Extraktion und Analyse der taiwanesischen grünen Propolis

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Biochemistry

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Summary

Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll für die Verwendung von Ethanol als Lösungsmittel zu extrahieren und zu charakterisieren, taiwanesische grüne Propolis, das antibakteriellen Aktivität aufweist.

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Chen, C. T., Chien, Y. H., Yu, Y. H., Chen, Y. W. Extraction and Analysis of Taiwanese Green Propolis. J. Vis. Exp. (143), e58743, doi:10.3791/58743 (2019).

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Abstract

Taiwanesische grüne Propolis ist reich an prenylierten Flavonoide und weist eine Vielzahl von biologischen Aktivitäten, wie z. B. antioxidative, antibakterielle, und Anti-Krebs. Die bioaktiven Substanzen der taiwanesischen grünen Propolis sind Propolins, C, D, F und G. Die Konzentration der Propolins im taiwanesischen grünen Propolis variiert je nach der Jahreszeit und der geografischen Lage. Daher ist es wichtig, ein standard und wiederholbare Verfahren zur Bestimmung der Qualität der taiwanesischen grünen Propolis zu etablieren. Hier präsentieren wir eine Protokoll, die Ethanol-basierte Extraktion, Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie und eine antibakterielle Aktivitätsanalyse verwendet, um die taiwanesische grüne Propolis Qualität charakterisieren. Diese Methode gibt an, dass 95 % und 99,5 % Ethanol Extraktionen die maximale Trockenmasse Erträge von taiwanesischen grüne Propolis erreichen, nachgiebig dabei die höchsten Konzentrationen an Propolins, die antibakterielle Eigenschaften haben. Nach diesen Erkenntnissen gilt dieses Protokolls zuverlässig und reproduzierbar zur Qualitätsbestimmung von taiwanesischen grünen Propolis.

Introduction

Propolis ist eine natürliche harzigen Mischung von Bienenarten Apis Melliferaproduziert. Propolis hat seit der Antike in der Folk-Medizin verbreitet. Eine Studie berichtete kürzlich, dass Propolis vorteilhaft zur Vorbeugung von mikrobiellen Infektionen und Entzündungen1. Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass die wichtigsten bioaktiven Substanzen im Propolis Flavonoide, phenolische Acid Ester, prenylierten p sind-Cumarsäure Säuren und Diterpenic Säuren2,3. Bisher wurden 10 prenylierten Flavanone Derivate von taiwanesischen grünen Propolis durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC)4,5,6,7identifiziert. Die am häufigsten vorkommende unter diesen sind Propolins C, D, F und G5,7. Die erheblichen biologischen Wirkungen der taiwanesischen grünen Propolis korrelieren mit dem hohen Gehalt an Propolins8.

Die Konzentrationen von bioaktiven Substanzen im Propolis variieren stark je nach Saison und geographische Lage aus dem Propolis gewonnen wird. Europäische Propolis enthält hauptsächlich die Flavonoid Aglykon und phenolischen Säuren9. Die wichtigsten bioaktiven Substanzen im Propolis aus Brasilien sind prenylierten p-Cumarsäure Säuren, wie z. B. Artepillin C10. Eine Studie zeigte, dass die Saison ein entscheidender Faktor ist für die Bestimmung des insgesamt Propolin Inhalts in taiwanesischen grünen Propolis11. Der Propolin-Inhalt in taiwanesischen grünen Propolis ist höchste im Sommer (Mai - Juli) und niedrigsten im Winter11. Die antibakterielle Eigenschaft von Propolis gilt weithin als Indikator der biologischen Aktivität. Im allgemeinen zeigten die Proben von Propolis gesammelt aus verschiedenen Regionen eine ähnliche antibakterielle Eigenschaft; zum Beispiel, es ist in der Regel wirksam gegen fast alle Gram-positiven Bakterien und weist eine begrenzte antibakterielle Wirkung gegen Gram-negativen Bakterien10,12,13. Synergistische Wechselwirkungen zwischen der Flavonoide in Propolis wurden, haben eine antibakterielle Wirkung14demonstriert. In ähnlicher Weise wurde taiwanesischen grünen Propolis berichtet, eine antimikrobielle Wirkung gegen gram-positive Bakterien15haben. Eine Studie identifiziert darüber hinaus auch einen antimikrobiellen Wirkung aus den Wechselwirkungen von Propolins in Taiwan grüne Propolis8.

Die Charakterisierung von bioaktiven Substanzen im Propolis ist schwierig, da seine chemische Zusammensetzung nach der Quelle des Ursprungs variieren kann. Daher ist es notwendig, machbare und wiederholbare Methode zur Qualitätsbestimmung von der taiwanesischen grünen Propolis zu etablieren. Allerdings wurde kein Standardverfahren für die taiwanesische grüne Propolis Extraktion und anschließenden Funktionsanalyse gegründet. Mehrere Methoden, die verschiedentlich organische und anorganische Lösungsmittel gelten sind für Propolis Extraktion16,17,18,19,20vorgeschlagen worden. Da Propolis eine lipophile Mischung ist, haben Studien gezeigt, dass organische Extraktion besser als anorganische Extraktion8,18,19. Die totale Propolin-Konzentration im taiwanesischen grünen Propolis und seine antibakteriellen Eigenschaften sind wichtige Indikatoren für die Qualität der taiwanesischen grünen Propolis. So ist der Zweck dieser Studie, ein Protokoll für die Verwendung von Ethanol als Lösungsmittel zu extrahieren und zu charakterisieren die antibakteriellen Eigenschaften von taiwanesischen grünen Propolis zu präsentieren.

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Protocol

1. Vorbereitung von Ethanol extrahiert Verbindungen

  1. 10 g gefrorenen taiwanesischen grüne Propolis, die von Bienenstöcken in Taiwan von Mai bis Juli gesammelt wurde, wiegen und es mit dem Gewürz-Mühle mahlen. Bestätigen Sie, dass ganze Stücke von taiwanesischen grünen Propolis Boden zu einem feinen Pulver ohne jede große Partikel.
  2. Hinzugeben Sie 100 mL verschiedene Konzentrationen von Ethanol (60 %, 70 %, 80 %, 95 % und 99,5 %) und Wasser in Flaschen zu trennen und mischen jede Konzentration mit 10 g Boden Propolis.
  3. Bei 25 ° C inkubieren Sie und schütteln Sie die Flasche bei 250 u/min für 48 h.
  4. Filtern Sie die Ethanol-Extrakte durch Filterpapier mit einer 25 µm Porengröße.
  5. Bereiten Sie die Filtrate zu ihrem ursprünglichen Volumen (100 mL) mit 95 % Ethanol mit einem volumetrischen Kolben.
  6. Speichern Sie die Ethanol-Extrakte bei-20 ° C.
    Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden.

2. Vorbereitung von Ethanol extrahiert für HPLC

  1. Konzentrieren Sie 10 mL Ethanol Extrakte durch Vakuumverdampfung bei 40 ° C für 15 Minuten.
  2. Backen Sie die Trockenmasse bei 45 ° C für 24 h.
  3. Bereiten Sie die Trockenmasse mit 10 mL von 95 % Ethanol.
  4. Filter 1 mL Ethanol extrahiert eine sterile Spritze-Filter mit einer Porengröße von 0,45 µm.
  5. Refilter die Ethanol-Extrakte mit einem sterile Spritze-Filter mit einer Porengröße von 0,22 µm. Das Filtrat wird gesammelt und kann direkt mittels HPLC analysiert werden.

3. Analyse der Propolin-Inhalte mittels HPLC

  1. Einrichtung von Standardkurven des propolins
    1. Bereiten Sie 1 L der mobilen Phase des 88.8:11.2 (V/V) Methanol: Wasser-Lösung.
    2. Bereiten Sie serielle Verdünnungen von Propolin standard (C, D, F und G) Konzentrationen (15,625 mg/mL, 31,25 mg/mL, 62,5 mg/mL und 125 mg/mL, beziehungsweise) mit der mobilen Phase-Lösung als Lösungsmittel.
    3. Propolin-standard-Konzentrationen in der Reverse-Phase-Spalte sequenziell von der niedrigen Konzentration auf die hohe Konzentration 20 µL zu injizieren.
    4. Die HPLC-Säule bei 30 ° C und die Durchflussmenge 1 mL/min eingestellt.
    5. Legen Sie die Wellenlänge des UV-Detektor auf 280 nm und der Recorder Zeit um 20 Minuten.
    6. Analysieren Sie die Standards mindestens 3 X.
    7. Plot die Messung Antwort (y-Achse) gegen die Konzentration (x-Achse) mit Berechnung Software Blatt, und erstellen Sie eine Standardkurve mit der Gleichung und R-Quadrat-Wert.
  2. Analyse der Ethanol zu extrahieren s
    1. Injizieren Sie 20 µL Ethanol Extrakte aus Schritt 2.5 in der Reverse-Phase-Spalte gewonnen.
    2. Die HPLC-Säule bei 30 ° C und die Durchflussmenge 1 mL/min eingestellt.
    3. Legen Sie die Wellenlänge des UV-Detektor auf 280 nm und der Recorder Zeit um 20 Minuten.
    4. Analysieren Sie die Standards mindestens 3 X.
    5. Berechnen Sie die Konzentration von Propolin in Ethanol-Extrakt, unter Verwendung der Gleichung für die Standardkurve gewonnenen Schritt 3.1.7, die die Peakfläche für jedes Propolin verwendet.

4. minimale inhibitorische Konzentration und minimale bakterizide Konzentration-Analyse

Hinweis: Die Microdilution-Methode dient zur Bewertung der antibakteriellen Wirksamkeit von Ethanol extrahiert Propolins von taiwanesischen grüne Propolis.

  1. Vorbereitung der Testorganismen
    1. Bakterienstämme, Staphylococcus Aureus und Escherichia coli, Auftauen und dann Kultur sie in tryptic Soy Bouillon und Nährbouillon, bzw. bei 37 ° C für 24 h.
    2. Durchgang der S. Aureus mit tryptic Soy Bouillon und E. Coli mit Nährbouillon für zwei Generationen und dann berechnen Koloniebildenden Einheiten durch zählen der einzelnen Kolonien auf einer Nährbodenplatte.
  2. Vorbereitung von Ethanol extrahiert für antibakterielle Aktivität testen
    1. Konzentrieren sich die Ethanol-Extrakte aus Schritt 1.5 durch Vakuumverdampfung bei 40 ° C für 15 Minuten gewonnen.
    2. Wiederherstellen der Trockenmasse mit Dimethyl Sulfoxid (DMSO) und passen Sie die Konzentration des Extraktes, 12,8 mg/mL.
    3. Machen Sie eine serielle Verdünnung (Konzentrationen: 5, 10, 20, 40, 80, 160, 320 und 640 µg/mL) Ethanol extrahiert die Brühe verwenden.
  3. Minimale inhibitorische Konzentration tests
    1. Fügen Sie 10 µL verdünnter Ethanol Extrakte von 0.156 bis hin zu 640.0 µg/mL in einer 96-Well-Platte.
    2. Mit Brühe, stellen Sie die Lautstärke auf 100 µL und erhalten Sie 5 % DMSO in die Verdünnungen zu.
    3. Impfen Sie 100 µL der Bakterienkultur (1 x 106/mL), in der 96-Well-Platte.
    4. Kultur-Inokulum mit verschiedenen Konzentrationen von Ethanol extrahiert bei 37 ° C für 48 h.
    5. Analysieren Sie das Bakterienwachstum nach Trübung und optische Dichte (Mikrotestplatte Leser) bei 590 nm der minimale inhibitorische Konzentration (MIC) zu bestimmen.
  4. Minimale bakterizide Konzentration Tests
    1. Impfen Sie 10 µL Flüssigkultur aus jedem Brunnen des MIC-Tests, der kein Wachstum auf einer Nährbodenplatte ausgestellt.
    2. Inkubation bei 37 ° C für 24 h.
    3. Bestimmen Sie die bakterizide Aktivität durch die Identifizierung der niedrigsten Konzentration, die keine sichtbaren Bakterienwachstum offenbart. Die Konzentration, die vollständig Zellwachstum eliminiert gilt als die minimale bakterielle Konzentration (MBC).

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Representative Results

Positive repräsentative Daten für die Gewinnung von Ethanol sind in Tabelle 1dargestellt. Der Trockenmasseertrag von taiwanesischen grünen Propolis war positiv mit der Konzentration von Ethanol in Verbindung gebracht. Die 95 % und 99,5 % Ethanol Extrakte hatte die höchsten Trockenmasse von taiwanesischen grünen Propolis Ertrag. Der niedrigste Trockenmasseertrag von taiwanesischen grünen Propolis ereignete sich, als Wasser als Lösungsmittel Extraktion verwendet wurde. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass ein organisches Lösungsmittel wie Ethanol, am besten für die taiwanesische grüne Propolis Extraktion führt. Das Signal des standard Propolins, C, D, F und G wurde identifiziert und quantifiziert mittels HPLC (Abbildung 1a). Das Signal des Propolins in die Ethanol-Extrakte wurde mit einzelnen Propolin Standards und HPLC (Abbildung 1 b) charakterisiert. Normalerweise ist die Konzentration der Propolins (C, D, F und G) im taiwanesischen grünen Propolis positiv assoziiert mit der Ethanolkonzentration während der Extraktion (Tabelle 1). Der höchste Ertrag der Propolins im taiwanesischen grünen Propolis wurde auszugsweise die 95 bis 99,5 % Ethanol produziert.

Positiven repräsentative Daten für die antibakterielle Wirkung von Ethanol Extrakte werden in Tabelle 2dargestellt. Antibakterielle Aktivität gegen S. Aureus und E. Coli in der Ethanol-Extrakte wurden untersucht. Die durchschnittliche MIC und MBC Ethanol Extrakte für S. Aureus wurden 10-20 µg/mL und 20 µg/mL, (Tabelle 2). Wasser-Extrakte haben keine antibakterielle Wirkung gegen S. Aureus (Tabelle 2). Keine antibakterielle Wirkung auf E. Coli beobachtet mit entweder das Ethanol oder Wasser extrahiert (Tabelle 2).

Figure 1
Abbildung 1: Identifizierung von Propolins in Taiwan grüne Propolis. Diese Tafeln zeigen (ein) Standards für Propolins und (b) die Messung der Propolins im taiwanesischen grünen Propolis mittels HPLC. Diese Zahl wurde von Chen Et Al. modifiziert 8. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Lösungsmittel * Rendite (%) Propolin (C + D + F + G)
(mg/mL)
99,5 % EtOH 66.75 ± 0,5ein** 36.73 ± 0,80ein
95 % EtOH 66.25 ± 0,50ein 37.55 ± 1.29ein
80 % EtOH 64,75 ± 0.96b 34.25 ± 0,71b
70 % EtOH 63.25 ± 0,96c 31.53 ± 0,31c
60 % EtOH 59,00 ± 1.41d 29.34 ± 1,59d
Wasser 7,00 ± 0,82e ND ***

Tabelle 1: trockene Materie Rendite (%) und Propolin-Gehalt (mg/mL) in taiwanesischen grünen Propolis mit verschiedenen Lösungsmitteln extrahiert. * 10 g Propolis wurde mit 100 mL Lösungsmittel extrahiert und Extrakte wurden schließlich auf 100 mL rekonstituiert. ** Die Werte sind der Mittelwert ± Standardabweichung (SD). a-e Mittel innerhalb einer Spalte, die keine gemeinsamen hochgestellt haben unterscheiden sich signifikant (P < 0,05). ND = nicht erkannt. Diese Tabelle wurde von Chen Et Al. modifiziert 8.

Extrakt Staphylococcus aureus Escherichia coli
MIC (µg/mL) MBC (µg/mL) MIC (µg/mL)
99,5 % EtOH 10 20 > 640
95 % EtOH 10 20 > 640
80 % EtOH 20 20 > 640
70 % EtOH 10 20 > 640
60 % EtOH 20 20 > 640
Wasser ND ND ND

Tabelle 2: MIC und MBC (µg/mL) von verschiedenen Extrakten gegen S. Aureus und E. Coli. Diese Tabelle wurde von Chen Et Al. modifiziert 8.

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Discussion

Eine Studie berichtet, dass Mazeration, mit verschiedenen Konzentrationen von Ethanol, für brasilianische Propolis Extraktion17verwendet werden könnte; Allerdings war der Prozess zeitaufwendig17. Es dauerte mindestens 10 Tage, die bioaktiven Verbindungen, wie z. B. phenolische Inhalte aus brasilianischen Propolis17zu extrahieren. Alternativ schlägt Ethanol Extraktion in Kombination mit Heizung bei 37 ° C, 50 ° C oder 70 ° C für 30 min für die Gewinnung von brasilianischen Propolis19,21,22. Es wurde festgestellt, dass bioaktive Verbindungen, die in brasilianischen Propolis differentiell je nach Anteil von Ethanol19extrahiert werden konnten. Die Extraktionseffizienz von bioaktiven Substanzen im Propolis variieren aufgrund unterschiedlicher chemischer Zusammensetzung der brasilianischen Propolis und taiwanesischen grünen Propolis. Hier bieten wir eine zuverlässige und wiederholbare Protokoll zum Extrahieren von taiwanesischen grünen Propolis. Die bioaktiven Substanzen in taiwanischen grüne Propolis könnte innerhalb von 2 Tagen geerntet werden, mit Ethanol als Lösungsmittel. Ein ähnlicher Befund unterstützt auch das Protokoll hier vorgestellten und festgestellt, dass Propolins (C, D, F und G) vom taiwanesischen grünen Propolis mit 95 % Ethanol in Kombination mit einem 3-Tages-Extraktion-23extrahiert werden konnten. Eine andere Studie zeigte, dass 95 % igem Ethanol in Kombination mit einem 21 h konnte die Extraktion Propolins von taiwanesischen grünen Propolis24ernten. Allerdings ist die genaue Konzentration des Propolins nach der Extraktion 21 h Ethanol nachzuweisen. Forscher haben vorgeschlagen, dass der Aufheizvorgang Extraktionseffizienz für brasilianische Propolis19,21,22erhöht. Ob Propolins von taiwanesischen grünen Propolis durch Erhitzen extrahiert werden kann, muss untersucht werden.

Die Ethanol-Extrakte von taiwanesischen grünen Propolis haben antibakterielle Wirkung gegen gram-positive Erreger. Da Propolis hydrophob ist, haben Studien gezeigt, dass ein organisches Lösungsmittel wie Ethanol geeigneten Lösungsmitteln für Propolis Extraktion8,16,17,18,19, 20. Studien haben auch gezeigt, dass eine erhöhte Ethanolkonzentration zu mehr extrahierten bioaktiven Verbindungen, die8,17,18,20 führt. In diesem Protokoll extrahiert die maximale Trockensubstanz, die Erträge der taiwanesischen grünen Propolis in den 95 % und 99,5 % Ethanol eingehalten werden sowie die höchste Konzentration von Propolins und antibakterielle Aktivität.

Dieses Protokoll dient zur taiwanesischen grünen Propolis Extraktion mit Ethanol, und Bewertung der Qualität erfolgt auf der Grundlage der Inhalt des Propolins. Jedoch können nicht einige Ethanol unlösliche bioaktiven Substanzen in taiwanischen grüne Propolis richtig isoliert unter Verwendung dieses Protokolls werden.

Der wichtigste Aspekt der Methode in Bezug auf bestehende Methoden ist, dass diese Methode Zeit im Vergleich zu Methoden, die in anderen Studien17,23 spart. Darüber hinaus stellte 95 bis 99,5 % Ethanol-Extrakte von taiwanesischen grünen Propolis eine hohe Konzentration von Propolins und antibakterielle Aktivität.

Dieser Ansatz hat direkte Bewerbungen für die Charakterisierung von anderen unbekannten Ethanol löslich bioaktiven Verbindungen, die im taiwanesischen grünen Propolis. Darüber hinaus könnte Ethanol Extrakte mit Propolins zur Bestimmung von anderen Bioactivities verwendet werden.

Eines der wichtigsten experimentellen Verfahren gewährleistet die Einheitlichkeit der taiwanesischen grünen Propolis beim Schleifen (Protokoll Schritt 1.1). Unangemessene Schleifen von taiwanesischen grünen Propolis kann zu niedrigen Trockenmasse Erträge und Propolin Inhalte führen. Es ist wichtig, einen richtigen Schleifen Apparat wie ein Gewürz Mühle, Gewebe-Mühle oder Homogenisator, zu verwenden und darauf achten, dass die Propolis ein feines Pulver ohne jede große Partikel bleiben nach dem Schleifen wird.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verzollen.

Acknowledgments

Dieses Manuskript wurde von Wallace wissenschaftliche Bearbeitung bearbeitet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ethanol Sigma-Aldrich E7023
Whatman no. 4 filter paper Sigma-Aldrich WHA1004125
methanol Sigma-Aldrich 34860
reverse phase RP-18 column Phenomenex Inc. 00G-0234-E0
Staphylococcus aureus ATCC BCRC 10780
Escherichia coli ATCC BCRC 10675
tryptic soy broth Sigma-Aldrich 22092
nutrient broth Sigma-Aldrich 70122
dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D2650
spice grinder Waring WSG60K
microplate Reader Molecular Devices EMAX PLUS
HPLC system Agilent 1200 Series
vacuum evaporation BÜCHI Rotavapor R-215

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