Meso-schaal Particle Image Velocimetry Studies van neurovasculaire stroomt In Vitro

* These authors contributed equally
Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Hier presenteren we vereenvoudigde methoden voor het fabriceren van transparante neurovasculaire fantomen en daarin het karakteriseren van de stroom. Wij wijzen op verschillende belangrijke parameters en tonen hun relatie tot veld nauwkeurigheid.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Peck, R. A., Bahena, E., Jahan, R., Aguilar, G., Tsutsui, H., Princevac, M., Wilhelmus, M. M., Rao, M. P. Meso-Scale Particle Image Velocimetry Studies of Neurovascular Flows In Vitro. J. Vis. Exp. (142), e58902, doi:10.3791/58902 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Particle image velocimetry (PIV) wordt gebruikt in een breed scala aan velden, als gevolg van de mogelijkheid die het voorziet juist visualiseren en kwantificeren van stromen in een heel grote Spatio scala. Echter vereist de uitvoering ervan meestal het gebruik van dure en gespecialiseerde instrumentatie, waardoor het nut van ervan breder wordt beperkt. Bovendien, op het gebied van de studierichtingen Bio-ingenieur, in vitro stroom visualisatie studies zijn ook vaak verder beperkt door de hoge kosten van commercieel geproduceerde weefsel fantomen die gewenste anatomische structuren, met name voor degenen recapituleren die span het MESOSCHAAL regime (dat wil zeggen, submillimeter naar millimeter lengte schalen). Hierin presenteren wij een vereenvoudigde experimenteel protocol ontwikkeld voor het pakken van deze beperkingen, de belangrijkste elementen van die 1) een relatief goedkope methode voor het fabriceren van MESOSCHAAL weefsel phantoms met behulp van 3D-printen en siliconen gieten bevatten, en 2) een open-source image analyse en verwerking kader dat de aanvraag van de instrumentatie vermindert voor het meten van MESOSCHAAL stromen (d.w.z., snelheden tot tientallen millimeters/seconde). Collectief, verlaagt dit de toetredingsdrempel voor nonexperts, door gebruik te maken van middelen reeds ter beschikking van vele bioengineering onderzoekers. We demonstratethe toepasselijkheid van dit protocol binnen de context van de karakterisering van de stroom van de neurovasculaire; echter naar verwachting relevant zijn voor een breder scala van toepassingen van de MESOSCHAAL in de studierichtingen Bio-ingenieur en daarbuiten.

Introduction

PIV wordt het veel gebruikt in de experimentele stromingsleer voor stroom visualisatie en kwantitatieve onderzoeken van vloeiende bewegingen die in lengte schaal van atmosferische tot microcirculatory stromen1,2,3 variëren. Hoewel de specifieke kenmerken van de uitvoering ervan zo breed als de toepassingen variëren kunnen, is een aspect gemeen hebben bijna alle PIV studies het gebruik van video beeldvorming van tracer deeltjes uitgezaaid binnen het werkmedium, gevolgd door een paarsgewijse analyse van opeenvolgende afbeeldingsframes uitpakken van gewenste flow eigenschappen. Meestal is dit bereikt door het eerste controledoeleinden elk frame van de afbeelding in kleinere regio's ondervraging windows genoemd. Als gevolg van de willekeurige posities van de verspreide deeltjes bevat elke ondervraging venster een unieke verdeling van pixel intensiteiten. Als het venster grootte en gegevens verwerving tarief geschikt zijn gekozen, kan cross-correlatie van het signaal van de intensiteit in elk venster worden gebruikt om te schatten de gemiddelde verplaatsing binnen dat gebied. Ten slotte, gezien het feit dat de vergroting en de framesnelheid bekend zijn experimentele parameters, een vectorveld momentane snelheid kan worden gemakkelijk berekend.

Een groot voordeel van PIV over één-punt meettechnieken is haar vermogen om de kaart van vectorvelden binnen een domein op twee - of drie - dimensional. Hemodynamische toepassingen, met name baat hebben gehad bij deze mogelijkheid, aangezien hierdoor een grondig onderzoek van lokale stromen, waarvan bekend is dat een belangrijke rol spelen bij vaatziekten of het remodelleren (b.v., atherosclerose, angiogenese) 4 , 5 , 6. is dit ook het geval voor de evaluatie van neurovasculaire stromen geweest, en de interacties daarvan met endovasculaire apparaten (bijvoorbeeldstroom omleiders, stents, intrasaccular spoelen), sinds de relevante lengte-schalen in dergelijke toepassingen kunnen vaak omvatten een of meer ordes van grootte (b.v.van micrometer en millimeter), en apparaat geometrie en plaatsing kan beduidend beïnvloeden de lokale stromingsleer7.

De meeste groepen in orkestdirectie PIV gebaseerde hemodynamische hebben vertrouwd op experimentele set-ups die enkele van de vroegste onderzoeken van stent invloed vasculaire stroom7,en8nauw na te bootsen. Meestal deze omvatten een) gepulseerde lasers en high-speed camera's, om vast te leggen hoge-snelheid stromen; b) synchronisatieprocessen, om te voorkomen dat aliasing tussen de frequentie van de pols van de laser en de camera acquisitie framesnelheid; c) cilindrische optica, te vormen van een lichte blad, dus het minimaliseren van de fluorescentie van de achtergrond van tracer deeltjes boven en beneden de ondervraging vlak; d) in het geval van de commerciële kant en klare systemen, propriëtaire softwarepakketten, de cross-correlatie-analyses uitvoeren. Nochtans, terwijl sommige toepassingen vereisen de prestaties en/of de veelzijdigheid collectief die worden geboden door deze onderdelen, vele anderen dat niet doen. Bovendien, de hoge kosten van commercieel geproduceerde weefsel fantomen die gewenste vasculaire structuren recapituleren kunnen ook blijken beperken voor veel in vitro studies, met name voor spoken met beschikt over die brug het MESOSCHAAL regime (> 500 USD / "Phantom"). Hierin, rapporteren we de ontwikkeling van een vereenvoudigde protocol voor de uitvoering van PIV voor de visualisatie in vitro van neurovasculaire stromen, die meestal beide ruimtelijk liggen en stoffelijk binnen het MESOSCHAAL regime (dat wil zeggen, lengte schalen variërend van submillimeter millimeter, en snelheden tot tientallen millimeters/seconde). Het protocol beoogt aan hefboomwerking de middelen reeds ter beschikking van vele bioengineering onderzoekers, dus het verlagen van de toetredingsdrempel voor nonexperts.

