Meso-skala partikel billede Velocimetri undersøgelser af neurovaskulære strømme In Vitro

* These authors contributed equally
Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Her præsenterer vi forenklede metoder til opdigte gennemsigtig neurovaskulære phantoms og kendetegner strømmen deri. Vi fremhæve flere vigtige parametre og vise deres forhold til feltet nøjagtighed.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Peck, R. A., Bahena, E., Jahan, R., Aguilar, G., Tsutsui, H., Princevac, M., Wilhelmus, M. M., Rao, M. P. Meso-Scale Particle Image Velocimetry Studies of Neurovascular Flows In Vitro. J. Vis. Exp. (142), e58902, doi:10.3791/58902 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Partikel billede Velocimetri (PIV) bruges i en lang række felter, på grund af mulighed for giver netop visualisere og kvantificere strømme på tværs af et stort spatiotemporelle område. Dets gennemførelse kræver dog typisk brug af dyre og specialiserede instrumentering, som begrænser dens bredere nytte. Desuden inden for bioteknologi, in vitro- flow visualisering undersøgelser er også ofte yderligere begrænset af de høje udgifter til kommercielt producerede væv phantoms, at sammenfatte ønskede anatomiske strukturer, især for dem, der span mesoscale regime (dvs., submillimeter til millimeter længdeskalaer). Heri, præsenterer vi en forenklet eksperimentel protokol udviklet til at håndtere disse begrænsninger, de centrale elementer som omfatter 1) en relativt billig metode til at opdigte mesoscale væv phantoms ved hjælp af 3D-udskrivning og silikone støbning, og 2) et Open-source image analyse og behandling ramme, der reducerer efterspørgslen efter instrumenterne til måling af mesoscale flow (dvs., hastigheder op til ti millimeter/sekund). Kollektivt, sænker det adgangsbarriere for nonexperts, ved at udnytte ressourcer allerede til rådighed for mange bioteknologi forskere. Vi demonstratethe anvendeligheden af denne protokol inden for rammerne af neurovaskulære flow karakterisering; Det forventes dog at være relevante for en bredere vifte af mesoscale programmer i bioteknologi og videre.

Introduction

PIV er meget udbredt i eksperimentel fluid mekanik til flow visualisering og kvantitative undersøgelser af glidende bevægelser, der varierer i længde skala fra atmosfæriske microcirculatory strømme1,2,3. Mens de nærmere enkeltheder i dets gennemførelse kan variere så bredt som dens applikationer, er et aspekt fælles for næsten alle PIV undersøgelser brugen af video billeddannelse af tracer partikler seedede inden for arbejdsvæsken, efterfulgt af en parvise analyse af sammenhængende billedrammer at udvinde ønskede flydeegenskaber. Dette opnås typisk ved første inddele hver billedramme i mindre regioner kaldes forhør windows. Som følge af de spredte partikler tilfældige holdninger indeholder hver forhør vindue en entydig fordeling af pixel intensiteter. Hvis vinduet størrelse og data erhvervelse sats er valgt korrekt, kan cross-korrelation af intensitet signal i hvert vindue bruges til at estimere den gennemsnitlige forskydning inden for dette område. Endelig, at forstørrelse og framerate er kendt eksperimentelle parametre, en øjeblikkelige hastighed vektor felt kan let beregnes.

En stor fordel af PIV over single-point måleteknikker er dens evne til at knytte vektorfelter på tværs af et to - eller tre - dimensionelle domæne. Hæmodynamiske programmer, især har nydt godt af denne evne, da det giver mulighed for en grundig undersøgelse af lokale strømme, der er kendt for at spille en væsentlig rolle i vaskulær sygdom eller remodellering (fx, åreforkalkning, angiogenese) 4 , 5 , 6. dette har også været tilfældet for evaluering af neurovaskulære strømme, og interaktioner heraf med Intravaskulært udstyr (f.eks.flow omdirigeringsmaskiner stenter, og intrasaccular spoler), siden de relevante længdeskalaer i sådanne ansøgninger kan strækker sig over ofte en eller flere ordrer størrelsesorden (f.eks.fra mikrometer til millimeter), og enheden geometri og placering kan betydeligt påvirke den lokale fluid mekanik7.

De fleste grupper PIV-baserede hæmodynamiske undersøgelser har stolet på eksperimentelle opstillinger, der nøje efterligner nogle af de tidligste undersøgelser af stent indflydelse på vaskulære flow7,8. Typisk, disse omfatter en) impuls lasere og højhastigheds kameraer til at fange høj hastighed strømme; b) Synchronizere, at forhindre aliasing mellem puls hyppigheden af laser og kamera erhvervelse frame rate; c) cylindrisk optik, danner en lys plade og dermed minimere baggrund fluorescens fra tracer partikler over og under forhør fly; d) i kommercielle nøglefærdige systemer, proprietære software-pakker til at udføre Kors-sammenhæng-analyser. Dog mens nogle programmer kræver ydeevne og/eller alsidighed kollektivt som disse komponenter, mange andre gør ikke. Desuden, den høje pris på kommercielt producerede væv phantoms at sammenfatte ønskede vaskulære strukturer kan også bevise begrænsning for mange in vitro- undersøgelser, navnlig for spøgelser med funktioner denne bro mesoscale regime (> 500 USD / Phantom). Heri, rapporterer vi udviklingen af en forenklet protokol for at gennemføre PIV til in vitro- visualisering af neurovaskulære strømme, der typisk ligger både rumligt og tidsligt inden for mesoscale regimet (dvs.længdeskalaer spænder fra submillimeter til millimeter, og hastigheder op til ti millimeter/sekund). Protokollen har til formål at udnytte ressourcerne allerede til rådighed for mange bioteknologi forskere, hvilket vil mindske adgangsbarriere for nonexperts.

Det første element i denne protokol indebærer anvendelse af en investering støbning teknik hen til muliggøre den in-house fabrikation af gennemsigtige, Polydimethylsiloxan (PDMS)-baseret væv phantoms fra udskrives 3 3-d opoffrende forme. Ved at udnytte den øgede tilgængelighed af 3D-printere i de seneste år, navnlig i delt/multi-multi-user faciliteter (f.eks., institutionelle faciliteter eller offentlige makerspaces), denne metode skærer omkostningerne betydeligt (f.eks.< 100 USD/phantom i tilfælde præsenteres her), samtidig med at en hurtig ekspeditionstid til fremstilling af en bred vifte af designs og geometrier. I den nuværende protokol, et sammenvokset deposition modellering system bruges med acrylonitril butadien styren (ABS) som byggemateriale og den udskrevne del fungerer som en opoffrende mold til de efterfølgende phantom støbning. Vores erfaring har vist at ABS er velegnet til sådan anvendelse, da det er opløseligt i fælles opløsningsmidler (fx, acetone), og det har tilstrækkelig styrke og stivhed til at opretholde skimmel integritet efter fjernelse af support-materiale (f.eks., at forhindre deformation eller brud på diminutive skimmel funktioner). I den nuværende protokol, er skimmel integritet yderligere sikret ved hjælp af solid trykte modeller, selv om det kommer på bekostning af øget opløsning tid. Brugen af hule modeller kan også være muligt i nogle tilfælde, at forbedre opløsningsmiddel adgang, og således reducere opløsningen tid. Dog forsigtig bør overvejes om, at dette kan have på mug integritet. Endelig, mens phantoms fabrikeret heri er baseret på idealiserede repræsentationer af neurovaskulære strukturer genereret ved hjælp af en fælles computerstøttet design (CAD) programmel pakke, protokollen er forventes at være modtagelig til fabrikation af mere komplekse , patient-specifikke geometrier samt (f.eks. via brugen af modelfiler genereret af kliniske billeddiagnostiske data til konvertering af. STL filformat, der bruges af de fleste 3D-printere). Yderligere detaljer vedrørende fantom fabrikationsproces er fastsat i punkt 2 i protokollen.

Det andet element i protokollen indebærer anvendelse af en open-source plug-in for ImageJ at gennemføre cross-korrelation analyser9. Dette er kombineret med gennemførelsen af en simple statistiske tærskel ordning (i.e., intensitet capping)10 at forbedre billedet signal forud for Kors-sammenhæng, samt en postcorrelation vektor efterprøvelse ordning, den normaliserede Median test (NMT), at fjerne spurious vektorer gennem en sammenligning af hver til sin nærmeste naboer11. Kollektivt, giver dette imaging at være udført ved hjælp af udstyr, der er almindeligt forekommende i mange laboratorier, bioteknologi, hvilket eliminerer behovet for erhvervelse af mange af de dyre komponenter af typiske PIV-systemer (fx, pulserende laser, Synchronizer, cylindrisk optik, og proprietær software). Yderligere detaljer vedrørende videosamling, billedbehandling og analyse af data er fastsat i afsnit 5 og 6 i protokollen.

Figur 1 illustrerer PIV set-up bruges i denne protokol, som er afhænger af et fluorescens mikroskop udstyret med en høj hastighed kamera til billedbehandling, samt en ekstern, kontinuerlig hvid-lyskilde (dvs., metalhalogen lampe) for gennem mål volumetriske belysning. En variabel hastighed gear pumpe bruges til at indføre en gennemsigtig mock blod løsning gennem neurovaskulære væv phantoms recirkulerende strømmen. Løsningen består af en 60: 40 blanding af deioniseret (DI) vand og glycerol, som er en fælles erstatning for blod i hæmodynamiske undersøgelser12,13,14, skyldes en) dens lignende tæthed og viskositet (dvs., 1,080 kg/m3 og 3,5 cP vs 1.050 kg/m3 og 3-5 cP for blod)15,16; b) dens gennemsigtighed i det synlige spektrum; c) dens tilsvarende brydningsindeks som PDMS (1,38 vs 1.42 til PDMS)17,18,19,20, som minimerer optisk forvrængning; d) den lethed, hvormed der kan indføres ikke-newtonske adfærd, hvis det er nødvendigt, via tilføjelsen af xanthane21. Endelig, fluorescerende polystyren perler er brugt som tracer partikler (10,3 µm i diameter, 480 nm/501 nm excitation/emission). Mens neutralt livlig perler er ønsket, kan sourcing tracer partikler med optimal flydende mekaniske egenskaber (f.eks.massefylde, størrelse, sammensætning) og emission bølgelængde blive en udfordring. For eksempel, er Perlerne anvendes heri lidt mindre tætte end glycerol løsning (1.050 kg/m3 vs 1,080 kg/m3). Dog de hydrodynamiske virkninger heraf, er ubetydelig, idet varigheden af en typisk eksperiment er langt kortere end tidshorisonten tilknyttet opdrift effekter (dvs., 5 min og 20 min, henholdsvis). Yderligere er detaljer vedrørende mock blod løsning formulering og in vitro- kredsløbssygdomme set-up fastsat i afsnit 3 og 4 i denne protokol.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ABS-baserede opoffrende skimmel fabrikation

  1. Designe en invers model af ønskede væv fantomet ved hjælp af CAD-software.
  2. Udskrive den model, ved hjælp af en 3D-printer med ABS som byggemateriale.

2. PDMS-baserede vaskulære Phantom fabrikation

  1. Blanding
    1. Bland PDMS prepolymer base og hærder i forholdet 10:1 (efter vægt); en 66 g blanding giver tilstrækkeligt materiale til fabrikation af spøgelser med mængder op til 50 cm3.
    2. Placer blandingen i et vakuum ekssikkator til 60 min til degas og minimere boble entrapment. Bruge cyklisk opretholdelse tryk i hovedbrandledningssystemet/trykreduktion for at lette boble brud.
  2. Støbning
    1. Montere den trykte ABS mug på et glas dias ved hjælp af støbning putty for at forsegle grænsefladen.
    2. Omhyggeligt hæld PDMS blandingen i formen under forsøg på at minimere boble entrapment. Dvælende bobler kan være bristede manuelt ved hjælp af en nål.
    3. Helbrede stemmer phantom ved stuetemperatur (25 ° C) i mindst 24 timer.
      Bemærk: Ved højere temperaturer, denne proces kan blive fremskyndet22.
  3. Demolding
    1. Opløses ABS ved nedsænkning phantom i acetone og sonicating i mindst 15 min., ved hjælp af beføjelser op til 70 W.
      Forsigtig: Acetone har et højt damptryk ved stuetemperatur og et lavt flammepunkt. Derfor arbejde altid under et stinkskab og væk fra mulige antændelseskilder. Bære passende personlige værnemidler (f.eks., beskyttelsesbriller eller face shield, laboratoriekittel, acetone-resistente handsker).
    2. Grundigt skylle phantom med isopropylalkohol og derefter DI vand for at fjerne opløsningsmiddel restkoncentrationer.
      Bemærk: PDMS svulmer ved udsættelse for acetone; men hævelsen aftager når phantom er skyllet og tørret tilstrækkeligt23.
  4. Bekræftelse af phantom troskab ved hjælp af Optisk mikroskopi
    1. Ved hjælp af en optisk mikroskop med vedlagte kamera og image capture software, hente en afbildning af en kritisk funktion inden for phantom under en forstørrelse, der maksimerer funktionen inden for synsfeltet.
    2. Hent en afbildning af en passende kalibrering reticle på samme forstørrelse.
    3. Læg både billeder i ImageJ ved at trække dem til værktøjslinjen.
    4. Klik på kalibrering reticle billedet for at gøre det aktivt, og vælg derefter værktøjet streg . Ved hjælp af musen, trække en linje langs en funktion af en kendt distance, og vælg Analyze > angive skala fra menuen ImageJ.
      Bemærk: I vinduet Sat skala feltet mærket afstanden i pixel skal være forudfyldt med længden af den tegnede linje i enheder af pixels.
    5. Angiv længden af funktionen i feltet mærket Kendt afstandog dets enhed i feltet mærket Enhed af længde. Markere afkrydsningsfeltet Global for at anvende denne kalibreringsfaktor på alle åbne billeder.
    6. Gøre billedet af de fantom kritiske funktion aktiv og brug værktøjet streg til at tegne en linje langs en funktion af interesse. Vælg menuen ImageJ Analyze > foranstaltning (eller tryk på Ctrl + M) til at måle længden af linjen.
    7. Undersøg den forventede værdi mod værdien i kolonnen markeret længde i resultatvinduet for at bekræfte phantom troskab.

3. mock blod løsning formulering

  1. Bland DI vand og glycerol i forholdet 60: 40 (efter volumen).
    Bemærk: Et 100 mL volumen er tilstrækkelig til i vitro kredsløbssygdomme beskrevet heri.
  2. Der tilsættes 1 mL af 2,5% w/v fluorescerende polystyren perle løsning (dvs., tracer partikler) til mock blod løsning.
  3. Rystes blandingen på en magnetisk røre pladen på 400 rpm i 10 min.

4. in Vitro kredsløbssygdomme Set-up

  1. Pumpe set-up
    1. Bruge en wire stripper værktøj for at afskære DC-end stikket fra AC til DC adapter strømkilde.
    2. Strip belægning slukke for strømmen og jorden ledninger og forbinde dem til indgangsterminal af pulse bredde modulation (PWM) spændingsregulator.
    3. Tilslut power og jorden ledningerne fra pumpens DC motor til output terminal af PWM spændingsregulator.
      Bemærk: Den PWM syv-segment display output normeret maksimalydelse (0% - 100%) anvendes til at opnå en variabel spænding til DC-motor.
  2. Pumpe kalibrering
    1. Forberede 200 mL af mock blod løsning (Se afsnit 3).
    2. Placere slangen fra pumpeindgangen til bægerglasset holding mock blod løsning.
    3. Placere slangen fra pumpen outlet til en tom bægerglas.
    4. Vælg en ønskede duty cycle sætpunkt (0% - 100%). Tryk på knappen og starter en timer.
    5. Stop tidtager, når pumpen har overført den hele mængden af mock blod løsning. Bruge denne tid til at beregne den volumetriske strømningshastighed.
    6. Gentag trin 4.2.1 - 4.2.5 til mindst fem forskellige duty cycle sæt punkter at etablere en mindste kvadraters regression kurve.
      Bemærk: Et minimum af tre Repliker point per duty cycle sætpunktet anbefales. Dette forhold kan bruges til at korrelere de ønskede strømningshastighed til den krævede PWM normeret maksimalydelse.

5. videosamling

  1. Billede kalibrering
    1. Bestemme kalibrering forholdet til den video imaging (Se afsnit 2).
  2. Apparater set-up
    1. Placer PDMS phantom på scenen af fluorescens mikroskop.
    2. Tilsluttes tandhjulspumpe phantom og indføre mock blod løsning.
      Bemærk: Du kan eventuelt Forudfyld model med ethanol til lette fuld befugtning; derefter skylle og fylde det med mock blod løsning. Dette kan være særligt gavnligt for modeller med mindre fartøjer og/eller blind funktioner.
    3. Indstil pumpen motor controller til den ønskede flow baseret på kalibreringskurven pumpe.
    4. Kør pumpen i 1-5 min. før eksperiment at sikre steady-state-betingelser.
    5. Tænd den eksterne lampen til at belyse synsfelt. Vælg en passende filter baseret på excitation boelgelaengden de fluorescerende perler.
    6. Justere imaging brændplanet at fartøjet midplane.
      Bemærk: Dette kan opnås ved hjælp af en brændvidde, der maksimerer afbildet fartøj tværsnit (f.eks., når du bruger phantoms med cirkulær fartøj tværsnit); og/eller indeksering af et fantom funktion designet til at lette identifikationen af fartøjet midten flyet.
  3. Video optagelse
    1. Vælg video optagelse parametre til at optimere signal-støj-forhold (SNR). Vigtige parametre omfatter eksponeringstid, billedfrekvens, og vinde.
      Bemærk: I denne protokol, vi bruger en rammehastighed på 2.000 fps og en gevinst på 1,0. Disse parametre kan dog variere baseret på ansøgningen (Se afsnittet diskussion for yderligere detaljer).
    2. Indsamle videoen og gemme det i AVI-format.
  4. Phantom oprydning
    1. Hvis perle-stikning er observeret efter et eksperiment, der sonikeres phantom i en vandig opløsning, ved hjælp af beføjelser op til 70 W.

6. billede behandling og analyse af Data

  1. Billede forbehandling
    1. Træk den gemte AVI fil til vinduet ImageJ importere den. Marker feltet mærket konvertere til gråtoner.
    2. Vælg menuen ImageJ Analyze > generere Histogram (eller tryk på Ctrl + H) til at generere et histogram for billedet pixel intensiteter. Tage til efterretning af middelværdi og standardafvigelse for uforarbejdede billedet.
      Bemærk: På høj billedhastighed, det er ikke usædvanligt for distribution til at være skæv stærkt mod nul (dvs., intet signal).
    3. Vælg menuen ImageJ Image > Adjust > lysstyrke og kontrast (eller tryk på Skift + Ctrl + H) til at anvende et filter, lysstyrke/kontrast.
    4. Tryk på knappen sæt til at definere billede grænser i menuen lysstyrke og kontrast . Angiv minimumværdien gennemsnitsværdien plus én standardafvigelse og den maksimale værdi til at være den maksimale intensitet af billedet (begge baseret på statistik indhentet i trin 6.1.2).
      Bemærk: Dette typisk eliminerer alle, men de øverste 10% af intensiteterne for pixel. Antallet af standardafvigelser kan varieres afhængigt af den ønskede distribution af pixel intensiteter. En brugerdefineret makroscript til at udføre intensiteten loft operation er fastsat i Supplerende materialer.
    5. Vælg menuen ImageJ processen > Støj > Despeckle til at reducere antallet af mættede pixels.
      Bemærk: Denne operation er nødvendiggjort af den øgede potentiale for pixel mætning, der opstår under optimering af lysstyrke og kontrast, som kan producere falske vektorer under efterfølgende Kors-sammenhæng.
    6. Vælg menuen ImageJ processen > filtre > Gaussian Blur med en radius på 1,5 til reducere artefakter som følge af den lejlighedsvise fjernelse af lysende pixel i et 3 x 3 kvarter af forudgående despeckling operation.
    7. Klik på værktøjet Polygon , og klik derefter på billedet for at skitsere regionen af interesse (ROI).
    8. Vælg menuen ImageJ Rediger > klar udenfor at fjerne sensor støj i steder hvor intet signal er forventet (fxområder uden fartøj væggen grænsen), der kan reducere den samlede SNR.
  2. PIV beregning
    Bemærk: Denne del af protokollen beskæftiger en tredjeparts-PIV plug-in for ImageJ, som er afhænger af Gaussisk peak-montering at muliggøre en vurdering af fordrivelse med subpixel nøjagtighed.
    1. Vælg menuen ImageJ Plugins > makroer > køre... og navigere til de gemte makro supplerende kode 2. ijjm til cross-korrelat successive billede par.
      Bemærk: Makroen provenuet som følger. 1) en cross-korrelation af feltet intensitet i på hinanden følgende billeder er først udføres for at bestemme den lokale forskydning af ind tracer partikler (dvs, den første billede par består af de første og anden billeder, det andet billede par består af andet og tredje billeder, osv.). 2) en to-trins multipass evaluering er derefter udført med indledende og afsluttende forhør vinduesstørrelser 256 x 256 pixels og 128 x 128 pixel, henholdsvis. Endelig, 3) makroen udfører en tidsmæssig gennemsnit for yderligere at reducere forekomsten af falske vektorer.
  3. Normaliserede median test (NMT)
    1. Vælg menuen ImageJ Plugins > makroer > køre... og navigere til de gemte makro supplerende kode 3. ijjm at validere velocity felter via den normaliserede median test.
      Bemærk: Makroen provenuet som følger. 1) hver vektor i en øjeblikkelig vektor felt er først i forhold til sine otte nærmeste naboer til at beregne middelværdien. 2) vifte af resterende fejl beregnes som forskellen mellem hver nærliggende vektor og den beregnede median. 3) forskellen mellem vektor under undersøgelsen og den nærliggende vektor middelværdien er derefter normaliseret af medianen af residualerne. 4) Dette er derefter sammenlignet med en tærskelværdi (typisk 0,2 pixels), som kan varieres baseret på forhånd viden om støj under image erhvervelse. Endelig, 5) en tidsmæssig gennemsnittet af alle validerede øjeblikkelige vektorfelter er udført for at producere et sammensat felt, som det har vist sig at øge vektor felt kvalitet24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 2 illustrerer PDMS væv phantom opdigte oparbejde. De phantoms designet heri er beregnet til studiet af flow i idealiseret wide-hals, saccular, intrakranielle aneurismer, samt proksimale forgrening perforator arterier. Vigtigt yderligere design funktioner omfatter 1) en fælles reservoir, som alle fartøjer, der flyder ind i, for at sikre uhindret væske afstigning fra phantom - ellers droplet-dannelse kan forekomme på de mindre fartøj forretninger; 2) en boble fælde, at lette boble fjernelse; 3) en ydre hulrum væg, at sikre parallelisme fartøj med det vandrette plan, samt en præcis definition af de endelige phantom plade højde, længde og bredde; 4) anvendelse af en 21 G kanyle skaft (820 µm i nominel udvendig diameter) til støbning af perforator arterie, på grund af vores printerens evne til at definere sådanne funktioner med tilstrækkelig præcision. Trofaste gengivelse af alle designfunktioner er observeret i hele.

Repræsentative resultater af en PIV-baserede flow karakteristik udføres ved hjælp af den nuværende protokol er præsenteret i figur 3 og figur 4. Disse undersøgelser blev udført ved hjælp af phantom inlet strømningshastigheder 100 mL/min., erhvervelse datahastigheder på 2.000 fps, og en tidsmæssig gennemsnit over spænder af 0,05 s. figur 3 viser repræsentativt billedrammer perforator arterie, før og efter intensitet udjævningen, samt tilsvarende overflade parceller af intensitet 8-bit pixelværdier. Begge viser, at intensiteten udjævningen øger peak definitionen ovenfor støj gulvet (dvs., øger SNR), som er kritiske for at sikre nøjagtighed, når du udfører efterfølgende Kors-sammenhæng. Figur 4 viser virkningerne af intensitet udjævningen og NMT operationer på feltet velocity vektor. Markant forbedring i feltet ensartethed er observeret, således yderligere understregning af betydningen af maksimering SNR for at minimere data frafald.

Figure 1
Figur 1 : Partikel billede Velocimetri set-up. Tillid til en open source billedanalyse og en pre/efterbehandling rammerne reducerer efterspørgslen efter instrumenterne til måling af mesoscale flow, hvilket eliminerer behovet for mange af de dyre komponenter af typiske PIV systemer (f.eks.pulserende laser, synchronizer, cylindrisk optik, og proprietær software). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : PDMS-baserede væv phantom fabrikationsproces. Billederne illustrere (en) en CAD model af den neurovaskulære phantom mold, (b) den trykte ABS skimmel efter fjernelse af støttemateriale, (c) støbning og hærdning af PDMS inden for ABS skimmel, (d) delvis opløsning af ABS mold materiale, og (e) den udfyldte PDMS fantom, med inset viser de endelige dimensioner af kritiske funktioner, samt region af interesse (ROI) i arteria perforator hvor PIV målingerne er foretaget. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Effekt af intensiteten loft operation på billedet SNR. Disse paneler viser repræsentative billedrammer og de tilsvarende pixel intensitet overflade parceller inden forde perforator arterie, (og b) før og (c og d) efter anvender intensiteten loft operation. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : Virkningerne af intensitet udjævningen og NMT operationer på velocity vektor felter. Disse paneler illustrere repræsentative øjeblikkelige hastighed vektor felt inden for perforator arterie stammer fra (en) ubehandlede billeddata, (b) intensitet-udjævnede data, og (c) intensitet-udjævnede data + NMT efterbehandling . Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 : Effekt af forhør vindue dimensionering på korrelation kvalitet. Optimal vindue dimensionering opstår, når værdien af korrelationskoefficienten nul-normaliseret er maksimeret og standardafvigelsen er minimeret. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollen beskrevet heri skitserer en forenklet metode til at udføre PIV undersøgelser for at visualisere neurovaskulære flyder på fysiologisk relevante dimensioner og flow betingelser in vitro. Dermed, tjener det til at supplere protokoller rapporteret af andre, der har også fokuseret på at forenkle kvantificering af vektorfelter, men i meget forskellige sammenhænge, der kræver overvejelse af langt større længde skalaer25 eller lavere flow satser26,27 (fx, atmosfæriske eller microcirculatory strømme), og således med en tillid til ordninger, der er uforenelig med det aktuelle program.

De vigtigste overvejelser i forbindelse med den vellykkede gennemførelse af PIV ligge i minimering af flow felt artefakter og maksimering af billedkvaliteten. Flere trin i væv phantom opdigte oparbejde er vigtige for begge disse kriterier. For eksempel, er grundig afgasning afgørende, da luften medrives i PDMS under blanding kan føre til boble dannelse inden for den endelige phantom, som kan påvirke både funktion troskab og optisk klarhed. Derudover minimering af overfladeruhed ABS skimmelsvamp ønskes, da PDMS trykstøbning proces trofast gengiver selv de mest minut skønhedsfejl (f.eks.bygge linjer, overfladen porerne, ridser), hvilket resulterer i overfladeruhed i den endelige phantom, der kan mindske optisk klarhed og øge potentialet for perle ophobning. Mens protokollen beskrevet heri har vist sig tilstrækkeligt for det aktuelle program, der er talrige rapporter i litteratur fra middel til at mindske sådanne ruhed, bør ethvert behov (fx, acetone vapor gulvafslibning28 eller den optimering af lag tykkelse og en del orientering med hensyn til retningen bygning)29.

Valg af parameter for videooptagelse er også afgørende for at sikre en high-fidelity vektor. En optimal SNR opnås typisk på højeste opnåelige frame rate, der stadig giver mulighed for tilstrækkelig perle eksponering (den maksimale frame rate er begrænset af den mindste eksponeringstid). Gevinst kan bruges til at forstærke signalet, men det øger også sensor støj. Hvis den maksimale hastighed kan estimeres ud fra andre flow parametre (f.eks., indløb volumenstrøm rate), kan være anslået en nedre grænse på kræves framerate under de følgende relation30.

Equation 1(1)

Her, fprøveudtagning er kamera erhvervelse sats (Hz), vmax er den maksimale forventede hastighed (mm/s), ckalibrering er kalibrering konstant (pixels/mm), og hforhør vindue er størrelsen af vinduet forhør (pixels). Dog kan mere optimale værdier bestemmes ved hjælp af såkaldte korrelation kvalitet skøn teknikker, såsom nul-normaliseret korrelationskoefficienten11. I denne teknik, er gennemsnit af supplerende signaler fra hver frame par først trækkes og derefter normaliseret af standardafvigelsen af deres intensitet11. Hvis en forskydning af det oprindelige signal findes, sådan at alle toppe og dale match, vil tidsforskudte værdien af dette signal være lig med en. Omvendt, hvis der er nogen forskydning, som kan bringe disse signaler, vil værdien være nul. Denne information er indeholdt i ImageJ PIV output for hver vektor, og det kan være afbildet som sit eget felt til at kontrollere, om der er rumlig effekter bidrager til dårlig sammenhæng (f.eks.ujævn belysning). Korrelationskoefficienten kan også være et gennemsnit over et felt som et samlet skøn over dens kvalitet. Denne mængde kan endelig også afbildes mod varierende billedhastigheder eller forhør rude størrelser til at bestemme en optimal. Figur 5 illustrerer resultaterne fra en sådan analyse, ved hjælp af en Monte Carlo-syntetiseret partikel felt med forskydninger i overensstemmelse med vores eksperimentelt målte strømme (en typisk teknik til kendetegner korrelation kvalitet11 ). Resultaterne viser, at forhør vinduet størrelse og frame rate skal vælges således, at en partikel felt er fordrevet af ≤ 20% af forhør vinduesstørrelse pr. ramme par at maksimere korrelationskoefficienten samtidig minimere dens variation.

Selv om protokollen beskrevet heri har vist sig tilstrækkelig til at imødekomme behovene i det aktuelle program, er det vigtigt at anerkende sine begrænsninger. For eksempel, mens kontrast enhancement via intensitet udjævningen tilbyder lettere at gennemføre, kan transformationer af hele fordelingen af pixel intensiteter forbedre SNR yderligere31. Ligeledes, selv om korrelationen-baseret sporing er veletableret og giver nok opløsning til pålideligt estimering af første-ordens flydeegenskaber relevante for Hæmodynamik (fx, intra-aneurysmal hastighed), andre teknikker kan tilbyde en højere spatial opløsning (fxhybrid PIV/PTV, mindste-kvadraters matching)32,33 , og dermed større nøjagtighed, når de overvejer karakteristika, som er mere følsomme over for hastighed felt opløsning (f.eks. , væg shear stress, fly vorticity). Ligeledes, mens NMT giver et middel til at forbedre velocity vektor felt efter Kors-sammenhæng, er det vigtigt at understrege, at dette er blot en af mange vektor validering teknikker, der kunne være brugt24,34, hver med deres egen unikke fordele og ulemper, der kan gøre deres anvendelse mere velegnet til applikationer ud over dem, der beskrives her. Endelig, mens den eksperimentelle set-up beskrevet her søger at efterligne fysiologisk relevante strømningshastigheder og længde skalaer for neurovasculature, det i øjeblikket tillader ikke analyse af pulsatile strømme. Det har ikke været en begrænsning for det aktuelle program, da vifte af Womersley numre i meget af neurovasculature tendens til at være ≤ 1 (dvs., der er en minimal additiv effekt af flere hjerte cyklusser)35, hvilket tyder på, at steady-state-betingelser er tilstrækkelig til at sammenfatte diskret tidspunkter langs hjerte bølgeformen, hvor flowet er sammenlignelige. Dog til applikationer, hvor Womersley antallet er større (f.eks.Vaskulaturen tættere til hjertet), vi ser et potentiale for at indføre Pulsatilitetsindeks ved hjælp af en Arduino, som kunne bruges til at sende pumpen et tidsvarierende PWM spænding bølgeform, der muliggør efterligning af et hjerte flow profil36,37,38.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at erklære.

Acknowledgements

Forfatterne anerkende delvis støtte til dette projekt leveret af kollaborative frø tilskud fra Office for forskning og økonomiske udvikling på UC Riverside.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Solidworks 2015 Dassault Systems N/A CAD Software 
Dow Corning Sylgard 184 Kit Ellsworth Adhesive 184 SIL ELAST KIT 3.9KG PDMS Kit
Stratasys Dimension Elite Stratasys 9180-00105 3D printer
P430 Model Material Cartridge Stratasys 340-21202 ABS build material 
P400 SR Soluble Support Material Cartridge Stratasys 340-30200 Support material
CleanStation DT3 PM3 Technologies 00-00300R Base bath
Lindberg Blue M LGO Box Furnace  Thermo Scientific LB305745M Oven
21G BD PrecisionGlide Needle Betcon Dickenson BD 305167 Branching perforator mold segment
Desiccator (Vacuum) Polylab 55205 Desiccator
Branson 1800 Utrasonic Cleaning Branson CPX-952-116R Sonicator
Acetone Fisher Chemical A9494 Acetone
Isopropol Alcohol Fisher Chemical A4514 Isopropol Alcohol
Glycerol Fisher Chemical GW33500 Glycerol
10um Polystyrene Yellow-Green Fluorescent Particles Magsphere PSF-010UM Fluorescent beads
Phantom Miro  Vision Research Miro M310 High speed camera
Micropump Cole-Parmer 81101 Recirculating pump
Leica DM2000 Leica Microsystems DM2000 Fluorescent Microscope
Leica 10X Objective Leica Microsystems 506259 Objective for perforator
Leica 2.5X Objective Leica Microsystems 11506083 Objective aneurysm sac
Leica Blue Filter Cube L5 Leica Microsystems 513840 Blue filter cube
Leica EL6000 Leica Microsystems 11504115 Light source
Alconox Alconox Inc 1104-1 Detergent
ImageJ NIH N/A Open source image analysis software
https://imagej.nih.gov/ij/
Particle Image Velocimetry PIV Plugin Qingson Tseng N/A https://sites.google.com/site/qingzongtseng/piv

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Grant, I. Particle image velocimetry: A review. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part C: Journal of Mechanical Engineering Science. 211, (1), 55-76 (1997).
  2. Lindken, R., Rossi, M., Große, S., Westerweel, J. Micro-Particle Image Velocimetry (µPIV): Recent developments, applications, and guidelines. Lab on a Chip. 9, (17), 2551 (2009).
  3. Hove, J. R., et al. Intracardiac fluid forces are an essential epigenetic factor for embryonic cardiogenesis. Nature. 421, 172 (2003).
  4. Ando, J., Yamamoto, K. Vascular Mechanobiology. Circulation Journal. 73, (11), 1983-1992 (2009).
  5. Conway, D. E., et al. Fluid Shear Stress on Endothelial Cells Modulates Mechanical Tension across VE-Cadherin and PECAM-1. Current Biology. 23, (11), (2013).
  6. Kuhlencordt, P. J., et al. Accelerated Atherosclerosis, Aortic Aneurysm Formation, and Ischemic Heart Disease in Apolipoprotein E/Endothelial Nitric Oxide Synthase Double-Knockout Mice. Circulation. 104, (4), 448-454 (2001).
  7. Lieber, B. B., Stancampiano, A. P., Wakhloo, A. K. Alteration of hemodynamics in aneurysm models by stenting: Influence of stent porosity. Annals of Biomedical Engineering. 25, (3), 460-469 (1997).
  8. Bulusu, K. V., Plesniak, M. W. Experimental Investigation of Secondary Flow Structures Downstream of a Model Type IV Stent Failure in a 180° Curved Artery Test Section. Journal of Visualized Experiments. (113), e51288 (2016).
  9. Tseng, Q., et al. Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell-cell junction positioning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, (5), 1506-1511 (2012).
  10. Shavit, U., Lowe, R. J., Steinbuck, J. V. Intensity Capping: a simple method to improve cross-correlation PIV results. Experiments in Fluids. 42, (2), 225-240 (2007).
  11. Raffel, M., Willert, C. E., Werely, S., Kompenhans, J. Particle Image Velocimetry: a Practical Guide. Springer. New York, NY. (2007).
  12. Kerl, H. U., et al. Implantation of Pipeline Flow-Diverting Stents Reduces Aneurysm Inflow Without Relevantly Affecting Static Intra-aneurysmal Pressure. Neurosurgery. 74, (3), 321-334 (2014).
  13. Lieber, B. B., Livescu, V., Hopkins, L. N., Wakhloo, A. K. Particle Image Velocimetry Assessment of Stent Design Influence on Intra-Aneurysmal Flow. Annals of Biomedical Engineering. 30, (6), 768-777 (2002).
  14. Charonko, J., Karri, S., Schmieg, J., Prabhu, S., Vlachos, P. In vitro, time-resolved PIV comparison of the effect of stent design on wall shear stress. Annals of Biomedical Engineering. 37, (7), 1310-1321 (2009).
  15. Rand, P. W., Lacombe, E., Hunt, H. E., Austin, W. H. Viscosity of normal human blood under normothermic and hypothermic conditions. Journal of Applied Physiology. 19, (1), 117-122 (1964).
  16. Kenner, T., Leopold, H., Hinghofer-Szalkay, H. The continuous high-precision measurement of the density of flowing blood. Pflügers Archiv European Journal of Physiology. 370, (1), 25-29 (1977).
  17. Hoyt, L. F. New Table of the Refractive Index of Pure Glycerol at 20°C. Industrial & Engineering Chemistry. 26, (3), 329-332 (1934).
  18. Cai, Z., Qiu, W., Shao, G., Wang, W. A new fabrication method for all-PDMS waveguides. Sensors and Actuators A: Physical. 204, 44-47 (2013).
  19. Bouillot, P., et al. Particle imaging velocimetry evaluation of intracranial stents in sidewall aneurysm: hemodynamic transition related to the stent design. PloS ONE. 9, (12), 113762 (2014).
  20. Trager, A. L., Sadasivan, C., Lieber, B. B. Comparison of the in vitro hemodynamic performance of new flow diverters for bypass of brain aneurysms. Journal of Biomechanical Engineering. 134, (8), 084505 (2012).
  21. Clauser, J., et al. A Novel Plasma-Based Fluid for Particle Image Velocimetry (PIV): In-Vitro Feasibility Study of Flow Diverter Effects in Aneurysm Model. Annals of Biomedical Engineering. 46, (6), 841-848 (2018).
  22. Johnston, I. D., McCluskey, D. K., Tan, C. K. L., Tracey, M. C. Mechanical characterization of bulk Sylgard 184 for microfluidics and microengineering. Journal of Micromechanics and Microengineering. 24, (3), 035017 (2014).
  23. Lee, J. N., Park, C., Whitesides, G. M. Solvent Compatibility of Poly(dimethylsiloxane)-Based Microfluidic Devices. Analytical Chemistry. 75, (23), 6544-6554 (2003).
  24. Meinhart, C. D., Wereley, S. T., Santiago, J. G. A PIV Algorithm for Estimating Time-Averaged Velocity Fields. Journal of Fluids Engineering. 122, (2), 285 (2000).
  25. Bosbach, J., Kühn, M., Wagner, C., Raffel, M., Resagk, C. Large-Scale Particle Image Velocimetry of Natural and Mixed Convection. 13th Int Symp on Applications of Laser Techniques to Fluid Mechanics. (2006).
  26. Meinhart, C. D., Wereley, S. T., Santiago, J. G. PIV measurements of a microchannel flow. Experiments in Fluids. 27, (5), 414-419 (1999).
  27. Lima, R., et al. In vitro blood flow in a rectangular PDMS microchannel: experimental observations using a confocal micro-PIV system. Biomedical Microdevices. 10, (2), 153-167 (2008).
  28. Kuo, C. -C., Mao, R. -C. Development of a Precision Surface Polishing System for Parts Fabricated by Fused Deposition Modeling. Materials and Manufacturing Processes. 31, (8), 1113-1118 (2016).
  29. Kang, K., Oh, S., Yi, H., Han, S., Hwang, Y. Fabrication of truly 3D microfluidic channel using 3D-printed soluble mold. Biomicrofluidics. 12, (1), 014105 (2018).
  30. Prasad, A. K. Particle Image Velocimetry. Current Science. 79, (1), 51-60 (2000).
  31. Dellenback, P. A., Macharivilakathu, J., Pierce, S. R. Contrast-enhancement techniques for particle-image velocimetry. Applied Optics. 39, (32), 5978-5990 (2000).
  32. Cowen, E. A., Monismith, S. G. A hybrid digital particle tracking velocimetry technique. Experiments in Fluids. 22, (3), 199-211 (1997).
  33. Gruen, A. W. Adaptive least squares correlation: a powerful image matching technique. South African Journal of Photogrammetry, Remote Sensing and Cartography. 14, (3), 175-187 (1985).
  34. Nogueira, J., Lecuona, A., Rodríguez, P. A. Data validation, false vectors correction and derived magnitudes calculation on PIV data. Measurement Science and Technology. 8, (12), 1493-1501 (1997).
  35. Loudon, C., Tordesillas, A. The Use of the Dimensionless Womersley Number to Characterize the Unsteady Nature of Internal Flow. Journal of Theoretical Biology. 191, (1), 63-78 (1998).
  36. Drost, S., De Kruif, B. J., Newport, D. Arduino control of a pulsatile flow rig. Medical Engineering and Physics. 51, 67-71 (2017).
  37. Tsai, W., Savaş, Ö Flow pumping system for physiological waveforms. Medical & Biological Engineering & Computing. 48, (2), 197-201 (2010).
  38. Kato, T., et al. Contrast-enhanced 2D cine phase MR angiography for measurement of basilar artery blood flow in posterior circulation ischemia. American Journal of Neuroradiology. 23, (8), 1346-1351 (2002).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics