dalla vescica fino a ogni corno dell'utero. Utilizzare le forbici per tagliare il mesometrio e le aree cervicali e vaginali e raccogliere l'utero in una piastra di Petri contenente PBS freddo sul ghiaccio. Tagliare la parete uterina anteriore da un corno uterino all'altro per esporre gli embrioni all'interno dell'involucro alla decidua e utilizzare pinzette fini per sbucciare i tessuti deciduali.
Tagliare il cordone ombelicale per rilasciare gli embrioni per il trasferimento in una nuova piastra di Petri sul ghiaccio. Per raccogliere il primo timo, pulire un embrione con il 70% di alcol e trasferire l'embrione in una nuova piastra di Petri. Dopo la decapitazione, fissare l'embrione nel piatto in posizione supina e utilizzare forbici sterili per tagliare la parete laterale del torace orizzontalmente lungo il fronte ascellare.
Taglia il diaframma per aprire il petto. Il timo dovrebbe essere visibile come due lobi bianchi situati di fronte alla trachea e adiacenti al cuore. Inserire con cura le fasci piegate dietro il timo e tirare delicatamente verso l'alto per raccogliere il tessuto.
Controllare l'integrità del timo per confermare che contiene due lobi articolari. Quindi lavare il timo con PBS prima di utilizzare un microscopio stereo per tagliare via i tessuti connettivi e i vasi sanguigni. Una volta raccolto tutto il thymi, trasferire ogni tessuto pulito in singoli pozzi di una piastra di 24 porri contenente 500 microlitri di mezzo di coltura per pozzo.
E aggiungere 2'deossigranosina ad una concentrazione finale di 1,25 millimolare per pozzo. Quindi posizionare il thymi isolato nell'incubatore di coltura cellulare per otto giorni. L'ultimo giorno di coltura, usa le forbici per tagliare un ago della vena del cuoio capelluto sulla parte del tubo dell'infusione con un angolo di 45 gradi e confermare la mancanza di risposta al dito del piedino in un animale ricevente nudo.
Posizionare il mouse sul tavolo operatorio in una posizione laterale destra e utilizzare un tampone di iodio di iodio allo 0,5% per tamponare la pelle nell'area chirurgica due volte dall'interno all'esterno del corpo. Usa il bisturi per fare un'incisione cutanea da cinque a nove millimetri parallela alla colonna vertebrale nella zona renale sinistra e tagliare il tessuto sottocutaneo e il muscolo per aprire la cavità addominale. Usando un paio di pinzette con una mano, sollevare il muscolo e il tessuto adiposo dal bordo di incisione laterale della colonna vertebrale del rene esposto e utilizzare l'altra mano per spremere delicatamente il rene.
Per mantenere la capsula renale umida durante l'intervento chirurgico, bagnare la superficie del rene con soluzione salina e utilizzare l'ago del cuoio capelluto per graffiare delicatamente la capsula renale in basso a destra circa 1/2 a 2/3 della larghezza del rene. Far scorrere il tubo di infusione nel nick della capsula e staccare delicatamente la capsula renale dal rene lungo il lato lungo del rene di circa tre o quattro millimetri nella capsula renale. Quindi ritrarre il tubo di infusione.
Per impiantare il timo nello spazio subcapsulare creato, lavare un timo di coltura due volte in soluzione salina fresca e collegare il tubo di infusione tagliato a una siringa. Aspirare lentamente il timo preparato nel tubo di infusione modificato. E inserire delicatamente il tubo di infusione nella capsula renale fino a raggiungere il polo superiore.
Per consegnare il timo nella capsula renale, ritrarre il tubo lentamente mentre allo stesso tempo deprimere delicatamente lo stantuffo. Usando una lampada alcolica, riscaldare leggermente l'ago del cuoio capelluto e dopo aver confermato che l'intero timo si trova all'interno dello spazio sottocapsulare, utilizzare l'ago riscaldato per cauterizzare il nick. Ripristinare il rene cauterizzato nella cavità addominale e chiudere il peritoneo e il muscolo con suture.
Utilizzando una sutura del materasso verticale interrotta modificata, chiudere l'incisione cutanea con almeno tre nodi e utilizzare un tampone di iodio povidone per disinfettare l'incisione. Quindi fornire un'iniezione sottocutanea di antibiotico e analgesia e posizionare il mouse sotto una lampada a infrarossi con monitoraggio fino al pieno recupero. Qui, si può osservare un giorno embrionale isolato di 18,5 timo contenente due lobi completi.
Immediatamente dopo l'impianto, il timo può essere visualizzato sotto la capsula renale sulla punta del rene ricevente. Dopo otto settimane di crescita all'interno dell'animale ricevente di topo nudo, il timo rimane sotto la capsula, ma aumenta robustamente di dimensioni. Le cellule T sono prodotte sia nel timo trapiantato che nel sangue periferico dei riceventi di topi nudi.
Ma come previsto, non vengono rilevate cellule T nella periferica di animali nudi non trapiantati. Inoltre, in questo esperimento rappresentativo, non è stato rilevato alcun gene LacZ nelle cellule T periferiche raccolte dal sangue periferico dei riceventi di topi nudi trapiantati con lobi di timo contenenti l'allele LacZ, indicando che le cellule T periferiche sono state generate dagli animali riceventi. Sii delicato quando scivoli il tubo in una capsula renale.
Evitare di rompere la capsula. E assicurati di avere abbastanza spazio nella per la consegna del timo. Le popolazioni di cellule T timiche o periferiche possono essere analizzate usando il citometro a flusso.
Dove, le risposte immunitarie nei tessuti periferici del ricevente possono essere analizzate dall'I2d e dall'analisi istochimica immunitaria.