Het eerste element van dit protocol omvat het gebruik van een techniek gieten investering om de eigen fabricage van transparante, Polydimethylsiloxaan (PDMS)-op basis van weefsel spoken van opofferende mallen 3-d-3-d-afgedrukt. Door de toenemende beschikbaarheid van 3D-printers in de afgelopen jaren, met name die in gedeelde/multi-eindgebruiker voorzieningen (bijvoorbeeld, institutionele voorzieningen of openbare makerspaces), deze methode verlaagt kosten aanzienlijk (bijvoorbeeld< 100 USD/phantom in de hier voorgelegde geval), terwijl het toelaten van een snelle ommekeer voor de fabricage van een grote verscheidenheid van ontwerpen en geometrieën. In het huidige protocol, een fused deposition modeling systeem wordt gebruikt met acrylonitril butadieen styreen (ABS) als het bouwmateriaal, en het afgedrukte gedeelte fungeert als een offer mal voor het latere phantom gieten. Onze ervaring is gebleken dat ABS geschikt voor dergelijk gebruik, is aangezien het is oplosbaar in gemeenschappelijke oplosmiddelen (bijv., aceton), en het heeft voldoende sterkte en stijfheid aan schimmel integriteit behouden na de verwijdering van het dragermateriaal (b.v., om voorkomen dat de vervorming of breuk van het verkleinwoord schimmel functies). In het huidige protocol, wordt schimmel integriteit verder verzekerd met behulp van solide gedrukte modellen, hoewel dit ten koste van de toegenomen ontbinding tijd gaat. Het gebruik van holle modellen ook mogelijk in sommige gevallen, te verbeteren oplosmiddel toegang en dus ontbinding tijd te verminderen. Echter zorgvuldig moet worden overwogen om het effect dit kan hebben op de integriteit van de schimmel. Tot slot, terwijl de fantomen vervaardigd hierin zijn gebaseerd op geïdealiseerde voorstellingen van neurovasculaire structuren gegenereerd met behulp van een gemeenschappelijke computer aided design (CAD)-softwarepakket, het protocol zal naar verwachting worden vatbaar voor de fabricage van meer complexe , patiënt-specifieke geometrieën evenals (bijvoorbeeld via het gebruik van model-bestanden gegenereerd door de conversie van de klinische beeldvorming gegevens aan de. STL bestandsindeling die wordt gebruikt door de meeste 3D-printers). Verdere details met betrekking tot de phantom Productie-procédé vindt u in sectie 2 van het protocol.

Het tweede element van het protocol omvat het gebruik van een open-source plug-in voor ImageJ uit te voeren van de cross-correlatie analyse9. Dit is in combinatie met de uitvoering van een eenvoudige statistische drempelmethode actie (dat wil zeggen, intensiteit aftopping)10 ter verbetering van het signaal van de afbeelding voorafgaand aan cross-correlatie, evenals een postcorrelation vector validatie regeling, de genormaliseerde mediane test (NMT), aan het elimineren van valse vectoren door middel van een vergelijking van elk naar de dichtstbijzijnde buren11. Collectief, hierdoor imaging om te worden uitgevoerd met apparatuur die gewoonlijk worden aangetroffen in veel bioengineering laboratoria, waardoor de noodzaak voor de verwerving van veel van de dure onderdelen van typische PIV-systemen (bijv., gepulste laser, de synchronisatieroutine cilindrische optica en private software). Nadere details betreffende de videocollectie beeldverwerking en de gegevensanalyse vindt u in de paragrafen 5 en 6 van het protocol.

Figuur 1 illustreert de PIV set-up gebruikt in dit protocol, die op een fluorescentie Microscoop uitgerust met een high-speed camera berust voor imaging, evenals een externe, continu wit-lichtbron (d.w.z., HQI-lamp) voor via-doelstelling volumetrische verlichting. Een veranderlijk-snelheid versnelling pomp wordt gebruikt om de recirculatie stroom van een oplossing van de transparante mock bloed via de neurovasculaire weefsel phantoms opleggen. De oplossing bestaat uit een 60:40 mengsel van gedeïoniseerd water (DI) en glycerol, die een gemeenschappelijk substituut voor bloed in hemodynamische12,13,14, wegens bestudeert een) zijn soortgelijke dichtheid en viscositeit (dat wil zeggen, 1.080 kg/m3 en 3.5 cP vs. 1.050 kg/m3 en 3-5 cP voor bloed)15,16; b) de transparantie in het zichtbare bereik; c) zijn soortgelijke brekingsindex als PDMS (1.38 vs. 1.42 voor PDMS)17,18,19,20, die minimaliseert van optische vervorming; d) het gemak waarmee niet-Newtoniaanse gedrag komen kan, indien nodig, via de toevoeging van xanthane21. Ten slotte, fluorescerende polystyreen parels worden gebruikt als tracer deeltjes (10.3 µm in diameter; 480 nm/501 nm excitatie/emissie). Terwijl neutraal drijfvermogen kralen gewenst zijn, kan sourcing tracer deeltjes met optimale vloeistof mechanische eigenschappen (zoalsdichtheid, grootte, samenstelling) en emissie golflengte uitdagende bewijzen. Bijvoorbeeld, zijn de kralen gebruikt hierin iets minder dicht dan de oplossing van glycerol (1.050 kg/m3 vs. 1.080 kg/m3). De hydrodynamische effecten, daarvan, zijn echter te verwaarlozen, gezien het feit dat de duur van een typisch experiment veel korter dan de tijdschaal drijfvermogen effecten gekoppeld is (dat wil zeggen, 5 min en 20 min, respectievelijk). Verdere details met betrekking tot de mock bloed oplossing formuleren en in vitro circulatory system set-up vindt u in de afdelingen 3 en 4 van het protocol.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ABS gebaseerde opofferende schimmel Fabrication

  1. Het ontwerp van een omgekeerde model van het spook van de gewenste weefsel met behulp van CAD software.
  2. Het afdrukken van het model met behulp van een 3D-printer met ABS als het bouwmateriaal.

2. PDMS gebaseerde vasculaire Phantom Fabrication

  1. Mengen
    1. Meng de PDMS prepolymer base en genezen agent in een verhouding 10:1 (in gewicht); een mengsel van 66 g verstrekt voldoende materiaal voor de fabrikatie van spoken met volumes tot 50 cm3.
    2. Plaats het mengsel in een vacuüm exsiccator voor 60 min tot ontgas en minimaliseren van de zeepbel entrapment. Cyclische drukregeling/drukverlaging gebruiken om breuk van de zeepbel.
  2. Gieten
    1. Monteer de afgedrukte ABS schimmel op een glasplaatje molding putty gebruiken voor het afdichten van de interface.
    2. Giet zorgvuldig het PDMS mengsel in de mal terwijl het proberen om het minimaliseren van de zeepbel entrapment. Aanhoudende bubbels kunnen handmatig worden gescheurd met behulp van een naald.
    3. Genezen de cast phantom bij kamertemperatuur (25 ° C) gedurende ten minste 24 uur.
      Opmerking: Bij hogere temperaturen, dit proces kan worden versneld22.
  3. Demolding
    1. Los van de ABS door dompelen de phantom in aceton en sonicating gedurende ten minste 15 minuten, met behulp van de bevoegdheden tot 70 W.
      Let op: Aceton heeft een hoge dampdruk bij kamertemperatuur en een laag vlampunt. Daarom werkt altijd onder een zuurkast en uit de buurt van potentiële onstekingsbronnen. Draag de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (bijvoorbeeld, bril of gezicht schild, laboratoriumjas, aceton-bestendige handschoenen).
    2. Spoel de phantom met isopropyl alcohol en, vervolgens, DI water te verwijderen van oplosmiddelen.
      Opmerking: PDMS zwelt bij blootstelling aan aceton; de zwelling afneemt echter zodra de phantom is gespoeld en gedroogd voldoende23.
  4. Bevestiging van de phantom trouw met behulp van optische microscopie
    1. Met behulp van een optische Microscoop met een aangesloten camera en image capture software, is een opname van een kritische functie binnen de phantom onder een vergroting dat de functie binnen het gezichtsveld maximaliseert.
    2. Een opname van een juiste kalibratie dradenkruis op de dezelfde vergroting.
    3. Beide beelden in ImageJ laden door deze naar de werkbalkte slepen.
    4. Klik op de afbeelding van de dradenkruis kalibratie om het te activeren en selecteer vervolgens het gereedschap lijn . Met de muis, tekent u een lijn langs een functie van een bekende afstand en selecteer analyseren > schaal instellen uit het menu ImageJ.
      Opmerking: In het venster Instellen schaal , moet het veld afstand in pixels zich worden vooraf ingevuld met de lengte van de getekende lijn in eenheden van pixels zijn.
    5. Geef de lengte van de functie in het veld Bekend afstanden zijn eenheid in het veld Eenheid van lengte. Vinkt u het selectievakje Global deze kalibratiefactor om op te passen alle geopende afbeeldingen.
    6. Het beeld van de phantom kritische functie actief te maken en gebruik het gereedschap lijn om te tekenen van een lijn langs een functie van belang. Selecteer in het menu ImageJ analyseren > maatregel (of druk op Ctrl + M) voor het meten van de lengte van de lijn.
    7. Vergelijk de verwachte waarde ten opzichte van de waarde in de kolom lengte in het resultatenvenster Controleer phantom trouw gemarkeerd.

3. bespotten bloed oplossing formulering

  1. Meng DI water en glycerol in een verhouding van 60:40 (volumeprocent).
    Opmerking: Een volume van 100 mL is voldoende voor de in vitro bloedsomloop die hierin worden beschreven.
  2. Voeg 1 mL 2,5% w/v fluorescerende polystyreen kraal oplossing (dat wil zeggen, tracer deeltjes) aan de mock bloed-oplossing.
  3. Meng het mengsel op een magnetische roer plaat van 400 toeren per minuut gedurende 10 minuten.

4. in Vitro Circulatory System Set-up

  1. Pomp set-up
    1. Een draad stripper hulpprogramma af te snijden de DC-einde stekker uit het stopcontact voor AC-naar-DC-adapter gebruiken.
    2. Strip van de coating van de stroom en gemalen draden en sluit ze aan op de ingang van de spanningsregelaar puls breedte modulatie (PWM).
    3. Verbind de macht en gemalen draden van de pomp gelijkstroommotor aan de uitgang van de PWM-spanningsregelaar.
      Opmerking: Van de PWM 7-segment display output het pulserend sproeien (0% - 100%) gebruikt om een variabele spanning op de DC-motor.
  2. Pomp kalibratie
    1. Bereiden van 200 mL mock bloed oplossing (zie punt 3).
    2. Plaats buis van de inlaat van de pomp naar het bekerglas houden de mock bloed-oplossing.
    3. Plaats de buis van de uitlaat van de pomp in een lege bekerglas.
    4. Selecteer een gewenste plicht cyclus instelpunt (0% - 100%). Druk op de knop op en een timer te starten.
    5. De timer stoppen zodra de pomp het gehele volume van mock bloed oplossing heeft overgedragen. Gebruik deze tijd om het volumetrisch debiet berekenen.
    6. Herhaal stap 4.2.1 - 4.2.5 voor ten minste vijf verschillende plicht cyclus set punten om een kleinste kwadraten regressie curve.
      Opmerking: Een minimum van drie repliceren punten per plicht cyclus instelpunt wordt aanbevolen. Deze relatie kan worden gebruikt voor het correleren van het gewenste debiet naar de vereiste PWM-taakcyclus.

5. video collectie

  1. Afbeelding kalibratie
    1. Bepaal de kalibratie-breedteverhouding voor de video beeldvorming (zie punt 2).
  2. Apparaat set-up
    1. Plaats het PDMS spook op het toneel van de fluorescentie Microscoop.
    2. De phantom verbinden met de versnelling pomp en voeren de mock bloed-oplossing.
      Opmerking: Optioneel, prefill het model met ethanol om volledige bevochtiging; dan spoelen en vullen met de mock bloed-oplossing. Dit kan met name gunstig zijn voor modellen met kleinere vaartuigen en/of blinde functies.
    3. Stel de pomp motor controller voor het gewenste debiet op basis van de kalibratiekromme pomp.
    4. De pomp voor 1-5 min voordat het experiment om steady-state omstandigheden worden uitgevoerd.
    5. Schakel de externe lamp voor het verlichten van het gezichtsveld. Selecteer een geschikte filteren op basis van de golflengte van de excitatie van de fluorescerende parels.
    6. Pas het imaging brandvlak naar de midplane van het vaartuig.
      Opmerking: Dit kan worden bereikt met behulp van een brandpuntsafstand die de verbeelde vaartuig dwarsdoorsnede maximaliseert (bijvoorbeeldbij gebruik van spoken met circulaire vaartuig kruissecties); en/of indexering off van een phantom functie ter vergemakkelijking van de identificatie van het vaartuig halverwege vlak.
  3. Video-opname
    1. Selecteer de video-opname-parameters voor het optimaliseren van de signaal-ruisverhouding (SNR). Sleutelparameters belichtingstijd, framesnelheid, omvatten en krijgen.
      Opmerking: In dit protocol gebruiken we een framesnelheid van 2.000 bps en een gain van 1.0. Echter, deze parameters kunnen variëren afhankelijk van de toepassing (Zie de sectie discussie voor nadere bijzonderheden).
    2. Verzamelen van de video en sla het in AVI-formaat.
  4. Phantom-opschonen
    1. Als parel-steken wordt waargenomen na een experiment, bewerk de phantom in een waterige schoonmaakmiddel bevoegdheden tot 70 W. met ultrasone trillingen ten

6. image Processing en Data-analyse

  1. Afbeelding voorbewerken
    1. Sleep het opgeslagen AVI-bestand naar het venster ImageJ te importeren. Het selectievakje gemarkeerd omzetten in grijswaarden.
    2. Selecteer in het menu ImageJ analyseren > Histogram genereren (of druk op Ctrl + H) voor het genereren van een histogram voor beeld pixel intensiteiten. Neem nota van het gemiddelde en de standaarddeviatie voor de onbewerkte afbeelding.
      Opmerking: Bij hoge frame rates, het is niet ongebruikelijk voor de distributie aan worden zwaar scheef naar nul (dat wil zeggen, geen signaal).
    3. Selecteer in het menu ImageJ Afbeelding > aanpassen > helderheid en Contrast (of druk op Shift + Ctrl + H) een helderheid/contrast filter wilt toepassen.
    4. De helderheid en het Contrast -menu, drukt u op de knop instellen om te bepalen van de grenzen van de afbeelding. Stel de minimale waarde als de gemiddelde waarde plus één standaarddeviatie en de maximumwaarde worden de maximale intensiteit van de afbeelding (beide gebaseerd op statistieken die zijn verkregen in stap 6.1.2).
      Opmerking: Dit meestal elimineert alle, maar de top 10% van de pixel intensiteiten. Het aantal standaarddeviaties kan variëren afhankelijk van de gewenste verdeling van de pixel intensiteiten. Een aangepaste macroscript voor het uitvoeren van de intensiteit aftopping operatie vindt u in de Aanvullende materialen.
    5. Selecteer in het menu ImageJ proces > Ruis > Despeckle te verminderen van het aantal verzadigde pixels.
      Opmerking: Deze operatie is noodzakelijk door de toegenomen potentieel voor verzadiging van de pixel die zich voordoet tijdens de optimalisatie van de helderheid en het contrast, die valse vectoren tijdens latere cross-correlatie produceren kan.
    6. Selecteer in het menu ImageJ proces > Filters > Gaussian Blur met een straal van 1,5 tot het verminderen van artefacten die voortvloeien uit de incidentele verwijdering van verlichte pixels in de buurt van een 3 x 3 door de voorafgaande despeckling werking.
    7. Klik op het vormgereedschap en klik op de afbeelding om een overzicht van de regio van belang (ROI).
    8. Selecteer in het menu ImageJ Bewerken > duidelijk buiten sensor ruis verwijderen op locaties waar geen signaal is verwacht (bijvoorbeeldgebieden buiten de grenzen van de muur vaartuig), die de totale SNR kan verminderen.
  2. PIV-berekening
    Opmerking: Dit gedeelte van het protocol maakt gebruik van een derde-partij PIV plug-in voor ImageJ, die berust op Gaussiaans piek-montage om een schatting van de verplaatsing met subpixel nauwkeurigheid.
    1. Selecteer in het menu ImageJ Plugins > macro's > uitvoeren... en ga naar de opgeslagen macro aanvullende Code 2. ijjm aan cross-correlaat opeenvolgende afbeelding paren.
      Opmerking: De macro wordt als volgt uitgevoerd. 1) een cross-correlatie van het veld van de intensiteit in opeenvolgende beelden is voor het eerst uitgevoerd om te bepalen van de lokale verplaatsing van advected tracer deeltjes (dat wil zeggen, het eerste beeld paar uit de eerste en tweede beelden, de tweede afbeelding paar bestaat bestaat uit de tweede en derde afbeeldingen, enz). 2) een tweestaps multipass evaluatie wordt vervolgens uitgevoerd met eerste en laatste ondervraging venstergrootten van 256 x 256 pixels en 128 x 128 pixels, respectievelijk. Ten slotte, 3) de macro uitvoert een temporele gemiddelde om te verder de verschijning van valse vectoren.
  3. Genormaliseerde mediaan test (NMT)
    1. Selecteer in het menu ImageJ Plugins > macro's > uitvoeren... en ga naar de opgeslagen macro aanvullende Code 3. ijjm voor het valideren van de snelheid velden via de genormaliseerde mediaan test.
      Opmerking: De macro wordt als volgt uitgevoerd. 1) elke vector in een momentane vectorveld is eerst in vergelijking met haar acht dichtstbijzijnde buren de mediane waarde te berekenen. 2) het aantal resterende fouten wordt dan berekend als het verschil tussen elke naburige vector en de berekende mediaan. 3) het verschil tussen de vector onderzochte en de mediane naburige vector waarde is dan genormaliseerd door de mediaan van de storingswaarden. 4) dit wordt vervolgens vergeleken met een drempelwaarde (meestal 0.2 pixels), die kan worden gevarieerd op basis van de a priori kennis van lawaai tijdens de Beeldacquisitie. Ten slotte 5) een temporele gemiddelde van alle gevalideerde momentane vectorvelden wordt uitgevoerd voor de productie van een samengestelde veld, zoals dit is aangetoond dat het verhogen van de vector veld kwaliteit24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figuur 2 illustreert het PDMS weefsel phantom fabricageproces. De spoken ontworpen hierin zijn bedoeld voor de studie van de stroming in de geïdealiseerde wide Rondbodemkolf, saccular, intracraniële aneurysmata, evenals proximale vertakkende perforator slagaders. Belangrijke extra ontwerp functies omvatten 1) een gemeenschappelijk reservoir dat alle vaartuigen afwateren in, om onbelemmerd vloeistof uitgang uit de musical The phantom - anders, druppel vorming kan optreden bij het kleinere schip afzetmogelijkheden; 2) een Waterventiel, op te heffen zeepbel; 3) een buitenste spouwmuur, om parallellisme van het schip met het horizontale vlak, alsmede een nauwkeurige definitie van het definitieve phantom plaat hoogte, lengte en breedte; 4) het gebruik van een schacht hypodermische naald 21 G (820 µm in nominale buitendiameter) voor de plinten van de perforator slagader, te wijten aan onze drukkerij onvermogen om te definiëren van dergelijke functies met voldoende trouw. Getrouwe reproductie van alle ontwerpfuncties wordt waargenomen in de gehele.

Representatieve resultaten van de karakterisering van een stroom PIV gebaseerde uitgevoerd met behulp van het huidige protocol worden gepresenteerd in Figuur 3 en Figuur 4. Deze studies werden uitgevoerd met behulp van phantom inlaat spuitsnelheid van 100 mL/min, data acquisitie-tarieven van 2.000 bps, en een tijdelijke gemiddeld over spanwijdten van 0,05 s. Figuur 3 toont representatieve afbeeldingsframes binnen de perforator slagader, voor en na intensiteit aftopping, evenals overeenkomstige oppervlakte percelen van de intensiteit van 8-bit pixelwaarden. Beide tonen aan dat de aftopping van de intensiteit aanzienlijk de definitie van de piek boven de noise-floor (d.w.z., verhoogt de SNR), wat cruciaal is verhoogt om de nauwkeurigheid bij het uitvoeren van latere cross-correlatie. Figuur 4 toont de gevolgen van de aftopping van de intensiteit en de NMT operaties op het vectorveld snelheid. Duidelijke verbetering in de uniformiteit van het veld wordt waargenomen, dus verder onderstrepen het belang van het maximaliseren van de SNR om te minimaliseren van gegevens dropout.

Figure 1
Figuur 1 : Particle image velocimetry set-up. Vertrouwen op een open-source beeldanalyse en een pre/postprocessing kader vermindert de aanvraag van de instrumentatie voor het meten van MESOSCHAAL stromen, waardoor de behoefte aan veel van de dure onderdelen van typische PIV-systemen (bijvoorbeeldgepulseerde Laser, synchronisatieroutine, cilindrische optica, en/of propriëtaire software). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2 : PDMS gebaseerde weefsel phantom Productie-procédé. De afbeeldingen illustreren (een) een CAD-model van de neurovasculaire phantom schimmel, (b) de afgedrukte ABS schimmel na de verwijdering van het dragermateriaal, (c) de casting en genezen van PDMS binnen de ABS-mal, (d) gedeeltelijke ontbinding van ABS schimmel materiaal en (e) de voltooide PDMS phantom, met de inzet toont de uiteindelijke afmetingen van kritische features en de regio van belang (ROI) in de slagader perforator waar de PIV-metingen werden verricht. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3 : Effect van de bewerking op de afbeelding SNR aftopping intensiteit. Deze panelen Toon representatieve afbeeldingsframes en de corresponderende pixel intensiteit oppervlakte percelen binnen de perforator slagader, (een en b) vóór en (c en d) na het toepassen van de intensiteit aftopping van de operatie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4 : Gevolgen van de aftopping van de intensiteit en de NMT operaties op snelheid vector velden. Deze panelen illustreren het vectorveld representatieve momentane snelheid binnen de slagader van de perforator afgeleid van (een) onbewerkte afbeeldingsgegevens, (b) de gegevens van de intensiteit-afgetopte, en (c) intensiteit-afgetopte data + NMT postprocessing . Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5 : Effect van ondervraging venster formaatgrepen op correlatie kwaliteit. Optimale venster grootte treedt op wanneer de waarde van de correlatiecoëfficiënt nul-genormaliseerd is gemaximaliseerd, en de standaarddeviatie is geminimaliseerd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het protocol beschreven hierin schetst een vereenvoudigde methode voor het uitvoeren van PIV studies om te visualiseren neurovasculaire op fysiologisch relevante afmetingen en stroom voorwaarden in vitro stroomt. Daarbij, dient het ter aanvulling van de protocollen die zijn gemeld door anderen en die ook gericht hebben op het vereenvoudigen van de kwantificering van vectorvelden, maar in zeer verschillende contexten die vereisen dat de behandeling van veel grotere lengte schalen25 of lagere stroom tarieven26,27 (b.v., atmosferische of microcirculatory stromen), en dus met een vertrouwen op regelingen die onverenigbaar met de huidige toepassing zijn.

De belangrijkste overwegingen voor de succesvolle tenuitvoerlegging van PIV liggen in de minimalisering van stroom veld artefacten en de maximalisatie van de beeldkwaliteit. Verschillende stappen in het weefsel phantom fabricageproces zijn cruciaal voor beide van deze criteria. Bijvoorbeeld, is grondige ontgassing van cruciaal belang aangezien lucht entrained binnen het PDMS tijdens het mengen kan leiden tot luchtbel vorming binnen het definitieve phantom, die nadelig zowel functie trouw en optische helderheid beïnvloeden kan. Bovendien, minimalisering van de oppervlakteruwheid van de ABS-schimmel is gewenst, aangezien de PDMS gietproces getrouwe weergave van zelfs de meest minuut onvolkomenheden (bijvoorbeeld, build lijnen, oppervlakte poriën, krassen), waardoor in oppervlakteruwheid in de definitieve phantom die kan optische helderheid te verkleinen en vergroten het potentieel voor kraal accumulatie. Terwijl het protocol hierin beschreven heeft bewezen voldoende voor de huidige toepassing, zijn er talrijke rapporten in de literatuur van middel om dergelijke ruwheid, te verminderen moet er nodig (b.v., aceton damp28 vloeiend te maken of de optimalisatie van laag dikte en deel oriëntatie ten aanzien van de richting van gebouw)29.

De selectie van de parameter voor het vastleggen van de video is ook cruciaal om ervoor te zorgen een hifi-vectorveld. Een optimale SNR wordt meestal bereikt met de hoogste haalbare beeldsnelheid waarmee nog voldoende kraal blootstelling (de maximale framesnelheid wordt beperkt door de minimale blootstellingstijd). Winst kan worden gebruikt om het signaal versterken, maar dit verhoogt ook lawaai van de sensor. Als de maximale snelheid kan worden geraamd van andere parameters van de stroom (b.v., inlaat volumetrisch debiet), kan vervolgens een ondergrens op de vereiste framesnelheid worden geschat met behulp van de volgende relatie30.

Equation 1(1)

Hier, fbemonstering is de camera acquisitie rate (Hz) vmax is het maximale verwachte snelheid (mm/s), ckalibratie is de kalibratie constant (pixels/mm), en hondervraging venster is de grootte van het venster van de ondervraging (pixels). Echter kan meer optimale waarde worden bepaald met behulp van zogenaamde correlatie kwaliteit schattingstechnieken, zoals de correlatiecoëfficiënt nul-genormaliseerd11. Bij deze techniek, zijn de gemiddelden van de aanvullende signalen van elk frame paar eerst afgetrokken en vervolgens door de standaarddeviatie van hun intensiteiten11genormaliseerd. Als een verplaatsing van het oorspronkelijke signaal bestaat, zodanig dat alle pieken en dalen overeenkomen met, zal de waarde van tijd-verschoven van dit signaal gelijk zijn aan één. Omgekeerd, als er geen verplaatsing die deze signalen kunt uitlijnen, zullen de waarde nul. Deze informatie is opgenomen in de ImageJ PIV-output voor elke vector, en het kan worden uitgezet als eigen veld moeten nagaan of er ruimtelijke effecten bij te dragen aan slechte correlatie (bijvoorbeeldongelijke verlichting). De correlatiecoëfficiënt kan ook worden gemiddeld over een veld als een globale raming op van haar kwaliteit. Deze hoeveelheid kan ten slotte ook worden afgeplot tegen de verschillende beeldsnelheden of ondervraging venstergrootten om een optimale. Figuur 5 illustreert de resultaten van een dergelijke analyse met behulp van een veld van het Monte Carlo-gesynthetiseerd deeltje met verplaatsingen conform onze experimenteel gemeten stromen (een typische techniek voor het karakteriseren van correlatie kwaliteit11 ). Uit de resultaten blijkt dat de ondervraging venster grootte en frame tarief worden zodanig gekozen moet dat een veld van het deeltje is verdreven door ≤ 20% van de ondervraging vensterformaat per frame paar de correlatiecoëfficiënt maximaliseren terwijl het minimaliseren van de variabiliteit.

Hoewel het protocol hierin beschreven heeft bewezen voldoende om te voldoen aan de behoeften van de huidige toepassing, is het belangrijk om te erkennen van zijn beperkingen. Bijvoorbeeld, terwijl contrast enhancement via intensiteit aftopping gemak van implementatie biedt, kunnen transformaties van de totale verdeling van pixel intensiteiten verbeteren de SNR verdere31. Evenzo, hoewel correlatie gebaseerde tracking is reeds lang gevestigd en voldoende resolutie biedt om eerste-orde flow eigenschappen relevant zijn voor de hemodynamica (bijvoorbeeld, intra-aneurysmal snelheid) betrouwbaar te schatten, andere technieken kunnen bieden een hogere ruimtelijke resolutie (bijvoorbeeldhybride PIV/PTV, kleinste kwadraten matching)32,33 , en dus grotere nauwkeurigheid bij het overwegen van de kenmerken die gevoeliger voor de snelheid veld resolutie zijn (bv , muur schuifspanning, in-plane vorticiteit). Ook, terwijl de NMT een middel biedt voor het verbeteren van de snelheid vectorveld na cross-correlatie, het is belangrijk om te benadrukken dat dit is slechts een van vele vector validatie technieken die gebruikt24,34, elk met worden kunnen hun eigen unieke voor- en nadelen die hun gebruik meer geschikt voor toepassingen buiten die hier beschreven kunnen maken. Tot slot, terwijl de experimentele opstelling hier beschreven tracht na te bootsen fysiologisch relevante debiet en lengte voor het neurovasculature weegtoestellen, het niet momenteel toe de analyse van Pulsatiele stromen. Dit is niet een beperking voor de huidige toepassing, sinds de nummers van de reeks van Womersley in een groot deel van de neurovasculature de neiging om ≤ 1 (dat wil zeggen, er is een minimale additief effect van meerdere cardiale cycli)35, die dat suggereert steady-state omstandigheden volstaan om te recapituleren discrete tijd punten langs de cardiale golfvorm waarin het debiet vergelijkbaar is. Echter, voor toepassingen waar het Womersley nummer groter (bijvoorbeeldtherapieën dichter naar het hart), wij voorzien een potentieel is voor de invoering van pulsatility met behulp van een Arduino, die kan worden gebruikt voor het verzenden van de pomp een PWM tijd-variërende spanning golfvorm waarmee het nabootsen van een cardiale stroom profiel36,37,38.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te verklaren.

Acknowledgements

De auteurs erkennen gedeeltelijke steun voor dit project geboden door een gezamenlijke zaad subsidie van het Bureau voor onderzoek en economischeontwikkeling op UC Riverside.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Solidworks 2015 Dassault Systems N/A CAD Software 
Dow Corning Sylgard 184 Kit Ellsworth Adhesive 184 SIL ELAST KIT 3.9KG PDMS Kit
Stratasys Dimension Elite Stratasys 9180-00105 3D printer
P430 Model Material Cartridge Stratasys 340-21202 ABS build material 
P400 SR Soluble Support Material Cartridge Stratasys 340-30200 Support material
CleanStation DT3 PM3 Technologies 00-00300R Base bath
Lindberg Blue M LGO Box Furnace  Thermo Scientific LB305745M Oven
21G BD PrecisionGlide Needle Betcon Dickenson BD 305167 Branching perforator mold segment
Desiccator (Vacuum) Polylab 55205 Desiccator
Branson 1800 Utrasonic Cleaning Branson CPX-952-116R Sonicator
Acetone Fisher Chemical A9494 Acetone
Isopropol Alcohol Fisher Chemical A4514 Isopropol Alcohol
Glycerol Fisher Chemical GW33500 Glycerol
10um Polystyrene Yellow-Green Fluorescent Particles Magsphere PSF-010UM Fluorescent beads
Phantom Miro  Vision Research Miro M310 High speed camera
Micropump Cole-Parmer 81101 Recirculating pump
Leica DM2000 Leica Microsystems DM2000 Fluorescent Microscope
Leica 10X Objective Leica Microsystems 506259 Objective for perforator
Leica 2.5X Objective Leica Microsystems 11506083 Objective aneurysm sac
Leica Blue Filter Cube L5 Leica Microsystems 513840 Blue filter cube
Leica EL6000 Leica Microsystems 11504115 Light source
Alconox Alconox Inc 1104-1 Detergent
ImageJ NIH N/A Open source image analysis software
https://imagej.nih.gov/ij/
Particle Image Velocimetry PIV Plugin Qingson Tseng N/A https://sites.google.com/site/qingzongtseng/piv

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Grant, I. Particle image velocimetry: A review. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part C: Journal of Mechanical Engineering Science. 211, (1), 55-76 (1997).
  2. Lindken, R., Rossi, M., Große, S., Westerweel, J. Micro-Particle Image Velocimetry (µPIV): Recent developments, applications, and guidelines. Lab on a Chip. 9, (17), 2551 (2009).
  3. Hove, J. R., et al. Intracardiac fluid forces are an essential epigenetic factor for embryonic cardiogenesis. Nature. 421, 172 (2003).
  4. Ando, J., Yamamoto, K. Vascular Mechanobiology. Circulation Journal. 73, (11), 1983-1992 (2009).
  5. Conway, D. E., et al. Fluid Shear Stress on Endothelial Cells Modulates Mechanical Tension across VE-Cadherin and PECAM-1. Current Biology. 23, (11), (2013).
  6. Kuhlencordt, P. J., et al. Accelerated Atherosclerosis, Aortic Aneurysm Formation, and Ischemic Heart Disease in Apolipoprotein E/Endothelial Nitric Oxide Synthase Double-Knockout Mice. Circulation. 104, (4), 448-454 (2001).
  7. Lieber, B. B., Stancampiano, A. P., Wakhloo, A. K. Alteration of hemodynamics in aneurysm models by stenting: Influence of stent porosity. Annals of Biomedical Engineering. 25, (3), 460-469 (1997).
  8. Bulusu, K. V., Plesniak, M. W. Experimental Investigation of Secondary Flow Structures Downstream of a Model Type IV Stent Failure in a 180° Curved Artery Test Section. Journal of Visualized Experiments. (113), e51288 (2016).
  9. Tseng, Q., et al. Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell-cell junction positioning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, (5), 1506-1511 (2012).
  10. Shavit, U., Lowe, R. J., Steinbuck, J. V. Intensity Capping: a simple method to improve cross-correlation PIV results. Experiments in Fluids. 42, (2), 225-240 (2007).
  11. Raffel, M., Willert, C. E., Werely, S., Kompenhans, J. Particle Image Velocimetry: a Practical Guide. Springer. New York, NY. (2007).
  12. Kerl, H. U., et al. Implantation of Pipeline Flow-Diverting Stents Reduces Aneurysm Inflow Without Relevantly Affecting Static Intra-aneurysmal Pressure. Neurosurgery. 74, (3), 321-334 (2014).
  13. Lieber, B. B., Livescu, V., Hopkins, L. N., Wakhloo, A. K. Particle Image Velocimetry Assessment of Stent Design Influence on Intra-Aneurysmal Flow. Annals of Biomedical Engineering. 30, (6), 768-777 (2002).
  14. Charonko, J., Karri, S., Schmieg, J., Prabhu, S., Vlachos, P. In vitro, time-resolved PIV comparison of the effect of stent design on wall shear stress. Annals of Biomedical Engineering. 37, (7), 1310-1321 (2009).
  15. Rand, P. W., Lacombe, E., Hunt, H. E., Austin, W. H. Viscosity of normal human blood under normothermic and hypothermic conditions. Journal of Applied Physiology. 19, (1), 117-122 (1964).
  16. Kenner, T., Leopold, H., Hinghofer-Szalkay, H. The continuous high-precision measurement of the density of flowing blood. Pflügers Archiv European Journal of Physiology. 370, (1), 25-29 (1977).
  17. Hoyt, L. F. New Table of the Refractive Index of Pure Glycerol at 20°C. Industrial & Engineering Chemistry. 26, (3), 329-332 (1934).
  18. Cai, Z., Qiu, W., Shao, G., Wang, W. A new fabrication method for all-PDMS waveguides. Sensors and Actuators A: Physical. 204, 44-47 (2013).
  19. Bouillot, P., et al. Particle imaging velocimetry evaluation of intracranial stents in sidewall aneurysm: hemodynamic transition related to the stent design. PloS ONE. 9, (12), 113762 (2014).
  20. Trager, A. L., Sadasivan, C., Lieber, B. B. Comparison of the in vitro hemodynamic performance of new flow diverters for bypass of brain aneurysms. Journal of Biomechanical Engineering. 134, (8), 084505 (2012).
  21. Clauser, J., et al. A Novel Plasma-Based Fluid for Particle Image Velocimetry (PIV): In-Vitro Feasibility Study of Flow Diverter Effects in Aneurysm Model. Annals of Biomedical Engineering. 46, (6), 841-848 (2018).
  22. Johnston, I. D., McCluskey, D. K., Tan, C. K. L., Tracey, M. C. Mechanical characterization of bulk Sylgard 184 for microfluidics and microengineering. Journal of Micromechanics and Microengineering. 24, (3), 035017 (2014).
  23. Lee, J. N., Park, C., Whitesides, G. M. Solvent Compatibility of Poly(dimethylsiloxane)-Based Microfluidic Devices. Analytical Chemistry. 75, (23), 6544-6554 (2003).
  24. Meinhart, C. D., Wereley, S. T., Santiago, J. G. A PIV Algorithm for Estimating Time-Averaged Velocity Fields. Journal of Fluids Engineering. 122, (2), 285 (2000).
  25. Bosbach, J., Kühn, M., Wagner, C., Raffel, M., Resagk, C. Large-Scale Particle Image Velocimetry of Natural and Mixed Convection. 13th Int Symp on Applications of Laser Techniques to Fluid Mechanics. (2006).
  26. Meinhart, C. D., Wereley, S. T., Santiago, J. G. PIV measurements of a microchannel flow. Experiments in Fluids. 27, (5), 414-419 (1999).
  27. Lima, R., et al. In vitro blood flow in a rectangular PDMS microchannel: experimental observations using a confocal micro-PIV system. Biomedical Microdevices. 10, (2), 153-167 (2008).
  28. Kuo, C. -C., Mao, R. -C. Development of a Precision Surface Polishing System for Parts Fabricated by Fused Deposition Modeling. Materials and Manufacturing Processes. 31, (8), 1113-1118 (2016).
  29. Kang, K., Oh, S., Yi, H., Han, S., Hwang, Y. Fabrication of truly 3D microfluidic channel using 3D-printed soluble mold. Biomicrofluidics. 12, (1), 014105 (2018).
  30. Prasad, A. K. Particle Image Velocimetry. Current Science. 79, (1), 51-60 (2000).
  31. Dellenback, P. A., Macharivilakathu, J., Pierce, S. R. Contrast-enhancement techniques for particle-image velocimetry. Applied Optics. 39, (32), 5978-5990 (2000).
  32. Cowen, E. A., Monismith, S. G. A hybrid digital particle tracking velocimetry technique. Experiments in Fluids. 22, (3), 199-211 (1997).
  33. Gruen, A. W. Adaptive least squares correlation: a powerful image matching technique. South African Journal of Photogrammetry, Remote Sensing and Cartography. 14, (3), 175-187 (1985).
  34. Nogueira, J., Lecuona, A., Rodríguez, P. A. Data validation, false vectors correction and derived magnitudes calculation on PIV data. Measurement Science and Technology. 8, (12), 1493-1501 (1997).
  35. Loudon, C., Tordesillas, A. The Use of the Dimensionless Womersley Number to Characterize the Unsteady Nature of Internal Flow. Journal of Theoretical Biology. 191, (1), 63-78 (1998).
  36. Drost, S., De Kruif, B. J., Newport, D. Arduino control of a pulsatile flow rig. Medical Engineering and Physics. 51, 67-71 (2017).
  37. Tsai, W., Savaş, Ö Flow pumping system for physiological waveforms. Medical & Biological Engineering & Computing. 48, (2), 197-201 (2010).
  38. Kato, T., et al. Contrast-enhanced 2D cine phase MR angiography for measurement of basilar artery blood flow in posterior circulation ischemia. American Journal of Neuroradiology. 23, (8), 1346-1351 (2002).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics