Ved hjælp af Ustilago maydis som en trojansk hest for i Situ levering af majs proteiner

Genetics

Your institution must subscribe to JoVE's Genetics section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Dette arbejde beskriver kloning af en Ustilago maydis trojansk hest stamme for in situ levering af udskilles majs proteiner i tre forskellige typer af majs væv.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Fiedler, I. C., Weiberg, A., van der Linde, K. Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins. J. Vis. Exp. (144), e58746, doi:10.3791/58746 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Inspireret af Homer´s Trojan hest myte, vi manipuleret majs patogenet Ustilago maydis at levere udskilles proteiner i majs apoplast tillader in vivo fænotypiske analyser. Denne metode stole ikke på majs transformation men udnytter mikrobielle genetik og sekretoriske funktioner af patogener. Heri, det giver mulighed for inspektion af in vivo leveret udskilles proteiner med høj spatiotemporelle opløsning på forskellige former for infektion websteder og væv. Den trojanske hest strategi kan udnyttes til at forbigående supplere majs tab af funktion fænotyper, at funktionelt karakterisere protein domæner, analysere off target protein effekter eller studere onside protein overdosering, hvilket gør det til et kraftfuldt værktøj protein undersøgelser i majsen afgrøde system. Dette værk indeholder en præcis protokol om hvordan man kan generere en trojansk hest stamme efterfulgt af standardiserede infektion protokoller til at anvende denne metode til tre forskellige majs vævstyper.

Introduction

Biotrophic patogen Ustilago maydis er den udløsende agens af majs sjofelheder sygdom1. Det inficerer alle antenne dele af majs resulterer i store tumorer, der indeholder melanized, sort sporer. På det globale niveau skønnes U. maydis for at medføre et årligt tab på omkring 2% af majs udbytte, mens tumorer er værdsat som et gastronomisk delikatesse i Mexico. Plante infektion er initieret af en appressorium, der udskiller cellevæg lysing enzymer for at trænge ind på det første lag af majs epidermale celler. Fra en primær infektion websted, U. maydis vokser intracellulært og intercellularly, invaderer en til to celle lag hver dag1,2. Vellykket infektion resultaterne i anlægget hypertrofi, der forvandler til synlige tumorer på fem dage post infektion1,3,4. Alle infektion stadier invaginate svampe hyfer plante cytoplasma membran uden nogen direkte kontakt til værten cytoplasma1,2. Den stramme apoplasmic plads mellem de inficerer hyfer og plante plasmamembran anses for at være vært/patogen interaktivt site, kaldet zonen biotrophic interaktion. For at overvinde plante medfødte immunsystem, udskiller U. maydis et array af effektor proteiner i biotrophic interaktion zone1. Nogle effektorer er taget af planteceller, mens andre forbliver i biotrophic interaktion zone5,6,7,8. Én apoplastisk effektor er UmPit2, som interagerer med apoplastisk majs proteaser at forhindre frigivelse af signaling peptid ZmZIP1 fra ZmPROZIP af apoplastisk protease aktivitet9,10.

I de sidste årtier, U. maydis blev ikke kun en model for svampe genetik i plante-patogen interaktion, men også et værdifuldt redskab i bioteknologi på grund af en velforståede livscyklus, let genetiske tilgængelighed og Heterolog ekspression af udskilles proteiner11,12,13. Signaler til både traditionelle og utraditionelle protein sekretion har fastslået at tillade kontrol af posttranslationelle modifikationer14. For nylig, U. maydis var ansat som en trojansk hest værktøj til at studere små, udskilles majs proteiner i situ15. Den trojanske hest tilgang var med held bruges til at analysere funktionen af de små, udskilles protein ZmMAC1, der er involveret i anther udvikling. ZmMAC1 inducerer pluripotente celler og celle skæbne specifikation af de nydannede celler15periclinal deling. På samme måde, blev den biologiske funktion af den majs skader-associerede peptid ZmZIP1 afsløret. U. maydis secernerende majs ZmZIP1 resulterede i nedsat svulst dannelse10. Således, den trojanske hest tilgang repræsenterer en værdifuld alternativ rute til protein i situ studier med høj spatiotemporelle opløsning, der gør hverken kræver generation af stabil Majs transformation linjer eller væv infiltration med heterologously udtrykt og rensede proteiner. Navnlig gør den trojanske hest strategi udskillelsen af enhver heterolog protein i majs apoplast og direkte sammenligning af inficerede versus ikke-inficerede planteceller inden for det samme væv.

Denne protokol illustrerer de vigtigste trin for at generere en U. maydis trojansk hest stamme for at studere et protein af interesse. Det yderligere indeholder præcise oplysninger om infektion procedurer af tre forskellige majs vævstyper (voksne blade, kvaster og ører) med U. maydis, som er en forudsætning for at studere spatiotemporelle infektion progression og protein funktion i disse målvæv. Ingen yderligere specifikationer er givet på majs gen forstærkning og mikroskopisk billeddannelse teknikker, da disse trin er målet-specifikke og instrument-afhængige. Således, denne protokol henvender sig til erfarne brugere af standard molekylærbiologiske teknikker.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. opførelse af en trojansk hest, U. maydis

Bemærk: Se figur 1.

  1. Forstærke et gen af interesse fra majs cDNA ved hjælp af gen-specifikke primere og en korrekturlæsning DNA polymerase. Klone den primære PCR produkt og omdanne konstruktionen til E. coli efter leverandørens plasmid instruktioner. Kontrollér den korrekte gen af interesse sekvens af Sanger sekventering før brug for de næste skridt, kloning.
    Bemærk: PCR specifikationer skal optimeres på grund af primer sekvens særpræg og optimale DNA polymerase reaktionsbetingelser.
  2. Design primere til at forstærke den majs gen af interesse uden sekvensen kodning en signal peptid (SP).
  3. Udvide 5´ enden af den omvendte primer med RSIATA motiv og en underofficerjeg skære websted (tabel 1).
  4. Forstærke den majs gen af interesse med en korrekturlæsning DNA polymerase ved hjælp af PCR konstruere genereret i 1.1 som skabelonen PCR.
  5. Dobbelt-digest PCR produkt og U. maydis transformation plasmid, p123-PUmpit2-SpUmpit2- Zmmac1-mCherry-Ha15, med Xbajeg og Nco I. rense fordøjet PCR produkt og plasmidet.
  6. Ligate fordøjet PCR produktet ind i den p123-PUmpit2-SpUmpit2- Zmmac1-mCherry-Ha skabelon ved hjælp af T4 DNA ligase efter manufacturer´s anvisninger. Omdanne ligatur produkt i E. coli og kontrollere den korrekte gen af interesse sekvens af Sanger sekvensering.
  7. Linearize p123-PUmpit2-SpUmpit2- Zmgen af interesse-mCherry-Ha med begrænsning enzym Sspjeg og omdanne DNA i solopathogenic U. maydis stamme SG20016. Isolere U. maydis transformants af carboxin udvalg og bekræfte isolerede transformants af sydlige duppes analyse16.
    Bemærk: For hvert protein af interesse, i det mindste tre uafhængige U. maydis transformants bør isoleres og analyseres for at vurdere eventuelle fænotype virkninger af tilfældige baggrund mutationer.

2. dyrkningsmedier

  1. Forberede YEPSlight flydende medium16: 1,0% (w/v) gær extract, 0,4% (w/v) Bacto-pepton og 0,4% (w/v) saccharose. Opløse alle komponenter i ddH2O og autoklaver ved 121 ° C i 15 min. autoklavering ved en højere temperatur i en længere periode af tid eller gentagne gange ville reducere kvaliteten af mediet.
  2. Forberede kartoffel-dextrose-agar (PD-agar)20: 3,9% (w/v) kartoffel dextrose agar og 1,0% (w/v) 1 M Tris-HCl pH 8.0 (FC 0,01 M). Bland alle komponenter direkte i flasken for autoklavering og tilføje ddH2O plus en magnetisk røre bar. Autoklavering ved 121 ° C i 15 min. autoklavering ved en højere temperatur i en længere periode af tid eller gentagne gange ville reducere kvaliteten af mediet.
  3. Forberede PD-trækul agar20: 3,9% (w/v) kartoffel dextrose agar, 1% (w/v) trækul og 1,0% (v/v) 1 M Tris-HCl pH 8.0 (FC 0,01 M). Bland alle komponenter direkte i flasken for autoklavering og tilføje ddH2O plus en magnetisk røre bar. Autoklavering ved 121 ° C i 15 min. autoklavering ved en højere temperatur i en længere periode af tid eller gentagne gange ville reducere kvaliteten af mediet.

3. plante infektion

  1. Udføre analyse af majs celledeling i svar til trojansk hest leveret protein (f.eks. mikroskopi-baserede celle tælle) på forhånd. U. maydis -induceret majs celleproliferation og efterfølgende tumordannelse starter omkring 4-5 dage efter infektion. Kvantitative sygdom vurderinger er væv-afhængige og bør udføres fra 6 til 14 dage efter infektion.
    Bemærk: Forskellige majs sorter viser forskellige niveauer af følsomhed over for U. maydis infektion. Majs cvs. W23, A188, Gaspe flint, tidlig Golden Bantam eller Va35 vise modtagelighed mod dette patogen og er således velegnede sorter for trojansk hest undersøgelser.
  2. Forberedelse af U. maydis inokulum
    1. Omfatte stamfader stamme SG200 som en negativ kontrol i alle trojansk hest eksperimenter for at kunne vurdere bivirkninger på infektion af den transgene stamme. Her brug en U. maydis stamme give udtryk for en ikke-udskilles version af protein af interesse som en negativ kontrol. Af hensyn til praktisk anvendelighed (fx større screeninger), kan stamfader stamme dog lettere valget af kontrol.
    2. Før du starter eksperimentet, vurdere hvilke mængder af infektion kultur er nødvendige. Husk på, at infektion af hver plante, der kræver 1-1,5 mL af U. maydis suspension afhængig af majs vævstype.
      Bemærk: Ca. 1 mL af en overnight kultur er tilstrækkelig for fortynding til en OD600 0,2 i 20 ml af YEPSlys medium, og 25 mL af en U. maydis kultur med en OD600 af 0,8-1,0 er tilstrækkelig for infektion af 13-16 planter.
    3. Scratch U. maydis fra en PD agar plade ved hjælp af en steril Pasteur pipette, podes i 5 mL af YEPSlys medium og lad kultur vokser ved 28 ° C med konstant ryster på 200 rpm for 16 h.
    4. Forud for infektion, skal du undersøge U. maydis podning kultur af standard lysmikroskopi for ordentlig vækst og bakteriel forurening på 400 X forstørrelse.
      Bemærk: I en egnet kultur er kun cigar-formede svamp synlige (figur 2).
    5. Bland 900 µL af frisk YEPSlys med 100 µL af overnight kultur og måle OD600 bruge YEPSlys medium som en tomme i spektrofotometrets analyse.
    6. Fortyndes den overnight kultur med friske YEPSlys medium til en OD600 på 0,2 og lad kultur vokser ved 28 ° C med konstant ryster på 200 rpm indtil nå midten log vækstfase angives med en OD600 nm af 0,8-1,0.
      Bemærk: U. maydis celler duplicate hver 2 h under disse betingelser, den ønskede OD600 nåede således efter 4-5 h dyrkning.
    7. Høste cellerne i OD600 af 0,8-1,0 af spinning på 3.000 x g i 10 min. og supernatanten.
    8. Vask celle pellet én gang med ddH2O. Til dette formål, tilføje én kultur volumen af Hedeselskabet2O, spin med 3000 x g i 10 min. og supernatanten.
    9. Resuspenderes celle omhyggeligt i ddH2O ved hjælp af en 20-mL glas pipette, dermed justere den endelige OD600 til 3.0 (til en trojansk hest assay) eller 1,0 (for sygdom rating).
  3. Verifikation af den trojanske hest: planta sekretion af majs fusion protein
    1. Inficere majs stiklinger med en trojansk hest stamme17.
    2. Udføre mikroskopisk billeddannelse af inficeret plantemateriale på 2-3 dage efter infektion ved hjælp af en Konfokal mikroskop laser-scanning. Med henblik herpå, punktafgifter et rektangulært stykke af blad 1 cm under punktet, injektion, placere prøve på et objektglas og tilføje en dråbe af Hedeselskabet2O. For at visualisere mCherry fusion protein, ophidse prøvemateriale ved λ = 561 nm, og Optag emission ved λ = 580-630 nm.
  4. Infektion af voksne majs blade
    1. Dyrke majs planter til fase af voksne blade (da i det mindste blad 7 vokser i stilken).
      Bemærk: Denne fase er nået efter fire uger efter såning på drivhusgasser betingelser 14 h, 28 ° C dag/10 h, 22 ° C nat rytme ved hjælp af cv. W23. Varighed kan variere med majs kultivar og drivhus betingelserne.
    2. Overføre U. maydis kultur (Se 3.2.9) i en 3-mL sprøjte med en 20G x 1 kanyle.
    3. Tryk på stilk omhyggeligt at lokalisere meristem væv i stilken. Bunden af meristem kan være kendetegnet ved en overgang fra sværere stilk til blødere væv.
    4. Markere meristem på stilk ved hjælp af en pen.
    5. Injicere 1,5 mL af U. maydis kultur 1 cm over skyde meristem eller blomsterstand meristem.
    6. Vurder sygdomssymptomer på 6 og 12 dage efter infektion.
  5. Infektion af kvaster
    1. Dyrke majs planter indtil nå kvast fase.
      Bemærk: En detaljeret tidslinje på anther og kvast udvikling i majs cv. W23 var tidligere beskrevet1819. Kvaster indeholdende pre meiotiske støvknapperne er meget modtagelige for U. maydis infektion; i den majs cv. W23 er kvaster på størrelse med 4-7 cm.
    2. Tryk på stilk omhyggeligt at lokalisere kvast i stilken.
    3. Marker spidsen og bunden af kvast på stænglen ved hjælp af en pen.
    4. Overføre U. maydis kultur (Se 3.2.9) i en 3-mL sprøjte med en 20G x 1 kanyle.
    5. Injicere 1,5 mL inokulum omkring Kvasten. For at sikre ligelig fordeling af inokulat, langsomt placere 0,5 mL på spidsen, den midterste del, og bunden af Frynsetip præget med pennen.
    6. Vurder sygdomssymptomer på 10 dage efter infektion.
  6. Infektion af ører
    Bemærk:
    øre væv udvikling er forskellig i forskellige majs sorter og drivhus betingelser og skal observeres nøje før podning. Ører begyndt at vokse fra silke er meget modtagelige for U. maydis infektion.
    1. Overføre U. maydis kultur (Se 3.2.9) i en 3 mL sprøjte med en 20 G x 1 kanyle.
    2. Injicere podning nålen ind i rummet mellem skallerne bladene så dybt som muligt uden at skade øret.
    3. Release 1,5 mL inokulum omkring øret.
    4. Fjern sprøjten plus nål og forsigtigt massere cob for at distribuere U. maydis løsning lige så.
    5. Vurder sygdomssymptomer på 14 dage efter infektion.
  7. Bekræfte levedygtighed af U. maydis inokulum
    1. Drop 10 µL af inokulat på en PD trækul agar plade og inkuberes ved stuetemperatur i 2 dage.
      Bemærk: Hvis de respektive U. maydis kultur er i stand til form filamenter, bløde, hvide mycelium bliver synlige (figur 5)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Konstruktioner for U. maydis trojansk hest eksperimenter er klonet i plasmidet p123-PUmpit2-SpUmpit2-gen af interesse-mCherry-Ha. Majs-gen af interesse er sammenvoksede til en mCherry fluorescens reporter og en epitop HA-tag. Udtryk for fusion protein er under kontrol af U. maydis Umpit2 initiativtageren, som er specifikt aktiveret under infektion21. Til direkte udskillelse af protein af interesse peptid i zonen biotrophic interaktion, er regionen kodning sammenvokset til signal peptid sekvens af U. maydis Umpit221 (figur 1). Ved U. maydis transformation, transgenet er indsat i SG200 ip-locus af homologe rekombination og målrettede genom indsættelse kan verificeres ved sydlige skamplet analyse. Sekretion af fusion protein er bekræftet af Konfokal laser scanning mikroskopisk billeddannelse i seedling blade inficeret med en trojansk hest stamme (figur 3). Som et eksempel, frøplanter inficeret med enten U. maydis trojansk hest stammen SG200Zmmac1 hemmelig en ZmMAC1-mCHERRY eller en trojansk hest kontrol stamme udtrykker noSP-Zmmac1-mCHERRY , som mangler Umpit2- SP, og efterfølgende ikke hemmelighed ZmMAC1-mCHERRY-HA protein, er vist i figur 315. Hyfer secernerende ZmMAC1 er omgivet af fluorescerende mCherry signal (figur 3A). Derimod vise ikke-secernerende hyfer kun fluorescens signal i svampe cytoplasma (figur 3B).

Især bygger kvast infektion med U. maydis på ordentlig væv podning, som beskrevet i trin 3.5. Forkert kvast lokalisering eller ulige fordeling af inokulat kan resultere i ikke-inficerede kvast (figur 4A) eller kun delvis infektion af kvast (figur 4B). For at sikre ligelig fordeling, skal inokulat frigøres langsomt fra podning nål til at erhverve hele væv infektion (figur 4 c). Levedygtigheden af inokulat kan verificeres ved at placere en dråbe på PD-trækul agar. Smitsomme stammer danne filamenter optræder som skriver fnug på plade som vist for solopathogenic trojansk hest stamfader stamme SG200 (figur 5A) mens U. maydis stamme FB1 kræver parring før smitsomme glødetrådens dannelse ( Figur 5B).

Navn Primer tilsætning Sekvens (5´→3´)
Fremad XbaI-majs gen GCTCTAGA...
Omvendt NcoI-RSIATA-majs gen CATGCCATGGAGGCGGTGGCGATCGAGCG...

Tabel 1: Sekvenser af primer tilføjelser tilføjes begrænsning sider og RSIATA motiv kodende sekvens til den majs gen af interesse.

Figure 1
Figur 1 : Skematisk oversigt over de U. maydis Trojan hest plasmid kloning strategi. ZMmac1 (lys grå) er udgivet af dobbelt digest fra p123-PUmpit2-SpUmpit2- Zmmac1-mCherry-Ha. Sideløbende der gen af interesse (gul) forstærkes ved PCR. For kloning formål, frem og bak primere er designet som omfatter Xbajeg og underofficerjeg kloning websteder og en RSIATA linker (lilla). PCR produkt er fordøjet med Xbajeg og underofficerjeg. Efter ligatur, trojansk hest plasmid indeholder følgende elementer: drevet af Umpit2 promotor, en Umpit2-SP (blå) er smeltet N-terminalt et majs gen interesse ORF (gul). C-terminus, en RSIATA linker, et mCHERRY reporter gen (rød) og en HA epitop tag (grøn) er smeltet efterfulgt af et stop-codon. Før U. maydis transformation, trojansk hest plasmid er fordøjet med Sspjeg tillade homologe integration i U. maydisip-locus (grå).  Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Light-mikroskopisk undersøgelse af U. maydis podning kultur. Flere cigar-formede U. maydis sporidia er synlige, hvoraf nogle gennemgå spirende (vises med stjerner). Ingen yderligere celler er til stede som ville indikere en forurening af kulturen. Skalalinjen = 20 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : I planta Konfokal laser scanning mikroskopisk billeddannelse af en Ustilago Trojansk hest stamme. Imaging mCherry-smeltet majs protein ZmMAC1 efter majs sætteplante infektion ved hjælp af den trojanske hest stamme SG200Zmmac1 (A) eller en trojansk hest stamme SG200Zmmac1- noSP mangler Umpit2-SP (B). Udskilles ZmMAC1-mCHERRY-HA fusion protein ligger på overfladen af U. maydis hyfer (A)15, angivet med pilen hoveder. I SG200Zmmac1- noSP kun cytoplasmatisk lokalisering af ZmMAC1 er synlige (B), anført af asterisk 15. Skalere barer = 5 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : Kvast infektion med U. maydis. Mislykket infektion af kvast med U. maydis (A), delvis kvast infektion (B) og komplet kvast infektion (C) 12 dage efter infektion er vist. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 : Inokulum levedygtighed assay på PD-trækul agar. Solopathogenic stamme SG2001 blev brugt til trojansk hest generation. SG200 er selvstændige stimulerende og danner smitsomme filamenter på en PD-trækul agar plade (A). Haploide U. maydis stamme FB1 kræver parring med en kompatibel stamme inden trådformede vækst (B)22. Skalere barer = 2 mm.  Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Moderne afgrøde forskning kræver protokoller for Molekylær analyse på genetiske og protein niveauer. Genetiske tilgængelighed via transformation er ikke tilgængelig eller ineffektive og tidskrævende for de fleste afgrøder arter såsom majs. Derudover er pålidelige genetiske værktøjer som promotor reporter systemer sparsomme, hvilket gør det vanskeligt at studere in situ protein funktion med høj spatiotemporelle opløsning på forskellige væv steder. Apoplastisk proteiner kan studeres ved infiltration af heterologously udtrykt og rensede proteiner i væv. Men trods fremskridt i heterolog protein udtryk, målrettede perkolatnedsivning i afgrøde væv forbliver vanskelige og ofte ineffektive for protein funktionelle analyse. Den trojanske hest strategi er en alternativ tilgang, der ikke kræver transformation eller protein infiltration. Ved at ansætte apparatet sekretion af majs patogenet U. maydis, kan levering af teoretisk enhver protein af interesse i plant apoplast af inficeret væv opnås. Med hensyn til størrelsen af en protein af interesse, grænserne for denne teknik har endnu at blive udforsket. I tidligere assays var 290 aminosyrer U. maydis effektor Cmu1 sammenvokset til mCherry med held udskilles7. Anvendeligheden af den trojanske hest metode til større proteiner er imidlertid fortsat skal testes. Hvis tilføjelser af posttranslationelle modifikationer til protein af interesse er uønskede, kan ukonventionelle sekretion bruges som en alternativ rute til klassisk sekretion via SP14.

U. maydis er ansat som et standard værktøj i protein bioteknologi på grund af pålidelig proteinfoldning, posttranslationelle modifikation og sekretion effektivitetsgevinster11,12,13. Ikke desto mindre skal protein sekretion for hver ny trojansk hest stamme analyseres grundigt som beskrevet i trin 3. Det anbefales at udføre en indledende test af hver stamme, nyligt genererede trojansk hest ved at inficere stiklinger, der er let at inficere og inspicere ved mikroskopisk billeddannelse.

SG200 er en solopathogenic stamme, der ikke kræver parring før de trojanske hest eksperimenter og er således lettere at håndtere. Selv om infektion effektiviteten af kompatible stammer som FB1 og FB2 er højere23, effektiviteten af SG200 er tilstrækkelig for trojansk hest eksperimenter. Nogle U. maydis effektor proteiner er taget af værtsceller, mens andre forbliver i apoplast. Differentiering mellem begge grupper synes at være en kontrolleret og specifik proces; men de underliggende mekanismer fortsat undvigende8 og kan ikke tages i betragtning, når designe et eksperiment. Proteiner af interesse der skal integreres i cellevæggen eller der skal handle intracellulært er derfor ikke egnede kandidater til den trojanske hest tilgang.

Da U. maydis er almægtig i inficerer forskelligartede antenne majs væv, den trojanske hest metode kan anvendes til flere proteiner, i forskellige væv og på forskellige plante udviklingsstadier, såsom seedling blade, voksne blade, kvaster, og ører. For at nævne et par nyttige programmer, tillader den trojanske hest test lokale overdosering, offside protein effekter eller funktionelle karakterisering af forskellige protein domæner.

Opretholde en uforurenet U. maydis er kultur afgørende for alle beskrevne eksperimenter da Co infektion med en stor mængde bakterier udløser plantens immunrespons og ændrer sin reaktion over for proteinet af interesse, hvilket gør nogen resultatet usikkert. Trojansk hest undersøgelser i voksen blade, kvaster og ører skal udføres med maksimalt 1,5 mL infektion kultur som større mængder kan føre til vævsskader. Kvast og øreinfektioner kan trænes ved hjælp af mad farve-farvede vand i stedet for Ustilago inokulum.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke Thomas Dresselhaus, Martin Parniske, Noureddine Djella og Armin Hildebrand for at give plads og plante materiale, lab. Det oprindelige værk på metoden trojansk hest blev støttet af en Leopoldina postdoc stipendium og NSF projekt IOS13-39229. Det arbejde, der er præsenteret i denne artikel blev støttet af SFB924 (projekter A14 og B14) af DFG.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2 mL syringe  B. Braun 4606027V
23 G x 1 1/4 hypodermic needle B. Braun 4657640
Bacto Peptone  BD 211677
cDNA from maize from maize tissue expressing the gene of interrest
Charcoal Sigma-Aldrich 05105
Confocal laser scanning microscope use locally available equipment
Cuvette (10 mm x 4 mm x 45 mm) Sarstedt 67742
Incubator-shaker set to 28 °C, 200 rpm use locally available equipment
Light microscope with 400-fold magnification use locally available equipment
Nco I NEB R0193
p123-PUmpit2-SpUmpit2-Zmmac1-mCherry-Ha please contact the corresponding author 
Pasteur pipet (glass, long tip) VWR 14673-043
pCR-Blunt-II-TOPO Thermo Fisher Scientific K280002 can be exchanged for other basic cloning vectors like pENTR or pJET
Potato Dextrose Agar  VWR 90000-745
Sharpie pen use locally available equipment
Spectrophotometer use locally available equipment
Ssp I NEB R0132
Sucrose Sigma-Aldrich S0389
T4 DNA ligase NEB M0202
TRIS Sigma-Aldrich TRIS-RO
Xba I NEB R0145
Yeast extract  BD 212750

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kämper, J., et al. Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis. Nature. 444, 97-101 (2006).
  2. Doehlemann, G., et al. Establishment of compatibility in the Ustilago maydis/maize pathosystem. Journal of Plant Physiology. 165, 29-40 (2008).
  3. Matei, A., et al. How to make a tumour: cell type specific dissection of Ustilago maydis-induced tumour development in maize leaves. New Phytologist. (2018).
  4. Doehlemann, G., et al. Reprogramming a maize plant: transcriptional and metabolic changes induced by the fungal biotroph Ustilago maydis. The Plant Journal. 56, 181-195 (2008).
  5. Doehlemann, G., et al. Pep1, a secreted effector protein of Ustilago maydis., is required for successful invasion of plant cells. PLOS Pathogens. 5, e1000290 (2009).
  6. Redkar, A., et al. A secreted effector protein of Ustilago maydis guides maize leaf cells to form tumors. The Plant Cell. 27, 1332-1351 (2015).
  7. Djamei, A., et al. Metabolic priming by a secreted fungal effector. Nature. 478, 395-398 (2011).
  8. Tanaka, S., et al. A secreted Ustilago maydis effector promotes virulence by targeting anthocyanin biosynthesis in maize. eLife. 3, e01355 (2014).
  9. Mueller, A. N., Ziemann, S., Treitschke, S., Assmann, D., Doehlemann, G. Compatibility in the Ustilago maydis-maize interaction requires inhibition of host cysteine proteases by the fungal effector Pit2. PLOS Pathogens. 9, e1003177 (2013).
  10. Ziemann, S., et al. An apoplastic peptide activates salicylic acid signalling in maize. Nature Plants. 4, 172-180 (2018).
  11. Juárez-Montiel, M., et al. The corn smut ('Huitlacoche') as a new platform for oral vaccines. PLoS One. 10, e0133535 (2015).
  12. Sarkari, P., Feldbrügge, M., Schipper, K. Gene Expression Systems in Fungi: Advancements and Applications. Schmoll, M., Dattenböck, C. Springer International Publishing. 183-200 (2016).
  13. Monreal-Escalante, E., et al. The corn smut-made cholera oral vaccine is thermostable and induces long-lasting immunity in mouse. Journal of Biotechnology. 234, 1-6 (2016).
  14. Stock, J., et al. Applying unconventional secretion of the endochitinase Cts1 to export heterologous proteins in Ustilago maydis. Journal of Biotechnology. 161, 80-91 (2012).
  15. van der Linde, K., et al. Pathogen Trojan horse delivers bioactive host protein to alter maize (Zea mays) anther cell behavior in situ. The Plant Cell. 30, 528-542 (2018).
  16. Bösch, K., et al. Genetic manipulation of the plant pathogen Ustilago maydis to study fungal biology and plant microbe interactions. Journal of Visualized Experiments. e54522 (2016).
  17. Chavan, S., Smith, S. M. A rapid and efficient method for assessing pathogenicity of Ustilago maydis on maize and teosinte lines. Journal of Visualized Experiments. 50712, (2014).
  18. Kelliher, T., Walbot, V. Emergence and patterning of the five cell types of the Zea mays anther locule. Developmental Biology. 350, 32-49 (2011).
  19. Egger, R. L., Walbot, V. Quantifying Zea mays. tassel development and correlation with anther developmental stages as a guide for experimental studies. Maydica. 60, M34 (2015).
  20. Holliday, R. Bacteria, Bacteriophages, and Fungi: Volume 1. King, R. C. Springer US. 575-595 (1974).
  21. Doehlemann, G., Reissmann, S., Aßmann, D., Fleckenstein, M., Kahmann, R. Two linked genes encoding a secreted effector and a membrane protein are essential for Ustilago maydis-induced tumour formation. Molecular Microbiology. 81, 751-766 (2011).
  22. Banuett, F., Herskowitz, I. Different a alleles of Ustilago maydis are necessary for maintenance of filamentous growth but not for meiosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 86, 5878-5882 (1989).
  23. Bortfeld, M., Auffarth, K., Kahmann, R., Basse, C. W. The Ustilago maydis a2 mating-type locus genes lga2 and rga2 compromise pathogenicity in the absence of the mitochondrial p32 family protein Mrb1. The Plant Cell. 16, 2233-2248 (2004).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics