En imagerie calcique Vivo des cellules ciliées ligne latérale chez le poisson zèbre larvaire

Neuroscience
 

Summary

Le poisson-zèbre est un système de modèle qui possède de nombreuses fonctionnalités utiles y compris la clarté optique, rapide développement externe et, d’une importance particulière pour le domaine de l’ouïe et l’équilibre, extérieurement situé des cellules ciliées sensorielles. Cet article décrit comment transgénique zebrafish permet de doser la mécanosensibilité cellulaire-cheveux et la fonction présynaptique dans sa totalité.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lukasz, D., Kindt, K. S. In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish. J. Vis. Exp. (141), e58794, doi:10.3791/58794 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Des cellules ciliées sensorielles sont les mécanorécepteurs dans l’oreille interne qui sont requises pour l’ouïe et l’équilibre. Cellules ciliées sont activés en réponse à des stimuli sensoriels qui mécaniquement faire dévier apicales protubérances appelées faisceaux de cheveux. Déflexion ouvre la mécanotransduction (MET) canaux en faisceaux de poils, conduisant à un afflux de cations, y compris le calcium. Cet afflux de cation dépolarise la cellule et ouvre les canaux calciques voltage-dépendants situés à la base à la presynapse des cellules ciliées. Chez les mammifères, les cellules ciliées sont encastrées dans les os, et c’est difficile à évaluer sur le plan fonctionnel ces activités in vivo. En revanche, zebrafish larvaire sont transparent et possèdent un organe situé à l’extérieur de ligne latérale qui contient les cellules ciliées. Ces cellules ciliées sont fonctionnellement et structurellement semblables aux cellules mammifères de cheveux et peut être évaluées sur le plan fonctionnel in vivo. Cet article présente une technique qui utilise un indicateur de calcium génétiquement encodé (GECI), GCaMP6s, de mesurer le calcium induite par stimulation des signaux dans les cellules ciliées de poisson-zèbre-la ligne latérale. GCaMP6s peut être utilisé, ainsi que l’imagerie confocale, pour mesurer des signaux de calcium in vivo à l’apex et la base des cellules ciliées de ligne latérale. Ces signaux offrent une lecture en temps réel et quantifiable de ces deux activités de calcium dépendante mécanosensibilité et presynapse au sein de ces cellules ciliées. Ces signaux calciques fournit également des informations fonctionnelles importantes au sujet de comment les cellules ciliées détecter et transmettre les stimuli sensoriels. Dans l’ensemble, cette technique génère des données utiles sur les changements relatifs à l’activité de calcium in vivo. Il est moins bien adapté pour la quantification de la magnitude absolue des changements de calcium. Cette technique in vivo est sensible aux artefacts de mouvement. Une quantité raisonnable de pratique et des compétences sont nécessaires pour un positionnement correct, immobilisation et la stimulation des larves. En fin de compte, lorsqu’il est correctement exécuté, le protocole décrit dans cet article fournit un puissant moyen de recueillir des informations précieuses sur l’activité des cellules ciliées dans leur état naturel et totalement intégré au sein d’un animal vivant.

Introduction

Imagerie fonctionnelle calcique est un outil puissant qui peut être utilisé pour surveiller l’activité de plusieurs cellules en même temps1. En particulier, imagerie calcique en utilisant des indicateurs de calcium génétiquement encodé (GECIs) s’est avéré être avantageux car GECIs peuvent être exprimées de types spécifiques de cellules et par des subcellularly2. Dans la recherche en neurosciences, ces caractéristiques ont fait imagerie calcique en utilisant GECIs une méthode puissante à la fois définir les schémas d’activité au sein des réseaux neurones et mesurer l’influx de calcium aux synapses individuelles3,4. Profitant de ces caractéristiques, une étude récente utilisé la microscopie confocale et GECIs pour surveiller l’activité intracellulaire dans les collections de cellules sensorielles de cheveux5.

Cellules ciliées sont les mécanorécepteurs qui détectent des stimuli sonores et vestibulaires dans l’oreille interne et la circulation locale de l’eau dans le système de la ligne latérale aquatiques vetebrates6,7. Cellules ciliées sont souvent la cible des dommages ou des mutations génétiques qui entraînent la forme la plus courante de perte auditive chez les humains, appelée surdité neurosensorielle perte8,9. Par conséquent, il est essentiel de comprendre le fonctionnement de ces cellules afin de comprendre comment traiter et prévenir la perte d’audition. Pour fonctionner correctement, les cellules de cheveux utilisent deux structures spécialisées appelées faisceaux mécanosensoriels-cheveux et rubans synaptiques de détecter et de transmettre les stimuli, respectivement. Faisceaux de cheveux est situés à l’apex des cellules ciliées et est constitués principalement de saillies fines, semblables à des cheveux appelées stéréocils (Figure 1A). Dans les cellules ciliées vestibulaires et la ligne latérale, chaque paquet de cheveux dispose également d’un seul kinocilium long (CIL seul véritable de la cellule), qui peut s’étendre bien au-delà les stéréocils (Figure 1A). Mécanosensoriels des stimuli dévier les faisceaux de poils, et déflexion met tension liens appelés « pointe-liens » qui interconnectent les stéréocils10. Cette tension s’ouvre mécanotransduction (MET) canaux situés dans les stéréocils, entraînant un afflux apical des cations, y compris le calcium11,12. Cette activité apicale finalement dépolarise la cellule cheveux et ouvre les canaux voltage-dépendants de calcium (Cav1.3) à la base de la cellule. Cav1.3 canaux est trouvés adjacentes aux rubans synaptiques, une structure présynaptique qui longes les vésicules sur les zones actives. Influx de calcium basal par le biais de canauxv1.3 Ca est requis pour la fusion des vésicules, neurotransmission et l’activation des neurones afférents13,14.

Pendant de nombreuses années, les techniques électrophysiologiques comme germes entiers patch de serrage ont été utilisés pour sonder les propriétés fonctionnelles des cellules ciliées de nombreuses espèces, y compris le poisson-zèbre15,16,17, 1819,de,20. Ces enregistrements électrophysiologiques ont été particulièrement utiles dans les domaines de l’ouïe et l’équilibre, car ils peuvent être utilisés pour obtenir des mesures extrêmement sensibles de différentes cellules sensorielles, dont le but est de coder des stimuli extrêmement rapides sur une large gamme de fréquences et les intensités de21,22. Malheureusement, les enregistrements de cellules entières ne peuvent mesurer l’activité des populations de cellules ciliées. Pour étudier l’activité des populations de cellules dans la ligne latérale de poisson-zèbre, potentiel microphonique et des potentiels d’action afférentes ont été utilisés pour mesurer la somme mécanosensibles et les propriétés de réponse postsynaptique de neuromasts individuel23 ,,24. Malheureusement, ni germes entiers enregistrements ni mesures potentielles de champ local ont la résolution spatiale de repérer où l’activité a lieu dans des cellules individuelles ou mesure l’activité de chaque cellule au sein d’une population. Plus récemment, des colorants de calcium et GECIs ont été employés pour contourner ces défis25,26.

Chez le poisson zèbre, GECIs ont prouvé être une approche puissante pour étudier la fonction des cellules cheveux en raison de la relative facilité de création zebrafish transgénique et la clarté optique des larves27. Chez les larves de poisson zèbre, les cellules ciliées sont présents dans l’oreille interne, mais aussi le système de la ligne latérale. La ligne latérale est composée de grappes de rosette-comme des cellules ciliées appelés neuromasts qui sont utilisés pour détecter les modifications locales dans le mouvement de l’eau (Figure 1). La ligne latérale est particulièrement utile car il est situé à l’extérieur le long de la surface du poisson. Cet accès a permis de stimuler les cellules ciliées et de mesurer les signaux calciques optiquement en larves intactes. Dans l’ensemble, la facilité de la transgénèse, transparence des larves et l’accès sans précédent des cellules ciliées ligne latérale ont fait poisson-zèbre, un modèle précieux pour étudier l’activité des cellules ciliées in vivo. Il s’agit d’un avantage significatif par rapport aux systèmes mammaliens dans lequel cellules ciliées sont entourés par des structures osseuses de l’oreille interne. Ce manque d’accès a rendu très difficile d’acquérir fonctionnelles mesures in vivo des cellules de mammifères cheveux.

Le protocole décrit ici décrit comment surveiller les modifications de fonction canal et presynapse MET en calcium dans les cellules individuelles de cheveux et les cellules au sein de le neuromasts chez le poisson zèbre larvaire. Ce protocole utilise une ligne établie zebrafish transgénique qui exprime une GCaMP6s membrane localisée sous le contrôle du promoteur cheveux-cellule spécifique myosin6b 28. Cette localisation de la membrane des postes GCaMP6s pour détecter les influx de calcium par le biais de canaux ioniques, situé dans la membrane plasmique qui sont critiques pour la fonction de cellules ciliées. Par exemple, GCaMP6s membrane localisée peut détecter calcium influx par MET les chaînes en faisceaux de poils apicale et grâce à CaV1,3 chaînes près de rubans synaptiques à la base de la cellule. Cela contraste avec l’aide de GECIs localisées dans le cytosol, comme GECIs cytosoliques détecter les signaux calciques qui sont une combinaison de MET et CaV1.3 l’activité ainsi que les contributions de calcium provenant d’autres sources (par exemple, magasin de sortie). Ce protocole décrit comment immobiliser et paralyser les larves transgéniques GCaMP6s avant l’imagerie. Il décrit ensuite comment préparer et utiliser un jet fluide pour faire dévier les ballots de cheveux afin de stimuler les cellules ciliées ligne latérale d’une manière contrôlée et reproductible. Des données représentatives qui peuvent être réalisées à l’aide de ce protocole sont présentées. Exemples de données qui représentent des artefacts de mouvement sont également présentés. On décrit des expériences de contrôle qui sont utilisés pour vérifier les résultats et exclure les artefacts. Enfin, on décrit une méthode pour visualiser les signaux de calcium spatiale dans le logiciel de Fidji. Cette analyse de Fidji est une adaptation de méthodes de visualisation établie précédemment développées à l’aide de MATLAB5. Dans l’ensemble, ce protocole présente une technique de préparation puissante qui utilise GECIs chez le poisson zèbre larvaire pour mesurer et visualiser la dynamique du calcium in vivo de cellules ciliées.

Protocol

Tout travail animal a été approuvé par le Comité utilisation des animaux à la National Institutes of Health, en vertu du protocole de l’étude animale #1362-13.

Remarque : Ce protocole prend environ 0,5 à 1 h pour terminer sans interruption si les solutions et les équipements sont préparés et mis en place à l’avance. Ce protocole est optimisé pour les larves de poisson zèbre29 Tg(myo6b:GCaMP6s-caax)5,à fécondation après 3 à 7 jours (dpf). Cette lignée transgénique exprime une GCaMP6s membrane localisée (zebrafish codon optimisé) spécifiquement dans toutes les cellules de cheveux de poisson-zèbre. Avant l’imagerie, les larves sont déclenchés dans le tampon de l’embryon (E3) dans des conditions normales. Se référer à la Table des matières pour les numéros de catalogue de tous les équipements et les médicaments nécessaires à l’exécution de ce protocole.

1. préparation des Solutions

  1. Préparer 1 mL de α-bungarotoxine (125 µM), qui sert à paralyser les larves de poisson zèbre au cours de l’imagerie fonctionnelle.
    1. Ajouter 968.6 µL d’eau stérile ultrapure et 33,4 µL de rouge de phénol à 1 mg de α-bungarotoxine (bouteille entière). Faire 100 µL d’extraits et de les stocker à-20 ° C.
      Mise en garde : Porter des gants et faire des préparatifs dans la hotte lorsque vous manipulez des α-bungarotoxine poudre. Gants sont également recommandés lors de la manipulation de la solution de le α-bungarotoxine.
  2. Préparer 1 L de 60 x embryon tampon (E3).
    1. Ajouter 17,2 g de NaCl et 0,76 g de poudre de KCl à 954,4 mL d’eau ultrapure.
    2. Ajouter 19,8 mL de 1 M CaCl2, 19,8 mL de 1 M MgSO4et 6 mL de tampon HEPES 1 M à la solution. Stocker la solution x E3 60 à 4 ° C pendant 6 mois.
  3. Préparer 10 litres de 1 x E3 (5 mM NaCl, KCl 0,17 mM ; 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4, pH 7,2), qui est une solution que les larves sont propagées en avant l’imagerie fonctionnelle.
    1. Ajouter 167 mL de solution mère de 60 x E3 pour 10 L d’eau ultrapure pour faire une solution de x E3 1. Stocker la solution de x E3 1 à température ambiante (RT) jusqu'à 6 mois.
  4. Préparer un tampon neuronal (NB) (140 mM NaCl ; 2 mM KCl ; 2 mM CaCl2; 1 mM MgCl2; un tampon HEPES 10 mM, pH 7,3), qui sert à immerger des larves au cours de l’imagerie fonctionnelle.
    Remarque : 1 x E3 peut également être utilisé pour l’imagerie fonctionnelle, mais les réponses sont plus robustes et fiables au Nouveau-Brunswick.
    1. Combiner les 28 mL de 5 M de NaCl, 2 mL de KCl 1 M, 2 mL de 1 M CaCl2, 1 mL de 1 M du MgCl2et 10 mL de tampon HEPES M 1 957 ml d’eau ultrapure. Amener le pH à 7,3 avec 1 NaOH M.
    2. Filtre à stériliser. Conserver à 4 ° C pendant environ 1 mois.
      NOTE : Porter à RT avant d’utiliser la solution.
  5. Préparer le stock de MS-222 (tricaïne, 0,4 %), qui est utilisé pour anesthésier les larves.
    1. Dissoudre 400 mg de sel de méthanesulfonate 3-aminobenzoate d’éthyle et 800 mg de Na2HPO4 dans 100 mL d’eau distillée. Ajuster le pH à 7. Conserver à 4 ° C.
    2. Utilisez 0,04 % MS-222 afin d’anesthésier les larves pendant l’injection de l’immobilisation et le α-bungarotoxine.

2. Elaboration d’imagerie chambre et Pins

  1. Préparer la chambre d’imagerie (Figure 2A). Appliquer une fine couche de graisse de silicone sous vide élevé jusqu’au fond de la chambre de perfusion sur les bords de la place à laquelle adhèrent la lamelle. Ne laissez pas de lacunes dans la graisse. Appuyez fermement sur les bords de la lamelle pour sceller à la chambre d’imagerie. Essuyer l’excès de graisse à l’extérieur.
    Remarque : Une seringue de 5 mL avec un embout de micropipette 200 µL est recommandée pour l’application de la graisse.
  2. Préparer l’enrobage silicone pour combler la chambre. Mélanger un ratio de 10:1 (en poids) de base à la salaison. Mélanger soigneusement mais délicatement, en utilisant un embout de micropipette pour créer des bulles minimales.
    1. Verser l’encapsulation de silicone sur la lamelle annexée afin qu’il soit de niveau avec la surface de la chambre. Environ 3 g d’encapsulation remplira la chambre.
    2. Soigneusement touchez la chambre contre une surface plane, tout en la gardant horizontale ou utiliser un embout de micropipette (sous un stéréomicroscope) de supprimer ou de retirer des bulles au bord de la chambre.
    3. Placez la chambre dans un four de laboratoire pendant une nuit à 60 – 70 ° C. Placez la chambre à l’intérieur d’une zone ventilée pour s’assurer que l’air chaud ne souffle pas directement sur l’encapsulation pour éviter de créer des ondulations.
  3. Utiliser pince fine et fil de tungstène pour façonner les broches utilisées pour immobiliser des larves à travers la tête et la queue (Figure 2B1) sur l’encapsulation durcie.
    1. Pour rendre les goupilles de tête, tenez un morceau de fil de tungstène de 0,035 mm dans une main sous un stéréomicroscope. À l’aide de pinces fines dans l’autre main, plier le fil de 1 mm vers le haut de l’extrémité à 90°. Échanger les pinces pour des ciseaux et coupez 1 mm après le virage pour créer le code pin.
    2. Répétez l’étape 2.3.1 utilisant un fil de 0,025 mm pour faire des broches de la queue, mais laissez 0,5 mm de fil de chaque côté du pli. Forceps permet d’insérer les goupilles dans l’encapsulation durcie sur la chambre (pour le stockage).

3. préparation des aiguilles pour la paralysie et la Stimulation

  1. Préparer les aiguilles d’injection de cœur à l’aide de capillaires en verre avec un filament. Tirez sur les aiguilles d’un diamètre intérieur de 1 à 3 µm (Figure 2C).
  2. Préparer les aiguilles jet fluide à l’aide de capillaires en verre sans un filament. Tirer des aiguilles avec une pointe fine, longue qui peut être rompu pour le diamètre de pointe correcte.
    1. Briser la pointe mince, longue du fluide-pointeau à frotter perpendiculairement contre un autre fluide-pointeau ou un carreau de céramique juste au-dessus où la pointe de l’aiguille peut être pliée pour créer un diamètre intérieur de 30 – 50 µm [Figure 2C (image du milieu) et Figure 3 A2]. Assurez-vous que la pause est encore à travers l’extrémité (Figure 2C, image du milieu) et non en escalier ou même trop importante (Figure 2C, image de droite) afin de garantir et précis fluide couler durant la stimulation des cellules ciliées.
      Remarque : Un polisseur de l’aiguille peut être utilisé pour fixer des pauses en escalier.

4. l’épinglage et immobiliser la larve d’imagerie chambre

  1. Se baigner une larve de Tg(myo6b:GCaMP6s-caax) dans environ 1 mL de tampon de E3 contenant 0,04 % MS-222 pendant 1 à 2 min sur la surface d’encapsulation de silicone de la chambre d’imagerie jusqu'à ce que la larve devient immobile ou ne répond pas au toucher.
    1. Sous un stéréomicroscope, positionner la larve au centre de la chambre de perfusion donc il se trouve du côté plat contre l’encapsulation de silicone.
      Remarque : Par souci de cohérence, toujours monter les larves du même côté (par exemple, le côté droit vers le bas, côté gauche vers le haut) (Figure 2,B1).
  2. À l’aide de pinces fines, mettre une épingle de tête de 0,035 mm vers le bas de la perpendiculaire à la larve et de la chambre. Insérez la tige de la tête entre le œil et de la vésicule otique et vers le bas dans l’encapsulation (Figures 2 b 1 et 2 b 2). Utilisez un deuxième ensemble de pinces pour stabiliser la larve sur son côté dorsale ou ventrale tout en épinglant. Veiller à ce que la partie horizontale de l’axe entre en contact avec la larve et n’appuie pas sur tout le chemin dans l’encapsulation. Angle de la broche sur le ventre (Figure 2B1) ou pointant légèrement vers la partie antérieure du poisson pour éviter les interférences avec l’injection subséquente de coeur et l’imagerie de cellules ciliées.
    1. À l’aide de la pince, insérez une tige de queue de 0,025 mm la notochorde aussi près que possible de l’extrémité de la queue (Figure 2,B1).
      Remarque : Veillez à éviter qui s’étend de la larve. Goupille de la larve à plate. Yeux doit être superposées (Figure 2,B1). C’est très important pour faciliter l’injection du cœur (Figure 2B2-B2', étape 5), facilitant un avion d’imagerie souhaitable (Figure 1B1-B2'', les étapes 8 et 9) et de quantifier l’intensité du stimulus jet fluide ( Figure 3A3, étape 7).

5. injection de α-bungarotoxine dans la cavité cardiaque à paralyser la larve

Remarque : Portez des gants lorsque vous manipulez des α-bungarotoxine.

  1. Centrifuger l’aliquote de α-bungarotoxine brièvement avant de les utiliser pour éviter tout colmatage de l’aiguille d’injection de cœur.
    1. Remblai 3 µL de solution de α-bungarotoxine dans une aiguille d’injection de cœur à l’aide d’un gel de pipette de chargement. Chargez la solution uniformément à la pointe avec pas de bulles.
    2. Insérer l’aiguille d’injection de coeur dans un support de pipette attaché à un micromanipulateur manuels. Sous un stéréomicroscope, placez l’aiguille n’est aligné perpendiculairement à l’axe de l’A-P des larves épinglés et anesthésiés, pointant vers le bas à un angle d’environ 30°.
    3. Connectez le titulaire de la pipette dans l’injecteur de pression. Appliquer les paramètres proposés suivants : Pinjection = 100 hPa, tinjection = 0,5 s et Pcompensation = 5 hPa. Injecter un bolus dans la solution pour vérifier si la pointe de l’aiguille est patent.
    4. Vous recherchez un petit nuage de la solution rouge (de rouge de phénol) pour laisser la pointe de l’aiguille. Si on voit pas la couleur rouge, très doucement gratter l’extrémité de l’aiguille contre le bord d’une épingle et recommencez jusqu'à ce que l’aiguille est patent. Vous pouvez également tirer une aiguille avec une plus grande ouverture de pointe.
  2. Avancer l’aiguille vers le cœur jusqu'à ce qu’il touche la peau à l’extérieur du cœur (Figure 2B2). Enfoncer l’aiguille dans la larve et cherchez l’indentation de la cellule de pigment sur la peau devant le coeur pour s’assurer que l’aiguille est placée dans le plan correct par rapport à la larve (Figure 2B2 ").
    1. Avancer l’aiguille plus loin jusqu'à ce qu’il perce la peau et pénètre dans la cavité du cœur. Tirez l’aiguille légèrement. Injecter un bolus de α-bungarotoxine dans la cavité du cœur. Cherchez l’inflation de la cavité cardiaque ou colorant rouge qui pénètrent dans la cavité.
  3. Rincer doucement la larve 3 fois avec 1 mL de NB pour supprimer résiduelle MS-222. Ne jamais retirer tout le liquide. Maintenir la larve dans environ 1 mL de NB sur la chambre de perfusion.
    Remarque : Veiller à ce que des battements de coeur larvaire et la circulation sanguine restent robustes après injection d’épinglage et de cœur et tout au long de l’expérience d’imagerie complet.

6. préparation du Microscope et fluide-jet Setup

  1. Assembler un microscope confocal vertical en utilisant les composants décrits dans la Table des matières: un microscope confocal avec un 488 nm laser et de filtres appropriés, de logiciels de microscope pour contrôler et coordonner l’imagerie et de stimulation, de 10 x air objectif, objectif de l’eau 60 x, le scanner objective de piezo-Z (pour z-cheminées), caméra à grande vitesse, chambre circulaire adaptateur, platine motorisée et adaptateur insert stade. Se référer à Zhang et al.,29 , pour des options supplémentaires et des conseils sur des configurations de microscope.
  2. Assembler le jet fluid composé de 3 éléments principaux : un vide et pression pompe, pince de pression à grande vitesse et stade tête (également décrit dans la Table des matières). La pince de pression à grande vitesse permettent de contrôler le moment et la durée de décharge de pression ou sous vide sur la scène de la tête et dans la pipette de liquide-jet.
    1. Connectez la sortie de l’étape en tête à la pipette de liquide-jet titulaire via à paroi épaisse tube en silicone.

7. alignement de larve et fluide-jet

Remarque : Il y a 3 plans d’intérêt au sein de chaque neuromast : (1) les conseils des faisceaux du cheveux (Figure 3A3: le kinocilia, utilisé pour mesurer l’intensité de la stimulation) ; (2) le plan MET cheveux-bundle (Figure 1B1-B1': la base des faisceaux apicale cheveux où les signaux calciques MET-canal-dependent sont détectés) ; et (3) le plan synaptique (Figure 1B2-B2': où les signaux calciques présynaptique sont détectés à la base de la cellule de cheveux). Ces avions sont décrits dans la Figure 1A.

  1. Remblai 10 µL de NB dans un fluide-pointeau bien cassé (de l’étape 3.2) à l’aide d’un gel de chargement de pointe. Chargez la solution uniformément à la pointe avec pas de bulles. Introduire l’aiguille dans le support de pipette attaché au micromanipulateur motorisé.
  2. Placer la chambre de perfusion dans un adaptateur de chambre circulaire sur la platine du microscope.
    Remarque : Par souci de cohérence, placez toujours la larve dans la même orientation (p. ex., la chambre contenant la larve avec son postérieur vers jet fluide et ventrale orientée vers l’expérimentateur).
    1. Déplacer la platine motorisée afin que la larve se situe dans le centre du champ de vision. Tournez l’adaptateur chambre circulaire afin que l’axe A-P de la larve est à peu près aligné avec la trajectoire de l’aiguille jet liquide.
    2. À l’aide de contraste transmissibles interférence lumineuse et différencié (DIC), mettre la larve au point et centrer sous l’objectif 10 x. Soulever l’objectif 10 x.
  3. En utilisant le micromanipulateur motorisé, abattre le fluide-pointeau dans le centre du champ de vision donc elle est éclairée par la lumière transmise et à peine toucher la solution NB.
    1. Abaisser l’objectif 10 x. Mettre l’accent sur la larve de confirmer sa position. Se concentrer vers le haut pour trouver le fluide-pointeau. Déplacer le fluide-pointeau avec le micromanipulateur dans les axes x et y jusqu'à ce qu’il est dans une position parallèle à la face dorsale du poisson.
    2. Mettre l’accent sur la larve. Abaisser l’aiguille dans l’axe z. Placez l’aiguille le long de la face dorsale du poisson et de ~ 1 mm loin du corps (Figure 3,A1).
    3. Déplacer délicatement l’adaptateur chambre circulaire (si nécessaire) pour s’assurer que le fluide-pointeau est aligné le long de la ligne médiane du A-P de la larve (Figure 3,A1).
    4. Déplacer la platine motorisée pour placer le neuromast d’intérêt dans le centre du champ de vision. Tenir l’extrémité de l’aiguille jet fluide le long de la face dorsale du poisson. Ne pas toucher la pointe de l’aiguille jet fluide à la larve ou la surface de la chambre.
  4. Placez-vous dans le 60 x objectif de l’eau. Veiller à ce que l’objectif est immergé dans la solution NB. La mise au point fine pour localiser un neuromast à l’aide d’utilisation transmis photonique et optique DIC.
    Remarque : Cette configuration est conçue pour stimuler la neuromasts le long de la primaire de la ligne latérale postérieure. Cellules ciliées dans ces neuromasts répondre aux écoulements de fluides dirigée soit antérieur ou postérieur. Voir Chou Al31 pour une carte précise de neuromast fluide sensibilité au sein du système de la ligne latérale.
    1. Positionner l’aiguille jet fluide avec le micromanipulateur afin qu’il soit 100 µm du bord extérieur de la neuromast (Figure 3A2).
      Remarque : Choisissez neuromasts qui offrent une vue claire de haut en bas (Figures 1 b 1 '-B2' et Figure 3A3) plutôt que des vues de côté-angle (Figure 1,C1-C2). Simultanée de tous les faisceaux de poils apicale dans un seul plan optique d’imagerie ou d’imagerie des zones synaptiques moins optiques planes (Figure 3A3) permet une vue claire de haut en bas.
    2. Se concentrer jusqu'à l’extrémité des cheveux-faisceaux apicales (kinocilia) (Figure 1A, 3 a 2 chiffres et 3 a 3). La partie inférieure de l’aiguille jet fluide doit être au point dans ce plan.
  5. Définir la pince de pression à grande vitesse à partir du manuel en mode externe pour recevoir des entrées de l’imagiciel.
    1. Zéro la pince de pression à grande vitesse en appuyant sur le bouton « zero ». Utilisez le bouton de point de consigne pour régler la pression au repos légèrement positive (environ 2 mm Hg). Confirmer la sortie au repos de la pince de pression à grande vitesse à l’aide d’un manomètre PSI attaché à la sortie de scène tête.
      Remarque : Définir une pression légèrement positive au repos pour éviter l’absorption progressive de liquide dans le liquide-pointeau au fil du temps. Si le liquide pénètre dans le tuyau connecté à la jet fluide et atteint le stade de la tête, il peut endommager l’équipement.
    2. Déterminer la pression nécessaire pour stimuler les ballots de cheveux. Utiliser une entrée V 0,125 et 0,25 (6,25 et 12,5 mm de Hg) pour 200 à 500 ms pour appliquer une stimulation test (Figure 3A3-A3'').
      Remarque : La pince de pression à grande vitesse convertit une tension d’entrée (à partir de logiciels ou d’autres appareils qui se connectent au port BNC sur le port de commande de pince de pression à grande vitesse) en pression qui est libérée de l’étape en tête et en fin de compte, le fluide-pointeau (1,0 V = 50 mmHg, tout en -1,0 V =-50 mmHg). Dans cette configuration (Voir l’étape 7.2) positif de pression (Poussée) dévie des faisceaux de cheveux vers la partie antérieure, et une pression négative (tirer) dévie des faisceaux de cheveux vers la partie postérieure.
    3. À l’aide de lumière transmise et optique DIC avec une échelle graphique, mesurer la distance de déviation par les stimuli mmHg 6,25 et 12,5 des conseils des faisceaux du cheveux, la kinocilia (Figure 1A et 3 a 3-3 les chiffres ''). Choisissez une pression qui déplace les faisceaux (comme 1 unité cohésive) une distance d’environ 5 µm (Figure 3A3''). S’assurer que les conseils de la kinocilia restent, en bref, tout le temps.
    4. Déplacez le µm ± jet fluide 25 le long de l’axe A-P de la larve à trouver une distance et une pression qui dévie vers l’extrémité des kinocilia 5 µm.
      Remarque : À l’aide de GCaMP6s chez les larves 3 – 7 dpf, une déflexion de 5 µm devrait atteindre près de saturer les signaux calciques GCaMP6s et ne devrait pas endommager des structures apicale cheveux-bundle (Figure 3A3''). Distances de déplacement plus petits peuvent être utilisés pour fournir des stimuli non-saturant (Figure 3A3'). Distances de déplacement > 10 µm sont difficiles à estimer ( Figure 3A3'' ') et peut être préjudiciable au fil du temps. Saturation du signal dépend de l’âge du neuromast (et kinocilial hauteur) ainsi que l’indicateur utilisé. Vérifier la perméabilité de l’aiguille jet fluide dans chaque sens (pression/push et aspirateur/collecteur) périodiquement au cours de l’imagerie. Fluide-jet aiguilles obstruent facilement et perdent la perméabilité sous vide, mais ils maintiennent la perméabilité de la pression résiduelle. Utilisation DIC optique et un stimulus court essai dans chaque direction pour vérifier la perméabilité du jet liquide.
    5. Concentrer l’échantillon dans le plan des intérêts (p. ex., la base des faisceaux cheveux apicale ou la base de la cellule de cheveux dans le plan synaptique ; Figure 1 B1-B2').

8. imagerie Acquisition procédure Option 1 : Acquisition de seul plan

Remarque : L’imagerie tous décrits dans le présent protocole est effectuée à température ambiante.

  1. Définir le logiciel d’imagerie pour acquérir une acquisition de 80-cadre en continu ou en continu avec une capture toutes les 100 ms pour atteindre une cadence de 10 Hz.
  2. Régler le gain, l’ouverture et puissance du laser pour optimiser la détection du signal, mais éviter la saturation, le photoblanchiment et le bruit. Exemple de réglages pour un Opterra/SFC est les suivants : 488 nm laser puissance : 50 (plan MET cheveux-bundle), 75 (plan synaptique) ; fente de 35 µm ; gain = 2,7 ; Gain de EM = le 3900.
    Remarque : Appliquez 2 X binning si des signaux sont trop faibles ou trop bruyant ou ont photoblanchiment excessif. 2 x binning volonté améliorer la détection des signaux au détriment de la résolution spatiale.
  3. Sélectionnez un stimulus à livrer au cours de la 80-(8 s) acquisition après trame 30, 3 s.
    Remarque : Certains stimuli de l’exemple sont comme suit : 200 ms (+ ou - 0.25 V) jusqu'à 2 s (+ ou - 0.25 V) pas dans la direction antérieure ou postérieure à identifier la sensibilité directionnelle de chaque cellule de cheveux ; 2 s, 5 Hz onde carrée (0.25 V pendant 200 ms, -0.25 V pendant 200 ms, répété 5 fois) pour stimuler les cheveux toutes les cellules en même temps. Une pression positive (stimulation antérieure) activera la moitié des cellules ciliées. Une pression négative (stimulus postérieur) l’autre activera la moitié des cellules ciliées. Veillez à ce que le logiciel de stimulation ou l’appareil retourne la pression de serrage à 0 V lorsque le stimulus est terminé.
  4. Mesurer les réponses de calcium mécanosensibles. Mettre l’accent sur la base des faisceaux cheveux apicale (Figures 1 a et 1 b 1-B1') et acquisition d’images de démarrage.
    Remarque : Si le neuromast est clairement vu du haut vers le bas (Figure 1B1-B1'), tous les faisceaux de poils apicale peut être photographiée simultanément sur un seul plan.
  5. Mesurer les réponses de calcium présynaptique. Focus sur la base des cellules ciliées (Figures 1 a et 1 b 2-B2') et acquisition d’images de démarrage.
    Remarque : Si le neuromast est clairement vu du haut vers le bas (Figure 1B2-B2'), les plans d’imagerie présynaptiques de toutes les cellules de cheveux peuvent être acquis en 2 ou 3 avions ensemble 2 µm dehors. Tg [myo6b:ribeye-mcherry] poissons transgéniques peuvent être utilisés pour identifier et localiser les rubans présynaptiques et sites de calcium entrée29.

9. imagerie Acquisition procédure Option 2 : Acquisition multi-plane

  1. Syntonisez le piezo-Z attaché à l’objectif 60 x pour les acquisitions rapides (12 – 18 ms). Vérifiez que les paramètres de vitesse max sont sélectionnés.
  2. Créer une acquisition de Z-pile à l’aide d’un piezo-Z. Acquérir l’activité MET cheveux-bundle 5 avions avec la taille de palier de 0,5 µm. acquérir les signaux présynaptiques dans 5 plans avec la taille de palier de 1 µm.
  3. Définir la cadence de 10 Hz. Chaque image sera capturé toutes les 20 ms et chaque Z-pile toutes les 100 ms.
  4. Mettre en place l’acquisition pour 400 cadres ou 80 Z-piles à 10 Hz pour une 8 s en streaming acquisition.
  5. Définir la puissance du laser, l’ouverture et gain pour optimiser la détection du signal, mais éviter la saturation, le photoblanchiment et le bruit. Paramètres de l’exemple d’un système Opterra/SFC sont comme suit : 488 nm laser puissance : 75 (plan MET cheveux-bundle), 125 (plan synaptique) ; fente de 35 µm ; gain = 2,7 ; Gain de EM = le 3900.
    Remarque : Appliquez 2 X binning si les signaux sont trop faibles,bruyant, ou avoir le photoblanchiment excessif. 2 x binning volonté améliorer la détection des signaux au détriment de la résolution spatiale.
  6. Sélectionnez un stimulus pour offrir lors de l’acquisition à partir de trame 150, après 3 s.
  7. Continuer le protocole comme indiqué ci-dessus pour l’acquisition de l’avion seul, mais centrez la Z-pile dans les plans apicales ou basales (étapes 8.4 et 8.5).

10. commande : Pharmacologique bloc de signaux calciques évoqués tout

NOTE : BAPTA (bis(o-aminophenoxy)-1, 2 éthane-N, N, N′, N′-tétraacétique) le traitement est un contrôle critique lorsqu’il établit tout d’abord ce protocole.

  1. Après avoir complété les étapes 8 ou 9, remplacez le NB par 1 mL de NB contenant 5 mM BAPTA en conjonction avec les liens de pointe requis pour barrière apicale MET canaux situés en faisceaux de cheveux.
  2. Incuber pendant 10 à 20 min à température ambiante.
  3. Laver la BAPTA 3 fois avec 1 mL du Nouveau-Brunswick.
  4. Répétez l’étape 8 ou 9. Après le traitement BAPTA, il ne devrait y avoir aucun changement dans la fluorescence GCaMP6s en réponse à une stimulation jet fluide dans les faisceaux de poils apicale ou avion synaptique. Si les changements de fluorescence GCaMP6s persistent, elles ne sont pas des signaux calciques vrai et peut-être artefacts de mouvement.

11. commande : Bloc pharmacologique des signaux de Calcium présynaptique (facultatifs)

  1. Après avoir complété les étapes 8 ou 9, remplacez le NB NB contenant 10 µM isradipine avec 0,1 % de diméthyl sulfoxide (DMSO) pour bloquer les canaux calciques de type L à la presynapse des cellules ciliées.
  2. Incuber pendant 10 min à température ambiante.
  3. Sans effectuer un lavage, répétez l’étape 8 ou 9. Après le traitement, il faut toujours GCaMP6s les changements de fluorescence en réponse à jet fluide stimulation apicales cheveux-bundles mais pas l’avion synaptique. Si les changements de fluorescence GCaMP6s persistent dans le plan synaptique, ceux-ci ne sont pas des signaux calciques vrai et peuvent être des artefacts de mouvement.

12. représentation graphique et traitement de données de l’image

Remarque : Utiliser des Fidji (étapes 12.1 – 12.1.5) et un programme graphique (étapes 12.2 – 12.2.3) pour l’étape 12. StackReg, TurboReg (étape 12.1.3), Time Series Analyzer V3 (mesures 12.1.4–12.1.6), et les plugins de Fidji sont également requis (voir Table des matières).

  1. Ouvrir une séquence d’images dans les îles Fidji, seul plan chronologiques (80-cadre seul plan) ou une série temporelle de Z-pile (400-cadre multi plan). Cliquez sur « Fichier », sélectionnez « Importer » dans le menu déroulant et cliquez sur « Séquence d’images. »
    1. Pour une série de fois pile Z, Z-projet chaque fois point (5 avions par validant) pour créer une séquence d’image 80 frames. Cliquez sur « Image », sélectionnez « Piles » dans le menu déroulant, sélectionnez « Outils » dans le menu déroulant et cliquez sur « Groupés Z-projet ». Sélectionnez « Moyenne intensité » comme la méthode de Projection et entrez « 5 » pour « Effectif ».
      Remarque : Chaque avion au sein de la pile-Z peut être analysée séparément pour plus d’informations spatiales.
    2. Enlever la première 1 s (10 images) depuis le 8 s (80 images) d’acquisition d’images. Cliquez sur « Image », sélectionnez « Piles » dans le menu déroulant, sélectionnez « Outils » dans le menu déroulant et cliquez sur « Make Substack. » Entrez « 11-80 » pour « Tranches ».
      Remarque : Cette substack sera dénommé stk1.
    3. Enregistrer la séquence d’images (stk1) en utilisant le plugin de StackReg32. Cliquez sur « Plugins », sélectionnez « StackReg » et sélectionnez « Traduction » comme la méthode d’inscription pour la série 70-trame temporelle.
      Remarque : Cette substack enregistré sera dénommé stk2.
    4. Utiliser le plugin fois série Analyzer V3 pour extraire les mesures d’intensité (F) GCaMP6. Placer une région d’intérêt (ROI) sur les faisceaux de poils apicale ou sites présynaptiques dans stk2. Consulter le site Web de ImageJ (voir Table des matières pour le lien) pour obtenir des instructions sur la façon d’utiliser Time Series Analyzer V3.
      Remarque : Utilisez une circulaire de 1 à 2 µm ROI pour faisceaux de poils apicale et une circulaire de 3 – 5 µm ROI pour le plan synaptique (Figures 4 a 1 et 4 a 2).
    5. Sélectionnez les paramètres de mesure. Cliquez sur « Analyser », sélectionnez « Définir la mesure » et vérifiez que seul « signifie valeur de gris » est sélectionnée.
    6. Dans le gestionnaire de ROI, sélectionnez tous les ROIs et utiliser la fonction de Multi-mesures pour générer des valeurs d’intensité (F) pour chaque ROI dans les séries chronologiques. Dans le gestionnaire de ROI, cliquez sur « Plus >> » et sélectionnez « Multi mesure » dans le menu déroulant.
  2. Tracer les valeurs (F). Collez les valeurs (F) d’après les résultats de « Mesure Multi » dans un programme graphique pour créer un graphique xy (Figures 4 a 1 « et 4 a 2 »).
    Remarque : Créer (X) valeurs manuellement ou utiliser l’horodatage des métadonnées.
    1. Quantifier le niveau de référence (Fo) pour chaque ROI en faisant la moyenne des valeurs (F) dans le programme graphique des cadres relance avant 1 – 20.
    2. Pour chaque ROI, soustraire les (Fo) les valeurs de (F) à chaque validant pour créer des valeurs ΔF (et Fo). Replot, si vous le souhaitez.
    3. Calculer et tracer ΔF/Fo. Pour chaque ROI, diviser la mesure ΔF par (Fo) et le relotissement (Figures 4 a 1 '' et 4 a 2 '').

13. traitement et chaleur Carte : représentation des signaux calciques spatio-temporelle d’images

Remarque : Travaux antérieurs pour créer la représentation carte thermique spatial des signaux calciques chez le poisson zèbre cellules ciliées ligne latérale ont utilisé un logiciel personnalisé écrit en Matlab5,28. Cette analyse a été adaptée pour le logiciel d’analyse de source ouverte Fidji33. Utilisation de Fidji pour toutes les étapes décrites ci-dessous. Plugins StackReg et TurboReg Fidji sont également requis (voir Table des matières).

  1. Effectuez les étapes 12.1 – 12.1.3 pour chaque Z-pile ou séries temporelles plan unique créer le substack enregistré, dénommé stk2.
  2. Utilisez stk2 pour créer une image de référence. Cliquez sur « Image », sélectionnez « Piles » dans le menu déroulant et sélectionnez « Projet Z ». Sélectionnez « Moyenne intensité » pour « Type de Projection » et entrer « 1 » pour « Tranche de démarrage » et « 20 » pour « Arrêt de tranche ».
    Remarque : Ce Z-projection sera dénommée baselineIMG.
    1. Bin dans le temps la séquence d’image (F) 70-image (stk2) dans 14 bacs à 0,5 s. Cliquez sur « Image », sélectionnez « Piles » dans le menu déroulant, sélectionnez « Outils » dans le menu déroulant et cliquez sur « Regroupés Z Project ». Sélectionnez « Moyenne intensité » comme la « méthode de Projection » et entrez 5 pour « Format du groupe ».
      Remarque : Cette Z-projection groupée sera être dénommée stk2bin et F à la Figure 5.
    2. Soustraire la valeur de pixel de référence (baselineIMG) de la séquence numérique d’images (F) (stk2bin) pour créer une séquence d’images ΔF. Cliquez sur « Process » et sélectionnez « Image Calculator » dans le menu déroulant. Sélectionnez stk2bin comme « Image1 » et baselineIMG comme« Image2 ». Sélectionnez « Soustraire » pour « L’opération »
      Remarque : Ce Z-projection soustraite à la ligne de base est appelée stk2binBL et F-BL = ΔF dans la Figure 5.
  3. Choisir une table de correspondance (LUT) de choix pour afficher la séquence d’images ΔF (stk2binBL). Cliquez sur « Image », sélectionnez « Tables de recherche » dans le menu déroulant et cliquez sur une LUT de choix.
    Remarque : « Red Hot » est le LUT utilisé dans la Figure 5. Cette base-soustrait Z-projection avec LUT est dénommée stk2binBL-LUT et ΔF LUT à la Figure 5.
    1. La valeur minimum (min) et les valeurs de luminosité (max) maximum pour stk2binBL-LUT. Cliquez sur « Image », sélectionnez « Ajuster » et cliquez sur « Luminosité/contraste ». La valeur min pour supprimer le bruit de fond de stk2binBL-LUT. Définit les valeurs max à conserver des signaux d’intérêt mais éviter la saturation du signal [par exemple, de 200 à 1600 (gamme d’intensité image 12 bits = 0 à 4095)].
      Remarque : Utiliser les mêmes valeurs min et max lorsque vous effectuez des comparaisons visuelles ou représentations. Un bar LUT ΔF d’étalonnage peut être généré dans les îles Fidji pour chaque séquence d’images (par exemple, stk2binBL-LUT) LUT. Cliquez sur « Analyser », sélectionnez « Outils » et cliquer sur « Barre d’étalonnage ». Décochez « Overlay » pour générer une image distincte et individuelle avec la barre d’étalonnage LUT pour référence.
    2. Convertir les deux le ΔF (stk2binBL-LUT)avec l’image souhaitée de la LUTand le temporellement jumelée (F) (stk2bin) séquences en RVB. Cliquez sur « Image », sélectionnez « Type » et cliquez sur « Couleur RVB ».
      Remarque : Les Z-projections RGB-converti seront être dénommés Stk2binBL-LUT-RVB et RVB-stk2bin, respectivement.
  4. Superposer les images LUT de ΔF (stk2binBL-LUT-RGB) sur des images (F) (stk2bin-RGB). Cliquez sur « Process », puis « Image Calculator ». Sélectionnez stk2bin-RGB Image1 et stk2binBL-LUT-RGB comme l’Image2. Sélectionnez « Transparent-zéro » pour le « Opération ».
    Remarque : S’il y a trop de bruit ou arrière-plan dans la superposition LUT ΔF, répétez l’étape 13,3 pour augmenter la valeur min. S’il y a saturation, répétez l’étape 13,3 et augmentez la valeur max.

14. l’image transformation et spatio-temporelle représentation de carte de chaleur à l’aide d’une Macro de Fidji

Remarque : La section suivante fait référence à une macro de Fidji, appelée LUToverlay, basé sur l’étape 13 qui créera automatiquement la représentation carte thermique spatial des signaux GCaMP6s. Cette analyse nécessite l’OpenSource analyse logiciel Fidji33 et les plugins StackReg et TurboReg Fidji (voir Table des matières).

  1. Télécharger la macro de superposition de Fidji LUT (LUToverlay.ijm) qui accompagne ce protocole (voir la Fiche de codage supplémentaire).
  2. Ouvrez une séries temporelles multiples plane ou seul plan chronologiques (voir étape 12.1).
  3. Cliquez sur « Plugins, » sélectionnez « Macros », cliquez sur « Exécuter », puis sélectionnez la macro LUToverlay. Une boîte de dialogue apparaît avec le texte, « Parlez-moi de votre acquisition d’images ».
    Remarque : Pour la boîte de dialogue, les chiffres actuels sont des valeurs suggérées et peuvent être changés selon la configuration utilisée par l’expérimentateur. Les valeurs répertoriées dans la boîte et ci-dessous sont définies pour une série de temps multiples avion avec 400 images et 5 avions par validant (étape 9).
  4. Après « Le nombre d’avions par validant », entrez le nombre d’avions par validant (p. ex., pour l’étape 12.1.1 en utilisant un multi-avion 400 séries temporelles avec 5 avions par validant, entrez « 5 »). Pour une acquisition de plan unique (par exemple, l’étape 8) Inscrivez « 1 ».
    NOTE : Dans les boîtes de dialogue restantes, pour une série d’avion plusieurs fois, « On » désigne les images numéros dans la Z-pile prévue (par exemple, pour étape 12.1.1 c’est 80 points).
    1. Utilisez l’option « Définir la plage d’analyser » pour supprimer le premier 1 s de la séquence d’images (par exemple, pour sélectionner étape 12.1.2 « 11-80" pour enlever les 10 premières images et première 1 s).
    2. Après « Define porté dans la ligne de base », entrez le nombre d’images à utiliser pour créer l’image de base [par exemple, pour l’étape 13,2., entrez « 20 » d’utiliser les images de stimulation préalable (11-30)].
    3. Après « Porté par bac temporelle » entrez le nombre d’images de bin pour la superposition. (par exemple, pour l’étape 13.2.2. Sélectionnez « 5 » pour créer des bacs de 0,5 s 14).
    4. Après que « Min intensité » et « Intensité Max » taper les valeurs de luminosité minimale et maximale qui supprime le bruit de fond (au minimum) et conserver des signaux d’intérêt tout en évitant la saturation (au maximum).
    5. Après « choisir une table de correspondance », sélectionnez le LUT désiré pour la superposition. Cliquez sur « OK ».
      Remarque : La macro se terminera en analysant les images selon les instructions présentées à l’étape 13. Les images générées par la macro seront également nommés selon les instructions à l’étape 13.
  5. Fermez toutes les fenêtres d’analyse avant de traiter une nouvelle séquence d’image.

Representative Results

Après myo6b:GCaMP6s-alpha poissons transgéniques sont correctement immobilisés et le stimulus jet fluide est livré aux cellules ciliées ligne latérale, signaux calciques robuste peuvent être visualisées et mesuré (Figures 4 et 5, prise à 2 X binning). Pendant la stimulation jet fluide, calcium signaux peuvent soit être mesurés dans les faisceaux de poils apicale, où canaux MET ouvre en réponse à des stimuli ou à la base des cellules ciliées, où les canaux calciquesv1.3 Ca présynaptiques déclenchent la neurotransmission. Un exemple représentatif des réponses de calcium dans ces régions avec un neuromast individuel sont indiquées à la Figure 4A1-A2''. Dans cet exemple, un stimulus de fluide-jet 2 s 5 Hz a été livré pour activer toutes les cellules de cheveux dans la neuromast représentative. Au cours de la stimulation, signaux calciques robuste peuvent être détectées en faisceaux de poils (Figure 4A1-A1'', réponses de 8 faisceaux de poils apparaissent). Dans ce système, presque toutes les cellules de cheveux matures afficher cet afflux apical de calcium5. En revanche, au sein de la même neuromast, il y a signaux calciques détectables dans le plan basal, synaptique dans seulement un sous-ensemble (~ 30 %) des cellules ciliées (Figure 4A2-A2'', 4 cellules présynaptiques réponses sont affichées)5. Les 4 vert ROIs spectacle cellules avec aucun signal calcium présynaptique importante (Figure 4A2-A2'') Malgré les signaux calciques apicale robuste (Figure 4A1-A1''). Dans cet exemple représentatif (Figure 4A1-A2'') couleur ROIs coïncident faisceaux de poils dans le plan MET apical (Figure 4A1) avec leurs corps cellulaires dans le plan basal synaptique (Figure 4A2). Cet exemple met en évidence comment les deux signaux de calcium dépendants et présynaptique MET peut être mesurée dans des cellules individuelles de cheveux et parmi les populations de cellules ciliées.

Les signaux calciques dans les deux faisceaux de cheveux et à la presynapse peuvent être tracées graphiquement comme intensité brute de GCaMP6s (F) ou intensitéo GCaMP6s ΔF/F (reportez-vous à l’étape 12, Figures 4 a 1 '-A1'' et 4 a 2 '-A2''). Les graphiques GaMP6s (F) mettre en évidence que l’intensité de fluorescence de base pour chaque cellule peut différer (Figures 4 a 1 ' et 4 a 2 '). Dans les graphiqueso GCaMP6s ΔF/F, chaque cellule est normalisé à sa valeur de référence et le changement de l’intensité relative de base est tracé (Figures 4 a 1 '' et 4 a 2 ''). Dans le deux (F) et ΔF/Fo GCaMP6s parcelles, les signaux calciques dans le faisceau de cheveux apicale et basale avion présynaptique initier avec l’apparition du stimulus (zone grise) et diminuent exponentiellement après la fin de la stimulation. Au cours de la stimulation, les signaux calciques en faisceaux de cheveux augmenter rapidement et saturer si la force de la déviation ne change pas (Figure 4A1-A1''). En revanche, dans le sous-ensemble de cellules de cheveux avec des signaux de calcium détectables dans le plan synaptique, les signaux calciques augmentent plus progressivement et sont moins sujettes à saturation (Figure 4A2-A2''). Dans les cellules de cheveux sans signaux de calcium présynaptique (ROIs verts), les signaux calciques demeurent près de ligne de base.

En plus de ces représentations graphiques (Figure 4), signaux calciques peuvent être visualisées dans l’espace au sein de la neuromast tout au cours de l’évolution temporelle de l’enregistrement. Un exemple d’une représentation spatio-temporelle figure dans la Figure 5 pour des signaux GCaMP6s présynaptiques dans le plan de base d’un neuromast. Dans la Figure 5, les principales étapes pour traiter une séquence d’images pour la visualisation spatiale sont décrites comme décrit à l’étape 13. Tout d’abord, les images raw de GCaMP6s (F) sont temporairement mis en cellule [Figure 5: 1er rang (5 des 14 bacs sont indiquées) ; étape 13.2.1]. Ensuite, l’image de référence, calculé à partir des images de stimulation préalable (étape 13,2), est soustrait les signaux de fluorescence (F) GCaMP6s d’obtenir des images ΔF (Figure 5: 2ème rang ; étape 13.2.2). Ensuite, les images en niveaux de gris ΔF sont converties en une couleur LUT (Figure 5: ligne 3, Red Hot LUT ; étape 13,3). Enfin, les images ΔF avec la conversion de LUT sont recouvertes sur les images (F) temporellement jumelées (Figure 5, la première rangée) pour révéler les signaux spatio-temporelle au sein de la neuromast pendant la stimulation (Figure 5: rang 4 ; étape 13,4). Les cartes de chaleur des signaux GCaMP6s ΔF fournissent les deux précieuses informations spatiales et temporelles qui n’est pas facile à analyser des ROIs unique et les graphiques utilisés dans la Figure 4. Cartes de chaleur peuvent aider à visualiser la critiques informations spatio-temporelles, y compris sous-cellulaires concernant l’apparition et la durée des signaux calciques dans chaque cellule de cheveux ainsi que les différences de calendrier et l’intensité chez les cellules ciliées dans l’ensemble neuromast.

Il est important de vérifier que les graphiques et les cartes de chaleur spatiales représentent les signaux calciques vrai et ne sont pas des artefacts dû à un mouvement. Dans le présent protocole, les artefacts de mouvement peuvent être le résultat de dérive excessive ou mouvement de la larve ou la motion fluide-jet d’une stimulation. Tous ces artefacts sont difficiles à éliminer complètement dans cette préparation in vivo. Alors que l’enregistrement des séquences d’images (étape 12.1.3) peut corriger la majorité du mouvement en x et y, séquences d’images avec un mouvement excessif dans l’axe des z doit être identifiée et supprimée des analyses. Les artefacts de mouvement sont plus faciles à identifier en traçant la courbe les signaux calciques. Exemples de changements d’intensité de GCaMP6s qui sont des artefacts et ne sont pas des vrais GCaMP6s signaux peuvent être observées à l’apex (Figure 4B1'-B1'') et base (Figure 4C1'-C1'') des cellules ciliées.

Les faisceaux de poils apicale, artefacts de mouvement sont communs lorsque le stimulus fluide-jet est trop fort (Figure 3A3'' '). Au cours de ces stimuli trop fort, l’avion apicale cheveux-bundle peut se déplacer hors de discussion pendant la stimulation jet fluide puis revenez à plan focal original après le stimulus s’arrête (Figure 4B1'-B '). Cela rend difficile de mesurer précisément les signaux de calcium apicales MET-dépendante. Un exemple d’artefacts de mouvement de cheveux-bundle peut être vu dans la Figure 4B1'-B1''. Ici, les graphiques montrent une diminution des signaux GCaMP6s au cours de la stimulation (zone grise) lorsque les faisceaux de cheveux sont out-of-focus. Après la fin de la stimulation, les signaux de GCaMP6s augmentent rapidement comme les faisceaux de cheveux revient à leur position d’origine et de reviennent dans le foyer. Cela contraste avec l’exemple de la Figure 4A1'-A1'' dans laquelle les signaux de calcium apical augmentent dès le début du stimulus et diminue lorsque le stimulus se termine.

Alors que le mouvement en raison des stimuli jet fluide excessifs peut également déplacer le plan synaptique floue, ce type d’artefact motion est moins fréquent dans ce plan. Au lieu de cela, les changements en bref dans l’axe des z en raison de la circulation ou dérive de la larve sont les causes les plus fréquentes des artefacts de mouvement. Motion larvaire ou dérive peut affecter les mesures de GCaMP6s à l’apex et la base des cellules ciliées. Un exemple de requête larvaire qui augmente GCaMP6s dans le plan basal, synaptique au cours de la stimulation est illustré à la Figure 4C'-C''. Artefacts de mouvement (Figure 4C1'-C1'') se distinguent des véritables signaux présynaptiques (Figure 4A2'-A2'') en examinant l’évolution temporelle des signaux GCaMP6s. Au lieu de croissantes et décroissantes de façon exponentielle avec le stimulus (Figure 4A2'-A2''), l’augmentation induite par le mouvement GCaMP6s signal avoir un carré façonner et brusquement avec l’apparition et l’offset du stimulus, respectivement ( Figure 4 C1'-C1'').

En plus de l’examen attentif de l’évolution temporelle des signaux GCaMP6s, des expériences de contrôle à l’aide de la pharmacologie peut être utilisés pour différencier les vrai GCaMP6s signaux des artefacts de mouvement. Par exemple, BAPTA (étape 10) peut être appliqué pour cliver l’astuce-liens qui sont requises pour la fonction canal MET en paquets de cheveux. BAPTA devrait éliminer tant évoquée par jet-fluide apicale influx de calcium dépendante de MET-canal que l’influx de calcium ultérieures de basale, présynaptique voie Cav1.3. Dans l’exemple représentatif des signaux vrai calcique induite par stimulation (Figure 4A1-A2'') durant la stimulation du jet liquide, toutes les modifications en fluorescence GCaMP6s dans les deux plans basales et apicales disparaîtrait après traitement BAPTA. Par contre, change en fluorescence GCaMP6s dû à un mouvement tels que ceux figurant dans les Figures 4 b 1 '-B1'' et 4 C 1'-C1'' ne seraient pas éliminées par traitement BAPTA.

Outre l’utilisation BAPTA pour éliminer tous les signaux de GCaMP6s induite par stimulation, isradipine peut être appliqué (étape 11) à spécifiquement bloquer l’influx de calcium dépendants 1,3vCa dans le plan basal synaptique tout en laissant le calcium apical de MET-canal-dépendants afflux intacte5. Après application de l’isradipine, dans un neuromast individuel avec sans artefacts de mouvement, change en fluorescence GCaMP6s en faisceaux de poils apicale (Figure 4A1'-A1'') pendant la stimulation jet fluide serait inchangée, alors que tous les GCaMP6s synaptique changements de fluorescence à la base seraient éliminés (Figure 4A2'-A2''). Tout changement de signal GCaMP6s dans le plan synaptique après l’isradipine application (par exemple,Figure 4C1-C1'') correspondraient probablement aux artefacts de mouvement.

Figure 1
Figure 1 : Vue d’ensemble d’une neuromast de la ligne latérale et les plans d’imagerie fonctionnelles. (A) le schéma de gauche représente une vue de côté d’un neuromast avec quatre corps cheveux-cell (noir) communiquant avec des neurones afférents postsynaptiques (bleu). Rubans (vert) attacher les vésicules présynaptiques sites actifs au sein de chaque cellule. Apical à chaque corps de la cellule est un ensemble de stéréocils (1 µm) qui contiennent des chaînes MET. Chaque paquet de cheveux a un kinocilium qui transfère la force mécanique du mouvement de l’eau à la base de l’ensemble des cheveux. Le diagramme sur la droite représente le même modèle dans une vue de haut en bas. Ce point de vue de haut en bas, noir est utilisé pour indiquer les quatre cellules représentées dans le diagramme sur la gauche, en gris est utilisé pour indiquer les autres cellules de la neuromast. Dans ce modèle et ces 2 vues, trois plans importants sont mis en évidence : (1) les conseils des faisceaux cheveux (kinocilia) utilisés pour quantifier l’ampleur de la déviation de cheveux-bundle, (2) l’avion MET apicale à la base des faisceaux cheveux où le calcium entre dans la cellule au cours de la stimulation et (3) le plan synaptique à la base de la cellule où le calcium pénètre près de rubans synaptiques. (B1-B1 ") DIC et GCaMP6s images de haut en bas du plan MET à la base des faisceaux du cheveux, où les signaux calciques mécanosensibilité-dépendants peuvent être enregistrées. (B2-B2') DIC et GCaMP6s images de haut en bas de la même neuromast B1-B1 ', mais à la base de la neuromast dans le plan synaptique, où les signaux calciques présynaptique peuvent être détectées. (C1-C2) Images d’un neuromast exprimant GCaMP6s où les larves est mal monté. Dans cet exemple, l’apicale MET plan (C1) et au plan synaptique (C2) à la base de la cellule sont placés à un angle sous-optimale. Cette position ne permet pas de tous les faisceaux de cheveux pour être photographiée sur un seul plan, et beaucoup d’avions d’imagerie sont nécessaires pour capturer l’activité au niveau des synapses tous au sein de cette neuromast par rapport à B1-B2 ". Les images sont des larves à dpf 5. La barre d’échelle en C2 correspond à toutes les images en B1-C2. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Chambre, procédures de poisson-zèbre montage et cœur d’injection et aiguilles d’imagerie. (A) montré est une chambre d’imagerie avec une larve (indiquée par un rectangle en pointillés) épinglée au centre au sommet de l’encapsulation de silicone. (B1) Montré est une larve de dpf 5 immobilisé par deux broches. Une grande épingle de tête est placée perpendiculairement au corps juste en arrière de le œil. Les deux yeux sont superposent complètement afin que le œil du fond est entièrement masqué par l’oeil supérieur. Une épingle de petite queue croise la notochorde dans la queue. La larve est plat et non vrillée. (B2) Pour paralyser la larve, une aiguille d’injection de coeur est orientés perpendiculairement au corps et adjacente au cœur. L’aiguille d’injection de coeur devrait communiquer avec les cellules pigmentaires devant le cœur. (B2') Dépression de l’aiguille dans la peau provoque l’indentation de la cellule de pigment devant le cœur. (C) aiguilles dans l’ordre de gauche à droite : exemple d’une aiguille d’injection de coeur avec une ouverture d’environ 3 µm ; exemple d’un bon liquide-pointeau avec une ouverture d’environ 50 µm ; exemple d’un mal cassé fluide-pointeau qui est grand et dentelées et sera susceptible de produire des stimuli excessifs et irréguliers. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Alignement de jet fluide, positionnement et étalonnage de stimulus. (A1) Montré est une larve orientée avec la siège orienté vers la gauche et de la queue vers la droite, et un fluide-pointeau orientés parallèlement à l’axe A-P du corps du poisson-zèbre. Ce fluide-pointeau est aligné pour stimuler la neuromasts qui répondent aux antérieure (push/pression) et postérieur (pull/vide) réalisé courant. (A2) Montré sont un neuromast (indiqué par une ligne blanche en pointillés) et les conseils de faisceaux de poils apicale (kinocilia) sur le côté gauche du panneau et le fluide-pointeau sur le côté droit du panneau. Le fluide-jet est placé environ 100 µm du bord de la neuromast. (A3-A3'' ') Le bout des faisceaux de poils apicale (kinocilia) est dévié des distances différentes en faisant varier la pression jet fluide stimulant. La trajectoire d’une pointe de kinocilial unique est indiquée pour 1,5 µm (A3') et 5 µm (A3'') distances de déflexion. Le cercle noir indique la position de repos de la kinocilium. Il est important que les kinocilia ne sont pas dévié trop loin, sinon l’intensité du stimulus ne peut être quantifiée de manière fiable et peut devenir nuisibles (A3'' '). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Rencontré apicale et basale présynaptique GCaMP6s signaux pendant la stimulation jet liquide dans les cellules de cheveux ligne latérale. (A1-A2'') GCaMP6s intensité change durant la stimulation jet fluide au sein d’un neuromast représentatif. Les images à gauche montrent l’apicale MET avion (A1) et au plan synaptique basale (A2) au sein de la même neuromast. La couleur de ROIs en A1 et A2 ont été utilisées pour tracer l’évolution temporelle de (F) et des ΔF/F GCaMP6s intensité graphiques à droite de chaque image. (B1-B1'') Exemple d’une séquence d’images MET apicale avec mouvement excessif pendant la stimulation jet liquide. L’image sur la gauche (B1) montre la ROIs utilisée pour l’intrigue le (F) et ΔF/F GCaMP6s intensité graphique vers la droite. (C1-C1'') Exemple d’une séquence d’images dans le plan basal synaptique qu’artefacts de mouvement de montre et GCaMP6s signaler les changements qui ne sont pas vrai calcique des signaux. L’image à gauche (C1) montre la ROIs utilisée pour l’intrigue le (F) et ΔF/F GCaMP6s intensité graphique vers la droite. La zone grise dans chaque graphique représente la durée du stimulus jet fluide lors de chaque séquence d’images. Un stimulus de fluide-jet 2 s 5 Hz a été utilisé pour l’exemple de A1-A2 « et B1-B1 ». En C1-C1'', un stimulus d’une étape antérieure s 2 a été utilisé. L’axe des Y pour les graphiques (F) GCaMP6s représente les unités arbitraires (U.A.) obtenues à partir des mesures d’intensité de Fidji image. Tous les exemples sont des larves à dpf 4-5. Echelle = 5 µm pour toutes les images. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Visualisation spatio-temporelle des signaux de GCaMP6s présynaptiques pendant la stimulation jet fluide. Les étapes pour visualiser les changements spatio-temporels en intensité de GCaMP6s dans un neuromast au cours de la stimulation sont décrites. Heure est représentée de gauche à droite selon l’horodatage au dessus des images. La rangée du haut montre 5 des 14 bacs temporelles d’une séquence d’images de la GCaMP6s (F) 70-frame (étape 13.2.1). Dans la deuxième ligne, la ligne de base (étape 13,2) a été retiré de chaque image numérique (F) GCaMP6s pour créer des images ΔF (étape 13.2.2). Dans la troisième rangée, images ΔF ont été convertis de niveaux de gris (seconde ligne) pour les Red Hot LUT (étape 13,3). Le min et max de ces images LUT sont fixés selon la carte de chaleur rouge chaud LUT d’intensité relative ΔF (U.A.) sur la droite (étape 13.3.1). Dans la rangée du bas, la troisième rangée a été superposer sur les images (F) dans la rangée du haut (étape 13,4). La barre grise en haut de la figure indique le moment où le stimulus de fluide-jet 2 s 5 Hz. L’exemple provient d’une larve de dpf 5. Une légende de la carte de chaleur rouge chaud LUT d’intensité relative ΔF (U.A.) est indiquée à droite. Echelle = 5 µm pour toutes les images. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

L’imagerie in vivo chez les animaux intacts est intrinsèquement difficile. Plusieurs étapes de cette méthode sont essentiels à l’obtention de mesures calcium fiable en vivo de cellules ciliées ligne latérale. Par exemple, il est très important que la larve est épinglée et paralysée correctement avant d’imagerie pour minimiser le mouvement pendant la formation image. Mouvement excessif pendant la formation image peut conduire à des changements en fluorescence GCaMP6s qui ne sont pas des vrais signaux et ne correspondent pas à des changements dans les niveaux de calcium (par exemple, Figures 4 b 1 '-B1'' et 4 C 1'-C1''). Broches de la queue peuvent être placés plus vers l’avant pour aider à minimiser le mouvement, même si cela peut rendre plus neuromasts postérieure inaccessibles. En outre, après injection de cœur, goupilles de tête peut être tournées afin que la portion horizontale de l’axe se trouve dans le jaune d’oeuf. En plus de modifier la position des goupilles, il est également possible d’utiliser une harpe de cerveau-tranche au lieu de broches pour immobiliser des larves34. Lorsqu’il est placé correctement sur les larves, une harpe est un autre, potentiellement moins invasive méthode d’immobilisation des larves. Alors qu’un déplacement important pouvant résulter de l’épinglage inadéquat, pour effectuer correctement l’injection de cœur de remettre α-bungarotoxine et paralyser les larves peuvent paralysie incomplète, mouvement et entraîner finalement des artefacts de mouvement. Bien que couramment utilisés anesthésiques ont démontré d’influer sur l’excitabilité des cellules ciliées de poisson-zèbre, les travaux récents ont montré que la benzocaïne anesthésique n’interfère pas avec de nombreux aspects de l’activité des cellules ciliées. De même, le plus couramment utilisé anesthésique MS-222 n’interfère avec certains aspects de l’activité de cellules ciliées15. Donc, en raison de la nature difficile de la α-bungarotoxine injection, benzocaïne ou l’application MS-222 peut s’avérer pour être une méthode alternative utile de paralysie pour empêcher tout déplacement chez la larve au cours de l’imagerie fonctionnelle calcique.

Outre les défis techniques impliqués dans le présent protocole, même un échantillon parfaitement monté est inutile si la larve et les cellules ciliées ne sont pas en bonne santé avant et Pendant chaque expérience d’imagerie. Pour s’assurer que les larves et les cellules ciliées sont en bonne santés, il est important que les larves soient maintenus en tampon E3 qui est exempt de débris tels que des chorions (coquilles de œufs), les déchets et les micro-organismes. Bien que la localisation superficielle des cellules de cheveux ligne latérale est avantageuse pour l’imagerie, cet endroit qui les rend plus vulnérables aux lésions cellulaires quand le tampon de l’E3 est encrassé. Un environnement propre et aqueux est particulièrement important pour les jeunes larves (2-4 dpf) ou mutants qui ne peut pas maintenir une nage verticale du poste et se trouvent principalement sur le fond de la boîte de Pétri. Dans ces situations, cellules ciliées ligne latérale et la cupula protectrice qui entoure les faisceaux de cheveux peuvent facilement devenir compromises. Même si à partir de larves saines et les cellules ciliées, tout au long de chaque expérience, il est essentiel de s’assurer que la larve a un rythme cardiaque et la circulation sanguine rapide. Si la circulation sanguine ralentit ou s’arrête, la santé des cellules cheveux peut devenir compromise. Dans les préparations compromises impliquant des larves de malsains ou de la perte du débit sanguin, mourir les cellules de cheveux peut être identifié plusieurs façons : tout d’abord, par l’apparition de karyopyknosis ou de condensation nucléaire, qui se manifeste par une bulle au sein de la cellule sous le systeme optique DIC ; Deuxièmement, en retrait de la cellule et la présence de déplacer rapidement les particules dans le cytoplasme ; et Troisièmement, lorsque les conseils de kinocilia s’écrasent dans différentes directions,35. Lorsque les faisceaux de cheveux est perturbés, la kinocilia écarté ne déplacez pas cohérente ensemble durant la stimulation.

Cette préparation a plusieurs limitations mineures, une étant que la préparation ne reste robuste pour 1 à 3 heures après que, il est établi. Modifications par exemple à l’aide de petites épingles ou une tranche de cerveau harpe pour immobiliser des larves et ajout d’un système de perfusion peut prolonger la durée de vie de cette préparation en vivo . Une autre limitation est que le photoblanchiment et phototoxicité peut survenir après plusieurs essais d’imagerie. Une façon amusante de relever ce défi est d’adapter ce protocole pour la microscopie de lumière-feuille. La microscopie à lumière-feuille est un puissant moyen de réduire de lumière mise au point, entraînant moins de photoblanchiment et phototoxicité36. Ensemble, immobilisation plus douce et moins d’exposition-photo peuvent aider à prolonger chaque séance d’imagerie. Des séances plus d’imagerie permet d’examiner toute la durée des changements fonctionnels qui accompagnent le développement et les processus qui sous-tendent le dégagement des cellules ciliées et régénération après une lésion. Il est important de souligner que, en plus de la microscopie à lumière-feuille, ce protocole peut être adapté à d’autres systèmes confocal types (disque de détection de point 2 photons et filature) ainsi que des systèmes relativement simples widefield28,34 . Dans l’ensemble, sa polyvalence en fait un outil précieux qui peut être adapté et utilisé avec plusieurs systèmes d’imagerie du protocole.

Alors que ce protocole peut être adapté et utilisé avec de nombreux systèmes d’imagerie, pièces du présent protocole peuvent être également adaptées et utilisés (1) avec d’autres indicateurs en plus GCaMP6s et (2) pour l’activité image dans d’autres cellules sensorielles et les neurones au sein du poisson-zèbre larvaire. Par exemple, dans une étude précédente, nous avons utilisé ce protocole se rapportant à l’activité d’image à l’aide de plusieurs indicateurs codés génétiquement au sein de cellules ciliées ligne latérale pour détecter le calcium cytosolique (RGECO1), la fusion des vésicules (SypHy), tension (Bongwoori) de la membrane et membrane calcium (jRCaMP1a-alpha et alpha-GCaMP6s) et au sein de la ligne latérale des processus afférents pour détecter la membrane calcique (GCaMP6s-alpha)5. Basé sur notre expérience à l’aide de ces indicateurs, la lignée transgénique Tg(myo6b:GCaMP6s-caax) décrit dans ce protocole offre un excellent début pour l’imagerie de l’activité en ligne latérale neuromasts. De tous les indicateurs énumérés ci-dessus, nous avons trouvé que la GCaMP6s est la plus sensible et photostable. Outre ces fonctionnalités, nous mettons en évidence la lignée transgénique Tg(myo6b:GCaMP6s-caax) parce qu’il peut être utilisé pour faire deux mesures distinctes : cellules ciliées mécanosensibilité et calcium présynaptique au sein d’une seule lignée transgénique.

La technique décrite dans cet article montre comment les imagerie calcique dans la ligne latérale de poisson-zèbre peut être une méthode puissante pour étudier le fonctionnement des cellules ciliées dans leur milieu d’origine. Cette approche est complémentaire à l’étude des mammifères dans les cheveux-cellule fonction est actuellement à l’étude ex vivo des explants. En outre, le modèle de poisson-zèbre peut continuer à être utilisé comme une plateforme pour tester l’efficacité des indicateurs génétiquement codés qui peut être appliqué afin d’examiner l’activité des cellules mammaliennes de cheveux.

Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par des fonds de recherche intra-muros NIH/NIDCD 1ZIADC000085-01 (KSK). Nous tenons à remercier Candy Wong son aide à la rédaction de la macro de Fidji. Nous tenons également à remercier Doris Wu et Candy Wong pour leurs suggestions utiles avec le protocole.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Section 1
α-Bungarotoxin R&D Systems 2133 For paralyzing larvae prior to imaging
Phenol red Solution 0.5%  Sigma-Aldrich P0290 For visualization of α-bungarotoxin solution during heart injection
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MESAB, MS-222, tricaine) Sigma-Aldrich A5040 For anesthetizing larvae
Section 2
Imaging chamber Siskiyou PC-R Platform to mount larvae for imaging
No. 1.5 Coverslips square, 22*22 mm VWR 48366-227 To seal imaging chamber 
High vacuum silicone grease Fischer Scientific 14-635-5D  For affixing of coverslip to imaging chamber
Silicone encapsulant clear 0.5 g kit Ellsworth Adhesives Dow Corning Sylgard, 184 SIL ELAST KIT 0.5KG To fill imaging chamber to create a surface to pin fish 
Oven Techne HB-1D For drying silicone encapsulant
Stereomicroscope Carl Zeiss Microscopy Stemi 2000 with transmitted light illumination For illuminating wire, forceps and scissors to make pins
Fine forceps Fine Science Tools Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10 For making pins 
Fine scissors  Cole-Palmer 5.5", EW-10818-00 For cutting tunsgten wire to make pins
Tungsten wire, 0.035 mm Goodfellow W005131 For head pins to immobilize larvae
Tungsten wire, 0.025 mm ThermoFischer Scientific AA10405-H4 For tail pins to immobilize larvae
Section 3
Micropipette guller Sutter Instrument Company P-97 For pulling capillary glass for fluid-jet and heart injection needles
Borosilicate glass capillaries w/ filament Sutter Instrument Company BF 150-86-10 Glass to be pulled into α-bungarotoxin injection needles for heart injection
Borosilicate glass capillaries w/o filament Sutter Instrument Company B 150-86-10 Glass to be pulled into fluid-jet needles to stimulate hair cells
Pipette polisher Narishige MF-830 microforge To polish fluid-jet pipette tips to smooth jagged breaks
Ceramic tile Sutter Instrument Company NC9569052 For scoring and evening breaking fluid-jet needles 
Sections 4 & 5
Fine forceps Fine Science Tools Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10 For pinning larvae
Gel loading tips Eppendorf 5242956003 For backfilling heart injection needles
Stereomicroscope Carl Zeiss Microscopy Stemi 2000 with transmitted light illumination For illuminating larvae during pinning and heart injection
Glass capillary/needle holder WPI MPH315 To hold fluid-jet needles
Manual micromanipulator Narishige M-152 For holding and positioning of needle holder to inject α-bungarotoxin 
Magnetic stand Narishige GJ-1 For holding manual micromanipulator for α-bungarotoxin injection
Pressure injector Eppendorf Femtojet 4x To deliver α-bungarotoxin
Sections 6, 7 & 8
Confocal microscope Bruker Swept field/Opterra confocal microscope Fixed, upright microscope with DIC optics and 488 nm laser with appropriate filters
Microscope software Bruker Prairieview 5.3 To coordinate and control the microscope, lasers, stage, piezo-z, cameras and fluid jet
10x air objective Nikon MRH00101 Low magnification for positioning of larvae and fluid jet
60x water objective Nikon MRF07620 Water immerison objective with high NA (1.0) and adequate working distance (2.0 mm)
Piezo-Z objective scanner with controller/driver Physik Intruments instruments/Bruker 01144210/UM-Z-PZ High-speed z-stack acquisition with 0.025um accuracy
EMCCD camera  QImaging Rolera EM-C2 EMCCD camera  Camera with small pixel size that can acquire up to 100 frames per s
Circular chamber adapter Siskiyou PC-A For holding and rotating imaging chamber on microscope stage
Motorized Z-deck stage Prior Scientific ZDN12MP Microscope stage that can hold and move sample and micromanipulator with fluid-jet needle together
Z-deck stage insert adaptor NIH Machine shop custom To fit the circular chamber adaptor onto the z-deck stage
Fluid-jet apparatus ALA scientific instruments HSPC-1 High-speed pressure Clamp with PV-PUMP For controlling and delivering the fluid-jet stimulus
Masterflex Peroxide-cured silicone tubing (1 feet) Cole-Palmer Masterflex L/S 13, 96400-13 For connecting the fluid-jet needle holder to pressure pump
Motorized micromanipulator Sutter Instrument Company MP-225 For holding and positioning of needle holder for fluid jet 
Micromanipulator controller Sutter Instrument Company MPC-200 For controlling fluid-jet needle manipulator
Gel loading tips Eppendorf 5242956003 For backfilling fluid-jet needles
Glass capillary/needle holder WPI MPH315 To hold fluid-jet needles
PSI manometer Sper Scientific 840081 For measuring pressure clamp output
Section 9
BAPTA, Tetrapotassium Salt, cell impermeant ThermoFischer Scientific B1204 To cleave tips links, uncouple MET channels and block all evoked GCaMP6s signals
Isradipine Sigma-Aldrich I6658 To block signals dependent on the L-type calcium channels (CaV1.3) at the presynapse
DMSO Sigma-Aldrich D8418 Solvent for pharmacological compounds
Section 10
Prism7 Graphpad Prism7 Software to plot GCaMP6 intensity changes
FIJI Schindelin, et., al.34 https://fiji.sc/ Software to process images and create spatio-temporal signal maps
Turboreg Plugin Thévenaz et., al.29  http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ Plugin to register GCaMP6 image sequences in FIJI
StackReg Plugin Thévenaz et., al.29 http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/ Plugin to register GCaMP6 image sequences in FIJI
Times Series Analyzer V3 Plugin Balaji J 2007, Dept. of Neurobiology, UCLA https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html Plugin to create multiple ROIs to measure GCaMP6 intensity changes

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Russell, J. T. Imaging calcium signals in vivo: a powerful tool in physiology and pharmacology. British Journal of Pharmacology. 163, (8), 1605-1625 (2011).
  2. Pérez Koldenkova, V., Nagai, T. Genetically encoded Ca2+ indicators: Properties and evaluation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1833, (7), 1787-1797 (2013).
  3. Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. Genetically encoded indicators of neuronal activity. Nature Neuroscience. 19, (9), 1142-1153 (2016).
  4. Tian, L., Hires, S. A., Looger, L. L. Imaging Neuronal Activity with Genetically Encoded Calcium Indicators. Cold Spring Harbor Protocols. 2012, (6), (2012).
  5. Zhang, Q., et al. Synaptically silent sensory hair cells in zebrafish are recruited after damage. Nature Communications. 9, (1), 1388 (2018).
  6. Harris, G. G., Frishkopf, L. S., Flock, A. Receptor potentials from hair cells of the lateral line. Science. 167, (3914), New York, N.Y. 76-79 (1970).
  7. Eatock, R. A. Vertebrate Hair Cells: Modern and Historic Perspectives. Vertebrate Hair Cells. 1-19 (2006).
  8. Deafness and Hearing Loss, Key Facts. World Health Organization. Available from: http://www.who.int/en/news-room/fact-sheets/detail/deafness-and-hearing-loss (2018).
  9. Tang, L. S., Montemayor, C., Pereira, F. A. Sensorineural hearing loss: potential therapies and gene targets for drug development. IUBMB Life. 58, (9), 525-530 (2006).
  10. Assad, J. A., Shepherd, G. M. G., Corey, D. P. Tip-link integrity and mechanical transduction in vertebrate hair cells. Neuron. 7, (6), 985-994 (1991).
  11. Lumpkin, E. A., Hudspeth, A. J. Detection of Ca2+ entry through mechanosensitive channels localizes the site of mechanoelectrical transduction in hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92, (22), 10297-10301 (1995).
  12. Ricci, A. J., Wu, Y. -C., Fettiplace, R. The Endogenous Calcium Buffer and the Time Course of Transducer Adaptation in Auditory Hair Cells. Journal of Neuroscience. 18, (20), 8261-8277 (1998).
  13. Moser, T., Beutner, D. Kinetics of exocytosis and endocytosis at the cochlear inner hair cell afferent synapse of the mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, (2), 883-888 (2000).
  14. Brandt, A., Khimich, D., Moser, T. Few CaV1.3 channels regulate the exocytosis of a synaptic vesicle at the hair cell ribbon synapse. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 25, (50), 11577-11585 (2005).
  15. Olt, J., Allen, C. E., Marcotti, W. In vivo physiological recording from the lateral line of juvenile zebrafish. The Journal of Physiology. 594, (19), 5427-5438 (2016).
  16. Olt, J., Johnson, S. L., Marcotti, W. In vivo and in vitro biophysical properties of hair cells from the lateral line and inner ear of developing and adult zebrafish. The Journal of Physiology. 592, (10), 2041-2058 (2014).
  17. Griguer, C., Fuchs, P. A. Voltage-dependent potassium currents in cochlear hair cells of the embryonic chick. Journal of Neurophysiology. 75, (1), 508-513 (1996).
  18. Art, J. J., Fettiplace, R. Variation of membrane properties in hair cells isolated from the turtle cochlea. The Journal of Physiology. 385, 207-242 (1987).
  19. Goutman, J. D., Pyott, S. J. Whole-Cell Patch-Clamp Recording of Mouse and Rat Inner Hair Cells in the Intact Organ of Corti. Methods in Molecular Biology. 1427, Clifton, N.J. 471-485 (2016).
  20. Einarsson, R., et al. Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (68), (2012).
  21. Fuchs, P. A. Time and intensity coding at the hair cell's ribbon synapse. The Journal of Physiology. 566, Pt 1 7-12 (2005).
  22. Moser, T., Brandt, A., Lysakowski, A. Hair cell ribbon synapses. Cell and Tissue Research. 326, (2), 347-359 (2006).
  23. Trapani, J. G., Nicolson, T. Chapter 8 - Physiological Recordings from Zebrafish Lateral-Line Hair Cells and Afferent Neurons. Methods in Cell Biology. 100, 219-231 (2010).
  24. Olt, J., Ordoobadi, A. J., Marcotti, W., Trapani, J. G. Physiological recordings from the zebrafish lateral line. Methods in Cell Biology. 133, 253-279 (2016).
  25. Stawicki, T. M., Esterberg, R., Hailey, D. W., Raible, D. W., Rubel, E. W. Using the zebrafish lateral line to uncover novel mechanisms of action and prevention in drug-induced hair cell death. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, (2015).
  26. Spinelli, K. J., Gillespie, P. G. Monitoring Intracellular Calcium Ion Dynamics in Hair Cell Populations with Fluo-4 AM. PLOS ONE. 7, (12), 51874 (2012).
  27. Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 236, (11), 3088-3099 (2007).
  28. Zhang, Q. X., He, X. J., Wong, H. C., Kindt, K. S. Chapter 10 - Functional calcium imaging in zebrafish lateral-line hair cells. Methods in Cell Biology. 133, 229-252 (2016).
  29. Sheets, L., et al. Enlargement of Ribbons in Zebrafish Hair Cells Increases Calcium Currents But Disrupts Afferent Spontaneous Activity and Timing of Stimulus Onset. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 37, (26), 6299-6313 (2017).
  30. Zhang, Q. X., He, X. J., Wong, H. C., Kindt, K. S. Functional calcium imaging in zebrafish lateral-line hair cells. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0091679X15002332 (2018).
  31. Chou, S. -W., et al. A molecular basis for water motion detection by the mechanosensory lateral line of zebrafish. Nature Communications. 8, (1), 2234 (2017).
  32. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7, (1), 27-41 (1998).
  33. Fiji is just ImageJ. Available from: https://fiji.sc/ (2018).
  34. Esterberg, R., Hailey, D. W., Coffin, A. B., Raible, D. W., Rubel, E. W. Disruption of intracellular calcium regulation is integral to aminoglycoside-induced hair cell death. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33, (17), 7513-7525 (2013).
  35. Stengel, D., Zindler, F., Braunbeck, T. An optimized method to assess ototoxic effects in the lateral line of zebrafish (Danio rerio) embryos. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology. 193, 18-29 (2017).
  36. Fadero, T. C., et al. LITE microscopy: Tilted light-sheet excitation of model organisms offers high resolution and low photobleaching. Journal of Cell Biology. (2018).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics