I Vivo kalsium bildebehandling av Lateral linje hårcellene i larver sebrafisk

Neuroscience
 

Summary

Sebrafisk er en modell som har mange verdifulle funksjoner inkludert optisk klarhet, raske eksterne utviklingen, og spesielt viktig å høre og balanse, eksternt ligger sensoriske hårcellene. Denne artikkelen beskriver hvordan transgene sebrafisk kan brukes til analysen både hår-cellers mechanosensation og presynaptic-funksjonen i toto.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lukasz, D., Kindt, K. S. In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish. J. Vis. Exp. (141), e58794, doi:10.3791/58794 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Sensorisk hårcellene er mechanoreceptors i det indre øret som er nødvendig for hørsel og balanse. Hårcellene aktiveres svar på sensoriske stimuli som mekanisk avlede apikale utstikkende deler kalt hår bunter. Nedbøyning åpner mechanotransduction (MET) kanaler i hår bunter, fører til en strøm av kasjoner, inkludert kalsium. Denne kasjon pågangen depolarizes cellen og åpner spenning-gated kalsium kanaler ligger basally på hår-celle presynapse. I pattedyr, hårcellene er omsluttet i ben og det er utfordrende å funksjonelt vurdere disse aktivitetene i vivo. Derimot larver sebrafisk er transparent og ha et eksternt ligger sidelinjen organ som inneholder hårcellene. Disse hårcellene er funksjonelt og strukturelt ligner på pattedyr hårcellene og kan være funksjonelt vurdert i vivo. Denne artikkelen beskriver en teknikk som bruker en genetisk kodet kalsium indikator (GECI), signaler GCaMP6s, måle stimulans-utløste kalsium i sebrafisk sidelinjen hårcellene. GCaMP6s kan brukes sammen med AC confocal imaging, måle i vivo kalsium signaler på toppen og bunnen av lateral linje hårcellene. Disse signalene inneholder en real-time, målbare avlesning av både mechanosensation - og presynapse-avhengige kalsium aktiviteter innenfor disse hårcellene. Disse kalsium signalene også gi viktige funksjonelle informasjon om hvordan hårcellene oppdage og overføre sensoriske stimuli. Total, denne teknikken genererer nyttige data om relativ endringer i kalsium aktivitet i vivo. Det er mindre velegnet for kvantifisering av absolutt omfanget av kalsium endringer. Denne i vivo teknikken er følsom for bevegelse. En rimelig andel av praksis og ferdigheter er nødvendig for riktig posisjonering, immobilisering og stimulering av larver. Til slutt, når godt utført, protokoll beskrevet i denne artikkelen gir en kraftfull måte å samle verdifull informasjon om aktiviteten av hårcellene i deres naturlige, fullt integrert delstater levende dyr.

Introduction

Funksjonell kalsium bildebehandling er et kraftig verktøy som kan brukes til å overvåke aktiviteten til mange celler samtidig1. Spesielt har kalsium bildevisning genetisk kodet kalsium indikatorer (GECIs) vist å være en fordel fordi GECIs kan uttrykkes i spesifikke celletyper og lokaliserte subcellularly2. I nevrovitenskap forskning, har disse funksjonene gjort kalsium bildevisning GECIs en kraftig metode for både definere aktivitet mønstre i nevrale nettverk og måle kalsium tilstrømningen personlige synapser3,4. Dra nytte av disse funksjonene, en fersk studie brukt AC confocal mikroskopi og GECIs for å overvåke subcellular aktivitet innen samlinger av sensoriske hårcellene5.

Hårcellene er mechanoreceptors som oppdager lyd og vestibular stimuli i indre øret og lokale vann bevegelse i sidelinjen systemet i akvatiske vetebrates6,7. Hårcellene er ofte målet for skade eller genetiske mutasjoner som resulterer i den vanligste typen hørselstap hos mennesker kjent som sensorineural hørselen tap8,9. Derfor er det avgjørende å forstå hvordan disse cellene funksjon for å forstå hvordan å behandle og forebygge hørselstap. For å fungere skikkelig, benytte hårcellene to spesialiserte strukturer kalles mechanosensory-hår bunter og synaptic bånd å oppdage og overføre stimuli, henholdsvis. Hår bunter ligger på toppen av hårcellene og består hovedsakelig av fine, hår-lignende utstikkende deler kalt stereocilia (figur 1A). Vestibular og sidelinjen hårcellene har hver håret bunt også en enkelt lang kinocilium (cellens eneste sanne Flimmerhår), som kan strekke seg langt over stereocilia (figur 1A). Mechanosensory stimuli avlede hår bunter, og nedbøyning setter spenning på sammenhengene kalt "tips-koblinger" som interconnect stereocilia10. Denne spenningen åpner mechanotransduction (MET) kanaler ligger i stereocilia, noe som resulterer i en apikale tilstrømning av kasjoner, inkludert kalsium11,12. Denne apikale aktiviteten til slutt depolarizes hår cellen og åpner spenning-gated kalsium kanaler (Cav1.3) på bunnen av cellen. Cav1.3 kanaler finnes tilstøtende synaptic bånd, en presynaptic struktur som tethers blemmer på aktive soner. Basal kalsium tilstrømningen gjennom Cav1.3 kanaler kreves for vesicle fusion, neurotransmission og aktivering av afferente neurons13,14.

I mange år, har elektrofysiologiske teknikker som helhet celle oppdateringen clamping brukt å undersøke funksjonelle egenskaper hårcellene i mange arter, inkludert sebrafisk15,16,17, 18,19,20. Elektrofysiologiske opptakene er spesielt verdifull i feltene høring og balanse fordi de kan brukes til å få ekstremt følsomme målinger fra personlige sensoriske celler, hvis formål er å kode ekstremt rask stimuli over en bredt spekter av frekvenser og intensiteter21,22. Dessverre, hele celler opptak kan ikke måle aktiviteten til bestander av hårcellene. For å studere aktiviteten til bestander av celler i sebrafisk-sidelinjen, har microphonic potensialer og afferente handling potensialer brukt til å måle summerte mechanosensitive og postsynaptic svar egenskapene for individuelle neuromasts23 ,24. Dessverre, verken hele celle opptak eller lokale feltet potensielle mål har romlig oppløsning å finne hvor aktiviteten skjer i enkeltceller eller måle aktiviteten i hver celle i en populasjon. Flere nylig, kalsium fargestoffer og GECIs har vært ansatt å omgå disse utfordringene25,26.

I sebrafisk, har GECIs vist seg for å være en effektiv tilnærming til å undersøke hår-celle-funksjonen på grunn av det er relative enkelt å lage transgene sebrafisk og optisk klarhet Larvene27. I sebrafisk Larvene er hårcellene tilstede i det indre øret, samt sidelinjen systemet. Sidelinjen består av rosett-lignende klynger av hårcellene kalt neuromasts som brukes til å oppdage lokale endringer i vann bevegelse (figur 1). Sidelinjen er spesielt nyttig fordi det ligger eksternt langs overflaten av fisken. Dette har gjort det mulig å stimulere hårvekst celler og måle kalsium signaler optisk i intakt larver. Total, enkel transgenesis, gjennomsiktighet næringsplante og enestående tilgang sidelinjen hårcellene har gjort sebrafisk en uvurderlig modell å studere aktiviteten til hårcellene i vivo. Dette er en betydelig fordel i forhold til pattedyr systemer der hårcellene er omgitt av benete strukturer i det indre øret. Denne mangelen på tilgang har gjort det svært vanskelig å skaffe funksjonelle i vivo målinger av hår pattedyrceller.

Protokollen skissert her beskriver hvordan å overvåke MET kanal - og presynapse-avhengige endringer i kalsium i enkeltceller hår og blant celler innenfor neuromasts i larver sebrafisk. Denne protokollen bruker en etablert transgene sebrafisk linje som uttrykker en membran-lokalisert GCaMP6s under kontroll av hår-celle bestemte myosin6b promoter28. Denne membranen lokalisering stillinger GCaMP6s for å oppdage kalsium tilstrømningen gjennom ionekanaler i plasma membranen som er avgjørende for håret-celle-funksjonen. For eksempel membran-lokalisert GCaMP6s finner kalsium tilstrømningen gjennom MET kanaler i apikale hår bunter og gjennom CaV1.3 kanaler nær synaptic bånd på bunnen av cellen. Dette gir kontrast til bruker GECIs lokalisert på stoffer som cytosolic GECIs oppdager kalsium signaler som er en kombinasjon av MET og CaV1.3 kanal aktivitet samt kalsium bidrag fra andre kilder (f.eks, store release). Denne protokollen skisserer hvordan nakkens og lamme GCaMP6s transgene Larvene før bildebehandling. Det beskriver hvordan du forbereder og bruke en væske-jet for å avlede hår pakker for å stimulere sidelinjen hårcellene i en kontrollert og reproduserbar måte. Representant data som kan oppnås ved hjelp av denne protokollen presenteres. Eksempler på data som representerer bevegelse gjenstander er også presentert. Kontroll eksperimenter som brukes til å bekrefte resultatene og utelukke gjenstander er beskrevet. Til slutt, en metode for å visualisere romlige kalsium signaler i Fiji programvaren er beskrevet. Fiji analysen er tilpasset fra tidligere etablert visualisering metoder utviklet ved hjelp av MATLAB5. Samlet skisserer denne protokollen en kraftig forberedelse teknikk som bruker GECIs larver sebrafisk å måle og visualisere hår-celle kalsium dynamikken i vivo.

Protocol

Alle dyr arbeid ble godkjent av dyr bruk ved National Institutes of Health under dyret studien protokollen #1362-13.

Merk: Denne protokollen tar ca 0,5 til 1 h å fullføre med ingen avbrudd hvis løsninger og utstyr er forberedt og definert på forhånd. Denne protokollen er optimalisert for Tg(myo6b:GCaMP6s-caax)5,29 sebrafisk larver på 3-7 dager etter befruktning (dpf). Denne transgene linjen uttrykker en membran-lokalisert GCaMP6s (sebrafisk codon-optimalisert) i alle sebrafisk hårcellene. Før bildebehandling, er Larvene oppvokst i fosteret bufferen (E3) under standard betingelser. Se Tabellen for materiale for katalogen antall alt utstyr og narkotika kreves for å utføre denne protokollen.

1. forberedelse av løsninger

  1. Forberede 1 mL av α-bungarotoxin (125 µM), som brukes til å lamme sebrafisk Larvene under funksjonell imaging.
    1. Legge til 968.6 µL ultrapure sterilt vann og 33.4 µL fenol rød 1 mg α-bungarotoxin (hele flaske). Gjøre 100 µL dele og lagre dem på 20 ° C.
      Forsiktig: Bruk hansker og gjøre forberedelser i panseret ved håndtering α-bungarotoxin pulver. Hansker som også anbefales ved håndtering α-bungarotoxin løsningen.
  2. Forberede 1 L 60 x embryoet buffer (E3).
    1. Legge til 17.2 g av NaCl og 0,76 g KCl pulver 954.4 mL ultrapure vann.
    2. Legge 19,8 mL 1 M CaCl219,8 mL 1 M MgSO4og 6 mL 1 M HEPES buffer til løsningen. Lagre 60 x E3 lager løsningen på 4 ° C for inntil 6 måneder.
  3. Forberede 10 L 1 x E3 (5 mM NaCl; 0,17 mM KCl; 0,33 mM CaCl2; 0,33 mM MgSO4, pH 7.2), som er en løsning som larver overføres i før funksjonell imaging.
    1. Legge til 167 mL 60 x E3 lager løsning 10 L ultrapure vann for å lage en 1 x E3 løsning. Lagre 1 x E3 løsningen ved romtemperatur (RT) for inntil 6 måneder.
  4. Forberede neuronal buffer (NB) (140 mM NaCl, 2 mM KCl; 2 mM CaCl2; 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES buffer, pH 7.3), som brukes til å fordype Larvene under funksjonell imaging.
    Merk: 1 x E3 kan også brukes for funksjonell imaging, men svar er mer robust og pålitelig i NB.
    1. Kombinere 28 mL 5 M NaCl, 2 mL 1 M KCl, 2 mL 1 M CaCl2, 1 mL 1 M MgCl2og 10 mL 1 M HEPES buffer med 957 mL ultrapure vann. Bringe pH til 7.3 med 1 M NaOH.
    2. Filteret sterilisere. Lagre på 4 ° C i opptil 1 måned.
      Merk: Bringe RT før du bruker løsning.
  5. Forberede MS-222 aksjer (tricaine, 0,4%), som brukes til å bedøve larver.
    1. Oppløse 400 mg ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt og 800 mg Na2HPO4 i 100 mL destillert vann. Justere pH 7. Butikken på 4 ° C.
    2. Bruke 0,04% MS-222 å bedøve Larvene under immobilisering og α-bungarotoxin injeksjon.

2. forberedelse Imaging kammer og Pins

  1. Forberede tenkelig kammeret (figur 2A). Påfør et tynt lag av høy vakuum silikon fett til bunnen av perfusjon kammeret langs kantene på torget som dekkglassvæske vil følge. Ikke la hull i fett. Fast trykk ned rundt kantene på dekkglassvæske å forsegle den til tenkelig kammeret. Tørk bort overflødig fett.
    Merk: 5 mL sprøyter med 200 µL brønnene tips anbefales for fett program.
  2. Forberede silikon encapsulant fylle kammeret. Bland 10:1 forholdet (av vekt) base til herding agent. Bland godt, men forsiktig, bruker et brønnene tips for å opprette minimal bobler.
    1. Hell silikon encapsulant på festet dekkglassvæske slik at den sitter med overflaten av kammeret. Omtrent 3 g av encapsulant fyller i kammeret.
    2. Nøye trykk i kammeret mot flate mens du holder den vannrette, eller bruke et brønnene tips (under en stereomicroscope) å fjerne eller trekke bobler til kanten av kammeret.
    3. Plass kammeret i laboratoriet ovn overnatting på 60-70 ° C. Plass kammeret i en ventilasjon for å sikre at varm luft ikke blåser direkte på encapsulant å unngå å skape krusninger.
  3. Bruke fine tang og tungsten wire mote pinnene til nakkens Larvene gjennom hode og hale (figur 2B1) på den herdet encapsulant.
    1. For å gjøre hodet pins, holde et stykke 0,035 mm tungsten ledningen i den ene hånden under en stereomicroscope. Bruke fine tang i den andre hånden, bøye ledningen 1 mm opp fra slutten ved 90°. Utveksle tang for fine saksen og kuttet 1 mm etter svingen opprette pin.
    2. Gjenta trinn 2.3.1 bruker en 0.025 mm wire å lage hale pinner, men la 0,5 mm tråd på hver side av svingen. Bruk tang til å sette inn nåler i det herdet encapsulant på kammeret (for lagring).

3. forberedelse av nåler til lammelse og stimulering

  1. Forberede hjertet injeksjon nåler med en filament glass kapillærer. Trekk nåler en indre tuppens diameter på 1 – 3 µm (figur 2C).
  2. Forberede væske-jet nåler bruker glass kapillærene uten en filament. Trekk nåler med en tynn, lang tips som kan brytes til riktig tuppens diameter.
    1. Bryte tynne, lange spissen av væske-jet nålen av rubbing den vinkelrett mot en annen væske-jet nål eller en fliser like over hvor pinne-spissen kan bøyes for å skape en indre tuppens diameter på 30-50 µm [figur 2C (midterste bildet) og Figur 3 A2]. Kontroller at pausen er også i spissen (figur 2C, midterste bildet) og ikke hakkete eller for stor (figur 2C, høyre bilde) garantere selv og nøyaktig væske strømme under hår-celle stimulering.
      Merk: En nål poleringsmaskin kan brukes å fikse hakkete pauser.

4. låsing og Immobilizing larve i Imaging kammer

  1. Bade en Tg(myo6b:GCaMP6s-caax) larve i ca 1 mL av E3 buffer inneholder 0,04% MS-222 for 1-2 min på silikon encapsulant overflaten av tenkelig kammer til Larven blir immobile eller ikke reagerer å berøre.
    1. Under en stereomicroscope, plasser Larven i sentrum av perfusjon kammeret så den ligger flatt på sin side mot silikon encapsulant.
      Merk: For konsistens, alltid montere larver på samme side (f.eks høyre side ned, venstre opp) (figur 2B1).
  2. Bruke fine tang, bringe en 0,035 mm hodet pin ned vinkelrett til Larven og kammer. Sett inn nålen hodet mellom øyet og otic vesicle og ned i encapsulant (tall 2B1 og 2B2). Bruke et annet sett med tenger for å stabilisere Larven langs sin rygg eller ventral side mens låsing. Kontroller at den vannrette delen av pin kontakter Larven og ikke trykker inn i encapsulant. Vinkel pin ventrally (figur 2B1) eller peker litt mot den fremre fisken å unngå konflikt med påfølgende hjertet injeksjon og hår-celle bildebehandling.
    1. Bruke pinsett, sett inn en 0.025 mm halen pin i notochord så nær som mulig til slutten av halen (figur 2B1).
      Merk: Pass på å unngå å strekke Larven. PIN Larven flat. Øyne bør være lagt (figur 2B1). Dette er svært viktig for enkel hjertet injeksjon (figur 2B2-B2', trinn 5), tilrettelegge ønskelig tenkelig flyet (figur 1B1-B2'', trinn 8 og 9), og kvantifisere intensiteten av væske-jet stimulans ( Figur 3A3trinn 7).

5. injeksjon av α-Bungarotoxin i hjertet hulrom lamme Larven

Merk: Bruk hansker når du håndterer α-bungarotoxin.

  1. Sentrifuge α-bungarotoxin aliquot kort før bruk for å hindre tilstopping av hjertet injeksjon nålen.
    1. Etterfylle 3 µL α-bungarotoxin løsning til en hjertet injeksjon nål bruker en gel lasting pipette tips. Last løsningen jevnt på spissen med noen bobler.
    2. Hjertet injeksjon nålen inn en pipette holder knyttet til en manuell micromanipulator. Plasser nålen under en stereomicroscope, så det er justert vinkelrett A-P aksen av låste og bedøvet larvene, peker nedover i en vinkel på ~ 30°.
    3. Koble pipette abonnenten til press injektoren. Bruk følgende foreslåtte innstillinger: Pinjection = 100 hPa, tinjection = 0,5 s og Pcompensation = 5 hPa. Injisere bolus i løsningen til å teste om pinne-spissen er.
    4. Se etter en liten puff av røde løsningen (fra fenol rød) for å la tuppen av nålen. Hvis ingen rød farge er sett, svært forsiktig skrape pinne-spissen mot kanten av en PIN-kode og prøv igjen før nålen er patent. Eventuelt trekke en nål med en større tips åpning.
  2. Forhånd nålen mot hjertet til det berører huden utenfor hjertet (figur 2B2). Trykk p i Larven og se etter innrykk av pigment cellen på huden foran hjertet å sikre at nålen plasseres i riktige flyet i forhold til Larvene (figur 2B2 ").
    1. Forhånd nålen videre til det skjærer huden og går inn hjertet hulrom. Dra pinnen tilbake litt. Injisere bolus av α-bungarotoxin i hjertet hulrom. Ser for inflasjon av hjertet hulrom eller rød farge inn i hulrommet.
  3. Forsiktig rense Larven 3 ganger med 1 mL av NB fjerne gjenværende MS-222. Aldri fjerne alle av væsken. Opprettholde larve i ca 1 mL av NB på perfusjon kammeret.
    Merk: Sikre at larver hjerteslag og blodstrøm være robust etter festing og hjertet injeksjon og gjennom hele tenkelig eksperimentet.

6. forberedelse av mikroskopet og væske-jet oppsett

  1. Montere en oppreist AC confocal mikroskop med komponenter som er beskrevet i Tabellen over materialer: AC confocal mikroskop med en 488 nm laser og riktig filtre, mikroskop programvare for å kontrollere og koordinere imaging og stimulering, 10 x air mål, 60 x vann mål, piezo-Z objektive skanner (for z-stabler), høyhastighets kamera, runde kammer adapter, motorisert scenen og scenen sett inn adapter. Se Zhang et al.29 for flere alternativer og veiledning på mikroskopet oppsett.
  2. Samle væske jet består av 3 hovedkomponenter: et vakuum og trykk pumpe, høyhastighets press klemme og hodet scenen (også beskrevet i tabellen over materialet). Bruk høyhastighets trykk klemmen for å styre tidsberegningen og varigheten av trykk eller vakuum utslipp fra hoder scenen og til væske-jet pipette.
    1. Koble til produksjon av hodet scenen til væske-jet pipette holderen via tykke vegger silikon slangen.

7. justering Larven og væske-jet

Merk: Det er 3 fly rundt i hver neuromast: (1) tips av hår bunter (Figur 3A3: kinocilia, brukes til å måle stimulans intensitet); (2) håret bunt MET flyet (figur 1B1-B1': en base av apikale hår bunter der MET-kanal-avhengige kalsium signaler oppdages); og (3) synaptic flyet (figur 1B2-B2': hvor presynaptic kalsium signaler oppdages ved foten av hår cellen). Disse flyene er beskrevet i figur 1A.

  1. Etterfylle 10 µL av NB i en riktig ødelagt væske-jet nål (fra trinn 3.2) bruker en gel lasting tips. Last løsningen jevnt på spissen med noen bobler. Sette inn nålen inn i pipette holderen knyttet til den motoriserte micromanipulator.
  2. Plass perfusjon kammeret i en runde kammer adapter på mikroskopet scenen.
    Merk: For konsistens, alltid plassere Larven i samme retning (f.eks kammeret som inneholder Larven med sin posterior mot flytende jet og ventrale vendt mot eksperimentator).
    1. Flytte motorisert scenen slik at Larven er i midten av synsfeltet. Slå sirkulær kammer-adapter slik at A-P aksen av Larven er omtrent på linje med banen væske-jet nålen.
    2. Bruke overføres lett og differensial forstyrrelser kontrast (DIC), bringe Larven i fokus og Midtstiller den 10 x mål. Øke 10 x målet.
  3. Bruke motoriserte micromanipulator, nedlegge væske-jet nålen i midten av synsfeltet slik det er opplyst av lyset og knapt berøre NB løsningen.
    1. Lavere 10 x målet. Fokus på Larven å bekrefte beliggenheten. Fokusere opp for å finne væske-jet nålen. Flytte væske-jet nålen med micromanipulator i x - og y - aksene til det er i en posisjon parallelt dorsal side av fisken.
    2. Fokus på larvene. Få nålen ned i z-aksen. Plasser nålen langs dorsal side av fisk og ~ 1 mm fra kroppen (Figur 3A1).
    3. Flytt forsiktig sirkulær kammer adapteren (om nødvendig) å sikre at væske-jet nålen er justert langs A-P midtlinjen av Larven (Figur 3A1).
    4. Flytte motorisert scenen å plassere neuromast rundt i sentrum av synsfeltet. Holde væske-jet pinne-spissen langs dorsal fisken. Ikke berør tuppen av væske-jet nålen Larven eller kammer overflaten.
  4. Bytt til 60 x vann mål. Kontroller at målet er nedsenket i NB løsningen. Bruk finskruen til å finne en neuromast med overført lys og DIC optikk.
    Merk: Dette oppsettet er designet for å stimulere neuromasts langs primære bakre sidelinjen. Hårcellene i disse neuromasts svare fremre eller bakre regissert væskestrøm. Se Chou et al.31 for nøyaktige kart av neuromast væske følsomhet i sidelinjen systemet.
    1. Plasser væske-jet nålen med micromanipulator slik at det er 100 µm fra ytterkanten av neuromast (Figur 3A2).
      Merk: Velg neuromasts som utsikt klart ovenfra og ned (tall 1B1'-B2' og Figur 3A3) i stedet for side-vinklet visninger (figur 1C1-C2). En klar topp-ned visning tillater samtidig imaging av alle apikale hår bunter i et enkelt optisk fly eller imaging av synaptic områder i færre optisk fly (Figur 3A3).
    2. Fokus til tips av apikale hår-pakker (kinocilia) (figur 1A, tall 3A2 og 3A3). Bunnen av væske-jet nålen skal være i fokus i dette flyet.
  5. Angi høyhastighets trykk klemmen fra manuell til eksterne modus å motta innspill fra tenkelig programvare.
    1. Null høyhastighets trykk klemmen ved å trykke på "zero" knappen. Bruk set-punktet knotten for å angi hviler presset litt positiv (~ 2 mmHg). Bekreft hvile resultatet av høyhastighets trykk klemmen med en PSI manometer knyttet til hodet scenen utdataene.
      Merk: Angi et svakt positivt trykk på resten å unngå gradvis opptaket av væske i væske-jet nålen over tid. Hvis væske inn slangen koblet til væske-jet og når hodet scenen, kan det skade utstyret.
    2. Bestemme presset som trengs for å stimulere hår bunter. Bruk en 0.125 og 0,25 V inngang (6,25 og 12,5 mmHg) for 200-500 ms for å bruke en test stimulans (Figur 3A3-A3'').
      Merk: Høyhastighets trykk klemmen konverterer en spenning inn (fra programvare eller andre enheter som kobler til BNC-porten på høyhastighets trykk klemmen kommandoen porten) Trykk som slippes ut fra hodet scenen, og til slutt, væske-jet nålen (1.0 V = 50 mmHg, mens V -1,0 =-50 mmHg). I denne konfigurasjonen (se trinn 7.2) positive trykk (trykk) deflects hår bunter mot det fremre, og negative trykket (pull) deflects hår bunter mot bakre.
    3. Bruke lyset og DIC optikk med en skala bar, måle avstand av nedbøyning 6,25 og 12,5 mmHg stimuli av tips av hår bunter, kinocilia (figur 1A og tallene 3A3-3''). Velg et trykk som flytter pakker (som 1 sammenhengende enhet) en avstand på ca 5 µm (Figur 3A3''). Sikre at tips av kinocilia forblir i fokus hele tiden.
    4. Flytte væske-jet ± 25 µm langs A-P akse Larven å finne avstand og press som deflects tips av kinocilia 5 µm.
      Merk: Bruke GCaMP6s i Larvene 3 – 7 dpf, en 5 µm deflection skal oppnå nærheten mette GCaMP6s kalsium signaler og skal ikke skade apikale håret-bunt strukturer (Figur 3A3''). Mindre forskyvning avstander kan brukes til å levere ikke-mette stimuli (Figur 3A3'). Forskyvning avstander > 10 µm er vanskelig å anslå ( Figur 3A3'' ') og kan skade over tid. Signalet metning er avhengig av alder av neuromast (og kinocilial høyde) samt indikatoren brukes. Kontroller patency væske-jet nålen i hver retning (trykk/push og vakuum/pull) med jevne mellomrom under bildebehandling. Væske-jet tresko lett og miste vakuum patency, men de vedlikeholde trykk patency. Bruk DIC optikk og en kort test stimulans i hver retning etter væske jet-patency.
    5. Fokusere prøven i flyet av interesse (f.eks basisen av apikale hår bunter eller undersiden av håret cellen i synaptic flyet; Figur 1 B1-B2').

8. imaging oppkjøpet prosedyren alternativ 1: Single-plane oppkjøp

Merk: Alle bilder i denne protokollen utføres på RT.

  1. Angi tenkelig programvare å erverve en streaming eller kontinuerlig 80-ramme oppkjøp med en fange hvert 100 ms for å oppnå en bildefrekvens på 10 Hz.
  2. Angi gevinst, aperture og laser makt å optimalisere signalgjenkjenning, men unngå metning, photobleaching og støy. Eksempelinnstillinger for en Opterra/SFC er som følger: 488 nm laser makt: 50 (håret bunt MET fly), 75 (synaptic fly); 35 µm slit; få = 2.7; EM gevinst = 3900.
    Merk: Bruk 2 X binning hvis signaler er for svakt eller støyende eller overdreven photobleaching. 2 x binning vil forbedre signalgjenkjenning på bekostning av romlig oppløsning.
  3. Velg en stimulans til å levere under 80-rammen (8 s) oppkjøp etter rammen 30 til 3 s.
    Merk: Enkelte eksempel stimuli er som følger: 200 ms (+ eller - 0,25 V) opptil 2 s (+ eller - 0,25 V) skritt i fremre eller bakre retning å identifisere retningsbestemt følsomheten til hver håret cellen; 2 s, 5 Hz firkantbølge (0,25 V for 200 ms,-0.25 V for 200 ms, gjentas 5 ganger) å stimulere alle hår cellene samtidig. Et positivt trykk (anterior stimulans) vil aktivere halvparten av hårcellene. Et negativt trykk (bakre stimulans) vil aktivere den andre halvparten av hårcellene. Pass på at den stimulans programvare eller returnerer trykk klemmen til 0 V etter stimulans er fullført.
  4. Måle mechanosensitive kalsium svar. Fokus på undersiden av apikale hår bunter (tall 1A og 1B1-B1') og starte bildeopptak.
    Merk: Hvis neuromast vises tydelig fra toppen ned (figur 1B1-B1'), alle apikale hår bunter kan avbildes samtidig i et enkelt fly.
  5. Måle presynaptic kalsium svar. Fokus på undersiden av hårcellene (tall 1A og 1B2-B2') og starte bildeopptak.
    Merk: Hvis neuromast vises tydelig fra toppen ned (figur 1B2-B2'), presynaptic tenkelig flyene på alle hårcellene kan skaffes i 2-3 fly sett 2 µm fra hverandre. Vs [myo6b:ribeye-mcherry] transgene fisk kan brukes til å identifisere og finne presynaptic bånd og nettsteder av kalsium oppføring29.

9. imaging oppkjøpet prosedyren alternativ 2: Flere fly oppkjøp

  1. Tune piezo-Z knyttet til 60 x målet for rask oppkjøp (12 – 18 ms). Kontroller at max hastighet innstillinger er valgt.
  2. Opprette en Z-stack oppkjøpet bruke en piezo-Z. Få håret bunt MET aktiviteten i 5 fly med trinn størrelse på 0,5 µm. Hent presynaptic signalene i 5 fly med trinn størrelse på 1 µm.
  3. Velg bildefrekvensen til 10 Hz. Hver ramme vil bli tatt hver 20 ms og hver Z-stack hvert 100 ms.
  4. Definere oppkjøpet for 400 rammer eller 80 Z-stabler ved 10 for en 8 s streaming oppkjøpet.
  5. Angi laser makt, aperture og gevinst å optimalisere signalgjenkjenning, men unngå metning, photobleaching og støy. Eksempelinnstillinger for en Opterra/SFC system er som følger: 488 nm laser makt: 75 (håret bunt MET fly), 125 (synaptic fly); 35 µm slit; få = 2.7; EM gevinst = 3900.
    Merk: Bruk 2 X binning hvis signaler er for svakt,støyende, eller overdreven photobleaching. 2 x binning vil forbedre signalgjenkjenning på bekostning av romlig oppløsning.
  6. Velg en stimulans til å levere under oppkjøpet starter på rammen 150, etter 3 s.
  7. Fortsette protokollen som beskrevet ovenfor for enkelt flyet oppkjøpet, men center Z-stakken i apikale eller basale flyene (trinn 8.4 og 8,5).

10. kontroll: Farmakologiske blokk med alle vakte kalsium signaler

Merk: BAPTA (1,2-bis(o-aminophenoxy) etan-N, N, N′, N′-tetraacetic syre) behandling er en kritisk kontroll når først å etablere denne protokollen.

  1. Når du har fullført trinn 8 eller 9, erstatte NB med 1 mL av NB som inneholder 5 mM BAPTA deler tips koblingene må gate apikale MET kanaler i hår bunter.
  2. Inkuber for 10-20 minutter til RT.
  3. Vaske BAPTA 3 ganger med 1 mL av NB.
  4. Gjenta trinn 8 eller 9. Etter BAPTA behandling skal det ingen endring i GCaMP6s fluorescens svar på væske-jet stimulering i apikale hår bunter eller synaptic flyet. Hvis endringer i GCaMP6s fluorescens vedvarer, dette er ikke sant kalsium signaler og kan være bevegelse.

11. kontroll: Farmakologiske blokk Presynaptic kalsium signaler (valgfritt)

  1. Når du har fullført trinn 8 eller 9, erstatte NB med NB som inneholder 10 µM isradipine med 0,1% dimethyl sulfoxide (DMSO) å blokkere L-type kalsium kanaler på hår-celle presynapse.
  2. Inkuber i 10 min på RT.
  3. Uten å utføre en vask, gjentar du trinn 8 eller 9. Det bør fortsatt være GCaMP6s fluorescens endringer svar på væske-jet stimulering i apikale hår-pakker, men ikke synaptic flyet etter behandling. Hvis endringer i GCaMP6s fluorescens vedvarer i synaptic flyet, dette er ikke sant kalsium signaler og kan være bevegelse.

12. bilde prosessering og grafisk representasjon av dataene

Merk: Bruk Fiji (Trinn 12,1-12.1.5) og et grafisk program (Trinn 12.2-12.2.3) for steg 12. StackReg, TurboReg (Trinn 12.1.3), tid serien Analyzer V3 (Trinn 12.1.4–12.1.6), og Fiji plugins er også nødvendig (se Tabell for materiale).

  1. Åpne en bildesekvens i Fiji, en enkelt-plane tidsserier (80-ramme enkelt fly) eller Z-stack tidsserier (400-rammen multi fly). Klikk på "File", velg "Import" fra det miste-ned menyen, og klikk på "Image Sequence."
    1. For en Z-stack ganger serien, Z-prosjekt hver gang peker (5 plan per timepoint) til å opprette en 80-ramme bildesekvens. Klikk på "Image," Velg "Stabler" fra det miste-ned menyen, velg "Tools" fra det miste-ned menyen og klikk på "Gruppert Z-project." Velg "Gjennomsnittlig intensitet" som metode for projeksjon, og angi "5" for "Gruppe størrelse".
      Merk: Hver planet i Z-stabelen kan analyseres separat for romlig tilleggsinformasjon.
    2. Fjern de første 1 s (10 bilder) fra 8 s (80 rammer) for bildeopptak. Klikk "Bilde," Velg "Stabler" fra det miste-ned menyen, velg "Tools" fra det miste-ned menyen og klikk på "Make Substack." Angi "11-80" for "Stykker".
      Merk: Denne substack vil bli referert til som stk1.
    3. Registrere bildesekvens (stk1) bruker StackReg plugin32. Klikk på "Plugins", velg "StackReg", og velg "Oversettelse" som metode for registrering for 70-ramme tiden serien.
      Merk: Denne registrerte substack vil bli referert til som stk2.
    4. Bruk ganger serien Analyzer V3 plugin å ekstra GCaMP6 intensitet (F) målingene. Plass en region av interesse (ROI) på apikale håret bunt eller presynaptic områder i stk2. Se webområdet ImageJ (se Tabell for materiale for koblingen) for instruksjoner om hvordan du bruker tiden serien Analyzer V3.
      Merk: Bruk en sirkulær 1 – 2 µm avkastning for apikale hår bunter og en sirkulær 3 – 5 µm avkastning for synaptic flyet (tall 4A1 og 4A2).
    5. Velg målingen parameterne. Klikk på "Analysere", velg "Angi Measurement", og kontroller at bare "betyr grå verdi" er valgt.
    6. I Avkastningen manager, velge alle ROIs og bruke funksjonen flere mål for å generere (F) intensitetsverdiene for hver avkastning i tidsserien. I Avkastningen Manager, klikk "Mer >>", og velg "Multi tiltak" fra det miste-ned menyen.
  2. Handlingen (F) verdier. Lime inn verdiene (F) fra "Multi tiltak" resultatene i grafisk program for å lage et xy-diagram (tall 4A1 "og 4A2").
    Merk: Opprette (X) verdier manuelt eller bruke tidsangivelsen fra metadataene.
    1. Kvantifisere grunnlinjen (Fo) for hver avkastning av gjennomsnitt (F) verdiene i grafisk programmet fra før stimulans rammer 1-20.
    2. For hver avkastning, trekke (Fo) fra (F) verdiene på hver timepoint opprette ΔF (F-Fo) verdier. Øya, om ønskelig.
    3. Beregne og tegne ΔF/Fo. For hver avkastning, dele ΔF måling av (Fo) og øya (tall 4A1'' og 4A2'').

13. image bearbeiding og varme kart representasjon av Spatio-temporale kalsium signaler

Merk: Tidligere arbeidet for å opprette romlige varme kart representasjon av kalsium signaler i sebrafisk sidelinjen hårcellene har brukt tilpasset programvare skrevet i i Matlab5,28. Denne analysen har blitt tilpasset for åpen kildekode analyseprogramvare Fiji33. Bruk Fiji for alle trinnene under. StackReg og TurboReg Fiji plugins er også nødvendig (se Tabell for materiale).

  1. Utfør trinnene 12,1-12.1.3 for hver Z stabel eller enkelt flyet tidsserier opprette den registrerte substack kalles stk2.
  2. Bruk stk2 til å opprette et opprinnelig bilde. Klikk på "Image," Velg "Stabler" fra det miste-ned menyen, og velg "Z prosjektet". Velg "Gjennomsnittlig intensitet" for "Projeksjon type", og angi "1" for "Start del" og "20" for "Stopp skive".
    Merk: Dette Z-prosjektering vil bli referert til som baselineIMG.
    1. Timelig bin 70-ramme (F) bildesekvens (stk2) i 14 0,5-s Vinduer. Klikk på "Image," Velg "Stabler" fra det miste-ned menyen, velg "Tools" fra det miste-ned menyen og klikk på "Gruppert Z prosjektet". Velg "Gjennomsnittlig intensitet" som "projeksjon metoden", og legger inn 5 for "Gruppe størrelse."
      Merk: Denne grupperte Z-prosjektering vil bli referert til som stk2bin og F i figur 5.
    2. Trekke bildepunktverdien til opprinnelig plan (baselineIMG) fra binned (F) bildesekvens (stk2bin) å lage en ΔF bildesekvens. Klikk på "Prosess" og velg "Bildet Kalkulator" fra det miste-ned menyen. Velg stk2bin som "Image1" og baselineIMG som"Image2." Velg "Trekke" for "Operation."
      Merk: Denne planlagte-trukket Z-projeksjonen kalles stk2binBL og F-BL = ΔF i figur 5.
  3. Velg en oppslagstabell (LUT) ønsker å vise ΔF bildesekvens (stk2binBL). Klikk på "Image," Velg "Oppslagstabeller" fra det miste-ned menyen, og klikk på en LUT valgfrihet.
    Merk: "Red Hot" er LUT i figur 5. Dette baseline-trukket Z-projeksjon med LUT kalles stk2binBL-LUT og ΔF LUT i figur 5.
    1. Angi minimum (min) og maksimal (max) lysstyrkeverdiene for stk2binBL-LUT. Klikk på "Image," Velg "Juster", og klikk på "Lysstyrke/kontrast". Angi minimumsverdien fjerne bakgrunnsstøy fra stk2binBL-LUT. Angi maks verdier å beholde signaler av interesse, men unngå signal metning [f.eks 200 til 1600 (12-biters avbildning intensitet utvalg = 0 til 4095)].
      Merk: Bruk de samme verdiene som min og max når visuelle sammenlikninger eller fremstillinger. En ΔF LUT kalibreringslinjen kan genereres i Fiji for hver LUT bildesekvens (f.eks stk2binBL-LUT). Klikk på "Analysere", velg "Verktøy", og klikk på "Kalibrering Bar". Unclick "Legg over" for å generere en egen, personlige bilde med LUT kalibreringslinjen for referanse.
    2. Konvertere både i ΔF (stk2binBL-LUT)med ønsket LUTand timelig binned (F) bilde (stk2bin) sekvenser til RGB. Klikk på "Image," merker "Type", og klikk på "RGB fargen."
      Merk: RGB-konvertert Z-anslagene vil bli referert til som stk2binBL-LUT-RGB og stk2bin-RGB, henholdsvis.
  4. Overlappe ΔF LUT bildene (stk2binBL-LUT-RGB) på binned (F) bilder (stk2bin-RGB). Klikk på "Prosess" og deretter "Bildet Kalkulator". Velg stk2bin-RGB som Image1 og stk2binBL-LUT-RGB som Image2. Velg "Transparent-null" for "Operasjon".
    Merk: Hvis det er for mye støy eller bakgrunn i ΔF LUT overlegg, Gjenta trinn 13,3 øke minimumsverdien. Hvis metning, Gjenta trinn 13,3 og øke den maksimale verdien.

14. bilde prosessering og Spatio-temporale varme kart representasjon bruker en Fiji makro

Merk: Delen nedenfor refererer til en Fiji kalt LUToverlay basert på trinn 13 som automatisk oppretter romlige varme kart representasjon av GCaMP6s signaler. Denne analysen krever åpen kildekode analyse programvare Fiji33 og StackReg og TurboReg Fiji plugins (se Tabell for materiale).

  1. Last ned Fiji LUT overlegg makroen (LUToverlay.ijm) følger denne protokollen (se Ekstra koding fil).
  2. Åpne en multi fly tidsserier eller single-plane tidsserier (se Trinn 12.1).
  3. Klikk på "Plugins", velg "Makroer" Klikk på "Kjør", og velg makroen LUToverlay. Det vises en dialogboks med teksten "Fortell meg om din image vinningen".
    Merk: Hvis dialogboksen tallene finnes foreslåtte verdier og kan endres i henhold til oppsettet som brukes av eksperimentator. Verdiene i boksen og nedenfor er satt for en flere fly tidsserier med 400 bilder og 5 fly per timepoint (trinn 9).
  4. Etter "Antall fly per timepoint", angir du antall fly per timepoint (f.eks for trinn 12.1.1 bruker et multi fly 400 tidsserier med 5 flyene per timepoint, angi "5"). For et enkelt flyet oppkjøp (f.eks trinn 8) Angi "1".
    Merk: I de gjenværende dialogboksene, for en flere fly tid serien, "Timepoints" refererer til antall bilder i forventet Z-stakken (f.eksfor trinn 12.1.1 er 80 timepoints).
    1. Bruke alternativet "Definere analysere" fjerne de første 1 s av bildesekvens (f.eks for trinn 12.1.2 Velg "11-80" å fjerne de første 10 rammene og første 1 s).
    2. Etter "definere timepoints planlagte", angir du antall bilder som skal brukes til å opprette planlagte bildet [f.eks for trinn 13.2., angi "20" bruke pre stimulans bildene (11-30)].
    3. Etter "Timepoints hver timelige" Angi antall bilder til bin for overlegget. (f.eks for trinn 13.2.2. Velg "5" opprette 14 0,5-s hyller).
    4. Når "Min intensitet" og "Max intensitet" Angi minimum og maksimum lysstyrkeverdiene som fjerner bakgrunnsstøy (minimum) og beholde signaler rundt mens du unngår metning (maksimum).
    5. Etter "Velg en oppslagstabell", Velg LUT ønsket for overlegget. Klikk "OK".
      Merk: Makroen avsluttes analysere bildene i henhold til instruksjonene i trinn 13. Bildene genereres makroen vil også bli navngitt i henhold til instruksjonene i trinn 13.
  5. Lukk alle analyse Vinduer før behandling en ny bildesekvens.

Representative Results

Etter myo6b:GCaMP6s-caax transgene fisk er riktig immobilisert og væske-jet stimulans leveres til sidelinjen hårcellene, robust kalsium signaler kan visualiseres og målt (tall 4 og 5på 2 X binning). Under væske-jet stimulering signaler kalsium kan enten måles i apikale hår bunter, der MET kanaler åpne som svar på stimuli eller ved foten av hårcellene, der presynaptic Cav1.3 kalsium kanaler utløse neurotransmission. Et representativt eksempel på kalsium svar i disse områdene med en individuell neuromast er vist i Figur 4A1-A2''. I dette eksemplet ble en 2-s 5 Hz væske-jet stimulans levert for å aktivere alle hårcellene i representative neuromast. Under stimulans, robust kalsium signaler kan påvises i hår bunter (Figur 4A1-A1'', svar fra 8 hår bunter vises). Nesten alle eldre hårcellene Vis denne apikale pågangen av kalsium5i dette systemet. Innenfor den samme neuromast, det er synlig kalsium signaler i basale, synaptic flyet i bare et delsett (~ 30%) av hårcellene (Figur 4A2-A2'', 4 celler med presynaptic svar vises)5. 4 grønn ROIs Vis celler med ingen signifikant presynaptic kalsium signaler (Figur 4A2-A2'') til tross for robust apikale kalsium signaler (Figur 4A1-A1''). I dette representant (Figur 4A1-A2''), farget ROIs matche opp hår bunter i apikale MET flyet (Figur 4A1) med kroppen sin celle på basale synaptic flyet (Figur 4A2). Dette eksemplet viser hvordan begge MET avhengige - og presynaptic-kalsium signaler kan måles i enkeltceller hår og blant populasjoner av hårcellene.

Kalsium signaler i begge hår pakker og presynapse kan tegnes grafisk som rå (F) GCaMP6s intensitet eller ΔF/Fo GCaMP6s intensitet (se Trinn 12, tall 4A1'-A1'' og 4A2'-A2''). (F) GaMP6s grafene markere at planlagte fluorescens intensiteten for hver celle kan variere (tall 4A1' og 4A2'). I ΔF/Fo GCaMP6s grafer, hver celle er normalisert til den opprinnelige verdien og den relative intensiteten endringen fra baseline tegnes (tall 4A1'' og 4A2''). I begge (F) og ΔF/Fo GCaMP6s tomter, kalsium signaler i både apikale håret bunt og basale presynaptic flyet starter med utbruddet av stimulans (grå boks) og avslå eksponentielt etter stimulans. Under stimulans, kalsium signaler i hår bunter stige raskt og Mette hvis styrke nedbøyning ikke endres (Figur 4A1-A1''). I kontrast i delsettet med hårcellene med synlig kalsium signaler i synaptic flyet, kalsium signaler mer gradvis øker og er mindre utsatt for metning (Figur 4A2-A2''). Kalsium signalene fortsatt nær planlagt i hårcellene uten presynaptic kalsium signaler (grønn ROIs).

I tillegg til disse grafiske fremstillinger (Figur 4), kan kalsium signaler visualiseres romlig i det hele neuromast i gang løpet av innspillingen. Et eksempel på en spatiotemporal representasjon er vist i figur 5 for presynaptic GCaMP6s signaler i basale planet på en neuromast. I figur 5, er de viktigste trinnene for å behandle en bildesekvens for romlig visualisering beskrevet som beskrevet i trinn 13. Først rå (F) GCaMP6s bildene er timelig binned [figur 5: 1.p (5 av 14 hyllene er vist); trinn 13.2.1]. Deretter opprinnelige bildet, beregnet fra før stimulans rammer (trinn 13.2), trekkes fra (F) GCaMP6s fluorescens signaler å få ΔF bilder (figur 5: rad 2; trinn 13.2.2). Neste, gråtonebilder ΔF konverteres til en farge LUT (figur 5: rad 3, Red Hot LUT; trinn 13,3). Til slutt, ΔF bilder med LUT konverteringen er kledde på timelig binned (F) bilder (figur 5, 1.p) å avsløre de spatiotemporal signalene i neuromast under stimulering (figur 5: rad 4; trinn 13,4). Varme kartene ΔF GCaMP6s signaler gir både verdifulle romlige og tidsmessige informasjon som ikke lett å sortere ut fra enkelt ROIs og grafene i Figur 4. Varme kart kan hjelpe visualisere kritiske spatiotemporal informasjon, inkludert subcellular informasjon om utbruddet og varigheten av kalsium signaler i hver håret celle samt til timing og intensitet forskjellene mellom hårcellene i hele neuromast.

Det er viktig å kontrollere at grafene og romlig varme kart representere sanne kalsium signaler og er ikke gjenstander pga bevegelse. I denne protokollen, kan bevegelse være et resultat av overdreven drift eller bevegelse av Larven eller bevegelse grunnet væske-jet stimulering. Alle disse gjenstander er utfordrende å fullstendig eliminere dette i vivo forberedelse. Mens registrering av bildesekvenser (Trinn 12.1.3) kan korrigere for må flertallet av bevegelse i x - og y-akser, bildesekvenser med overdreven bevegelse i z-aksen identifiseres og fjernes fra analyser. Bevegelse er lettest å identifisere av grafiske kalsium signaler. Eksempler på GCaMP6s intensitet endringer som gjenstander ikke og sant GCaMP6s signaler kan observeres på toppen (Figur 4B1'-B1'') og base (Figur 4C1'-C1'') av hårcellene.

I de apikale hår buntene, bevegelse er vanlig når væske-jet stimulans er for sterk (Figur 3A3'' '). Under disse overdrevet sterke stimuli, apikale håret-bunt flyet kan flytte ut av fokus under væske-jet stimulering deretter tilbake til den opprinnelige fokalplanet etter stimulans avslutter (Figur 4B1'-B''). Dette gjør det vanskelig å måle apikale MET-avhengige kalsium signaler. Et eksempel på håret bunt bevegelse gjenstander kan ses i Figur 4B1'-B1''. Her, grafene viser en nedgang i GCaMP6s signaler under stimulans (grå boks) når håret pakker er ute av fokus. Etter stimulans, øke GCaMP6s signalene raskt hår bunter tilbake til utgangsposisjonen og komme tilbake i fokus. Dette gir kontrast til eksemplet i Figur 4A1'-A1'' der apikale kalsium signalene øker utbruddet av stimulans og redusere når stimulans ender.

Mens bevegelsen på grunn av overdreven væske-jet stimuli kan også flytte synaptic flyet av fokus, er denne typen bevegelse gjenstand mindre vanlig i dette flyet. I stedet er endringer i fokus i z-aksen på grunn av bevegelse eller drift av Larven de vanligste årsakene til bevegelse. Larver bevegelse eller drift kan påvirke GCaMP6s mål både på toppen og bunnen av hårcellene. Et eksempel på larver bevegelse som øker GCaMP6s i basale, synaptic flyet under stimulans er vist i Figur 4C'-C''. Bevegelse gjenstander (Figur 4C1'-C1'') kan skilles fra sant presynaptic signaler (Figur 4A2'-A2'') ved å undersøke time course of GCaMP6s signaler. I stedet for å øke eller redusere eksponentielt med stimulans (Figur 4A2'-A2''), i bevegelse-indusert økning i GCaMP6s signalet har en firkantet form og stige og falle brått med utbruddet og forskyvning av stimulus, henholdsvis ( Figur 4 C1'-C1'').

I tillegg til nøye undersøkelse av time course of GCaMP6s signaler, kan kontroll eksperimenter ved hjelp av farmakologi brukes til å skille ekte GCaMP6s signaler fra bevegelse. BAPTA (trinn 10) kan for eksempel brukes til å holde seg tips-koblinger som kreves for MET kanal funksjon i hår bunter. BAPTA bør fjerne både væske-jet-utløste apikale MET-kanal-avhengige kalsium tilstrømningen samt etterfølgende basale, presynaptic kalsium tilstrømningen gjennom Cav1.3 kanaler. I eksemplet representant sant stimulans-utløste kalsium signaler (Figur 4A1-A2'') under væske-jet stimulering, alle endringer i GCaMP6s fluorescens i begge apikale og basal flyene vil bli eliminert etter BAPTA behandling. I kontrast, endringer i GCaMP6s fluorescens pga bevegelse som de som vises i tall 4B1'-B1'' og 4 C 1'-C1'' ville ikke bli eliminert av BAPTA behandling.

I tillegg til BAPTA for å eliminere alle stimulans-utløste GCaMP6s signaler, isradipine kan brukes (trinn 11) spesielt blokkere Cav1.3-avhengige kalsium tilstrømning basale synaptic flyet samtidig la apikale MET-kanal-avhengige kalsium tilstrømningen intakt5. Etter bruk av isradipine, i en enkelt neuromast med noen bevegelse gjenstander, endringer i GCaMP6s fluorescens i apikale hår bunter (Figur 4A1'-A1'') under væske-jet stimulering ville være uendret, mens alle synaptic GCaMP6s fluorescens endringer på basen ville bli eliminert (Figur 4A2'-A2''). Endringer i GCaMP6s signalet i synaptic flyet etter isradipine program (f.eks,Figur 4C1-C1'') vil mest sannsynlig tilsvarer bevegelse.

Figure 1
Figur 1 : Oversikt over en lateral linje neuromast og funksjonelle tenkelig fly. (A) i diagrammet til venstre viser en side-visning av en neuromast med fire hår-cellen legemer (svart) kontakter postsynaptic afferente neurons (blå). Bånd (grønn) tjore blemmer på presynaptic aktive nettsteder i hver celle. Apikale hver celle kroppen er en bunt med stereocilia (1 µm) som inneholder MET kanaler. Hver håret bunt har en kinocilium som overfører mekanisk kraft av vann bevegelse på undersiden av håret bunt. Diagrammet til høyre viser den samme modellen i en topp-ned visning. I denne topp-ned visning, svart brukes til å indikere fire cellene i diagrammet til venstre og grå brukes til å angi andre celler i neuromast. Tre viktige fly utheves i denne modellen, og disse 2 visninger: (1) tips av hår bunter (kinocilia) brukt om å kvantifisere omfanget av håret bunt utslag, (2) apikale MET flyet ved foten av hår bunter der kalsium inn cellen under stimulering, og (3) synaptic flyet på bunnen av cellen der kalsium inn nær synaptic bånd. (B1-B1') DIC og GCaMP6s ovenfra og ned bilder av MET flyet ved foten av hår bunter, hvor mechanosensation-avhengige kalsium signaler kan registreres. (B2-B2 ") DIC og GCaMP6s ovenfra og ned bilder fra den samme neuromast som B1-B1', men ved foten av neuromast i synaptic flyet, der presynaptic kalsium signaler kan oppdages. (C1-C2) Bilder av en neuromast uttrykke GCaMP6s hvor larvene er montert. I dette eksemplet er apikale MET flyet (C1) og synaptic flyet (C2) på bunnen av cellen plassert på en suboptimal vinkel. Denne posisjonen ikke tillater alle hår bunter til å avbildes i et enkelt fly, og mange flere tenkelig fly er nødvendig for å fange aktivitet på alle synapser i denne neuromast forhold til B1-B2 ". Bildene er av larver på 5 dpf. Baren skala i C2 tilsvarer alle bilder i B1-C2. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Imaging kammer, sebrafisk montering og hjerte injeksjon prosedyrer og nåler. (A) vist er en tenkelig kammer med en larve (uthevet av et stiplet rektangel) festet til midten på toppen av silikon encapsulant. (B1) Vist er en 5 dpf Larven immobilisert av to pinner. En stor leder pin er plassert vinkelrett kroppen bare bakenfor øyet. De to øynene er helt lagt så bunnen øyet er helt skjult av øvre øyet. En liten hale pin krysser notochord i halen. Larven er flat og ikke vridd. (B2) For å lamme Larven, en hjertet injeksjon nål er orientert vinkelrett til kroppen og brakt tilstøtende til hjertet. Hjertet injeksjon nålen bør kontakte pigment cellen foran hjertet. (B2 ") Depresjon nålen inn i huden forårsaker innrykk av pigment cellen foran hjertet. (C) nåler i rekkefølge fra venstre til høyre: eksempel på en hjertet injeksjon nål med en åpning på ca 3 µm; eksempel på en god væske-jet nål med en åpning på ca. 50 µm; eksempel på en dårlig brutt væske-jet nål som er store og taggete og vil trolig produsere overdreven og uregelmessig stimuli. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Væske-jet justering, posisjonering og stimulans kalibrering. (A1) Vist er en larve orientert med det hodet mot venstre og hale til høyre, og en væske-jet nål orientert parallelt med A-P aksen av sebrafisk kroppen. Denne væsken-jet p justeres for å stimulere neuromasts som reagerer på fremre (push/trykk) og bakre (trekk/vakuum) regissert væske-flow. (A2) Vist er en neuromast (uthevet med stiplet hvit linje) og tips av apikale hår bunter (kinocilia) på venstre side panelet og væske-jet nålen på høyre side av panelet. Væske-jet er plassert ca 100 µm fra kanten av neuromast. (A3-A3'' ') Tips av apikale hår bunter (kinocilia) er forandret retning ulik avstand ved å variere væske-jet stimulans press. Banen av et enkelt kinocilial tips vises for 1,5 µm (A3') og 5 µm (A3'') nedbøyning avstander. Den svarte sirkelen angir hvile posisjon i kinocilium. Det er viktig at kinocilia ikke er forandret retning for langt, ellers stimulans intensiteten ikke kan kvantifiseres pålitelig og kan bli ødeleggende (A3'' '). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Apikale MØTTE og basale presynaptic GCaMP6s signaler under væske-jet stimulering i sidelinjen hårcellene. (A1-A2'') GCaMP6s intensitet endringer under væske-jet stimulering i en representant neuromast. Bildene til venstre viser apikale MET flyet (A1) og basale synaptic flyet (A2) i den samme neuromast. ROIs fargekodet i A1 og A2 ble brukt til å tegne den gang løpet av (F) og ΔF/F GCaMP6s intensitet grafer til høyre for hvert bilde. (B1-B1'') Eksempel på en apikale MET bildesekvens med overflødig bevegelse under væske-jet stimulering. Bildet til venstre (B1) viser ROIs til plottet (F) og ΔF/F GCaMP6s intensitet grafer til høyre. (C1-C1'') Eksempel på en bildesekvens i basale synaptic flyet som viser bevegelse gjenstander og GCaMP6s signal endringer som ikke er sanne kalsium signaler. Bildet til venstre (C1) viser ROIs til plottet (F) og ΔF/F GCaMP6s intensitet grafer til høyre. Den grå boksen i hvert diagram representerer varigheten av væske-jet stimulans under hver bildesekvens. En 2-s 5 Hz væske-jet stimulans ble brukt for eksempel i A1-A2'' and B1-B1''. I C1-C1'', en 2 s fremre trinn stimulans ble brukt. Y-aksen for (F) GCaMP6s grafer viser vilkårlig enheter (A.U.) fra Fiji bilde intensitet målinger. Eksempler er fra larver på 4-5 dpf. Skala bar = 5 µm for alle bilder. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 : Spatiotemporal visualisering av presynaptic GCaMP6s signaler under væske-jet stimulering. Trinnene for å visualisere spatiotemporal endringene i GCaMP6s intensitet i en neuromast under stimulans er beskrevet. Tid er representert fra venstre til høyre etter tidsangivelsen på toppen av bilder. Den øverste raden viser 5 av 14 timelige hyllene fra en 70-ramme GCaMP6s (F) bildesekvens (trinn 13.2.1). I den andre raden, er opprinnelige (trinn 13.2) fjernet fra hvert (F) GCaMP6s binned bilde til å lage ΔF bilder (trinn 13.2.2). I den tredje raden, ΔF bilder har blitt konvertert fra gråtone (andre rad) til Red Hot LUT (trinn 13,3). Min og max på bildene LUT settes ifølge Red Hot LUT varmekartet av relativ ΔF intensitet (A.U.) til høyre (trinn 13.3.1). I den nederste raden har i tredje rad vært kledde på bildene (F) i den øverste raden (trinn 13,4). Den grå linjen øverst på figuren indikerer tidsberegningen for 2-s 5 Hz væske-jet stimulans. Eksempel er fra en 5 dpf larver. En legende av Red Hot LUT varmekart over relativ ΔF intensitet (A.U.) vises til høyre. Skala bar = 5 µm for alle bilder. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

I vivo imaging i intakt dyr er iboende utfordrende. Flere trinn i denne metoden er avgjørende for å oppnå pålitelige i vivo kalsium målinger fra sidelinjen hårcellene. For eksempel er det svært viktig at larvene er låst og lammet riktig før å minimere bevegelse under bildebehandling. Overflødig bevegelse under bildebehandling kan føre til endringer i GCaMP6s fluorescens som ikke sant signaler og ikke samsvarer med endringer i kalsium nivåer (f.eks tall 4B1'-B1'' og 4 C 1'-C1''). Hale pinner kan plasseres mer peke for å minimere bevegelse, men dette kan gjøre mer bakre neuromasts utilgjengelig. Videre etter hjertet injeksjon, kan hodet pinner roteres slik at den vannrette delen av pin ligger over eggeplomme. I tillegg til å endre plasseringen av pinner, er det også mulig å bruke en hjerne-skive harpe i stedet for pinner for å nakkens Larvene34. Når det plasseres over Larvene riktig, er en harpe en ekstra, potensielt mindre invasiv metode for immobilizing larver. Mens betydelig bevegelse kan skyldes utilstrekkelig låsing, kan riktig utføre hjertet injeksjon å levere α-bungarotoxin og lamme Larvene resultere i ufullstendige lammelse, bevegelse, og til slutt bevegelse gjenstander. Selv om brukte bedøvelse har blitt vist å påvirke excitability av sebrafisk hårcellene, har siste arbeid vist at det anesthetic benzocaine ikke påvirke mange aspekter av hair celle aktivitet. Tilsvarende vanlig mer bedøvelse MS-222 bare forstyrrer visse aspekter av hair celle aktivitet15. Derfor grunn utfordrende av α-bungarotoxin injeksjon, benzocaine eller MS-222 program kan vise seg for å være en nyttig alternativ lammelse å forhindre bevegelse i Larven under funksjonelle kalsium bildebehandling.

De tekniske utfordringene involvert i denne protokollen er selv en perfekt montert prøven ubrukelig hvis den Larven og hårcellene ikke er sunt før og under hver tenkelig eksperiment. For å sikre at larvene og hårcellene er sunn, er det viktig at larvene er opprettholdt i E3 buffer som er fri for rusk som chorions (egg skall), avfall og mikroorganismer. Selv om overfladiske plasseringen av lateral linje hårcellene er fordelaktig for bildebehandling, gjør beliggenheten dem mer utsatt for cellular skade når E3 bufferen er fouled. Et rent miljø for vandige er spesielt viktig for unge larver (2-4 dpf) eller mutanter som ikke kan opprettholde en oppreist svømming plasser og primært ligger på bunnen av Petriskål. I disse situasjonene kan sidelinjen hårcellene og beskyttende Cúpula rundt hår pakker lett bli svekket. Selv når starter med sunn larver og hårcellene i løpet av hver eksperimentet, er det viktig å sikre at larvene har hjerteslag og rask blod flyte. Hvis blodstrøm bremser eller stopper, kan helse hårcellene bli svekket. I utsatte preparater usunn larver eller tap av blodstrøm, døende hårcellene kan identifiseres på flere måter: først av utseendet på karyopyknosis eller kjernefysiske kondens, som manifesterer seg som en boble i cellen under DIC optikk; andre av cellen krymping og tilstedeværelsen av raskt flytte partikler i cytoplasma; og tredje, når kinocilia tips splay i forskjellige retninger35. Når håret bunt er forstyrret, flyttes ikke den sprikende kinocilia kontinuerlig sammen under stimulering.

Dette preparatet har flere mindre begrensninger, en er at forberedelsene bare forblir robust for 1-3 timer etter den er opprettet. Endringer som benytter mindre pinner eller en hjerne-bit terpe til nakkens larver og legge et perfusjon system kan forlenge levetiden til dette i vivo preparatet. En annen begrensning er at photobleaching Phototoksisitet kan oppstå etter at gjentatt imaging studier. En spennende måte å mestre denne utfordringen er å tilpasse denne protokollen for lys arks mikroskopi. Lys arks mikroskopi er en effektiv måte å redusere av fokus lys, fører til mindre photobleaching og Phototoksisitet36. Sammen kan mildere immobilisering og mindre Foto-eksponering hjelpe forlenge hver tenkelig økt. Lenger tenkelig økter kan brukes til å undersøke hele varigheten til funksjonelle endringer følger utviklingen og prosessene underliggende hår-celle klarering og regenerasjon etter skade. Det er viktig å påpeke at i tillegg til lys arks mikroskopi, denne protokollen kan tilpasses andre typer AC confocal systemer (punkt-skanning, 2-fotonet og spinning disk) og relativt enkle widefield systemer28,34 . Total, dens allsidighet gjør dette protokollen et verdifullt verktøy som kan tilpasses og brukes med flere imaging-systemer.

Mens denne protokollen kan tilpasses og brukes med mange imaging-systemer, kan deler av denne protokollen også tilpasses og brukes (1) med andre indikatorer foruten GCaMP6s og (2) bildet aktivitet i andre sensoriske celler og nerveceller i larver sebrafisk. For eksempel i en tidligere studie brukte vi denne protokollen til bildet aktivitet bruker flere genetisk kodet indikatorer innenfor sidelinjen hårcellene for å oppdage cytosolic kalsium (RGECO1), vesicle fusion (SypHy), membran spenning (Bongwoori) og membran kalsium (jRCaMP1a-caax og GCaMP6s-caax), og sidelinjen afferente prosesser å oppdage membran kalsium (GCaMP6s-caax)5. Basert på vår erfaring med disse indikatorene, gir transgene linjen Tg(myo6b:GCaMP6s-caax) beskrevet i denne protokollen en utmerket start på imaging aktivitet i sidelinjen neuromasts. Alle indikatorer ovenfor, har vi funnet at GCaMP6s er de mest sensitive og photostable. I tillegg til disse funksjonene vi markere Tg(myo6b:GCaMP6s-caax) transgene linjen fordi det kan brukes å lage to forskjellige målinger: hår-cellers mechanosensation og presynaptic kalsium i transgene enkeltlinjer.

Teknikken beskrevet i denne artikkelen viser hvordan kalsium imaging i sidelinjen sebrafisk kan være en kraftig metode å studere hvordan hårcellene fungerer i sitt eget miljø. Denne tilnærmingen er utfyllende til studier av pattedyr i hvilken hår-celle funksjonen studeres i ex vivo explants. I tillegg kan sebrafisk modell fortsette å bli brukt som en plattform for å teste effekten av genetisk kodet indikatorer som kan deretter brukes til å undersøke aktiviteten i pattedyrceller hår.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av NIH/NIDCD intramural forskning midler 1ZIADC000085-01 (K.S.K.). Vi ønsker å erkjenne Candy Wong for henne hjelp i å skrive makroen Fiji. Vi vil også gjerne takke Doris Wu og Candy Wong for deres forslag med protokollen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Section 1
α-Bungarotoxin R&D Systems 2133 For paralyzing larvae prior to imaging
Phenol red Solution 0.5%  Sigma-Aldrich P0290 For visualization of α-bungarotoxin solution during heart injection
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MESAB, MS-222, tricaine) Sigma-Aldrich A5040 For anesthetizing larvae
Section 2
Imaging chamber Siskiyou PC-R Platform to mount larvae for imaging
No. 1.5 Coverslips square, 22*22 mm VWR 48366-227 To seal imaging chamber 
High vacuum silicone grease Fischer Scientific 14-635-5D  For affixing of coverslip to imaging chamber
Silicone encapsulant clear 0.5 g kit Ellsworth Adhesives Dow Corning Sylgard, 184 SIL ELAST KIT 0.5KG To fill imaging chamber to create a surface to pin fish 
Oven Techne HB-1D For drying silicone encapsulant
Stereomicroscope Carl Zeiss Microscopy Stemi 2000 with transmitted light illumination For illuminating wire, forceps and scissors to make pins
Fine forceps Fine Science Tools Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10 For making pins 
Fine scissors  Cole-Palmer 5.5", EW-10818-00 For cutting tunsgten wire to make pins
Tungsten wire, 0.035 mm Goodfellow W005131 For head pins to immobilize larvae
Tungsten wire, 0.025 mm ThermoFischer Scientific AA10405-H4 For tail pins to immobilize larvae
Section 3
Micropipette guller Sutter Instrument Company P-97 For pulling capillary glass for fluid-jet and heart injection needles
Borosilicate glass capillaries w/ filament Sutter Instrument Company BF 150-86-10 Glass to be pulled into α-bungarotoxin injection needles for heart injection
Borosilicate glass capillaries w/o filament Sutter Instrument Company B 150-86-10 Glass to be pulled into fluid-jet needles to stimulate hair cells
Pipette polisher Narishige MF-830 microforge To polish fluid-jet pipette tips to smooth jagged breaks
Ceramic tile Sutter Instrument Company NC9569052 For scoring and evening breaking fluid-jet needles 
Sections 4 & 5
Fine forceps Fine Science Tools Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10 For pinning larvae
Gel loading tips Eppendorf 5242956003 For backfilling heart injection needles
Stereomicroscope Carl Zeiss Microscopy Stemi 2000 with transmitted light illumination For illuminating larvae during pinning and heart injection
Glass capillary/needle holder WPI MPH315 To hold fluid-jet needles
Manual micromanipulator Narishige M-152 For holding and positioning of needle holder to inject α-bungarotoxin 
Magnetic stand Narishige GJ-1 For holding manual micromanipulator for α-bungarotoxin injection
Pressure injector Eppendorf Femtojet 4x To deliver α-bungarotoxin
Sections 6, 7 & 8
Confocal microscope Bruker Swept field/Opterra confocal microscope Fixed, upright microscope with DIC optics and 488 nm laser with appropriate filters
Microscope software Bruker Prairieview 5.3 To coordinate and control the microscope, lasers, stage, piezo-z, cameras and fluid jet
10x air objective Nikon MRH00101 Low magnification for positioning of larvae and fluid jet
60x water objective Nikon MRF07620 Water immerison objective with high NA (1.0) and adequate working distance (2.0 mm)
Piezo-Z objective scanner with controller/driver Physik Intruments instruments/Bruker 01144210/UM-Z-PZ High-speed z-stack acquisition with 0.025um accuracy
EMCCD camera  QImaging Rolera EM-C2 EMCCD camera  Camera with small pixel size that can acquire up to 100 frames per s
Circular chamber adapter Siskiyou PC-A For holding and rotating imaging chamber on microscope stage
Motorized Z-deck stage Prior Scientific ZDN12MP Microscope stage that can hold and move sample and micromanipulator with fluid-jet needle together
Z-deck stage insert adaptor NIH Machine shop custom To fit the circular chamber adaptor onto the z-deck stage
Fluid-jet apparatus ALA scientific instruments HSPC-1 High-speed pressure Clamp with PV-PUMP For controlling and delivering the fluid-jet stimulus
Masterflex Peroxide-cured silicone tubing (1 feet) Cole-Palmer Masterflex L/S 13, 96400-13 For connecting the fluid-jet needle holder to pressure pump
Motorized micromanipulator Sutter Instrument Company MP-225 For holding and positioning of needle holder for fluid jet 
Micromanipulator controller Sutter Instrument Company MPC-200 For controlling fluid-jet needle manipulator
Gel loading tips Eppendorf 5242956003 For backfilling fluid-jet needles
Glass capillary/needle holder WPI MPH315 To hold fluid-jet needles
PSI manometer Sper Scientific 840081 For measuring pressure clamp output
Section 9
BAPTA, Tetrapotassium Salt, cell impermeant ThermoFischer Scientific B1204 To cleave tips links, uncouple MET channels and block all evoked GCaMP6s signals
Isradipine Sigma-Aldrich I6658 To block signals dependent on the L-type calcium channels (CaV1.3) at the presynapse
DMSO Sigma-Aldrich D8418 Solvent for pharmacological compounds
Section 10
Prism7 Graphpad Prism7 Software to plot GCaMP6 intensity changes
FIJI Schindelin, et., al.34 https://fiji.sc/ Software to process images and create spatio-temporal signal maps
Turboreg Plugin Thévenaz et., al.29  http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ Plugin to register GCaMP6 image sequences in FIJI
StackReg Plugin Thévenaz et., al.29 http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/ Plugin to register GCaMP6 image sequences in FIJI
Times Series Analyzer V3 Plugin Balaji J 2007, Dept. of Neurobiology, UCLA https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html Plugin to create multiple ROIs to measure GCaMP6 intensity changes

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Russell, J. T. Imaging calcium signals in vivo: a powerful tool in physiology and pharmacology. British Journal of Pharmacology. 163, (8), 1605-1625 (2011).
  2. Pérez Koldenkova, V., Nagai, T. Genetically encoded Ca2+ indicators: Properties and evaluation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1833, (7), 1787-1797 (2013).
  3. Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. Genetically encoded indicators of neuronal activity. Nature Neuroscience. 19, (9), 1142-1153 (2016).
  4. Tian, L., Hires, S. A., Looger, L. L. Imaging Neuronal Activity with Genetically Encoded Calcium Indicators. Cold Spring Harbor Protocols. 2012, (6), (2012).
  5. Zhang, Q., et al. Synaptically silent sensory hair cells in zebrafish are recruited after damage. Nature Communications. 9, (1), 1388 (2018).
  6. Harris, G. G., Frishkopf, L. S., Flock, A. Receptor potentials from hair cells of the lateral line. Science. 167, (3914), New York, N.Y. 76-79 (1970).
  7. Eatock, R. A. Vertebrate Hair Cells: Modern and Historic Perspectives. Vertebrate Hair Cells. 1-19 (2006).
  8. Deafness and Hearing Loss, Key Facts. World Health Organization. Available from: http://www.who.int/en/news-room/fact-sheets/detail/deafness-and-hearing-loss (2018).
  9. Tang, L. S., Montemayor, C., Pereira, F. A. Sensorineural hearing loss: potential therapies and gene targets for drug development. IUBMB Life. 58, (9), 525-530 (2006).
  10. Assad, J. A., Shepherd, G. M. G., Corey, D. P. Tip-link integrity and mechanical transduction in vertebrate hair cells. Neuron. 7, (6), 985-994 (1991).
  11. Lumpkin, E. A., Hudspeth, A. J. Detection of Ca2+ entry through mechanosensitive channels localizes the site of mechanoelectrical transduction in hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92, (22), 10297-10301 (1995).
  12. Ricci, A. J., Wu, Y. -C., Fettiplace, R. The Endogenous Calcium Buffer and the Time Course of Transducer Adaptation in Auditory Hair Cells. Journal of Neuroscience. 18, (20), 8261-8277 (1998).
  13. Moser, T., Beutner, D. Kinetics of exocytosis and endocytosis at the cochlear inner hair cell afferent synapse of the mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, (2), 883-888 (2000).
  14. Brandt, A., Khimich, D., Moser, T. Few CaV1.3 channels regulate the exocytosis of a synaptic vesicle at the hair cell ribbon synapse. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 25, (50), 11577-11585 (2005).
  15. Olt, J., Allen, C. E., Marcotti, W. In vivo physiological recording from the lateral line of juvenile zebrafish. The Journal of Physiology. 594, (19), 5427-5438 (2016).
  16. Olt, J., Johnson, S. L., Marcotti, W. In vivo and in vitro biophysical properties of hair cells from the lateral line and inner ear of developing and adult zebrafish. The Journal of Physiology. 592, (10), 2041-2058 (2014).
  17. Griguer, C., Fuchs, P. A. Voltage-dependent potassium currents in cochlear hair cells of the embryonic chick. Journal of Neurophysiology. 75, (1), 508-513 (1996).
  18. Art, J. J., Fettiplace, R. Variation of membrane properties in hair cells isolated from the turtle cochlea. The Journal of Physiology. 385, 207-242 (1987).
  19. Goutman, J. D., Pyott, S. J. Whole-Cell Patch-Clamp Recording of Mouse and Rat Inner Hair Cells in the Intact Organ of Corti. Methods in Molecular Biology. 1427, Clifton, N.J. 471-485 (2016).
  20. Einarsson, R., et al. Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (68), (2012).
  21. Fuchs, P. A. Time and intensity coding at the hair cell's ribbon synapse. The Journal of Physiology. 566, Pt 1 7-12 (2005).
  22. Moser, T., Brandt, A., Lysakowski, A. Hair cell ribbon synapses. Cell and Tissue Research. 326, (2), 347-359 (2006).
  23. Trapani, J. G., Nicolson, T. Chapter 8 - Physiological Recordings from Zebrafish Lateral-Line Hair Cells and Afferent Neurons. Methods in Cell Biology. 100, 219-231 (2010).
  24. Olt, J., Ordoobadi, A. J., Marcotti, W., Trapani, J. G. Physiological recordings from the zebrafish lateral line. Methods in Cell Biology. 133, 253-279 (2016).
  25. Stawicki, T. M., Esterberg, R., Hailey, D. W., Raible, D. W., Rubel, E. W. Using the zebrafish lateral line to uncover novel mechanisms of action and prevention in drug-induced hair cell death. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, (2015).
  26. Spinelli, K. J., Gillespie, P. G. Monitoring Intracellular Calcium Ion Dynamics in Hair Cell Populations with Fluo-4 AM. PLOS ONE. 7, (12), 51874 (2012).
  27. Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 236, (11), 3088-3099 (2007).
  28. Zhang, Q. X., He, X. J., Wong, H. C., Kindt, K. S. Chapter 10 - Functional calcium imaging in zebrafish lateral-line hair cells. Methods in Cell Biology. 133, 229-252 (2016).
  29. Sheets, L., et al. Enlargement of Ribbons in Zebrafish Hair Cells Increases Calcium Currents But Disrupts Afferent Spontaneous Activity and Timing of Stimulus Onset. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 37, (26), 6299-6313 (2017).
  30. Zhang, Q. X., He, X. J., Wong, H. C., Kindt, K. S. Functional calcium imaging in zebrafish lateral-line hair cells. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0091679X15002332 (2018).
  31. Chou, S. -W., et al. A molecular basis for water motion detection by the mechanosensory lateral line of zebrafish. Nature Communications. 8, (1), 2234 (2017).
  32. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7, (1), 27-41 (1998).
  33. Fiji is just ImageJ. Available from: https://fiji.sc/ (2018).
  34. Esterberg, R., Hailey, D. W., Coffin, A. B., Raible, D. W., Rubel, E. W. Disruption of intracellular calcium regulation is integral to aminoglycoside-induced hair cell death. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33, (17), 7513-7525 (2013).
  35. Stengel, D., Zindler, F., Braunbeck, T. An optimized method to assess ototoxic effects in the lateral line of zebrafish (Danio rerio) embryos. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology. 193, 18-29 (2017).
  36. Fadero, T. C., et al. LITE microscopy: Tilted light-sheet excitation of model organisms offers high resolution and low photobleaching. Journal of Cell Biology. (2018).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics