がん細胞への siRNA のエクソソームの準備

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Cancer Research
 

Summary

エキソソームが医薬品配送事業者の新世代です。高収量とによる siRNA デリバリーのための純度エキソソームの隔離のプロトコルを設立しました。また、エクソソームに蛍光標識非特異的 siRNA をカプセル化し、がん細胞で siRNA ロード エクソソームの細胞内取り込みを検討しました。

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Faruqu, F. N., Xu, L., Al-Jamal, K. T. Preparation of Exosomes for siRNA Delivery to Cancer Cells. J. Vis. Exp. (142), e58814, doi:10.3791/58814 (2018).

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Abstract

特定エクソソームの細胞の小胞が近年関心新しい薬として生物学的起源、豊富な様々 な生体分子の細胞間の配信で組み込み機能など配信ベクトル。この作品は、高収率とエクソソームによる siRNA デリバリーのための高純度を達成するために隔離のプロトコルを確立します。人間の萌芽期の腎臓細胞 (HEK 293 細胞) は、バイオリアクター フラスコで培養し、培養上清 (ここに至って馴化培地と呼ばれる) は HEK 293 エクソソームの濃縮のために週単位で収穫されます。馴化培地 (CM) 前に差動遠心分離によって死んだ細胞および細胞残骸のクリアは、エクソソームを収集するための洗濯手順続いてショ糖クッションに遠心を受ける.分離の HEK 293 エクソソームは、収量、形態および exosomal のマーカー式のそれぞれナノ粒子追跡分析、プロテインの定量、電子顕微鏡法、フローサイトメトリー、によって特徴付けられます。蛍光 Atto655、ラベルの付いた小さな干渉 RNA (siRNA) は電気穿孔法によるエクソソームに読み込まれ、過剰な siRNA はゲル濾過により除去。フローサイトメトリーによる PANC 1 がん細胞、37 ° C で 24 時間培養後の細胞摂取量を確認します。HEK 293 エクソソームは 107.0 ± 8.2 nm 程度です。エキソソーム収量と粒子・ タンパク質比 (P:P) 比は、それぞれ 6.99 ± 0.22 × 1012粒/mL と 8.3 ± 1.7 × 1010粒/μ g、です。エクソソームの siRNA のカプセル化効率は ~ 10-20%。セルの 40% は、後の培養 24 時間で Atto655 の肯定的な信号を表示します。結論としては、エキソソーム ショ糖クッションに超遠心法による分離は、良好な収率と純度の組み合わせを提供しています。siRNA エレクトロポレーション エクソソームに正常に読み込まれる可能性があります、その後癌細胞に配信体外。このプロトコルでは、がん細胞への効率的な配信 siRNA ロード エクソソームを開発するための標準的な手順を提供しています。

Introduction

エクソソームは免疫細胞1,2など種々 の細胞から分泌される、直径 50-200 nm に至る細胞小胞 (EV) のサブタイプ、癌細胞は3,4,5, 6幹細胞7と。エクソソームは様々 な生理的水分8,9,10,11に存在することも示されています。様々 な生体分子 (例えばRNA とタンパク質)12,13,14を運ぶエクソソームの固有能力と受信者の細胞にこれらの biomolecules の効果的な配信の組み合わせ15,16,17では、その潜在的なナノ薬剤配達ベクトルとして注目されます。抗がん・抗炎症薬エクソソームに正常にロードされることが実証されているし、ターゲット セル18,19,20,配信として各種の小分子21,22,23,24,25,26,27。 興味深いことに、siRNA28,29とマイクロ Rna30などの核酸もエクソソーム経由でエレクトロポレーションに正常に読み込まれてして標的細胞に配信。

RNA 干渉 (RNAi)経由で小さな干渉 RNA (siRNA)、遺伝子サイレンシングその高い特異性、強力な効果、最小限の副作用と siRNA 合成28の容易さのために、最寄りのメカニズムとしてより多くの関心を得ている最近、 29。Sirna 至る 19 25 ヌクレオチド長でそのトリガー シーケンス固有触媒 mRNA ノックダウン二本鎖 RNA 分子である.分子量大、ポリアニオン性性質のため細胞に裸の siRNA の受動的な吸収は妨げ28,29です。裸の siRNA プラズマ核酸31によって急速な劣化のため全身循環に注入するはいません。したがって、ナノキャリアの siRNA のカプセル化では、標的細胞に効果的な配信と siRNA の吸収を助けるだろう.

エクソソームは、その構造はリン脂質二重膜に包まれて、水性中空コアから成る siRNA のカプセル化のための理想的なシステムです。エクソソームは血安定性が良好であるだけでなく、また細胞32に機能性 RNA を提供する自然なターゲット プロパティがあります。正常にアルバレス Ervitiによって行なわれた研究は、sirna を用いたマウスの脳に効果的な配信がない合併症31事実上エクソソームを設計を示した。エキソソーム基づかせていた療法は細胞と転移特性15を表わさないためエクソソームを内生的複製しないよう他の治療法よりも比較的安全な仮定です。

細胞培養や生理流体からエクソソームを正常に分離するさまざまな方法を報告されています。最も人気のあるメソッドでは、超遠心法を使用して、開始材料31,32,33からエクソソームのペレットします。このメソッドは、エクソソームと通常共沈殿物蛋白質のサンプルからかなり厳しいことができます。サッカロースの勾配など密度ベースの分離と遠心を組み合わせることになって分離エクソソーム19,34の蛋白質と非 exosomal の汚染を減らすためより一般的です。サイズ排除クロマトグラフィー (SEC) サイズにより細胞小胞 (EV) の他のタイプからエクソソームの分離と最小限の蛋白質の汚染にもつながるが、開始35を処理することができます材料の少量によって制限されます。 36。イムノアフィニティーカラム キャプチャの使用ビーズのサブ人口を分離することと同様、tetraspanins などその他細胞特異的マーカー Ev よりもむしろエクソソームの特定のキャプチャを可能にする exosomal の表面タンパク質や他のタンパク質に結合する抗体でコーティングエクソソームのサンプル全体しますが、もう一度開始材料の量によって制限されます、高価な36,37。エクソソームのポリマー ベースの沈殿物、あまりにも人気があるが、むしろ原油沈殿物だからそれは高い非 exosomal 小胞および蛋白質汚染38,39に 。

エレクトロポレーションは、タンパク質凝集15,28,31による siRNA のエクソソームをロードする方法としてその非効率性の報告されています。トランスフェクション ベースのアプローチはより載荷効率とタンパク質の安定性を示していたが、その毒性と28細胞の遺伝子発現を変えることで遺伝子導入剤の副作用のため望ましくないです。したがって、エレクトロポレーションは、siRNA を読み込んでエクソソームそれはより安全な方法でより広く使用されています。ただし、最適化されたカプセル化メソッドは、強力な遺伝子ノックダウンのターゲット ・ サイトに siRNA の十分な量を提供するために確立する必要があります。

ここでは、ショ糖密度勾配よりもむしろ重水素酸化物の準備 1 つ 25% (w/w) ショ糖クッションだけに密度ベース超遠心法を用いたエキソソームの隔離のプロトコルを提案する.これ回避困難な密度勾配の準備と開始材料は、大量の処理を可能にまだ結果そのままエクソソームの高収率や純度 siRNA と後続の読み込みに適した、コスト効果の高い方法です。蛍光 Atto655 共役非特異的 siRNA が人間の萌芽期の腎臓細胞 (HEK 293 細胞) 由来エクソソーム経由でエレクトロポレーションに読み込まれました、ひと膵臓癌 (PANC-1) 癌細胞に配信体外

Protocol

1. 細胞の培養バイオリアクターのフラスコ

Figure 1
図 1: 細胞エキソソーム生産用バイオリアクター フラスコの内培養。(A) バイオリアクター フラスコの解剖学を簡略化します。(B) の開始は、バイオリアクター フラスコの文化します。通常とエキソソーム枯渇中エアコン (C) 収穫中 (CM) の組成や培養バイオリアクターのフラスコのメンテナンスのため材料の表を参照してください。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

  1. 通常の培地で HEK 293 細胞の培養 (資料の表を参照してください。5% CO2、37 ° C) (90% 合流) まで 4 x T75 フラスコに展開しています。
  2. バイオリアクターのフラスコの中の貯水池に通常媒体の 50-100 mL を追加して膜バイオリアクター フラスコを濡れています。
  3. コート t75 フラスコと再懸濁します x 4 からすべて HEK 293 細胞を収集エキソソーム枯渇中の 15 mL のそれら (材料の表を参照してください)。
  4. 鈍塗りつぶしに接続して 20 mL シリンジを用いたバイオリアクター フラスコの細胞コンパートメントに HEK 293 細胞懸濁液を追加 (材料の表を参照) を形成している可能性がありますすべてのバブルを削除する注意して針。
  5. いっぱいバイオリアクターのフラスコの中の貯水池通常培地で 500 mL とインキュベーター (5% CO2、37 ° C) でフラスコに 1 週間。

2. 馴化培地 (CM) バイオリアクター フラスコから収穫

  1. 1 週間後、バイオリアクターのフラスコの中の貯留層内のすべてのメディアを破棄します。
  2. すべてのメディアを取り出して細胞コンパートメント (すなわち、 CM) 20 mL の注射器を使用して鈍塗り針に接続しています。
  3. 中規模のリザーバーに通常媒体の 50-100 mL を追加します。
  4. 古いメディアを削除し追加新鮮なエキソソーム枯渇中鈍い塗り針に接続して 20 mL の注射器を使用して電池コンパートメントにエキソソーム枯渇中の 15 mL を追加します。
  5. いっぱいバイオリアクターのフラスコの中の貯水池通常培地で 500 mL とインキュベーター (5% CO2、37 ° C) でフラスコをもう一週間。
    注: 1 年以上の文化を継続できます。2.2 のステップの最初の収穫から CM エキソソーム分離され、破棄されます。2ndとその後の収穫は、CM はエキソソーム分離保持します。

3. エキソソーム ショ糖クッションに分離

Figure 2
図 2: エクソソームの分離と性状。(A) 事前清算収穫馴化培地 (CM) 死んだ細胞や細胞の残骸から。(B) ショ糖クッションに CM からエクソソームを分離します。(C) ショ糖と汚染タンパク質を削除するステップを洗浄します。(D) 分離エクソソーム、物理化学的、生化学的、形態学的評価を受けた。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

  1. とおり差動遠心分離と濾過によって (手順 2.2) から CM をクリア済み。
    1. 500 x g で 4 ° C で 5 分間遠心上清を新しいチューブに転送し、ペレットを破棄します。上清を回復して、ペレットを破棄この遠心分離手順をもう一度繰り返します。
    2. ステップ 3.1.1 2,000 x g は 15 分、4 ° C から上清を遠心し、ペレットを破棄します。0.22 μ m のフィルターを通して回復培養上清中一度をフィルターします。
  2. 前洗浄中に、1.9 g (± 0.001 g) 普遍的なチューブでショ糖のうち正確に計量し、重水素酸化物トッピング、重量 7.6 g (± 0.001 g) に達するまで重水素酸化物の 25% (w/w) のショ糖液を準備します。
  3. いっぱいなの遠心チューブ (材料の表を参照) を 0.22 μ m フィルターで 22.5 mL CM cm 作る事前認可の 22.5 ml PBS の場合は現在の量がより少ない。
  4. ガラス管にピペットの (材料の表を参照してください) と、それを通して、ショ糖溶液 3 mL を追加するソリューションが CM の下に独立した層を形成できるように場所です。
  5. 慎重にチューブを含む場所はスイング アウト ローターのバケットに CM/ショ糖液を層 (材料の表を参照)、ロータにバケツを確保。
  6. 超遠心機にローターを配置 (材料の表を参照してください)、4 ° C で 1.5 h の 100,000 × g でスピン
  7. ショ糖層 2 mL を収集し、遠心ボトルにこれを追加 (材料表参照) フィルターの 20 mL を含む PBS 洗浄工程。
  8. 固定角ローターにチューブを配置 (材料の表を参照してください)、4 ° C で 1.5 h の 100,000 × g でスピン
  9. 慎重に 10 mL の血清ピペットで上澄みを除去し、400 μ L フィルター PBS でペレットを再懸濁します。それぞれ、4 ° C または-80 ° C、短期または長期の記憶でこのエキソソーム株式を維持します。

4. エキソソーム サイズおよび追跡分析 (NTA) ナノ粒子による収量の評価

  1. 確認 1:1, 000 1:50、国税庁の表示フレームで 20-80 粒子を受けましたら 1 mL (最小 750 μ L) ボリュームでエキソソーム株式 000 希釈計測 (材料の表を参照) を表示します。
  2. 1 mL の注射器を使用して国税庁楽器サンプル室に希薄エキソソーム株式を挿入して温度プローブ入口温度計の温度プローブを挿入します。
  3. NTA ソフトウェアを設定 (材料の表を参照) 次のように記録するため: 3 つの標準的な測定は、30 s、それぞれ手動温度オプションをオフ;[詳細設定] タブの下で希釈倍率を入力します。
  4. カメラのレベルを 13 に設定し、国税庁ソフトウェア、サンプルの新鮮なバッチを注入して各読んだ後メッセージが表示されたら、サンプル室の温度を入力キャプチャ スクリプトを実行します。
  5. 4 その後の分析の部分のためにしきい値を設定し、平均モーダル サイズおよび粒子濃度測定からエキソソーム在庫に注意してください。

5. 粒子: タンパク質比測定によってエキソソーム純度の評価

  1. ビシンコニン酸 (BCA) タンパク質アッセイによるエキソソーム株式のたんぱくキット (材料表参照) 次のように測定します。
    1. 準備、基準を定義します
      1. 微量遠心チューブに BSA 原液 (2 mg/mL-アッセイ キットで提供される) の 45 μ L を追加することによって高い濃度 (500 μ g/mL) の標準を準備、PBS で最大 180 μ L です。
      2. 8 マイクロ遠心チューブ用を 90 μ L の PBS に詰めます。
      3. シリアルの希薄を作る (要因: 0.5) PBS (混ぜる) と管の標準的な最高の BSA から 90 μ L を取って、1st遠心にこれを追加することによって、このチューブから 90 μ L を撮影し、2nd遠心管にそれを追加します。
      4. 7 遠心チューブまでこの手順を繰り返します。8 チューブだけ PBS になります (すなわち空白: 0 μ g/mL)。
    2. (サンプルの 45 μ L、45 μ L の PBS) 90 μ L の総ボリュームで PBS でサンプルの 1:2 希釈することによってエキソソーム サンプルを準備します。
    3. BCA 試薬ミックスの作業を準備します。
      1. BCA 試薬ミックス必要 (50 μ L/ウェル、重複、基準を含む) の作業の合計量を計算します。
      2. 以下の比率に応じて個々 の BCA 試薬を混ぜる: 25 パーツ試薬 a: 24 パーツ試薬 b: 1 部分試薬 c.
    4. 測定と分析を実行します。
      1. (それぞれの標準およびサンプルの重複) 96 ウェル プレートのウェルに上記準備各標準とエキソソームのサンプルの 40 μ L を追加します。
        注: これは、比色定量法は、適切なピペッティング テクニックは正確な結果を達成するために非常に重要です。井戸のそれぞれに各標準/サンプルの複製を追加後にピペットを変更します。
      2. 各ウェルに試薬ミックスを働く蛋白質の試金の 50 μ l 添加し 37 ° C、30 分でプレートを孵化させなさい。
        注: 複製間のばらつきを最小限に抑えるために標準/サンプルの 1st複製にタンパク質アッセイ働き試薬を追加 1stにそれを追加する前に、同じサンプル/標準の 2ndの複製が続く別のサンプル/標準を複製します。
      3. 562 で吸光度を測定プレート リーダーの nm (材料の表を参照してください)。
      4. 規格の吸光度の値から標準曲線をプロットし、曲線の方程式を使用して各サンプルの蛋白質の集中のエクササイズします。
  2. 粒子: タンパク質比を計算する上で測定されますエキソソーム株式のタンパク濃度おいたエキソソーム収量を割る。

6. フローサイトメトリーによる Exosomal マーカー発現の解析

  1. (ストックから原液) アルデヒド/硫酸ラテックス ビーズの 10 μ L で 40 μ L エクソソーム (≥1x1011粒子/mL) の室温 (RT) で 15 分間インキュベートします。
  2. 100 μ M BSA 溶液 5 μ L を追加 (材料の表を参照) を 10 mM の最終濃度を達成し、室温 15 分間インキュベート エキソソーム ビーズ混合物に
  3. PBS の 1 mL を追加し、ロッキング シェーカー (~ 150 rpm) で軽度の動揺と微量遠心チューブに RT で 75 分間インキュベートします。
  4. RT で 5 分間 580 x グラムの懸濁液を遠心分離し、上澄みを廃棄します。
  5. 100 mM グリシン溶液 1 mL にペレットを再懸濁します (材料の表を参照してください)、室温 30 分間インキュベート
  6. 580 x g. 破棄で 5 分間懸濁液上清を遠心し、3% の 1 mL にペレットを再懸濁します FBS/PBS (材料の表を参照してください)。
  7. この洗浄工程を繰り返し、3% の 350 μ L でペレットを再懸濁します FBS/PBS。
  8. 懸濁液 50 μ L を含む各 7 管に懸濁液を分割し、蛍光標識抗 CD81、アンチ CD9 とアンチ CD63 抗体および対応するアイソタイプ コントロールでそれらを孵化させなさい (1:10 希釈)、それぞれ、4 ° C で 45 分無染色のコントロールが同じ処理を受ける管の 1 を保ちます。
  9. 3 %fbs/PBS 各チューブ、580 x g で 5 分間遠心し、上澄みを廃棄の 1 mL を追加します。
  10. 3% の 200-400 μ L でペレットを再懸濁します FBS/PBS および流れの cytometer のサンプルを分析 (材料表参照) 適切なチャネルの下で。

7 透過電子顕微鏡 (TEM) によるエキソソーム形態の特性

  1. 1010 p/mL のソリューションを修正など適切な濃度でエキソソームの水性分散液を修正 (材料の表を参照) で 15 分。
  2. 300 サンプル メッシュ カーボン コートの場所はグリッドを銅、空気に残して乾燥。
  3. マイナス 0.22 μ m フィルター水溶液ウラニル酢酸試料を染色 (材料表参照) 2 50% メタノール/H2O に続いて 4 分間洗う (材料の表を参照してください)。
  4. 空気は、試料を乾燥します。
  5. 電子顕微鏡下で試料を観察 (材料の表を参照してください)。80 で加速電圧をセット kV とスポット サイズ 2 で。すべてのサンプルと対物絞りを使用します。

8. siRNA エレクトロポレーション エクソソームにカプセル化

  1. エレクトロポレーション キュベットをあらかじめ冷やす (材料表参照) エレクトロポレーションの前に 30 分間氷の上。
  2. 遠心チューブの siRNA (RNase フリー水入荷 2 μ M から 12 μ L) の 0.33 μ g とエクソソーム (7 x 1012 p/mL PBS 入荷から 32 μ L) のミックス 7.0 μ。クエン酸バッファー 150 μ L にボリュームを構成する (材料の表を参照してください)。エキソソーム siRNA モル比は 1: 60 この場合です。
  3. エレクトロポレーション キュベットに混合物を転送します。キュベットをキャップし、本体のキュベット ホルダーに配置 (材料の表を参照してください)。回転ホイール 180 ° 時計回りに回転させます。
    注: ホイールは、キュベット電極に接触するためには、ロックの位置を完全にする必要があります。
  4. 目的エレクトロポレーション プログラムを選択 (例えば、 X-01、X-05、A-20、T-20, T-30、) し開始ボタンを押すとエレクトロポレーションを開始。
    注: 成功したパルスは、ディスプレイに"OK"を示すことによって示されます。
  5. 一度 electroporated、反時計回りにホイール 180 ° を後戻り後キュヴェットを削除します。さらなる処理のためプラスチック製のピペットとキュベットからサンプルを撤回します。

9. 無料 siRNA によるサイズ排除クロマトグラフィー (SEC) の除去

  1. 秒コラムを平衡させ (2.9 cm [H] × 1.3 cm [W];材料表を参照ください) フィルター処理された PBS の 3.5 mL を 2 回渡すことによって。
  2. 350 μ L フィルター処理された PBS ので electroporated サンプルの 150 μ L に溶解し、これを無料 siRNA 除去を実行する秒列に転送します。
  3. 列 (F0) から溶出最初 500 μ L の分数を収集します。
  4. 列にフィルターが適用された PBS の 500 μ L を追加し、次の 500 μ L の割合 (F1) を収集します。
  5. 10 x 500 μ L 分画 (F9) までの合計が収集されるまでは、上記の手順を繰り返します。F1 と F2 は、siRNA カプセル エクソソームを含める必要があります。
  6. フィルター処理された PBS を洗い流す (2 回、少なくとも) サンプルの任意の残基を削除します。

10. panc-1 細胞への siRNA ロード エクソソームのin Vitro取り込み

  1. 取り込み前にも 24 h あたり 50,000 セルの密度で 24 ウェル平底プレート (材料の表を参照) でシード panc-1 細胞研究し、インキュベーター (5% CO2、37 ° C) で細胞を孵化させなさい。
  2. Atto655 siRNA と Electroporate HEK 293 エクソソーム (7.0 μ g) (0.33 μ g)手順 8に従って。
  3. 手順 9に従って electroporated エキソソームを浄化し、100 μ L の PBS に再懸濁します。
  4. PANC-1 セルに electroporated エクソソームの 50 μ L を追加し、37 ° C、5% CO2 4 時間インキュベートします。
  5. 培養後、細胞を収集します。
  6. 1 ml 滅菌 PBS のセルを洗浄し、ポリスチレンの丸底で PBS の 200 μ L で再懸濁しますチューブ (材料の表を参照してください)。
  7. フローサイト メーターによる細胞を分析 (材料表参照) サンプルごと買収した 10,000 のイベント。
    注: 国連 electroporated エキソソーム siRNA 混合試料とフィルター処理された PBS で未処理のセルは、コントロールとして使用されました。

Representative Results

HEK 293 細胞 (HEK 293 Exo) から分離されたエクソソームの物理化学的特性を表 1にまとめます。ナノ粒子追跡解析 (NTA) 装置を用いた測定サイズは、107.0 ± 8.2 nm でした。また国税庁楽器を用いて HEK 293 細胞からエキソソーム収量 mL ~ 24 CM (収穫の 2 ラウンドから取得) の mL から/6.99 ± 0.22 x 1012 p であった。粒子・ タンパク質比 (P:P) を計算することによって評価 HEK 293 Exo の純度は、8.3 ± 1.7 × 10 の10 p/μ g でした。

分離の HEK 293 Exo のサイズ分布を図 3 aに示します。透過型電子顕微鏡 (TEM) を用いた形態素解析を示した HEK 293 Exo 100 を超える球状構造はやや nm の(図 3 b)。この結果に同意している国税庁の測定 (図 3 a) から。分離の HEK 293 Exo は陽性 CD81、CD9 や CD63、エクソソーム (図 3) として小胞を識別するために使用される標準的なマーカーであります。

サイズ排除クロマトグラフィー (図 4) を用いたエクソソームの浄化、エクソソームの割合回復、10 画収集 (F0 F9) 初期エキソソームの回復合計エキソソーム粒子数を割ることによって求めた粒子数が使用すると、収集したすべての 10 画分から得られた合計の蛍光強度と F3、F4、F5 から得られた合計蛍光強度で割って算出した siRNA の割合回復中。回復エキソソームの siRNA 後浄化を求めた 75.0%、80.4%、それぞれ。エクソソームの siRNA のカプセル化効率 siRNA 標準曲線を確立 (図 4) を用いて、10 〜 20% であった。

フローサイトメトリーを用いた蛍光 Atto655 siRNA 搭載エクソソームの取り込み体外の質的分析を示したエクソソームの siRNA カプセルで治療 panc-1 細胞が (図 5 a) 蛍光信号の最大の変化を記録すること. エクソソームの siRNA カプセルで治療 panc-1 細胞記録 Atto655 信号 (39.4%) と比較するとアンロード エクソソームと siRNA の混合物 (0.56%)、(上記の観察を裏付けているとの肯定的な人口の割合が高い図 5B).SiRNA カプセル エクソソーム (MFI 倍 PANC-1 細胞に有意 (未処理細胞の平均蛍光強度 (MFI) 値で倍の差として表される) siRNA の細胞内取り込みの程度が認められました。差 = 5.1) エキソソーム siRNA の混合物と扱われた比較 (MFI 倍差 = 1.1) (図 5)。これらの観察は、siRNA カプセル エクソソーム panc-1 細胞によって内面化されたことと、siRNA を細胞内で効果的に配信彼らことを示した。

Figure 3
図 3: 生化学と HEK 293 エクソソームのモルフォロジー分析します。(A) サイズのナノ粒子追跡分析 (NTA) を用いた HEK 293 エクソソームの分布。曲線を示しています 3 異なるから重畳ヒストグラムを測定間の標準偏差を示す赤の領域を 30 秒間隔でキャプチャ (n = 3)。(B) 透過電子顕微鏡 (TEM) 像 HEK 293 エクソソーム素朴な。スケール バー: 100 nm。(C) 検出 exosomal マーカー CD81、CD9 や CD63 の HEK 293 エクソソームのフローサイトメトリーを用いたします。エクソソームは、検出前にアルデヒド/硫酸ラテックス ビーズに結合されました。ビーズ エキソソーム複合体その後 fluorophore 共役アンチ CD81、アンチ CD9、アンチ CD63 抗体で染色。マーカーの発現の程度はコントロール (対応するアイソタイプで染色エキソソーム ビーズ複合体) の平均蛍光強度 (MFI) 値の倍差として表されます。値は平均 ± SD 表されます。 ここで、n = 3。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 4
図 4: エキソソーム浄化ポスト エレクトロポレーション。(A) サイズ排除 chormatography を使用して Atto655 siRNA と electroporated エクソソームの溶出プロファイル (F0 F9)。(B) 国税庁分析 Atto655 siRNA とサイズ排除 chormatography を使用して、F0 からエキソソーム f9 キーを押します。Atto655 の (C) 校正曲線は、siRNA をラベル付けされます。プレート リーダーで得られた蛍光強度 Ex/Em: 640-10/680 nm;2800 を得る。値は平均 ± SD として表されます (n = 3)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 5
図 5: 4 h で panc-1 細胞への siRNA カプセル エクソソームの細胞内取り込み(A) ヒストグラム アンロード エクソソーム + siRNA の混合物および siRNA カプセル エクソソームの細胞内取り込みを比較します。アンロード エクソソーム + 擬似カラー プロットで 4 h で siRNA 混合物の吸収の (B) を比較します。(C) 平均の倍の違い蛍光強度 (MFI) 値テスト サンプルの未処理細胞のそれと比較します。値は平均 ± SD 表されます。 ここで、n = 3。P 0.001 <。NS: 重要ではないです。一方向の分散分析は統計分析のために使用されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

エキソソーム サイズ1, 2
(nm)
1,2,3をもたらす
(p/mL)
[たんぱく質]2, 4
(μ g/mL)
粒子-蛋白質 (P:P) 比5
(p/μ g)
HEK 293 107.0 ± 8.2 6.99 ± 0.22 x 1012 84.3 ± 9.8 8.3 ± 1.7 × 1010 
追跡分析 (国税庁器械) ナノ粒子を用いた1測定
2平均 ± SD として値が表され、n = 3
3セル付き中バイオリアクター フラスコ (〜 24 mL) から収穫の 2 ラウンドからプールで収量が得られました。
4測定タンパク質アッセイ キットを使用して
数式を使用して取得された5値: P:P 比 = 収量/[蛋白質]

表 1: エクソソームの物理化学的キャラクタリゼーション。

Discussion

培養細胞からまともなエキソソーム収量を得る、まだ挑戦は、生体外でまたは生体内での研究のいくつかのラウンドのために十分であります。メーカーによるとバイオリアクター フラスコは抗体や様々 な不死化細胞株の培養から高い歩留まりとタンパク質の生産を想定しました。これにより、継続的に細胞コンパートメントに集中して馴化培地 (CM) の結果、目的の製品と培養液を豊かにするセル。理論的に、同じ概念は様々 な細胞からエキソソーム生産で有益であろうし、エキソソーム収量40を大幅増加を示した実際バイオリアクター フラスコでこれらの細胞を培養します。大きな媒体貯水池は継続的に栄養を供給し、細胞と接触する媒体または標準の大容量を必要とせず長時間文化を許可する 10 kDa 半透膜を通して細胞コンパートメントから廃棄物を削除しますフラスコ変更、最終的に全体的なコストと高規模エキソソーム生産40の労働を救うことができます。エクソソームの免疫調節機能と同様、形態、表現型が40通常 75 cm2のフラスコで培養された細胞から供給に類似している長期バイオリアクター フラスコ培養細胞を分離したことをまた示した。バイオリアクター フラスコ エキソソーム ソースとして他の不死化細胞株の培養したがって彼らの完全性と機能を維持しながらエキソソーム歩留まり向上に役立つでしょう。文化のこのフォームは高密度で培養できないがしかし限られた部門のサイクル、およびそれらの一次電池には適用されません。

CM の収穫は毎週行われますので、培養細胞が決して継代、バイオリアクター フラスコ内のセルが通常細胞培養のような単分子膜の成長が想定できます。彼らは壊死のセンターでクラスターを形成または単に表面と死ぬからデタッチ細胞が単層のためあまりにも合流する可能性が最も高い。バイオリアクター フラスコの細胞コンパートメントの目視検査はこの仮定を確認することはできませんが、CM 収穫時に死んだ細胞の大きい数によって反映されます。バイオリアクター フラスコから悪い付着性細胞と非実行可能な細胞の通常の取り外しは、ガス、栄養素や細胞コンパートメントとメディア間の廃棄物の交換に悪影響を与えることができる半透膜材料の蓄積を防ぐことができます。貯水池、ようにのバイオリアクター フラスコで長期にわたる文化 > 6 ヶ月40。このコンテキストでこの非規則バイオリアクター フラスコの細胞の成長の腫瘍成長体内の実態を従来の単層培養よりもっと密接に模倣し、期待される我々 は推測するので理想的であるが、エクソソームバイオリアクター フラスコ内のセルはより類似している腫瘍の生体内で分泌されるだろう癌によって生成されます。これは腫瘍病理進行腫瘍由来エクソソームの役割の研究で特に有益ででしょう。腫瘍由来エクソソームは本質的に、優先的に家庭起源32の自分の組織に報告されている、したがって、エクソソームの体内を模倣した系に生じる生産も望ましいでしょう見て研究ナノキャリア薬物としてエクソソームの受動的ターゲティング能力を探索します。

P:P 比率は41から供給されたエクソソームの生理学的な流体の培地から蛋白質を汚染から分離エクソソームの純度を評価するパラメーターとして報告されました。P:P 比 8.3 ± 1.7 × 1010 p/μ g この研究で得られた研究で提案した高純度範囲内にあります。この比率が収量やエクソソームを分離するこれは true エクソソーム蛋白質の問題を与えられたサンプルで利用可能な量を反映されません、それぞれ、下流の研究で使用量を表現する蛋白質の集中を使用しての危険性を強調します。分離中に汚染されています。エクソソーム粒子数濃度を測定する NanoSight などの機器経由で国税庁は、エクソソームの定量化のより賢明な正確な方法です。

重水素酸化物の 25% のショ糖液の準備の間に非常に正確な計量は、このメソッドは密度ベースの分離が重要です。エクソソーム浮選密度の比較的狭い範囲にあるショ糖ショ糖クッションの正確な準備は分離42中に, アポトーシス小体などの非 exosomal 小胞や小胞をゴルジ装置由来の汚染を減らすのでチューブ内の空気の凝縮または蒸発によって残りのショ糖溶液、溶液中の水の添加や損失などの密度を変えることができる要因のリスクを避けるためにそれを使用して 1 日後も維持することを勧めします。CM からエクソソームのも移行できるようにショ糖液にショ糖クッションに遠心分離中にスイング アウト ローターの使用も不可欠です。

ショ糖ソリューション後遠心分離を撤退、また繊細なステップとそれを見つけないと、回復とはあまりエキソソーム サンプル撤退する培地からタンパク質を導入、エクソソームの極大間の妥協.ショ糖液と条件媒体間のインターフェイスは、培養液からのタンパク質が遠心分離の後を収集して、インターフェイス上にある暗い茶色のリングとしては通常見ることです。私たちの手で上記妥協に同意する最適なボリュームは、追加初期 3 mL のショ糖クッションの 2 mL の脱退します。このプロトコルで記述されているボリュームは、特定のローターを使用しました。したがって、縮小すると種類別の施設で使用可能なローターのボリューム ダウンに撤退するショ糖の量を最適化することをお勧めします。オフホワイト ペレットとしてみるこれはショ糖よりも高い密度の粒子の土砂と通常のこととして、ショ糖を撤退、チューブの底の中心にエリア右を避けるために重要です。

PBS の比較的大量の洗浄のステップは、さらにエキソソーム分離41中蛋白質の汚染の度合いを減らすのに役立ちます。この手順もエキソソーム入荷細菌や真菌の成長の危険性を減らすことと同様、彼ら自身または exosomal 腔内生体分子、エクソソームに浸透圧損傷を避けるためにエクソソームから過剰蔗糖の取り外しに不可欠です。浸透圧損傷の微生物汚染リスクを減らし水分離のエキソソーム浮選密度を達成するために必要な糖の量を削減するのに役立ちますよりもむしろ、重水素酸化物のショ糖液を準備します。エキソソームを含むショ糖クッションの上に最初の遠心分離後ショ糖層を撤回し、PBS に追加が 4 ° C で保存でき翌日処理に時間的な制約に直面している場合。

我々 の知る限り、エキソソーム/siRNA のモル比はエレクトロポレーションの効率を決定する上で重要な要因です。このプロトコルでは 1: 60 を siRNA モル比エキソソームとして使用されます。エクソソームのさまざまな種類のカプセル化機能は異なっていると強くお勧めこのケースバイ ケースに基づいて最適化します。しかし、ここに提案するカプセル化効率は常に最適なエレクトロポレーション条件を選択するためのパラメーターをすることができます。

さらに、siRNA の集計は、エレクトロポレーションで最も一般的な問題の 1 つであると考えられています。そのエレクトロポレーションは、siRNA、エクソソームを入力するも困難の強い凝集を誘導することが証明されます。siRNA のエキソソームしたがって適切なコントロールにカプセル化は、エレクトロポレーション28中に siRNA の集合体の形成は避けられないと本研究で使用された siRNA 集計はしばしば誤って解釈されます。浄化手法の割合カプセル化効率はバック グラウンド ノイズ、エキソソーム、siRNA 集計データの信頼性に影響を与えるなどの他の情報源からの影響を最小限に抑えるための正規化された値を使用して計算されます。我々 の調査結果に基づいて、ごくわずかな siRNA 集計で、コントロール サンプルすなわちelectroporated と国連 electroporated siRNA を用いた観察があった。

このプロトコルは siRNA のエクソソームにカプセル化を実証し、がんに siRNA の細胞内配信、その後細胞の培養。したがって、異なる細胞からエクソソームの様々 なタイプをすることができます分離提案プロトコルを使用しての特徴し、その後さまざまな癌の過剰発癌性ターゲットの種類によって様々 な治療 siRNA 搭載します。興味深いアプリケーションは、エキソソーム ソース ターゲット細胞ペア体外の様々 な順列を用いた siRNA 配信と吸収効率を探索することでしょう。これと siRNA カプセル エクソソームの治療効率両方の配信の効率を評価するための動物モデルに翻訳できます体内

Disclosures

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

Acknowledgements

F. n. Faruqu は、マレーシア政府機関マジュリス アマナ Rakyat (マーラ) によって資金を供給します。L. はマリー ・ マリアスクウォドフスカ キュリー個人奨学金 (地平線 2020) (H2020 MSCA 場合 2016) の受信者です。K. t. アル ・ ジャマールは、BBSRC (BB/J008656/1) および Wellcome の信頼 (WT103913) からの資金提供を認めています。著者も感謝したい Dr ポール ・ ラヴェンダーと博士デビッド恐怖 (呼吸器内科、アレルギー、College ロンドン王の) 本体を提供するため。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
Sterile Newborn Calf Serum Heat Inactivated First Link 08-05-850 500 ml
EMEM medium Thermo Fisher Scientific 11090081 500 ml
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140-122 100 ml
GlutaMax Thermo Fisher Scientific 35050-038 100 ml
Sucrose Fisher Scientific S/8600/60 1 kg
Deuterium oxide (D2O) Sigma-Aldrich 151882 250 g
1X Phosphate Buffered Saline  Thermo Fisher Scientific 10010015 500 ml
Glycine VWR Chemicals 101196X 1 kg
Sepharose CL-2B GE Healthcare Life Sciences 17-0140-01 1 L; Particle Size 60 μm-200 μm
Trypsin-EDTA 0.05% Thermo Fisher Scientific 25300096 100 ml
Aldehyde/sulfate latex beads Thermo Fisher Scientific A37304 4% w/v, 4 µm, 15 ml
MicroBCA kit Thermo Fisher Scientific 23235
CD81 antibody (APC) Thermo Fisher Scientific 17-0819-42 Lot: E15950-104. RRID: AB_11150235. 1:10 dilution in 50 µl sample
CD81 isotype (APC) Thermo Fisher Scientific 17-4714-81  Lot: 4291563. RRID: AB_763650. 1:10 dilution in 50 µl sample
CD9 antibody (FITC) Thermo Fisher Scientific 11-0098-41 Lot: 4345870. RRID: AB_10698007. 1:10 dilution in 50 µl sample
CD9 isotype (FITC) Thermo Fisher Scientific 11-4714-41 Lot: 4299784. RRID: AB_10598647. 1:10 dilution in 50 µl sample
CD63 antibody (PE) Thermo Fisher Scientific 12-0639-41 Lot: 1930435. RRID: AB_2572564. 1:10 dilution in 50 µl sample
CD63 isotype (PE) Thermo Fisher Scientific 12-4714-81 Lot: 1937696. RRID: AB_470059. 1:10 dilution in 50 µl sample
Atto655-siRNA Eurogentec     SQ-SIRNA (Labelled-S) UGC-GCU-ACG-AUC-GAC-GAU-G55; (Unlabelled-AS) CAU-CGU-CGA-UCG-UAG-CGC-A55.
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Millex-GP Syringe Filter Unit 0.22 µm Millipore SLGP033RS
CELLine AD1000 bioreactor flasks Wheaton WCL1000ad
Ultracentrifuge Beckman Coulter Optima XPN-80
Swing-out rotor Beckman Coulter SW45 Ti
Fixed-angle rotor Beckman Coulter Type 70 Ti
Ultracentrifuge tubes Beckman Coulter 355631 Polycarbonate. Max. fill 32 ml
Ultracentrifuge bottles Beckman Coulter 355618 Polycarbonate. Min. fill 16 ml, max. fill 25 ml
NanoSight Malvern LM10 Software: NanoSight NTA v3.2
Flow Cytometer BD Biosciences FACSCalibur
Centrifuge Eppendorf 5810R
Plate reader BMG Labtech FLUOstar Omega
Flow cytometry tubes BD Biosciences, Falcon 352052
Microfuge tubes Starlab S1615-5500 1.5 ml
Cell culture flasks Fisher Scientific 156499 75 cm2
Transmission electron microscope FEI Electron Optics Philips CM 12 with Tungsten filament and a Veleta - 2k × 2k side-mounted TEM CCD Camera (Olympus, Japan)
Amaxa Nucleofector I Lonza Nucleofector I with Amaxa’s Nucleofector Kits
24-well flat-bottom plates Corning Costar
Blunt fill needle BD Biosciences 305180 18G x 1 1/2" (1.2 mm x 40 mm)
Glass pipettes Fisher Scientific 1156-6963
Name Company Catalog Number Comments
Reagents Composition
Normal medium Eagle's Minimum Essential Medium supplemented with 10% foetal bovine serum (FBS), 1% penicillin/streptomycin and 1% GlutaMax.
Exosome-depleted medium Eagle's Minimum Essential Medium supplemented with 10% exosome-depleted FBS (see below), 1% penicillin/streptomycin and 1% GlutaMax.
Exosome-depleted FBS Subject FBS to ultracentrifugation at 100,000 g for 18 h at 4°C. The FBS supernatant post-centrifugation was collected and sterile-filtered using 0.22 µm filters.
25% w/w sucrose cushion Add 1.9 g (± 0.001 g) of sucrose in a universal tube, and top up with D2O until the weight reaches 7.6 g (± 0.001 g). This makes ~6ml of the 25% w/w sucrose cushion.
3% FBS/PBS Add 1.5 ml exosome-depleted FBS to 48.5 ml 1X PBS to prepare 50 ml of 3% FBS/PBS.
100 µM BSA solution Prepare 1mM BSA solution by adding 0.3325 g to 50 ml PBS. Make 1:10 dilution of this stock to obtain 100 µM BSA solution. Make 5-10 µl aliqouts of this 100 µM BSA solution (for single use) and store them at -20°C. All BSA solution should be stored at -20°C, and discard solutions that have undergone ≥2 freeze-thaw cycles.
100 mM glycine solution Add 0.375 g of glycine to 50 ml PBS to obtain 100 mM glycine solution, store at 4°C.
Citric acid buffer with EDTA Mix 0.1954 g citric acid and 0.2087 g disodium phosphate in 50 mL of deionised water. Add EDTA to 0.1 mM. Adjust pH to 4.4.
Fixing solution Prepare formaldehyde/glutaraldehyde, 2.5% (w/v) each in 0.1 M sodium cacodylate buffer, and adjust pH to 7.4.
Aqueous uranyl acetate Prepare 25% (v/v) uranyl acetate in methanol.
50% methanol/H2O Mix methanol and H2O 1:1 (v/v).
SEC Column packed with Sepharose CL-2B Dilute 37.5 ml Sepharose CL-2B resin with 12.5 ml PBS to obtain 75% Sepharose CL-2B solution. Pour the Sepharose CL-2B solution into a column of dimension 2.9 cm [H] x 1.3 cm [W]. Pour the Sepharose CL-2B to 3-4 mm above the stated height, and then press it down to the stated height with the filter for optimal packing.

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